Summary
פרוטוקול זה מתאר יישומים של קיבוע מדגם באמצעות קרישי פיברין, הגבלת הסחף, ומאפשר הוספה ושטיפה של ריאגנטים במהלך הדמיה חיה. דגימות מועברות טיפה של פיברינוגן המכיל מדיום תרבות על פני השטח של כריכה, ולאחר מכן פילמור הוא המושרה על ידי הוספת תרומבין.
Abstract
דרוזופילה היא מערכת מודל חשובה לחקר מגוון רחב של שאלות ביולוגיות. איברים ורקמות שונים מהשלבים ההתפתחותיים השונים של הזבוב כגון דיסקים דמיוניים, מוח הזחל או תאי הביציות של נקבות בוגרות או המעי הבוגר יכולים להיות מופקים ונשמרים בתרבות להדמיה עם מיקרוסקופיה לשגות בזמן, מתן תובנות חשובות על ביולוגיה תאית התפתחותית. כאן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול הנוכחי שלנו לניתוח מוחות הזחל של דרוזופילה, ולאחר מכן מציגים את הגישה הנוכחית שלנו לשיתוק וכוונת מוחות זחל ורקמות אחרות על מכסה זכוכית באמצעות קרישי פיברין. שיטת קיבוע זו דורשת רק תוספת של פיברינוגן ותרומבין למדיום התרבותי. היא מתאימה להדמיית זמן ברזולוציה גבוהה על מיקרוסקופים הפוכים של דגימות מרובות באותה מנה תרבותית, ממזערת את הסחף הלרוחב הנגרם לעתים קרובות על ידי תנועות של שלב המיקרוסקופ במיקרוסקופיה ביקור רב-נקודתית ומאפשרת הוספה והסרה של ריאגנטים במהלך ההדמיה. כמו כן, אנו מציגים פקודות מאקרו מותאמות אישית שבהן אנו משתמשים באופן שגרתי כדי לתקן להיסחף ולחלץ ולעבד מידע כמותי ספציפי מניתוח זמן לשגות.
Introduction
דרוזופילה ממשיכה להיות מערכת מודלים חשובה לחקר מגוון רחב של שאלות ביולוגיות והצטיינה בקידום ידע בדיסציפלינות רבות במשך עשרות שנים. תכונה אחת שגורמת לו להתבלט במיוחד היא שהוא מתאים במיוחד להדמיה חיה. היכולת לנטר תהליכים תת-תאיים או התנהגות תאים ורקמות בזמן אמת ממשיכה לתרום ליצירת מושגי מפתח הרלוונטיים לביולוגיה התאית וההתפתחותית. פרוטוקולים מוצלחים רבים פותחו על ידי קבוצות שונות כדי לשמור על דגימות Drosophila כאלה חיים ובריאים כדי ללמוד את ההתנהגות של הדגימה ומולקולות פלואורסצנטיות לחיות. איברים ורקמות מהזבוב כגון דיסקים דמיוניים1,2, מוח הזחל 3,4,5,6, או תאי ביצה של נקבות בוגרות7,8,9, או המעי הבוגר10 למשל ניתן לחלץ ושמור בתרבות להדמיה עם מיקרוסקופ זמן לשגות. אתגר מרכזי להדמיה חיה הוא להבטיח שהדגימה תישמר קרוב למשטח ההדמיה לרזולוציה אופטימלית ושיתוק מבלי להתפשר על שלמות הדגימה שיכולה להיות רגישה להשפעות מכניות. כדי לחקור תאי גזע עצביים, הנקראים נוירובלסטים או נוירונים במוח הזחל Drosophila, למשל, שמירה על דגימות קרוב לפני השטח הדמיה יכול להיות מושגת על ידי כיסוי אותם עם מדיה תרבותית בתאי הדמיה אטומים11,12,13. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת בקלות חילופי מדיה ובכך מגבילה את מרחב התמרון הניסיוני. לחלופין, ניתן להכין ולהניח דגימות על כריכות שטופלו כדי להגביר את ההידבקות בתאים ולאפשר מיקרוסקופיה ביקור רב-נקודתית והדמיה ממושכת של תאים חיים במנות תרבות פתוחות, המאפשרות חילופי מדיה, אך אינן מספקות אמצעים קלים למניעת סחף או אובדן מדגם במהלך חילופי מדיה14,15.
שיטת קריש פיברין שפותחה במקור כדי ללמוד מיוזיס בזרעון עגורן חי16 מתאים במיוחד כדי להתגבר על בעיות אלה. פיברינוגן מומס במדיום תרבות רלוונטי, הדגימות ממוקמות ומכוונות בטיפה של פתרון זה על תא הדמיה זכוכית-משטח נאות לפני Thrombin מתווסף, וכתוצאה מכך היווצרות מהירה של קריש פיברין מסיס, רשת סיבית דביקה כי דבק משטח הזכוכית ואת הדגימות תוך הבטחת גישה של המדגם למדיום התרבות. לאחר מכן ניתן להחליף את המדיום מבלי להטריד את מיקום הקריש או המדגם. חילופי תרבות בינוניים במהלך ההדמיה, למשל, רצויים כאשר יש להוסיף מעכבים כמו בשיטה המקורית או לניסויי שטיפה או מרדף דופק או כאשר יש להוסיף צבעים פלואורסצנטיים במהלך הדמיית תאים חיים תוך שמירה על תאים ורקמות במקום. קרישי פיברין מתאימים להדמיה של רקמות Drosophila, כמו גם תאים בודדים13,17. קרישי פיברין ניתן להשתמש עוד יותר כדי לעזור דגימות אוריינטציה, כי בשל צורתם או מאפיינים אחרים בדרך כלל לא יהיה מכוון בדרך הרצויה על ידי אפנון מיקום המדגם בתוך קריש פיברין ואת הצורה של הקריש עצמו.
כאן אנו מספקים עדכון על שיטות ההדמיה הנוכחיות שלנו המבוססות על קריש פיברין ומספקים כלים לניתוח תמונה מבוסס פילוח ומתמקדים בשימוש בשיטה זו כדי לחקור חטיבות נוירובלסט במוח הזבוב המתפתח. אנו משתמשים באופן שגרתי בשיטת קריש פיברין כדי לעקוב אחר דגימות מרובות בקרישי דם שונים באותה צלחת תרבות. זה מאפשר i) הדמיה של אירועים תת תאיים כגון התנהגות centrosome או לוקליזציה mRNA לחיות18,19, ii) ניטור ההתנהגות של דגימות על טיפול תרופתי של גנוטיפים שונים תחת אותן הגדרות הדמיה באמצעות מיקרו ביקור רב נקודתיוסקופיה20, iii) לחקור את ההשפעות של עיכוב חריף שלאנזימים 21 ו iv) מזעור נסחף לחקור שינויים בכיוון של חלוקת התא של תאים בתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם על ממוקד לייזר אבלציה22. בעוד השפעות לא רצויות של תרומבין ופיברינוגן וקריש פיברין צריך להיבדק באופן אמפירי עבור כל מדגם, שיטה זו מתאימה עקרונית לשיתוק כל סוג של מדגם שיש לנתח על ידי הדמיית תאים חיים ובדרוסופילה שימש בהצלחה לחקר היבטים מרובים של ביולוגיה נוירובלסטים5,19,20אבל גם את הדינמיקה של תחזיות cytosensor של תאי גזע קו נבט נקבה23 ושינויים בקוטביות על עיכוב aPKC חריפה של תאי זקיק של תאי ביצה נקבה Drosophila 21.
הדמיה פלואורסצנטית של זמן לשגות גורמת ליצירת ערכות נתונים תלת-ממדיות מורכבות שנפתרו בזמן הדורשות שיטות לחילוץ מידע כמותי זה. כאן אנו מתארים את ההתפתחות הנוספת שלנו של24 פקודות מאקרו מבוססות ImageJ שניתן להשתמש בהן כדי לתקן להיסחף בהיפרסטקים ופקודות מאקרו מותאמות אישית של ImageJ המאפשרות כימות אוטומטי למחצה של פלואורסצנטיות רב-ערוצית בקליפת המוח התאית שפותחה לכימות חלבונים קליפת המוח בנוירובלסטים של מוחות זחל דרוזופילה או של נוירובלסטים בודדים בתרבית התאים העיקרית.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים
הערה: כל השלבים בפרוטוקול זה, אלא אם כן מוסבר אחרת מתבצעים בטמפרטורת החדר.
- כדי להכין פתרון של 1x PBS-BSA (0.1% w/v), להמיס 1 מ"ג של אלבומין סרום שור (BSA) ב 1 מ"ל של PBS. כדי להכין פתרון מלאי של תרומבין 1,000יחידות·mL-1, לפזר 1,000 יחידות של תרומבין ב 1 מ"ל של PBS-BSA (0.1% w / v). הפוך aliquots של 10 μL ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד 4 חודשים.
- כדי להכין את מדיום התרבות למוחות דרוזופילה, יש להמיס גרם אחד של גלוקוז ב-1 L של המדיום של שניידר בתנאים סטריליים. יש לסנן ולאחסן ב-4°C עד 3 חודשים.
- כדי להכין את הפתרון פיברינוגן, להמיס 10 מ"ג של פיברינוגן ב 1 מ"ל של מדיום תרבות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר או 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: אם נעשה שימוש במדיום תרבות שונה מזה שהוכן בשלב 1.2 וקרישי פיברין כבר נוצרים בשלב זה, מדיום התרבות מכיל ככל הנראה תרומבין פעיל, שיש להשביתו מראש. מקור סביר של טרומבין הוא סרום שור עוברי, אשר ניתן להשבית על ידי חימום הסרום ל 56 °C (70 °F) במשך 30 דקות. - כדי להכין פתרון ציפוי של PBS-BSA (5% w / v), להמיס 50 מ"ג של אלבומין סרום שור (BSA) ב 1 מ"ל של 1x PBS.
- לדוגמה ריאגנט בשימוש בשלב 4, להכין פתרון מלאי של 10 מ"מ NAPP1 על ידי המסת 1 מ"ג NAPP1 ב 315 μL דימתיל סולפוקסיד.
2. ניתוח של מוחות זחל דרוזופילה
הערה: בצע שלב זה תחת משקפת ניתוק.
- השתמש במברשת כדי להעביר זחלי L3 לתוך צלחת זכוכית 9-well borosilicate המכיל PBS. מערבבים כדי לנתק את רוב מזון זבוב מן הזחלים ולהעביר עוד מדיום תרבות המכיל היטב.
- השתמש במלקחיים (למשל, דומונט #55) כדי לאחוז בזחל לאורך כל קוטרו, באמצע אורך גופו (ראה איור 1A,B). תוך החזקת הזחל, להעביר אותו לבאר אחרת של צלחת borosilicate המכיל 200 μL של מדיום תרבות טרי.
- אל תשחרר את הזחל. כדי לחתוך את הזחל לשניים לאורך כל קוטרו (איור 1B),טוחנים את האזור האחיזה בתנועה רוחבית של קצות המלקחיים(איור 1A, הלוח העליון) או מחליקים קצה אחד של זוג מלקחיים אחר בין שני קצות המלקחיים המחזיקים בזחל(איור 1A, החלונית התחתונה). אין לחתוך את הזחל לשניים על ידי משיכת אחד הגפיים שלו, שכן הוא עלול לגרום נזק למוח על ידי משיכתו דרך העצבים החוצים את אורך הגוף (קווים אדומים באיור 1B).
- השתמשו במלקחיים כדי להחזיק את הזחל ליד הקוטיקל שלו וזוג מלקחיים נוסף כדי לקלף לגזרים את הקוטיקל מבלי למשוך את המוח (איור 1C). חזרו על הפעולה עד שהעצבים שמקורם במוח יהיו גלויים, וניתן יהיה לגשת לאיברים המחברים את המוח לחלקי הפה, כפי שמוצג באיור 1D.
- השתמש מלקחיים להחזיק את העצבים שמקורם במוח. עם זוג המלקחיים האחרים, השתמש באחת מהטכניקות המוצגות באיור 1A כדי לנתק את הקשר בין המוח לחלקי הפה, ולהפריד את המוח משאר הקוטיקל(איור 1D).
- השתמש מלקחיים להחזיק את המוח על ידי האקסונים יוצאים מחוט העצבים הגחוני. תלשו את האיברים המתוארים באפור באיור 1E על ידי משיכתם בעדינות מהמוח.
הערה: אין למשוך את הדיסקים הדמיוניים של העין/אנטנה (צהוב כהה) כדי לנתק אותם מהמוח. הקשר בין רקמות אלה הוא חזק מדי כדי להישבר על ידי משיכת מבלי לפגוע במוח. - בעודם אוחזים בעצבים כדי להחזיק ולכוון את המוח, תפסו את הקשר בין הדיסקים הדמיוניים של העין/אנטנה (צהוב כהה) לבין המוח עם זוג המלקחיים האחר(איור 1F). השתמש באחת מהטכניקות המוצגות באיור 1A כדי לנתק חיבור זה מבלי למשוך את המוח. בדקו אם המוח נקי כראוי מרקמות אחרות (איור 1G) ולא ניזוק (איור 1H). השלך את המוח אם הוא מראה סימנים של נזק.
- פיפטה פתרון הציפוי עם P20 פנימה והחוצה כדי לצפות את קצה פיפטה. פיפטה המוח עם קצה מצופה יחד עם 3 μL של בינוני(איור 2A, שמאל)ופיפט אותו בבאר אחרת המכילה 200 μL של מדיום תרבות נקייה.
- חזור על שלבים 2.2-2.8 עד לנתח מספיק מוחות, ומדי פעם להחליף את מדיום התרבות של הבאר שבה מבוצעים הניתוחים.
איור 1: ניתוח מוחות זחל של ד. מלנוגאסטר. (A)טכניקה לחיתוך מבלי למשוך באמצעות מלקחיים. המדגם (ירוק חיוור) ניתן לחתוך על ידי היותו הקרקע בין קצות המלקחיים (הלוח העליון) או על ידי הפעלת קצה של זוג מלקחיים קצה לאורך קצות זוג מלקחיים מחזיק את המדגם (הלוח התחתון). (B-ו) שלבים לבידוד מוח הזחל מבלי לפגוע בו (ראה טקסט). אדום: מוח. צהוב כהה: דיסקי עיניים/אנטנות. טקסט כחול: פעולות שיש לבצע עם המלקחיים המתאימים. (G) מראה של מוח מבודד ללא נזק נראה לעין. D הוא הצד הגבי ו- V הוא הצד הגחוני בתצוגה הצדדית. (H)נזקים נפוצים הנגרמים על ידי משיכת המוח יתר על המידה במהלך הניתוח. לוח עליון: ניתוק חוט העצבים הגחוני. לוח תחתון: עיוות של האונה. אחורי הוא שמאל ו anterior הוא ממש בכל הלוחות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
3. קיבוע על כיסוי עם קרישי פיברין
הערה: בצע שלב זה תחת משקפת ניתוק.
- השתמשו בפיפט P20 עם קצה מצופה כמו בשלב 2.8 כדי להעביר את המוח המנותח לבאר אחרת של צלחת הבורוסיליקט המכילה 200 μL של מדיום תרבות + פיברינוגן(איור 2A).
- פיפטה במוח אחד יחד עם 9 μL של מדיום תרבות + פיברינוגן. כשסוף הקצה כמעט נוגע בתחתית זכוכית הכיסוי של צלחת תרבית תאים של 35 מ"מ, פיפטה מוציאה את התוכן (מדיום התרבות והמוח) מה שהופך את התרבות למדיום נוגעת בכיסוי מיד לאחר היציאה מקצה פיפטה כך שהמוח והמדיום לא יחליקו לצדדים של הקצה, דבר שעלול לפגוע במוח (איור 2A).
- השתמש בקצה אחד של זוג מלקחיים או זוג סגור של מלקחיים כדי לדחוף בעדינות ולמקם את המוח בתוך מדיום התרבות + טיפת פיברינוגן.
הערה: נגיעה בשחרור עם זוג מלקחיים פתוחים עלולה לגרום למדיום התרבותי להימשך על ידי נימיות בין קצות המלקחיים (איור 2B). - אם יש לדמות את החלק הגחוני של המוח, לגרום לקרישת פיברינוגן כדלקמן כדי לכוון כראוי את המוח בתוך הקריש(איור 2C).
- לדחוף את המוח לצד אחד של הירידה. עם פיפטה P1 מצוידת קצה P1, פיפטה 1 μL של פתרון תרומבין, לגעת בקצה הירידה בצד הנגדי של המוח עם קצה פיפטה, פיפטה את Thrombin(איור 2C,ציור ראשון).
- המתינו 1-2 דקות עד שהפיברינוגן יתחיל בפולימריזציה, וכתוצאה מכך נוצר משקע מעונן בצד אחד של הירידה(איור 2C, ציור שני). בעדינות לדחוף ו "לתחוב" את המוח לתוך קריש פיברין, לוודא כי החלק לתמונה (למשל, הצד הגחוני) הוא קרוב ככל האפשר כיסוי מבלי לעוות את המוח (איור 2C, ציור שלישי).
- פיפטה החוצה 1 μL של תמיסת תרומבין קרוב לצד של המוח לא תחוב לתוך קריש פיברין. (איור2C, ציור רביעי).
- המתן 2-3 דקות לסט קריש פיברין השני(איור 2C, ציור חמישי). לחץ על הקצוות של הקריש כדי להפוך אותו דבק חזק יותר כיסוי, מקפיד לא לעוות את המוח (איור 2C, השישי והשביעי ציורים). אם המוח נראה רחוק מדי מן הכיסוי, לקרב אותו על ידי לחיצה על קריש פיברין קרוב למוח.
- אם יש לדמות את החלק הגבי של המוח, לגרום לקרישת פיברין באופן הבא (איור 2D).
- מקם את המוח במרכז הירידה, חלק הגבי מול הכיסוי. עם פיפטה P10 מצוידת בקצה דק, פיפטה 1 μL של פתרון תרומבין, לגעת בקצה הירידה בצד הנגדי של המוח עם קצה פיפטה, פיפטה את Thrombin (איור 2D, ציור ראשון).
- המתינו 2-3 דקות עד שהפיברינוגן יתחיל בפולימריזציה, וכתוצאה מכך נוצר משקע סיבי מעונן(איור 2D, ציור שני). לחץ על קצות הקריש כדי להפוך אותו לדבוק חזק יותר כיסוי, מקפיד לא לעוות את המוח (איור 2D, ציורים שלישיים והרביעיים).
- חזור על שלבים 3.1–3.5 אם יש לשתק מספר דגימות קריש על ה-coverslip.
- עם קצה הקצה ממוקם כ 0.5 ס"מ מעל קריש(s), בעדינות פיפטה 390 μL של מדיום תרבות ללא פיברינוגן dropwise על גבי קריש(איור 2B,צלחת פטרי ימין). אין להוסיף את מדיום התרבות בצידי הקריש מכיוון שהוא עלול לנתק אותו מהכיסוי.
- כדי לשטוף את Thrombin הנותרים, להשתמש פיפטה כדי להסיר 300 μl של מדיום התרבות ולהוסיף 300 μl של מדיום תרבות נקייה, לוודא כי קרישי להישאר שקוע לחלוטין. חזור פעמיים כדי לשטוף את טרומבין עודף.
איור 2: קיבוע של מוח זחל דרוזופילה באמצעות קרישי פיברין. (A)באמצעות קצה פיפטה מצופה BSA, המוח מועברים ממדיום התרבות (צהוב) למדיום תרבות + פתרון פיברינוגן (כתום), ולאחר מכן pipetted על כריכה (כחול בהיר) של צלחת תרבות יחד עם 3.5 μL של מדיום תרבות + פיברינוגן. קרישת פיברינוגן נגרמת על ידי תוספת של תרומבין כדי לשתק את המוח במצב הגב או הגחון (ראה D ו- E). המוחות המאובטחים בקרישי הים מכוסים לאחר מכן במדיום תרבות ללא פיברינוגן וטרומבין עודף מוסר על ידי הוספה והסרה של מדיום תרבות שלוש פעמים. (B) המיקום של המוח בתוך טיפת מדיום תרבות + פיברינוגן (כתום) על כריכה צריך להיות מותאם רק על ידי דוחף אותו בעדינות עם קצה של זוג סגור של מלקחיים, או רק קצה מלקחיים אחד. נגיעה בירידה עם זוג מלקחיים פתוחים יכולה לגרום למדיום התרבות להימשך על ידי נימיות בין קצות המלקחיים. (ג)צעדים למיקום מוח הזחל להדמיית הצד הגחוני (ראה טקסט). (D) צעדים למיקום מוח הזחל להדמיית הצד הגבי (ראה טקסט). ב(D) ו - (E), ירוק: תרומבין. כתום כהה: קריש פיברין. כחול חיוור: כיסוי. חצים כחולים: קצוות של הקריש להיות דחף נגד כיסוי כדי לייצב את הקריש. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
4. תוספת ריאגנטים במהלך הדמיה חיה
- כדי למנוע שינויי טמפרטורה הגורמים לשינויי מיקוד, שמור על הפתרון עם ריאגנטים להתווסף לצלחת התרבות באותה טמפרטורה כמו צלחת התרבות עצמה להביא אותו לאותה טמפרטורה לפני הוספתו. אם נעשה שימוש בתא סביבתי, השאירו את הפתרון בתוך התא.
- הסר את המכסה של צלחת התרבות מבלי לעקור את צלחת התרבות עצמה. להסרה קלה יותר, מניחים את המכסה של צלחת 35 מ"מ במהופך על גבי המנה לפני ההדמיה.
- עם פיפטה P1000, למקם את קצה פיפטה קרוב לפני השטח של מדיום התרבות בתוך צלחת התרבות בעדינות לשחרר את הנפח ההולם של פתרון מגיב על זה כדי להגיע לריכוז מגיב הרצוי (למשל, 400 μL של פתרון של 20 מיקרום NAPP1 על 400 μL של מדיום תרבות עבור ריכוז סופי של 10 מיקרומטר NAPP1) מבלי ליצור שטף חזק שיכול לנתק את הקרישים.
- כדי הומוגניזציה של הפתרון בתוך צלחת התרבות, להשתמש פיפטה P200 לאט פיפטה כמות קטנה של הפתרון פנימה והחוצה חמש פעמים (למשל, 150 μL עבור נפח של 800 μL בתוך המנה).
- החליפו את המכסה על מנת התרבות מבלי לעקור את מנת התרבות עצמה ולחדש את ההדמיה.
5. שטיפה של ריאגנטים במהלך הדמיה חיה
- לפני הסחף, לשמור על פתרון הכביסה באותה טמפרטורה כמו צלחת התרבות.
- הסר את המכסה של צלחת התרבות מבלי לעקור את צלחת התרבות עצמה.
- עם P200 או P1000 פיפטה, לאט להסיר קצת מדיום תרבות מצלחת התרבות מבלי לחשוף את החלק העליון של הקריש (למשל, להסיר 600 μL מ 800 μL של מדיום תרבות בתוך המנה).
- כדי לדלל את ריאגנט, עם פיפטה P1000, למקם את קצה פיפטה קרוב לפני השטח של מדיום התרבות בתוך צלחת התרבות לאט לשחרר את פתרון הכביסה (למשל, להוסיף 1 מ"ל של פתרון כביסה 200 μL של מדיום תרבות שמאל בתוך המנה עבור גורם דילול של 6).
- חזור על שלבים 5.3 ו 5.4 עד ריאגנט מדולל כנדרש (למשל, עוד שלושה סיבובים דומים יגרום גורם דילול של 1296, הפחתת הריכוז הראשוני של 10 מיקרומטר NAPP1 ל 7.7 nM).
- החליפו את המכסה על מנת התרבות מבלי לעקור את מנת התרבות עצמה ולחדש את ההדמיה.
6. תיקון הקסיז נסחף על מעידות זמן תלת-ממדיות ו/או רב-ערוציות
- הכנה
- הורד והתקן את ImageJ24. הורד את TurboReg25 ו MultiStackReg26 תוספים ומניחים אותם בתוך התיקייה תוספים של ImageJ.
- הורד את פקודות המאקרו MultiHyperStackReg(קובץ קידוד משלים 1)ופקודות מאקרו של AutoHyperStackReg ImageJ (קובץ קידוד משלים 2). כדי להתקין מאקרו, מקם את קובץ ה- .ijm בתוך תיקיית התוספים של ImageJ או הוסף את התוכן של קובץ ה- .ijm לקובץ ImageJ/macros/StartupMacros.txt.
- ב- ImageJ, פתח סרט לשגות בזמן הכולל מספר פרוסות ו/או מספר ערוצים (מעתה ואילך נקרא "היפרסטאק", איור 3A,4A). אם הזמן לשגות כולל רק פרוסה אחת וערוץ אחד, היישור יכול להתבצע ישירות באמצעות MultiStackReg.
- תיקון של סחף לרוחב באמצעות MultiHyperStackReg
- החלט באיזה ערוץ ו/או פרוסה של היפר-סטאק יש להשתמש כהפניה ליישור. ליצירת מחסנית הפניות חד-ערוצית של פרוסה אחת (מעתה ואילך נקראת "מחסנית הפניות"), לחצו על 'תמונה' | שכפל..., סמן את תיבת הסימון שכפול היפרסטאק, הקלד את מספר הערוץ הרלוונטי בערוצים (c): (למשל, החלף 1-2 ב- 1) ו/או את מספר הערוץ הרלוונטי בפרוסות (z): (למשל, החלף 1-15 ב- 8), וודא שמסגרות: (t) כוללות את כל המסגרות (למשל, 1–50) לפני לחיצה על אישור (איור 3B).
- לחלופין, לשלב 6.2.1, אם הקרנה של פרוסות מרובות עדיפה על מחסנית הפניות של ערוץ אחד ופרוסה אחת, לחץ על תמונה | ערימות | Z Project..., בחר את הפרוסות הראשונות והאחרונה ואת סוג ההקרנה, ודא שכל מסגרות הזמן מסומנות ולחץ על אישור. אם לשגות הזמן יש ערוצים מרובים או למחוק את הערוצים הלא רלוונטיים (תמונה | ערימות | מחק פרוסה) מההקרנה המתקבלת או שכפל את ערוץ ההפניה שנבחר (תמונה | שכפל) (איור 3B).
- לחלופין, חתוך את ערימת ההפניות כדי להשתמש רק בחלק אחד כתמונה כהפניה על-ידי בחירת הכלי מלבן בסרגל הכלים, מעקב אחר מלבן מעל אזור העניין ולחיצה על תמונה | חתוך .
- כדי להפעיל MultiStackReg, לחץ על תוספים | | רישום ריבוי ערוצים. בתפריט הנפתח Stack 1:, בחר בשם הערימה החד-ערוצית בפרוסה אחת שנוצרה בשלבים הקודמים. בתפריט הנפתח שינוי צורה:, בחר תרגום; סמן את תיבת הסימון שמור קובץ המרה והתעלם מכל השדות האחרים.
הערה: סוגים אחרים של טרנספורמציה (ראה25). - לחץ על אישור. בחר מיקום ושם לשמירת קובץ היישור ולחץ על שמור. בחלון מחסנית ההפניות, המתן עד שהמסגרות יפסיקו לנוע באופן אוטומטי, כדי לציין שהרישום נגמר (איור 3B).
- בדוק את מחסנית ההפניות כדי לראות אם היישור מספק. אם לא, חזור על שלבים 6.2.1–6.2.5 עם פרוסת ייחוס, ערוץ ו/או חיתוך שונים. סגור את מחסנית ההפניות.
- בחר את חלון ההיפר-סטאק והפעל את המאקרו MultiHyperStackReg. בחר את קובץ ההמרה שנוצר בשלב 6.2.5 ולחץ על פתח. המתן להחלת היישור על כל ערוץ ו/או פרוסה של היפר-סטאק, ובשלב זה ייפתח חלון חדש עם הסיומת "_aligned" (איור 3C).
- תיקון של התמקדות להיסחף באמצעות MultiHyperStackReg
- לחץ על תמונה | מאפיינים..., העתק את הערך המוצג ברוחב פיקסל. כדי לשרבט את ההיפר-סטאק של ערוץ אחד באמצעות מרווח של פיקסל אחד, לחץ על תמונה | ערימות | Reslice [/]..., הדבק את ערך רוחב הפיקסלים בשדה מרווח בין פלט: מספרי; בחר 'החלק העליון' בתפריט המוקפץ 'התחל ב': ,סמן הימנעות מאינטרפולציה ולחץ על אישור.
הערה: במקרה שיש לשחרר זיכרון ב- ImageJ, ניתן לסגור את היפר-סטאק לאחר השריד. - בחר את החלון החדש שנוצר על-ידי השריד (מכאן ואילך נקרא "היפרסטאק מסוכך", איור 4B). אם היפרסטאק resliced יש ערוצים מרובים, בחר ערוץ הפניה כדי לבצע את היישור ולמחוק את הערוצים האחרים על ידי בחירת אותם בפס הגלילה של הערוץ; לחץ על תמונה | ערימות | מחק פרוסה, בחר ערוץ בתפריט המוקפץ מחק נוכחי ולחץ על אישור.
- צור היפרסטאק עם שריד בפרוסה אחת (מכאן ואילך המכונה "מחסנית הפניה שנחתכה"), על-ידי שכפול פרוסה בודדת של היפר-סטאק השרף (ראה שלב 6.2.1) או על-ידי הקרנת מספר פרוסות של היפרסטאק השרף (ראה שלב 6.2.2) (איור 4C).
- באופן אופציונלי, חתוך את מחסנית ההפניות עם השרידים כדי להשתמש בחלק אחד בלבד כתמונה כהפניה (ראה שלב 6.2.3).
- בצע את רישום התמונה במחסנית ההפניות עם השרידים עם MutiStackReg (ראה שלבים 6.2.4–6.2.6) (איור 4C).
- בחר את חלון היפר-סטאק השימר והפעל את המאקרו MultiHyperStackReg. בחר את קובץ ההמרה שנוצר בשלב 6.3.5, לחץ על פתח והמתן להחלת היישור על כל ערוץ ו/או פרוסה של היפר-סטאק, ובשלב זה ייפתח חלון חדש עם הסיומת "_aligned" (מכאן ואילך המכונה "מחסנית הפניה שנחתכה", איור 4D). סגור את היפר-סטאק השריד המקורי.
- כדי להמיר את היפר-סטאק המיושר עם השריד לתצוגת ה- xy של היפר-סטאק המקורי, לחץ על ערימות | Reslice [/]..., בחר 'חלק עליון' בתפריט הנפתח 'התחל ב': 'סמן הימנעות מאינטרפולציה' ולחץ על 'אישור'. לאחר שנפתח חלון חדש עם היפר-סטאק עם יישור המיקוד הסופי (איור 4E), סגור את היפר-סטאק המיושר עם השריד.
- לחץ על תמונה | מאפיינים..., העתק את הערך המוצג ברוחב פיקסל. כדי לשרבט את ההיפר-סטאק של ערוץ אחד באמצעות מרווח של פיקסל אחד, לחץ על תמונה | ערימות | Reslice [/]..., הדבק את ערך רוחב הפיקסלים בשדה מרווח בין פלט: מספרי; בחר 'החלק העליון' בתפריט המוקפץ 'התחל ב': ,סמן הימנעות מאינטרפולציה ולחץ על אישור.
- כדי לתקן באופן אוטומטי את הסחף לרוחב ואת נדידת המוקד, הפעל את המאקרו AutoHyperStackReg. בחר את ערוץ ההפניה, אם ישים, ואם לתקן את הסחף לרוחב ו/או המוקד. לחץ על אישור.
איור 3: צינור לתיקון הסחף לרוחב עם MultiHyperstackReg. (A) ניתן להבחין בסחף רוחבי ובמיקוד על היפרסטאק המכיל מספר פרוסות ונקודות זמן. (B) פרוסה בודדת, מחסנית הפניה לערוץ יחיד נוצרת מתוך היפר-סטאק, בין אם על-ידי שכפול או הקרנת Z. מחסנית ההפניות מיושרת על-ידי התוסף MultiStackReg ויוצרת קובץ יישור. (C) המאקרו MultiHyperstackReg משמש להחלת קובץ היישור על היפר-סטאק, וכתוצאה מכך היפר-סטאק מיושר שעבורו תיקון הסחף הצדדי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: צינור לתיקון נדידת המיקוד באמצעות MultiHyperstackReg. (A) ניתן להבחין בסחף מיקוד על היפר-סטאק המכיל מספר פרוסות ונקודות זמן. (B) היפרסטאק הוא orthogonally resliced מלמעלה, לאורך כל שורה של פיקסלים לאורך ציר Y, ללא אינטרפולציה. התוצאה היא היפר-סטאק עם שריד המכיל את אותו מידע כמו ההיפר-סטאק, כאשר קואורדינטות ה- y וה- z שלו מוחלפות. נדידת המוקד (ב z) של היפרסטאק המקורי מתרחשת כמו להיסחף ב y על היפרסטאק resliced. (C) פרוסה בודדת, מחסנית הפניה עם שרידים של ערוץ יחיד, נוצרת מתוך היפר-סטאק שנחתך, בין אם על-ידי שכפול או הקרנת Z. מחסנית ההפניות השרשורית מיושרת על-ידי התוסף MultiStackReg ויוצרת קובץ יישור. (D) המאקרו MultiHyperstackReg משמש להחלת קובץ היישור על היפרסטאק השריד, וכתוצאה מכך היפר-סטאק מיושר שעבורו יתוקן נדידת המוקד (ב- y). (ה)שרף אורתוגונלי שני משחזר את הקואורדינטות המקוריות של היפרסטאק, אשר כעת כבר לא מציג נדידת מיקוד (ב z). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
7. מדידת אותות קליפת המוח עם קווים מסתובבים
- הורד את המאקרו של ImageJ של קווים מסתובבים (קובץ קידוד משלים 3).
- פתח פער זמן ב- ImageJ. מקמו את פס הגלילה של המסגרות למסגרת הראשונה, ובמקרה שהזמן לשגות מכיל מספר פרוסות, מקמו את פס הגלילה של הפרוסות לפרוסה שעליה יימדד האות.
- מצב מעקב
- בחרו בכלי הקו הישר בסרגל הכלים. עקבו אחר קו לאורך אזור קליפת המוח כדי להימדד (איור 5A), ודאו שהקו הוא בערך בניצב לקליפת המוח ושהקו ארוך מספיק כדי לחצות את קליפת המוח בכל נקודת זמן הבאה (איור 5B, הפאנל הראשון והשני).
- לחץ פעמיים על סמל כלי הקו בסרגל הכלים כדי לפתוח את החלון רוחב קו. הגדל את רוחב הקו לפי הצורך תוך שמירה על ההצטלבות בין הקו לקליפת המוח בקו ישר(איור 5B, פאנל שלישי).
- הפעל את המאקרו 'קווים מסתובבים'. הגדר את טווח הסיבוב (איור 5E)לערך נמוך (כ- 10°) אם כיוון האזור הקליפתי שיש למדוד אינו משתנה במידה רבה מנקודת זמן אחת לאחרת. הגדר את הערך Measure Around ל- 0 פיקסלים כדי למדוד רק את האות בקו שבו מזוהה עוצמת האות המקסימלית, או לערכים גבוהים יותר כדי למדוד גם את האות סביב קו זה.
הערה: הערך Measure Around ישפיע רק על מדידת האות לאחר זיהוי קליפת המוח ולא ישפיע על הזיהוי עצמו. - בתפריט המוקפץ חפש את Cortex בערוץ: , בחר את הערוץ שבו יבוצע הזיהוי. כדי להמחיש היכן זוהתה קליפת המוח בכל נקודת זמן, השאר את תיבת הסימון מיקום תצוגה... שמור על תיבת הסימון 'עדכני יותר' ו'כוון מחדש'... לחץ על אישור.
- לאחר סיום הפעולה, התוצאות שהועתקו למצב הלוח מוצגות במצב החלון ImageJ, גלול לאורך הזמן כדי לבדוק אם מיקומי קליפת המוח שזוהו (שכבת-על צהובה) והאזור הנמדד (שכבת-על של ציאן) מספקים. אם לא, חזור על שלבים 7.3.1–7.3.4 עם מיקום, אורך או רוחב שונים של קו והגדרות שונות בחלון האפשרויות 'סיבוב קווים'.
- הדבק את המידות בתוכנת גיליון אלקטרוני.
הערה: העמודות תואמות לערוצים לפי סדר הופעתם בפספוס הזמן והקווים תואמים למסגרות.
- מצב ללא מעקב
- בחרו בכלי הקו הישר בסרגל הכלים. עקבו אחר קו (המצוין בציאן, איור 5A)לאורך אזור קליפת המוח כדי להימדד, ודאו שהקו הוא בניצב גס לקליפת המוח ושהקו ארוך מספיק כדי לחצות את קליפת המוח בכל נקודת זמן (איור 5C, הפאנל הראשון והשני).
- לחץ פעמיים על סמל כלי הקו בסרגל הכלים כדי לפתוח את החלון רוחב קו. הגדל את רוחב הקו לפי הצורך תוך שמירה על ההצטלבות בין הקו לקליפת המוח בקו ישר (איור 5C, פאנל שלישי).
- הפעל את המאקרו 'קווים מסתובבים'. הגדר את טווח הסיבוב (איור 5E) בהתאם לשינויי הכיוון של אזור קליפת המוח שיש למדוד לאורך כל הזמן. הגדר את הערך Measure Around ל- 0 פיקסלים כדי למדוד רק את האות בקו שבו מזוהה עוצמת האות המקסימלית, או לערכים גבוהים יותר כדי למדוד גם את האות סביב קו זה.
הערה: הערך Measure Around ישפיע רק על מדידת האות לאחר זיהוי קליפת המוח ולא ישפיע על הזיהוי עצמו. - בתפריט המוקפץ חפש את Cortex בערוץ: , בחר את הערוץ שבו יבוצע הזיהוי. כדי להמחיש היכן זוהתה קליפת המוח בכל נקודת זמן, שמור על מיקומי התצוגה... בטל את הסימון של 'עדכני' ו'וריינט'... לחץ על אישור.
- לאחר סיום הפעולה, התוצאות שהועתקו ללוח מוצגות במצב החלון ImageJ, גלול לאורך הזמן כדי לבדוק אם מיקומי קליפת המוח שזוהו (שכבת-על צהובה) והאזור הנמדד (שכבת-על של ציאן) מספקים. אם לא, חזור על השלבים הקודמים עם מיקום, אורך או רוחב שונים של קו והגדרות שונות בחלון האפשרויות 'סיבוב קווים'.
- הדבק את המידות בתוכנת גיליון אלקטרוני.
הערה: העמודות תואמות לערוצים לפי סדר הופעתם בפספוס הזמן והקווים תואמים למסגרות.
איור 5: מדידת האות הקליפתי עם קווים מסתובבים. (A)קו (ציאן) הוא נעוצים בניצב לקליפת המוח (שחור) שבו האות יימדד. גווני אפור שונים מציגים את מיקום התא משתנה בשלוש נקודות זמן (t1, t2, t3). (B) משמאל: מיקום נכון של הקו במצב מעקב. אמצעי: מיקום שגוי של הקו במצב מעקב מכיוון שאין חפיפה עם קליפת המוח בנקודת הזמן הבאה. מימין: קו רחב מדי וכתוצאה מכך ההצטלבות (קו כתום) בין קליפת המוח לקו אינה ישרה. (C) משמאל: מיקום נכון של הקו במצב ללא מעקב. אמצעי: מיקום שגוי של הקו במצב ללא מעקב מכיוון שאין חפיפה עם קליפת המוח בכל נקודת זמן. מימין: קו רחב מדי וכתוצאה מכך ההצטלבות (קו כתום) בין קליפת המוח לקו אינה ישרה. (D) אורך ורוחב קו הסריקה. (E) קווים מבוצעים בטווח של כיוונים סביב הכיוון המקורי המוצג ב- (D) המוגדר על ידי הפרמטר "טווח סיבוב", במרווח זמן המוגדר על ידי הפרמטר "שלב סיבוב". (F) כיוון לא אופטימלי של קו הסריקה ביחס לקליפת המוח, וכתוצאה מכך אות נמוך נמדד לאורך הקו. (G) הכיוון האופטימלי של הקו מוגדר כאחד וכתוצאה מכך הפסגה הגבוהה ביותר של עוצמת האות נמדד לאורך הקו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Representative Results
קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין וחילופי תרבות בינוניים במהלך הדמיה חיה.
לאחר שניתחו בעקבות ההליך שהוצג בשלב 2 (איור 1) ושיתוק בקרישי פיברין על אותו כיסוי בעקבות ההליך שהוצג בשלב 3 (איור 2), מוחות זחל המבטאים בזוקה מתויגת GFP (Baz::GFP), אורתולוגיית הזבובים של חלבון הקוטביות Par-3, צולמו במשך 30 דקות במיקום רב-תכליתי. באז::GFP משולב עם apkcas4, אלל המאפשר עיכוב חריף של חלבון לא טיפוסי קינאז C (aPKC) באמצעות תוספת של אנלוגי ATP קטן 1-NAPP120. 1-NAPP1 נוסף אפוא למדיום התרבות בעקבות ההליך שהוצג בשלב 4 וההדמיה החיה חודשה למשך 2.5 שעות. מוחות בקרה הנושאים גרסה פראית של ה- aPKC קינאז לא הגיבו לאנלוגי ATP, ואילו מוחות הנושאים בנוסף מוטציה אנלוגית רגישה של aPKC (apkcas4) הציגו התכווצות של הנוירופיתליום ואשכולות בהירים של באז בנוירובלסטים וצאצאיהם ( איור6, וידאו 1). נוירובלסטים ממשיכים להתחלק לאורך כל הזמן, מה שמצביע על כך שהרקמה נשארת בריאה, ומוחות מראים מעט דריפט למרות השינוי הבינוני בתרבות, מה שמצביע על כך שהם משותקים היטב. באופן דומה, לאחר שנותחו בעקבות ההליך שהוצג ב27, ovarioles המבטא באז::GFP היו משותקים קרישי פיברין על אותו כיסוי ותמונה במשך 8 דקות, לאחר מכן יישום של 1-NAPP1 גרם התכווצות של APKCas4 תאים זקיקים מוטציה אבל לא של פקדים (איור 7, וידאו 2).
תיקון של להיסחף לרוחב ומיקוד באמצעות MultiHyperstackReg.
היפרסטאק המציג הן סחף רוחבי והן סחף מיקוד(וידאו 3,פאנל שמאלי) תוקן תחילה לסחף לרוחב (שלב 6.2, איור 3, וידאו 3, הפאנל האמצעי), ולאחר מכן התמקד בסחף (שלב 6.3, איור 4, וידאו 3, לוח ימני) באמצעות התוסף MultiStackReg והמאקרו MultiHyperstackReg, וכתוצאה מכך הפחתה משמעותית של התנועות שנצפו ב-
מדידת אותות קליפת המוח באמצעות סריקות קווים מסתובבות
נוירובלסט המבטא את באז::GFP (ירוק) ואת חלבון transmembrane CD4 מתויג עם חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום (CD4::mIFP, אדום) צולם במהלך מיטוזה אחת. אות ה-CD4::mIFP שימש כהפניה לגילוי קליפת המוח בחלקים שונים של הנוירובלסט עם קווים (שלב 7, איור 5, איור 8A-C)ואות ה-GFP נמדד בעמדות שזוהו איור 8D). במהלך החלוקה שלהם, נוירובלסטים מקוטבים באופן ארעי על ידי הקמת תחומים קליפתיים נפרדים ומנוגדים: הקוטב האפסי וקוטב הבסיס. באז מגדיר את הקוטב האפור, ובאופן עקבי, אות ה-GFP עלה בקוטב הנוירובלסט וירד בקוטב הבסיס במהלך החלוקה (איור 8C,D). המיקום של קליפת המוח היה במעקב מספק לאורך כל הזמן לשגות (איור 8C, וידאו 4). הקווים והגנוטיפים של דרוזופילה מוזכרים בטבלה משלימה 1-2.
איור 6: יישום של אנלוגי ATP במוח זחל משותק במהלך הדמיה חיה. (A) הדמיה חיה של שני מוחות זחל המבטאים את באז::GFP משותק על אותו כיסוי. מדיום התרבות משתנה לריכוז של 10 מיקרומטר של האנלוגי ATP 1-NAPP1 ב 0 דקות. מוחות בקרה אינם מגיבים באופן ניכר לאנלוגי ATP ואילו מוחות הנושאים מוטציה אנלוגית רגישה של aPKC (aPKCAS4) מציגים התכווצות של הנוירופיתליום (ראשי חץ) ואשכולות בהירים של באז בנוירובלסטים וצאצאיהם. הקרנת אינטנסיביות מקסימלית של 33 פרוסות לעומק של 23 מיקרומטר. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) הגדלה של הנוירופיתליום. סרגל קנה מידה: 10 μM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: יישום של אנלוגי ATP בתאי ביצים משותקים במהלך הדמיה חיה. הדמיה חיה של שני אובריולים המבטאים את באז::GFP משותק על אותו כיסוי. מדיום התרבות משתנה לריכוז של 10 מיקרומטר של האנלוגי ATP 1-NAPP1 ב 0 דקות. תאי ביצה בקרה אינם מגיבים באופן ניכר לאנלוגי ATP ואילו תאי ביצה הנושאים מוטציה אנלוגית רגישה של aPKC (aPKCAS4) מציגים התכווצות של האפיתל (ראשי חץ) שבסופו של דבר מובילים לפירוק לכאורה של צמתים דבקים. הקרנת עוצמה מקסימלית של 33 פרוסות לעומק של 27 מיקרומטר. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר.
איור 8: מדידת האות הקליפתי באמצעות קווים מסתובבים. (A) לחיות D. מלנוגאסטר נוירובלסט מבטא באז::GFP (ירוק) ו CD4::mIFP (אדום). קווי ציאן: קווי סריקה ראשוניים נעוצים בניצב לאזורים קליפתיים שונים למדידה. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר (B) זיהוי של קליפת המוח (קו כחול כהה) באמצעות אוניות קליפת המוח ו- CD4::mIFP (אדום) כערוץ הייחוס. קו תכלת: אזור המוגדר על ידי הפרמטר "מדוד מסביב" (כאן, 2 פיקסלים), שבו האות נמדד לאחר זיהוי קליפת המוח. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר (C) ציאן: אזורים קליפתיים שזוהו במהלך חלוקה נוירובלסט על ידי שיטת הקווים המסתובבים מקווי הסריקה הראשוניים המוצגים ב- (A), באמצעות CD4::mIFP (אדום) כערוץ הייחוס. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. חץ: מוט apical. ראש חץ: מוט בסיס. (D) מדידה של באז::עוצמת אות GFP לאורך זמן בשני האזורים המתאימים המזוהים על ידי קווים מסתובבים המוצגים ב- (C). במהלך המיטוזיס, באז::GFP מקבל מועשר באופן ארעי בקוטב apical של neuroblast והוא מרוקן מקוטב הבסיס הנגדי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: יישום של חילופי מדיה על מוח זחל משותק במהלך הדמיה חיה כדי להוסיף מעכב, המוצג באיור 6, סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר.
וידאו 2: יישום של חילופי מדיה על תאי ביצה משותקים במהלך הדמיה חיה כדי להוסיף מעכב, המוצג באיור 7, סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר.
וידאו 3: תיקון של להיסחף לרוחב ומיקוד באמצעות MultiHyperStackReg. הדמיה חיה של נוירובלסט המבטא את בדיקת הממברנה PH::GFP. מישור מוקד יחיד. Xz: שריד אורתוגונלי. משמאל: לפני תיקון הסחף. אמצע: לאחר תיקון הסחף לרוחב. מימין: לאחר תיקון הסחף לרוחב המיקוד, סרגל קנה המידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הווידאו הזה.
וידאו 4: זיהוי קליפת המוח באמצעות קווים מסתובבים, המוצג באיור 8, סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר.
טבלה משלימה 1: גנוטיפים של רקמות דרוזופילה דימוי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה משלימה 2: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ קידוד משלים 1: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 2: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ קידוד משלים 3: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
הדמיה חיה של מוח זחל הר D. melanogaster כולו מספק את ההזדמנות להתבונן חלוקות תאי גזע עצביים אסימטריים בתנאים קרובים להקשר פיזיולוגי. החלק הראשון של הפרוטוקול שלנו מציג את הגישה שלנו על ניתוח של מוחות זחל. כאמור13, היבט קריטי של ההכנה היא למנוע פגיעה במוח. ההיבט המאתגר ביותר של זה הוא להפריד את המוח מהדיסקים הדמיוני השכן מבלי למשוך יתר על המידה על המוח. הגישה שלנו ל"חיתוך ללא משיכה" היא לבצע תנועת שחיקה עם קצות זוג מלקחיים אחד, או להחליק מלקחיים לאורך שני קצות מלקחיים אחרים המחזיקים את הקשרבין רקמות ( איור 1A)ואילו לירית ואח 'מתארים תנועות דמויות מסור עם סיכה מנתחת. אנו מייעצים לנסיין לנסות את כל הגישות ולאמץ את המתאימה ביותר עבור עצמם. אנו מציעים גם להשתמש בטיפים לפיפט מצופה BSA או FCS במקום בכלי ניתוח להעברת מוחות מבודדים. הציפוי מונע מרקמות להידבק לפלסטיק ומאפשר העברה בטוחה של רקמות תוך שמירה עליהם שקועים לחלוטין, מבלי לחשוף אותם לעיוות חולף אפשרי כשהם נדבקים לכלי הניתוח במהלך ההעברה. טיפים מצופים יש יתרונות אחרים כדי לאפשר העברה של מספר מוחות בבת אחת, וזה שימושי במיוחד כאשר זה קריטי כדי לשלוט על זמן ההתמחות של הדגימות בתוך מדיום מסוים; הם מתאימים להעברת רקמות אחרות, אפילו שבריריות כמו, למשל, גופי שומן; הם יכולים להכיל מגוון רחב של גדלי מדגם שונים באמצעות טיפים גדולים יותר או חיתוך הקיצוניות של הקצה.
לאחר מכן, פרוטוקול זה מתאר את השימוש בקרישת פיברינוגן כדי לשתק מוחות זחל על העטיפה של צלחת תרבות. המוח הוא מכוון בתוך טיפה של מדיום תרבות + פיברינוגן, ולאחר מכן קרישה נגרמת על ידי תוספת של תרומבין. היווצרות פיברין היא הדרגתית, ומספקת חלון זמן שבמהלכו ניתן לכוונן את כיוון הדגימה, במידת הצורך (איור 2C). אם נדרשת דחיסה קלה של המדגם - אשר אנו ממליצים נגד במקרה של מוח הזחל - זה יכול גם להיות מותאם דק על ידי לחיצה על הקריש פחות או יותר קרוב למדגם במהלך שלבים 3.4.4 ו 3.5.2. היתרון העיקרי של קרישת פיברינוגן זו על פני הפרוטוקול המתואר ב Lerit et al., שבו המוחות רכובים בין קרום חדיר גז ו coverslip, היא היכולת להחליף את מדיום התרבות במהלך הדמיה חיה. יתרון אפשרי של שימוש בקרום חדיר גז על הפרוטוקול שלנו יכול להיות שהוא מספק חמצון אופטימלי של הדגימות, אשר יכול להיות מוגבל יותר עם הגישה שלנו כמו המוח מופרדים מהאוויר על ידי קריש וכמה בינוני. מסיבה זו, למרות שלא הערכנו את ההשפעה של כמות המדיום התרבותי בתוך צלחת התרבות, אנו ממליצים להגביל את כמות המדיום התרבותי על גבי הקרישים תוך שמירה על קרישי דם שקועים לחלוטין.
מכיוון שהמניפולציה של הקרישים יכולה להיות קשה מבחינה ניסיונית ולגזול זמן רב, אנו ממליצים לנסיין לתרגל תחילה מניפולציה של קרישי דם ללא דגימות. לווסת את נפח הירידה של מדיום תרבות + פיברינוגן על כריכה, את הריכוז של פיברינוגן או את נפח וריכוז של תרומבין יכול לעזור להפוך את ההכנה קלה יותר יכול להיות חשוב בעת התאמת הפרוטוקול לסוגים אחרים של רקמות. עם מספיק ניסיון במניפולציה של הקרישים, מספר מוחות יכולים להיות משותקים בקריש אחד במידת הצורך, אם כי זה מסבך את הכוונון העדין של האוריינטציה. ניתן ליצור מספר קרישי דם על ה-coverslip, מה שמאפשר, למשל, לדגימות תמונה של גנוטיפים שונים. אפשר גם לחשוף קרישי דם שונים על אותו כיסוי למדיה תרבותית שונה, אם כי יש להקפיד לא לערבב את טיפות המדיום התרבותי המכסה את הקרישים השונים. ברגע שמוחות הזחל משותקים ומוכנים להדמיה חיה, אנו ממליצים לפעול בהתאם להמלצות של Lerit et al.13 כדי למנוע פוטו-סאונד מוגזם. אנו מוסיפים להמלצות אלה רק כדי לשמור על המוח ב 25 מעלות צלזיוס במהלך הדמיה חיה עם חממת במה, אלא גם כדי לחמם שלב זה לפחות 30 דקות לפני תחילת ההדמיה. בידיים שלנו, כישלון לעשות זאת באופן שיטתי גורם לסחף מיקוד חזק.
זה יכול להיות יתרון בהקשרים מסוימים כדי להיות מסוגל לבצע מיקרוסקופיה מתואמת לתקן ולדכא מדגם לאחר הדמיה חיה. עם זאת, מגבלה של שימוש בקרישי פיברין היא שכמעט בלתי אפשרי לבודד באופן מכני מוח מקריש דם מבלי לפגוע בו. דרך אפשרית להתגבר על מגבלה זו יכולה להיות לפתח שיטות להשפיל קרישי פיברין עם פלסמין או לגרום לפירוק קריש על ידי תוספת של פפטיד מחקה את הידיות המאפשרות פילמריזציה פיברין28. בדרך כלל אנו משתמשים בקרישי פיברין על דגימות הנעות בין תאים בודדים לרקמות באורך 200 מיקרומטר, אך אנו יכולים גם לשתק בהצלחה קרישי דם ומוחות תמונה מדבורים בוגרות ברוחב של מעל 3 מ"מ. הגבול העליון של גודל המדגם שניתן לשתק בקרישי דם נותר לקבוע. באופן דומה, למרות שאנחנו בדרך כלל תמונה דגימות משותקות במשך 4 עד 5 שעות, אנחנו בהצלחה הדמיה neuroblasts בתרבות העיקרית עד 3 ימים, המציין כי קריש לפחות לא מפריע הכדאיות לטווח ארוך יותר. להיפך, קרישי דם יכולים להקל על החלפה קבועה של המדיום, דרישה להדמיה לטווח ארוך יותר, ללא צורך במכשירים כגון משאבות פריסטלטיות למטרה זו. אמנם לא מדדנו את הפרמטרים החודרים של קרישי פיברין, אבל האופי הסיבי דמוי הג'ל של הקרישים נראה חדיר על ידי מולקולות חדירות לתאים. מצאנו כי Latrunculin A, Colcemid או 1-NAPP1, HALO-תג ligands וצבעים סטנדרטיים אחרים המשמשים בביולוגיה של התא להגיע לתאים בקריש פיברין ללא בעיות, עד כה לא נתקלו מולקולות כי יישמרו על ידי הקריש, אשר, עם זאת, היא אפשרות שיש לבדוק באופן אמפירי.
לסיכום, שימוש בקרישי פיברין מספק דרך אמינה וקלה יחסית ליישום דרך לשיתוק רקמות חיות להדמיה חיה. מעבר לתועלתה בהגבלת הסחף לרוחב, היכולת לשנות את מדיום התרבות במהלך הדמיה חיה הוכיחה את עצמה כבעלת ערך רב בגישת הגנטיקה הכימית שלנו לחקר חלוקת התאים האסימטריים של D. melanogaster neuroblasts21. אנו צופים כי טכניקה זו תהיה מועילה למחקרים במגוון רחב של רקמות שונות, במיוחד אם הם כרוכים גנטיקה כימית או, למשל, חלבון עצמיתתיוג 29.
המאקרו MultiHyperStackReg שלנו מסתמך על תוסף TurboReg ImageJ, אשר מיישר מסגרות רצופות או פרוסות של מחסנית, ואת תוסף MultiStackReg ImageJ, המאפשר להחיל את המרות על ערימות אחרות. MultiHyperStackReg פשוט מאפשר להחיל טרנספורמציות אלה על hyperstacks (ערימות עם לפחות ארבעה ממדים). כמו השימוש MultiHyperStackReg, כפי שאנו מתארים את זה, דורש הרבה פעולות יכול לקבל די זמן רב, כתבנו גם את המאקרו AutoHyperStackReg, אשר מבצע באופן אוטומטי את כל השלבים המתוארים בשלבים 6.2 ו 6.3. עם זאת, בניגוד MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg כרגע חסר את האפשרות לחשב את היישור של מחסנית המבוססת על subregion של מחסנית זו, אפשרות שמצאנו הוא לפעמים חיוני עבור יישור מספק. מגבלה נוספת של AutoHyperStackReg היא כי השימוש בו מוגבל תרגומים ולא המרות אחרות המוצעות על ידי TurboReg ו MultiStackReg, ואילו MultiHyperStackReg יכול לחול על hyperstack כל סוג המרה אם המשתמש צריך את זה. מהדורות עתידיות ייישמו פונקציות אלה ויהיו זמינות ב- GitHub30. לבסוף, מאקרו הקווים המסתובב שלנו מספק דרך קלה למדוד במהירות אותות קליפת המוח בזמן פג, גם אם קליפת המוח משנה את מיקומה או את כיוונה לאורך זמן. בין אם מצב המעקב שלו או מצב אי המעקב שלו מתאים ביותר לניתוח תלוי באיכות ובעקביות של האות הקליפתי. מצב המעקב קל יותר לשימוש מכיוון שהמשתמש אינו צריך לשקול היכן תהיה קליפת המוח עבור כל נקודת זמן ויכול להכיל שינויים גדולים במיקום ובכיוון לאורך זמן. עם זאת, זה מתאים רק אם האות הקליפתי נשאר חזק מספיק לגילוי במהלך הסרט כולו: כישלון לזהות שום דבר אחר מאשר קליפת המוח (למשל, תא ציטופלזמי בהיר קרוב לקליפת המוח) יכול לסכן את הגילוי עבור כל נקודת זמן הבאה (למשל, התא הציטופלסמי מתרחק מקליפת המוח ואת הקווים קליפת המוח יכול לעקוב אחריו לשארית הזמן לשגות). למצב ללא מעקב אין את המלכודת הזו מכיוון שהזיהוי מוגבל לקו שצויר במקור על ידי המשתמש (למשל, תא ציטופלסמי בהיר עלול לגרום לגילוי להיכשל במשך כמה נקודות זמן, אך ככל שהתא הציטופלסמי מתרחק מאזור הגילוי, זיהוי נכון של קליפת המוח מתחדש), אך אינו מתנהג היטב אם מיקום קליפת המוח או הכיוון משתנים הרבה עם הזמן. התכונה הבאה (שתהיה זמינה ב- GitHub30) שתפותח עבור מצב המעקב תהיה האפשרות לנתח נקודות זמן שצוינו בלבד ולהגדיר נקודת זמן של הפניה (ולא את נקודת הזמן הראשונה) שלפניה ולאחריה יבוצע הזיהוי, מה שיאפשר למשתמש לפחות להימנע מנקודות זמן בעייתיות.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
העבודה במעבדת Januschke נתמכת על ידי מענקי נאמנות Wellcome 100031/Z/12/A ו- 1000032/Z/12/A. מתקן הדמיית הרקמות נתמך על ידי המענק WT101468 מ Wellcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
| Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
| FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
| Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
| Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |
References
- Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs. PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Dai, W., Montell, D. J. Live imaging of border cell migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
- Martin, J. L., et al. Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss. eLife. , (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
- Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages. PloS One. 8 (11), 79588 (2013).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).
- Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts. Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts. eLife. 7, 166 (2018).
- Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila. Development. 146 (2), (2019).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: http://bradbusse.net/sciencedownloads.html (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories (2020).
