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Preservación de la fertilidad a través de la vitrificación de ovocitos: perspectivas clínicas y de laboratorio

Published: September 16, 2021 doi: 10.3791/61963
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Summary

La criopreservación de ovocitos es reconocida por varias sociedades científicas internacionales como el estándar de oro para la preservación de la fertilidad en mujeres pospúrdicas. Las estrategias clínicas y de laboratorio adecuadas garantizan la máxima eficacia, eficiencia y seguridad de los tratamientos de preservación de la fertilidad.

Abstract

Preservar la fertilidad femenina es crucial en un sistema de salud multifuncional que se ocupa de la calidad de vida futura de los pacientes. La criopreservación de ovocitos es reconocida por varias sociedades científicas internacionales como el estándar de oro para la preservación de la fertilidad en mujeres pospúrdicas, tanto para indicaciones médicas como no médicas. Las principales indicaciones médicas son las enfermedades oncológicas, las enfermedades ginecológicas como la endometriosis grave, las enfermedades sistémicas que comprometen la reserva ovárica y las afecciones genéticas que implican la menopausia prematura. Este documento describe todo el trabajo clínico y de laboratorio de un tratamiento de preservación de la fertilidad al delinear recomendaciones para un asesoramiento objetivo y basado en la evidencia. Además, se centra en la eficacia del procedimiento y describe las estrategias más adecuadas para explotar al máximo la reserva ovárica y maximizar el número de ovocitos recuperados en el menor tiempo posible. La evaluación de la reserva ovárica, la definición de un protocolo de estimulación ideal, así como los procedimientos de recuperación, denudación y vitrificación de ovocitos se han detallado junto con los enfoques para maximizar su eficacia, eficiencia y seguridad.

Introduction

El desarrollo e implementación de un programa eficiente de criopreservación para ovocitos humanos ha sido un avance significativo en la medicina reproductiva. Según la evidencia reciente, la vitrificación es la estrategia más efectiva para criopreservar ovocitos de metafase II (MII), ya que resulta en tasas de supervivencia estadísticamente más altas en comparación con la congelación lenta, independientemente de la población de pacientes (pacientes infértiles o programa de donación de ovocitos)1,2,3. Los notables logros de la vitrificación de ovocitos llevaron a los Comités de Práctica de la Sociedad Americana de Medicina Reproductiva (ASRM) y la Sociedad de Tecnología de Reproducción Asistida (SART) a declarar que esta técnica es la más efectiva para la preservación electiva de la fertilidad en mujeres pospúbricas, tanto para indicaciones médicas como no médicas4,5,6. Las indicaciones médicas para la preservación de la fertilidad incluyen (i) cáncer y enfermedades autoinmunes que requieren terapias7 como radioterapia, quimioterapia citotóxica y terapia endocrina (cuyo efecto perjudicial sobre la reserva ovárica se asocia con la edad materna, así como con el tipo y la dosis del tratamiento); ii) enfermedades ováricas que requieran cirugía repetida o radical (como la endometriosis)8; y (iii) condiciones genéticas (por ejemplo, X-frágil) o insuficiencia ovárica prematura. Además, la preservación de la fertilidad se ha convertido en una opción valiosa para todas las mujeres que no han logrado su objetivo parental por razones no médicas (también conocida como congelación social).

Independientemente de la indicación para la preservación de la fertilidad y de acuerdo con las principales directrices internacionales sobre preservación de la fertilidad, todas las pacientes dispuestas a vitrificar sus ovocitos deben recibir el asesoramiento adecuado para estar informadas sobre sus posibilidades realistas de éxito, los costos, riesgos y limitaciones del procedimiento9,10,11,12,13. Lo más importante es que debe quedar claro que vitrificar una cohorte de ovocitos MII no asegura un embarazo, pero que ofrece una mayor probabilidad de éxito para el futuro tratamiento de fertilización in vitro (FIV), si es necesario14. En este sentido, la edad de la mujer en el momento de la vitrificación de ovocitos es sin duda el factor limitante más importante15 ya que la edad materna avanzada (AMA; >35 años) es la principal causa de infertilidad femenina16. Además de una reducción progresiva de la reserva ovárica, la AMA se asocia con un deterioro de la competencia de los ovocitos debido a vías fisiológicas defectuosas como el metabolismo, la regulación epigenética, los puntos de control del ciclo celular y la segregación meiótica17. Por lo tanto, el número razonable de óvulos para vitrificar depende principalmente de la edad materna. En mujeres menores de 36 años, se requieren al menos 8-10 ovocitos MII18 para maximizar las posibilidades de éxito. En general, cuanto mayor es el número de ovocitos vitrificados, mayor es la probabilidad de éxito. Por lo tanto, adaptar la estimulación ovárica de acuerdo con los marcadores de reserva ovárica, como los niveles de hormona antimülleriana (AMH) o el recuento de folículos antrales (AFC) es crucial para explotar completamente la reserva ovárica en el menor tiempo posible.

La seguridad de todo el procedimiento es el otro tema clave al inscribir pacientes para la preservación de la fertilidad. Los médicos deben emplear las mejores estrategias para minimizar los riesgos y prevenir (i)el síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO) mediante el uso de enfoques seguros como el protocolo antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) seguido de un desencadenante agonista de la GnRH19 y (ii) los riesgos remotos, pero posibles, de sangrado peritoneal, lesión de las estructuras pélvicas (uréter, intestino, apéndice, nervios) o infección pélvica durante la recuperación de ovocitos. Por último, (iii) los regímenes tradicionales de estimulación se asocian con estradiol sérico suprafisiológico y, por lo tanto, no se recomiendan en enfermedades sensibles a los estrógenos como el cáncer de mama. Los protocolos que involucran inhibidores de la aromatasa (como letrozol o tamoxifeno) son más adecuados en estos casos20,21. En el entorno de laboratorio, el protocolo más extendido para la vitrificación de ovocitos sigue siendo el descrito por primera vez por Kuwayama y sus colegas2,23, que consiste en un procedimiento gradual que implica la adición gradual de crioprotectores (CPA). En la primera fase (equilibrio/deshidratación), los ovocitos se exponen en una solución de CPA que contiene 7,5% v/v etilenglicol y 7,5% v/v dimetilsulfóxido (DMSO), mientras que en la segunda fase, los ovocitos se trasladan a una solución de vitrificación con 15% v/v etilenglicol y 15% v/v DMSO, más 0,5 mol/L de sacarosa. Después de una breve incubación en el medio de la vitrificación, los ovocitos se pueden colocar en criodispositivos abiertos específicamente diseñados y finalmente sumergirse en nitrógeno líquido a -196 ° C para almacenarlos hasta su uso.

Aquí, todo el estudio clínico y de laboratorio de un tratamiento de preservación de la fertilidad se ha descrito (i) esbozando recomendaciones para un asesoramiento objetivo y basado en la evidencia, (ii) centrándose en la rentabilidad del procedimiento, y (iii) describiendo las estrategias más apropiadas para explotar plenamente la reserva ovárica y maximizar el número de ovocitos recuperados en el menor tiempo posible. Se detallará la evaluación de la reserva ovárica, la definición de un protocolo de estimulación ideal, así como los procedimientos de recuperación, denudación y vitrificación de ovocitos junto con los enfoques para maximizar su eficacia, eficiencia y seguridad. Como existen otros protocolos o adaptaciones de este protocolo en la literatura, los resultados representativos y las secciones de discusión de este manuscrito solo se aplican a este procedimiento.

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Protocol

1. Trabajo y asesoramiento clínico

NOTA: En caso de pacientes que requieran preservación de la fertilidad por razones oncológicas, asegúrese de que no haya lista de espera para programar la consulta, y la cita se proporciona lo antes posible.

  1. Examinar la historia clínica y la documentación previa, y evaluar el estado de salud general del paciente.
  2. Registre toda la información (incluida la aprobación del oncólogo para someterse a la estimulación ovárica en caso de pacientes con cáncer) en una base de datos relacional.
  3. Proporcionar al paciente asesoramiento específico sobre la viabilidad del procedimiento. Explique los pasos del procedimiento (estimulación ovárica, recuperación de ovocitos, vitrificación de ovocitos) e infórmele sobre las posibilidades realistas de éxito (principalmente dependiendo de la edad materna y el número esperado de ovocitos MII en el momento de la recuperación de ovocitos), así como el costo y las limitaciones del procedimiento.
  4. Realizar ecografía transvaginal para obtener información sobre la reserva ovárica (es decir, AFC) y evaluar la accesibilidad de los ovarios para la recolección de óvulos.
  5. Solicite análisis de sangre para evaluar el grupo sanguíneo y el factor Rhesus, la detección de la coagulación (hemograma, protrombina, tromboplastina, fibrinógeno, proteína C, proteína S, antitrombina III, homocisteína) y enfermedades infecciosas (hepatitis B, hepatitis C, VIH, Laboratorio de investigación de enfermedades venéreas / Ensayo de hemaglutinación de Treponema pallidum).
    NOTA: En el caso de pacientes que acceden a un programa de preservación de la fertilidad por razones médicas no urgentes, una evaluación más completa puede incluir la hormona foliculoestimulante basal (FSH), la hormona luteinizante (LH), el estradiol, la AMH, el examen mamario, la prueba de Papanicolaou, el cribado genético de la coagulación (factor V de Leiden y protrombina) y el cribado TORCH (toxoplasmosis, rubéola, citomegalovirus).
  6. Solicitar una evaluación cardiológica (electrocardiograma).
  7. Recomendar asesoramiento psicológico.

2. Protocolos controlados de estimulación ovárica para la preservación de la fertilidad

NOTA: Cuando el tiempo disponible antes de comenzar el tratamiento contra el cáncer es limitado, se recomienda el protocolo de inicio aleatorio (es decir, iniciar la estimulación ovárica en cualquier momento durante el ciclo menstrual) para la estimulación ovárica en pacientes oncológicas que son candidatas para la preservación de la fertilidad. En un programa de preservación de la fertilidad por razones médicas no urgentes o sociales, es preferible la estimulación convencional que comienza en la fase folicular temprana, y la estimulación ovárica se inicia en función del ciclo menstrual. Los enfoques de estimulación ovárica controlada (COS) deben realizarse de acuerdo con las recientes directrices de la Sociedad Europea de Reproducción Humana y Embriología (ESHRE)24.

  1. Adapte el COS de acuerdo con las características de la paciente y los marcadores de reserva ovárica, principalmente la edad materna, FSH, AMH y AFC.
  2. Comience coS en el día 5 del ciclo menstrual usando FSH recombinante o urinaria con una dosis fija de 150-300 UI / día (protocolo antagonista).
    NOTA: En una población específica de pacientes con deficiencia de LH o respuesta deficiente-subóptima, se puede administrar LH adicional 75/150 UI/ día de acuerdo con la respuesta ovárica, los niveles de LH y el juicio del ginecólogo.
  3. En pacientes con enfermedades sensibles a los estrógenos, se incluyen gonadotropinas asociadas con inhibidores de la aromatasa (letrozol) desde el día 1 de la estimulación hasta el día 7 después de la recuperación de ovocitos.
  4. Administrar una dosis fija de gonadotropinas durante 4 días.
  5. Monitoree el crecimiento folicular el día 5 y luego cada 2-3 días; eventualmente, ajuste la dosis de gonadotropina.
  6. Una vez que al menos 3 folículos alcancen los 17-18 mm de diámetro, administre el desencadenante de la maduración final de los ovocitos con un solo bolo subcutáneo de agonista de la GnRH a la dosis de 0,5 ml.

3. Recuperación de ovocitos

  1. Preparación para la recuperación de ovocitos
    1. Para los materiales requeridos, consulte la Tabla de Materialesy mantenga listo el calzado y el atuendo de laboratorio, la mascarilla quirúrgica, la cubierta para el cabello, los guantes quirúrgicos, un marcador permanente no tóxico, pinzas, gasas pequeñas estériles, espéculo desechable o reutilizable, equipo de cirugía vaginal y desinfectante de superficies. Asegurar la disponibilidad de equipos de reanimación, medicamentos anestésicos para la reversión, un kit preparado para el tratamiento del shock anafiláctico y oxígeno en el quirófano.
    2. Realizar el procedimiento de recuperación de ovocitos según las recomendaciones del Grupo de Trabajo de Ecografía en Tecnologías de Reproducción Asistida (ART) de la ESHRE25.
      1. Administrar sedación o anestesia general, y antibióticos para la profilaxis.
        NOTA: En este protocolo, la sedación profunda se logró mediante la administración de propofol (cuya dosis se ajusta según el peso del paciente) y 50-100 μg de fentanilo, 1000 mg de paracetamol y ventilación asistida con máscara con oxígeno.
      2. Realice la recuperación de ovocitos utilizando una unidad de aspiración compuesta por una bomba de vacío, un tubo de recolección conectado a una aguja de un solo lumen de 17 G y un tubo colector de ovocitos. Durante la recolección, no exceda una presión de ~ 120 mmHg para evitar el riesgo de daño a los ovocitos, como la extracción de las células cúmulos o la fractura de la zona pelúcida.
      3. Calibre la temperatura de la superficie de trabajo para garantizar 37 °C en el medio de cultivo. Durante todo el procedimiento, minimice la exposición de los ovocitos incluso a temperaturas transitorias que puedan afectar su competencia de desarrollo.
      4. Al final de la recuperación de ovocitos, observe al paciente durante 3-4 h antes del alta.
  2. Quirófano
    1. Antes de entrar en el quirófano, identifique a la paciente y confirme el momento del desencadenamiento de la ovulación.
    2. Haga que la paciente se acueste en la mesa de operaciones en una posición ginecológica.
    3. Limpie la vagina / cuello uterino antes de la recuperación de ovocitos para minimizar la contaminación bacteriana.
    4. Realizar una ecografía transvaginal preliminar para evaluar la posición de los ovarios y las relaciones anatómicas con los diversos órganos y vasos sanguíneos.
    5. Bajo guía de ultrasonido, inserte una aguja de un solo lumen a través de la pared vaginal y en un folículo ovárico, teniendo cuidado de no dañar los órganos o vasos sanguíneos ubicados entre la pared vaginal y el ovario.
    6. Iniciar la aspiración desde el folículo más cercano y pasar a los más distales.
    7. Perforar todos los folículos de un diámetro mayor de 11-12 mm, realizando "movimientos de torsión" de la aguja para aspirar todo el líquido folicular, que luego se libera en un tubo estéril (fondo redondo de 14 ml) precalentado en el calentador de bloque del quirófano.
    8. Inmediatamente después de la recuperación, selle y etiquete el tubo con detalles de la identidad del paciente.
    9. Asegúrese de que la enfermera lleve el tubo al laboratorio, donde se examina inmediatamente para detectar la presencia de complejos cúmulos-ovocitos (AOC).
    10. Instruya a los embriólogos para que informen al médico del número total de AOC recuperados.
    11. Una vez que se complete el procedimiento para el primer ovario, enjuague la aguja con un medio limpio y proceda con el segundo ovario utilizando el mismo procedimiento.
    12. Después de la recuperación de ovocitos, evalúe cualquier sangrado de los ovarios o vasos sanguíneos del parametrio y líquido libre en la bolsa de Douglas.
      NOTA: Para automatizar y mejorar la eficacia de la trazabilidad de gametos y embriones a nivel clínico, se implantó en el centro un sistema electrónico de testigos(SAT) 26. Sin embargo, este protocolo no menciona el SAT, para garantizar la reproducibilidad del protocolo en cualquier laboratorio de FIV. Aún así, considere que todos los pasos del procedimiento requieren un segundo operador (es decir, un testigo) para garantizar la trazabilidad de gametos y embriones.

4. Laboratorio de FIV

  1. El día antes del procedimiento de recuperación de ovocitos
    1. Preparar tubos coleccionadores de ovocitos (consulte la Tabla de Materiales).
      1. Dispensar 1 ml de medio de FIV (consulte la Tabla de materiales)en cada tubo de recolección de ovocitos (fondo redondo, 5 ml) y cubrir con 0,2 ml de aceite mineral (consulte la Tabla de materiales)para el cultivo de embriones.
        NOTA: El número de tubos se definirá de acuerdo con el número de folículos que se espera recuperar. Cada tubo puede contener hasta 4 ACO.
    2. Selle los tubos con la tapa (primer chasquido). Etiquete los tubos con detalles del tipo de medio y la fecha de preparación. Incubar los tubos durante la noche a 37 °C en atmósfera controlada (6% CO2, 5% 02).
  2. El día de la recuperación de ovocitos
    1. Precalentar los suministros de plástico a 37 °C (platos de cultivo estériles y pipetas Pasteur).
    2. Pida a las pacientes que confirmen su identidad (nombre completo y fecha de nacimiento) y la hora del desencadenante de la ovulación. Anote en la hoja de laboratorio que se ha realizado el procedimiento de identificación (ID) y que se ha confirmado el momento del desencadenamiento de la ovulación.
    3. Saque los tubos de recolección de ovocitos de la incubadora (justo antes de que comience el procedimiento) y empuje hacia abajo la tapa para garantizar un cierre hermético. Etiquete los tubos de recolección de ovocitos con la información del paciente. Coloque los tubos de recolección de ovocitos en el calentador de bloques a 37 °C.
    4. Examine el líquido folicular en las antenas de cultivo estériles precalentadas e identifique los AOC. Una vez que se identifiquen uno o más AOC, enjuáguelos dos veces en dos gotas de medio para eliminar el líquido folicular y la contaminación de la sangre.
    5. Transfiera los AOC a los tubos de recolección de ovocitos y anote el número de AOC en el tubo. Afloje las tapas de los tubos medianos y incube rápidamente a 37 ° C en una atmósfera de 6% DE CO2, 5% O2.
    6. Repita los pasos 7 a 9 según el número de ovocitos recuperados. Actualizar la hoja de laboratorio.
      NOTA: Asegúrese de que un testigo verifique que todos los bloques de calentamiento de tubos (incluidos los del quirófano) estén vacíos y firme el cierre del procedimiento en la hoja de laboratorio.
    7. Limpie la etapa de trabajo después de completar el procedimiento.

5. Denudación de ovocitos

  1. Precalentamiento del medio tamponado con ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatenosulfónico (HEPES) y hialuronidasa (consulte la Tabla de Materiales)a 37 °C al menos 1 h antes de comenzar.
  2. Prepare una placa de FIV de 4 pocillos (consulte la Tabla de Materiales)con 0,6 ml/pocillo de medio tamponado con HEPES precalentado (complementado con albúmina sérica humana al 5% [HSA]) cubierto con 0,3 ml de aceite mineral para cultivo de embriones, y caliente a 37 °C durante al menos 30 min.
  3. Etiquete la placa de denudación de ovocitos con detalles de la identidad del paciente.
  4. Inmediatamente antes de comenzar el procedimiento, agregue hialuronidasa al primer pozo para obtener una concentración final de aproximadamente 20 UI / ml.
  5. Coloque un número limitado de AOC (hasta 6) en el primer pozo que contenga la enzima para dispersar las células cúmulos.
  6. Para mejorar la eliminación enzimática de las células cúmulos y corona, realice la extracción de las células del cúmulo mediante el pipeteo de los ovocitos repetidamente a través de una pipeta Pasteur con un diámetro interno de aproximadamente 250 μm durante un máximo de 30 s. Después de observar la disociación celular inicial, transfiera los ovocitos al segundo pozo que contiene solo el medio tamponado con HEPES, teniendo cuidado de transportar una cantidad mínima de la enzima.
  7. Realice una denudación adicional para eliminar las células corona mediante el uso de pipetas denudación con diámetros internos decrecientes (170-145 μm). Use diámetros más bajos (135 μm) solo si es estrictamente necesario.
  8. Lave cuidadosamente los ovocitos densnudados para eliminar la enzima.
  9. Después de la denudación, examine los ovocitos bajo un microscopio invertido para evaluar su integridad y etapa de maduración. Separar los ovocitos MII de los inmaduros (vesícula germinal y metafase-I).
  10. Mueva los ovocitos MII al área de vitrificación para realizar inmediatamente la criopreservación. Actualizar la hoja de laboratorio.

6. Vitrificación de ovocitos

NOTA: Realice la vitrificación de ovocitos preferiblemente dentro de las 38 h posteriores a la recuperación de ovocitos e inmediatamente después de la denudación. El procedimiento de vitrificación descrito aquí debe realizarse a temperatura ambiente (RT) y mediante el uso de una pipeta decapante con un diámetro interior de 170 μm para no dañar los ovocitos durante la manipulación.

  1. Aproximadamente 30 min antes del procedimiento, lleve la solución de equilibrio (ES) y la solución de vitrificación (VS) a RT (25-27 °C).
  2. Etiquete adecuadamente los criodispositivos con el nombre y la identificación del paciente, la identificación del tratamiento, la fecha de congelación, el número de ovocitos y el código criobar.
  3. Llene una rejilla de enfriamiento desechable hasta la parte superior con nitrógeno líquido fresco y comience el proceso de esterilización.
  4. Etiquete la placa de vitrificación (consulte la Tabla de materiales)con el nombre y la identificación del paciente. Pida a un testigo que verifique la identificación correcta de los criodevos.
  5. Invierta cuidadosamente cada vial dos veces para mezclar su contenido antes de su uso, y prepare la tapa de una placa de Petri de 6 mm con una gota de 30 μL de medio tamponado con HEPES (con 5% de HSA) y una gota adyacente de 30 μL de ES.
    NOTA: Coloque las gotas justo antes de usar para limitar la evaporación media.
  6. Usando una pipeta decapante de 170 μm de diámetro, coloque los ovocitos (hasta 9) en la primera gota con el menor volumen posible de medio. Utilizando la pipeta decapante, crear un puente de medio entre la gota n.1 y n.2 para obtener un aumento gradual de la concentración de los CPA (Figura 1A).
  7. Incubar los ovocitos en la primera gota durante 3 minutos. Añadir una tercera gota de 30 μL de ES (n.3). Después de 3 min, transfiera los ovocitos a la segunda gota de ES y cree un puente medio entre las gotas n.3 y n.2(Figura 1B). Incubar los ovocitos en gota n.3 durante 3 min.
  8. Durante la incubación, agregue una gota de ES de 30 μL por cada criodispositivo que se utilizará (si se van a criopreservar 9 ovocitos, coloque 3 gotas de ES con 3 ovocitos en cada gota de ES). Mueva los ovocitos a una solución ES pura y déjelos durante 6-9 minutos (hasta que recuperen su tamaño inicial después de la contracción) (Figura 1C).
  9. Preparar un plato de pozo central (60 x 15 mm) con 1 mL de VS. Al final de los primeros 6 min, transfiera los ovocitos a criopreservar a la solución VS, liberando el menor medio posible. Deje los ovocitos en VS durante 1 minuto y lávelos cuidadosamente moviéndolos de la parte inferior a la parte superior del plato para eliminar el exceso de ES.
  10. Aproximadamente 10 s antes del final del minuto de incubación, coloque el criodispositivo bajo el microscopio y ajuste el enfoque en la marca negra (es decir, la punta del criodispositivo). Coloque los ovocitos en el criodevo junto a la marca negra con la cantidad mínima de VS (Figura 2A).
  11. Mueva la pipeta decapante lejos de los ovocitos, y retire el exceso de medio VS (Figura 2B) para que los ovocitos permanezcan cubiertos por una fina capa de medio (Figura 2C).
  12. Sumerja rápidamente el criodedispositivo en nitrógeno líquido, sacudiéndolo rápidamente para eliminar las burbujas de aire de su superficie. Sostenga la tapa protectora del criodevice con pinzas y llénelo con nitrógeno líquido; luego inserte el criodedispositivo en él mientras mantiene las tiras de propileno en nitrógeno líquido.
  13. Guarde el criodevice en un visiotube previamente etiquetado con la información del paciente. Actualizar la hoja de laboratorio.

7. Calentamiento de ovocitos

  1. Aproximadamente 30 min antes del procedimiento, caliente la solución de descongelación (TS), la solución de dilución (DS) y la solución de lavado (WS) a RT (25-27 °C). Invierta cuidadosamente cada vial dos veces para mezclar su contenido. Coloque 1 ml de TS en una placa de Petri del pozo central y caliéle a 37 °C durante al menos 1 h antes de comenzar el procedimiento.
  2. Etiquete todos los suministros de plástico con el nombre y la identificación del paciente y el tipo de solución. Pídale a un testigo que confirme la información del paciente sobre el criodevice.
  3. Para cada criodispositivo a calentar, prepare una placa de 6 pozos con 200 μL de DS en el primer pozo y una cantidad igual de WS en el segundo y tercer (llamados WS1 y WS2, respectivamente). Agregue solución salina tamponada con fosfato (PBS) o agua estéril en el área fuera de los pozos para evitar la evaporación.
  4. Saque el plato de TS de la incubadora y colóquelo bajo el microscopio. Ajuste el foco del microscopio al centro de la placa de Petri.
  5. Gire y retire cuidadosamente la tapa protectora del criodevice, mientras mantiene las tiras de propileno en nitrógeno líquido. Transfiera el criodedispositivo del nitrógeno líquido al TS lo más rápido posible para evitar el riesgo de desvitrificación e inicie la cuenta regresiva (1 min).
  6. Localice los ovocitos centrándose en la punta del criodevice (es decir, la marca negra). Usando una pipeta stripper, libere los ovocitos del criodevice.
    NOTA: Trate de no aspirar los ovocitos del criodevice; suelte suavemente algunos medios en ellos hasta que se muevan hacia el TS.
  7. Usando una pipeta decapante de 170 μm de diámetro, transfiera los ovocitos a DS con una pequeña cantidad de TS (para crear un gradiente) y déjelos en el DS durante 3 min. Mueva los ovocitos a WS1 de la misma manera, y déjelos durante 5 minutos. Finalmente, transfiera los ovocitos a WS2 durante 1 min.
  8. Transfiera los ovocitos a un medio de cultivo de FIV preequilibrado apropiado e incube durante 1 h antes de proceder con la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Actualizar la hoja de laboratorio.

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Representative Results

Descripción general del programa de preservación de la fertilidad en el centro

Durante un período de 12 años (2008-2020), 285 mujeres se sometieron a al menos una recuperación de ovocitos que implicó la vitrificación de toda la cohorte de óvulos maduros recolectados. La mayoría de estas mujeres (n = 250) se sometieron a una sola recuperación, y 35 se sometieron a múltiples recuperaciones. Las razones para someterse a la recuperación de ovocitos para la vitrificación de óvulos se resumen en 4 categorías: médicas (excepto para el cáncer), cancerosas, no médicas y otras. Entre las 250 mujeres que se sometieron a una sola recuperación de ovocitos para vitrificación de óvulos, el 8% tenía razones médicas distintas del cáncer (10 endometriosis, 3 mioma, 4 quistes ováricos, 1 hidrosalpinx), el 16% tenía cáncer (31 cáncer de mama, 3 cáncer de ovario, 2 cáncer colorrectal, 2 linfoma de Hodgkin, 1 cáncer de vulva y 1 cáncer de cuello uterino), el 53% tenía razones no médicas y el 23% tenía otras razones (43 ausencia de espermatozoides recuperados, 10 riesgo de SHO, 4 infecciones y 1 fiebre). Esta distribución fue diferente entre los pacientes sometidos a múltiples recuperaciones de ovocitos para la vitrificación de óvulos. Específicamente, el 9% tenía razones médicas distintas al cáncer (1 endometriosis, 2 reservas ováricas reducidas), el 6% tenía cáncer (2 cáncer de mama), el 80% tenía razones no médicas y el 3% tenía otras razones (1 ausencia de espermatozoides recuperados). Ninguna de las pacientes sometidas a múltiples recuperaciones de ovocitos para la vitrificación de óvulos calentó esos óvulos, mientras que 78 de las 250 mujeres sometidas a un solo ciclo de vitrificación de óvulos volvieron a usar esos ovocitos(Figura 3).

La Tabla 1 resume los datos de las 250 mujeres sometidas a un solo ciclo de vitrificación de ovocitos agrupadas según las razones relacionadas. Las pacientes con una razón médica para la vitrificación de óvulos y las pacientes sometidas a preservación de la fertilidad debido al cáncer eran más jóvenes (edad materna media < 35 años) y mostraron una mejor reserva ovárica (AFC más altas) que las pacientes con razones no médicas o de otro tipo. Sin embargo, las tasas medias de maduración (número de ovocitos MII/número de AOC recuperados) fueron ligeramente inferiores (72-73% versus 77-79%), por lo que el número de ovocitos vitrificados en promedio fue similar en los 4 grupos (9-10 ovocitos). Es importante destacar que 9 de cada 40 pacientes oncológicas (22,5%) se sometieron a un protocolo de estimulación ovárica de inicio aleatorio porque tenían un tiempo limitado antes de comenzar la quimioterapia o la radioterapia. Es interesante que aproximadamente la mitad de los pacientes con razones médicas distintas del cáncer (53%) y la mayoría de los pacientes con otras razones para la vitrificación de óvulos (76%) en realidad regresaron para el calentamiento. Por el contrario, muy pocas pacientes que se sometieron a la preservación de la fertilidad por cáncer (17,5%) o razones no médicas (13%) utilizaron sus ovocitos vitrificados para la FIV. También es destacable el tiempo transcurrido entre la vitrificación y el calentamiento entre los pacientes que regresaron: en promedio, 283 días en pacientes con razones médicas distintas al cáncer, 132 días en pacientes con otras razones, 1264 días en pacientes oncológicos y 1547 días en pacientes con razones no médicas. Independientemente de todas estas diferencias relevantes, la tasa de supervivencia fue similar (83-88%; en promedio, se calentaron 8-11 ovocitos y sobrevivieron 7-9 ovocitos) entre las pacientes de los 4 grupos, confirmando así la eficacia y seguridad de los protocolos de vitrificación y calentamiento de ovocitos. Además, la tasa de supervivencia es independiente de la vitrificación y la experiencia del operador de calentamiento(Figura 4A,B). La Tabla 1 muestra las tasas de fertilización en los 4 grupos, que son de ~70%, excepto para los pacientes con razones no médicas para la vitrificación de ovocitos (~80%). Sin embargo, estos datos no son comparables debido a un tamaño de muestra pequeño y al sesgo del factor espermatozoide en el resultado de la fertilización27.

Figure 1
Figura 1: Configuración de gotas medianas para la criopreservación de ovocitos. Para realizar gradualmente el equilibrio, los ovocitos se colocan primero en una gota(A)de BS y se mezclan con (B) una gota de ES. Después de 3 min de incubación, (C) semezcla una tercera gota de solución de ES y los ovocitos se incuban durante 6-9 min. Abreviaturas: HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatanosulfónico; BS = medio tamponado por HEPES; ES = solución de equilibrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Carga de ovocitos en el dispositivo de criopreservación. Los ovocitos se colocan en el criodispositivo en (A) una sola pequeña gota de VS. (B) La pipeta stripper se desplaza lejos de losovocitos, y (C) el exceso de VS se vuelve a aspirar para dejar solo una capa delgada alrededor de cada ovocito. Abreviatura: VS = solución de vitrificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3:Ciclos de vitrificación de ovocitos realizados en el centro GENERA de medicina reproductiva de Roma (años 2008-2020). Durante el período de 12 años, 250 pacientes se sometieron a una sola recuperación de ovocitos para la vitrificación de ovocitos, mientras que 35 se sometieron a múltiples ciclos de recuperación de ovocitos. Las razones inherentes para la vitrificación de ovocitos se muestran en la figura. Las pacientes que regresan para el calentamiento (n = 78) pertenecen solo al grupo de mujeres que se sometieron a un solo ciclo de vitrificación de ovocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Tasa media de supervivencia por cohorte de ovocitos calentados. (A) Vitrificación y (B) experiencia de los operadores de calentamiento. Cada paciente se incluye solo para el primer ciclo de calentamiento. Las diferencias estadísticamente significativas se evaluaron mediante la prueba Ude Mann-Whitney. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Morfología de ovocitos al principio y al final del procedimiento de equilibrio. Para determinar el resultado del procedimiento de equilibrio, puede ser útil anotar la morfología de los ovocitos(A)antes de comenzar el procedimiento. (B) Se observa una fuerte contracción del ovocito después de la primera exposición a la solución crioprotectora. El procedimiento de equilibrio puede considerarse completo cuando (C) el ovocito ha recuperado su volumen inicial. Barras de escala = 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Motivo de la vitrificación de ovocitos Médico distinto del cáncer (n=19) Cáncer (n=40) No médico (n=133) Otros (n=58)
Edad materna en la recuperación de ovocitos, media±SD 33.6±6.4 años 34.6±5.9 años 37,0±3,4 años 38.2±4.3 años
FSH basal, media±SD 7.5±4.2 UI/L 7.6±1.7 UI/L 7.8±4.1 UI/L 8.8±5.2 UI/L
AMH, media±SD 1.8±1.7 ng/mL 1.9±0.2 ng/mL 2.2±2.4 ng/mL 3.0±2.5 ng/mL
AFC, media±SD 12,7±5,0 13.3±7.0 11.6±6.1 10.7±6.7
IMC, media±SD 20.1±1.5 21,8±1,6 20.2±3.1 22.9±3.6
Duración de la estimulación, media±SD 10,0±1,5 9.6±1.7 9.9±2.1 10.3±2.1
9/40, 22.5%
Inicio aleatorio
AOCs, total, media±SD 239 551 1493 592
12.6±5.3 13.8±9.1 11.2±7.1 10.2±8.5
Ovocitos MII, total, media±SD 167 400 1161 462
8.8±3.3 10.0±7.2 8.7±5.7 8.0±6.7
Tasa de maduración, media±SD 72,4±13,6% 72,1±19,6% 79,5±17,5% 77,4±22,2%
Pacientes que regresan para el calentamiento, % total de pacientes que se sometieron a vitrificación 10/19, 52.6% 7/40, 17.5% 17/133, 12.8% 44/58, 75.9%
Días entre la vitrificación y el primer calentamiento, media±SD 283±225 1264±764 1547±709 132±203
Ovocitos MII calentados, media total±SD 82 66 191 409
8.2±2.8 9.4±4.8 11.2±5.8 9.3±7.2
Ovocitos MII sobrevividos, media total±SD 73 55 160 345
7.3±3.3 7.9±4.0 9.4±4.8 7.8±6.9
Tasa de supervivencia media±SD 87,6±18,1% 83,2±1,7% 85,4%±14,5% 84,7±21,9%
Factor espermatozoide
N, n, % 5/10, 50% 4/7, 57% 13/17, 76% 13/44, 29%
MMF, n, % 3/10, 30% 3/7, 43% 3/17, 18% 17/44, 39%
OAT, n, % 2/10, 20% - 1/17, 6% 11/44, 25%
NOA, n, % - - - 3/44, 7%
Tasa de fertilización, media±SD 70,0±14,4% 70,0±17,0% 78,5±20,6% 71,0±24,3%

Tabla 1: Pacientes sometidos a un solo ciclo de vitrificación de ovocitos. Abreviaturas: FSH = hormona folículo estimulante; AMH = hormona anti-mülleriana; IMC = índice de masa corporal; COC = complejos de oocitos cúmulos; MII = metafase-II; N = normozoospermic; MMF = factor masculino moderado (1-2 defectos de esperma); OAT = oligoasthenoteratozoospermic; NOA = azoospermia no obstructiva (los espermatozoides se recolectaron a través de la extracción de espermatozoides testiculares).

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Discussion

Consideraciones clínicas

Aunque se han explorado estrategias emergentes, como la criopreservación del tejido ovárico y la maduración in vitro, la vitrificación de ovocitos después de COS es la técnica estándar de oro para la preservación de la fertilidad. En este escenario, el número de ovocitos recuperados y criopreservados debe maximizarse en el menor tiempo posible, ya que la mayoría de las pacientes con cáncer podrían beneficiarse únicamente de un ciclo ovárico antes de que tengan que comenzar su(s) tratamiento(s) contra el cáncer. Por lo tanto, un protocolo adecuado de estimulación ovárica es crucial para explotar plenamente la reserva ovárica y aumentar la probabilidad acumulada de un futuro nacido vivo28,un resultado que depende en gran medida de la edad materna en la recuperación de ovocitos. En este sentido, aún no se ha propuesto una edad ideal para la vitrificación de ovocitos con fines de preservación de la fertilidad29,y se requiere un consenso entre 35 años18 o 37 años30,31. Sin embargo, la preservación de la fertilidad debe ser accesible para todos los pacientes, incluidas las mujeres mayores de 37 años, siempre que se les brinde asesoramiento adecuado sobre las tasas de éxito en función de su edad.

El protocolo y la dosis inicial de los medicamentos deben describirse de acuerdo con el juicio del ginecólogo y, lo que es más importante, en función del tiempo disponible32,33. Se recomienda comenzar la estimulación convencional en la fase folicular temprana cuando el tiempo no es un problema. Sin embargo, si es necesario, el enfoque de inicio aleatorio es factible para minimizar los retrasos en el inicio de los tratamientos urgentes contra el cáncer / médicos34,35. Se ha informado que el desarrollo folicular es un proceso extremadamente dinámico, ya que se han descrito múltiples ondas de reclutamiento de folículos a lo largo de un solo ciclo ovárico. Aunque los mecanismos biológicos detrás de este fenómeno aún deben ser revelados, los ovocitos competentes pueden ser recuperados y criopreservados independientemente de la fase del ciclo menstrual en la que se inicia el COS36.

En este centro, la estimulación ovárica se realiza típicamente utilizando el protocolo antagonista de la GnRH y 150-300 UI / día de FSH recombinante o gonadotropina menopáusica humana. En poblaciones específicas de pacientes mayores de 35 años, con deficiencia de LH, o que muestran una respuesta subóptima después del COS estándar, se podría agregar LH durante coS para aumentar el reclutamiento y crecimiento de folículos a través de una acción sinérgica con factor de crecimiento similar a la insulina1 16,37,38. Además, se ha informado que el protocolo antagonista de la GnRH seguido de un desencadenante agonista de la GnRH es un protocolo de estimulación corto, seguro y altamente conveniente para maximizar la respuesta ovárica y minimizar el riesgo de SHO39. En pacientes con enfermedades sensibles a los estrógenos como el cáncer de mama, se administran gonadotropinas asociadas a inhibidores de la aromatasa, como el letrozol20.

De hecho, una revisión reciente mostró que el letrozol implica una respuesta ovárica similar a la estimulación convencional sin complicaciones en términos de defectos congénitos, recurrencia de neoplasias malignas y aumento de la mortalidad40. Del mismo modo, el tamoxifeno podría usarse durante el COS en el caso de tumores sensibles al estrógeno, que, al igual que el letrozol, no mostraron ningún impacto en la competencia de los ovocitos41,42. Sin embargo, esto debe confirmarse en estudios más amplios. En este centro, el letrozol se administra desde el día 1 de estimulación hasta el día 7 después de la recuperación de ovocitos en caso de tumores sensibles al estradiol. Se debe considerar el riesgo de SHO, que es la complicación más importante del COS que también retrasaría aún más los tratamientos contra el cáncer, particularmente en pacientes jóvenes con AFC altos. En estos casos, desencadenar la ovulación con un agonista de la GnRH en lugar de gonadotropina coriónica humana (hCG) ha demostrado ser beneficioso. Otros problemas que deben prevenirse son (i) la tromboembolia, que requiere la administración de heparina de bajo peso molecular durante el COS, y (ii) una respuesta ovárica reducida después del COS43. Para compensar esto último, se pueden realizar dos estimulaciones consecutivas en un solo ciclo ovárico. Este nuevo protocolo COS no convencional, conocido como DuoStim, implica estimulaciones de la fase folicular y lútea y dos recuperaciones de ovocitos en un corto período de tiempo (~ 15 días) y debe investigarse con fines de preservación de la fertilidad en el futuro44,45,46.

Otras estrategias posibles para la preservación de la fertilidad en las mujeres son: (i) la criopreservación del tejido ovárico, que es la única opción disponible para las mujeres prepúberes. Esta posibilidad es prometedora para restaurar la actividad reproductiva y endocrina y evitar el retraso en el inicio del tratamiento del cáncer, ya que no se necesita estimulación hormonal. Sin embargo, todavía es experimental y requiere cirugía laparoscópica con trasplante posterior, y existe el riesgo de retransmisión del cáncer ortotópico. (ii) Criopreservación embrionaria, que implica una mayor tasa de supervivencia después del calentamiento, pero retrasa el tratamiento del cáncer y requiere la participación de una pareja masculina o donante, lo que también limita la futura autonomía reproductiva de la mujer47. Además, podría estar sujeto a limitaciones legales en algunos países. Teniendo en cuenta estas limitaciones, la vitrificación de ovocitos se considera el enfoque más establecido y éticamente aceptable. Idealmente, todos los hospitales importantes, donde se trata a las mujeres afectadas por cáncer en su edad reproductiva, deberían proporcionar programas para la preservación de la fertilidad, y todo el proceso debería ser gratuito para estos pacientes para garantizar la igualdad de acceso a este programa. Aún así, la criopreservación de ovocitos debe realizarse únicamente en centros con suficiente experiencia para no afectar la competencia de los ovocitos en el proceso48.

Pasos críticos en el protocolo de vitrificación y solución de problemas

La vitrificación es una pseudo transición de fase de segundo orden (IUPAC Compendium of Chemical Terminology) que induce una solidificación similar al vidrio dentro de las células evitando la nucleación y el crecimiento de cristales de hielo, el principal factor causal de la lesión celular. Para lograr una vitrificación adecuada, se requiere una combinación de al menos dos CPA (típicamente etilenglicol y DMSO como agentes impregnantes y sacarosa como agente no permeante) junto con una velocidad de enfriamiento extremadamente alta (>20,000 ° C / min) lograda ya sea minimizando los volúmenes de carga o mediante la exposición directa de las muestras al nitrógeno líquido (dispositivos abiertos). Como los ovocitos son las células más grandes del cuerpo, contienen la mayor cantidad de agua. Por lo tanto, son más sensibles a las lesiones por congelación que los embriones. Durante la criopreservación de ovocitos, puede ocurrir daño a orgánulos intracelulares (por ejemplo, el citoesqueleto o huso meiótico), alteración de la permeabilidad de la membrana, endurecimiento de la zona pelúcida, activación de ovocitos, alteración de las vías bioquímicas y posiblemente muerte celular49. Por esta razón, se debe garantizar un delicado equilibrio entre múltiples factores para la preservación exitosa de la viabilidad de los ovocitos y la competencia de desarrollo. Para lograr la consistencia en la tasa de supervivencia después de la vitrificación y alcanzar los niveles de referencia, todos los pasos cruciales del procedimiento deben controlarse estrictamente.

CPA, osmolalidad celular y velocidades de enfriamiento

Para aumentar la probabilidad de vitrificación, se debe maximizar la viscosidad del medio (y por lo tanto la concentración de CPA). Sin embargo, la toxicidad de los CPA siempre debe mantenerse bajo control50. Para ello, es crucial minimizar tanto el tiempo de exposición de la célula a los CPAs como los volúmenes de carga, y trabajar siempre a temperatura ambiente (25-27 °C)51. Otros protocolos implican diferentes combinaciones de CPA y criodispositivos y se llevan a cabo a 37 °C; sin embargo, no se han descrito aquí. Por lo tanto, las notas, los resultados representativos y las secciones de discusión de este manuscrito solo se aplican al protocolo de vitrificación detallado aquí.

Durante la criopreservación, los ovocitos se exponen a soluciones de CPA de aumento de la concentración de osmollitos para promover la deshidratación celular y la contracción citoplasmática. Durante el calentamiento, se exponen a soluciones con disminución de la concentración de osmollitos para restaurar el volumen citoplasmático. Durante la vitrificación, los ovocitos se deshidratan, y las fluctuaciones involuntarias en el volumen celular pueden causar un shock osmótico severo, comprometiendo así la supervivencia y el potencial de desarrollo después del calentamiento52. Encontrar la velocidad de enfriamiento óptima es un aspecto clave para preservar la viabilidad celular, ya que afecta la osmolalidad53 y el potencial de desarrollo celular54. Por ejemplo, cuando una célula está expuesta a velocidades de enfriamiento más lentas que las tasas óptimas, puede estar ampliamente expuesta a condiciones hipertónicas que conducen a la muerte celular.

Para lograr la velocidad de enfriamiento óptima, los volúmenes de carga deben minimizarse, la RT debe controlarse para no afectar la velocidad del proceso de equilibrio y las muestras deben exponerse directamente al nitrógeno líquido. Una forma de evaluar cuándo se ha logrado el equilibrio es anotar la morfología del ovocito (en particular, el ancho del espacio perivitelino y el grosor de la zona pelúcida) antes del comienzo del procedimiento(Figura 5A). Después de una fase inicial de reducción del volumen celular(Figura 5B),se espera que el ovocito recupere su volumen inicial(Figura 5C). Aunque el pH correcto se mantiene durante el manejo de ovocitos bajo atmósfera de aire debido a los zwitterions que amortiguan las soluciones de calentamiento de vitrificación, la osmolalidad media es particularmente dependiente de la temperatura53. Por lo tanto, el método de preparación del plato es fundamental para reducir cualquier posible efecto perjudicial55.

La superposición de aceite es ciertamente fundamental para prevenir la evaporación y evitar cualquier aumento de la osmolalidad en los medios deFIV 56. Sin embargo, no se puede utilizar mientras se realizan los procedimientos de vitrificación y calentamiento. Por lo tanto, algunos consejos son importantes para los operadores: (i) preparar las gotas lo más rápido posible e inmediatamente antes de su uso; (ii) considerar mayores volúmenes de gotas para minimizar los cambios en la osmolaridad (no se recomienda <30 μL); (iii) cuando las condiciones ambientales no pueden estandarizarse, se puede usar una placa de 6 pomos y se puede agregar agua estéril o PBS al reservorio adyacente para limitar la evaporación; iv) preste atención a la fecha de la primera apertura del vial de medio, ya que la osmolalidad puede cambiar si el frasco se abre repetidamente.

Calentamiento de ovocitos y desvitrificación de ovocitos

El paso más crucial que puede afectar la consistencia en la tasa de supervivencia es definitivamente el proceso de calentamiento57. Durante este paso, los CPA se eliminan gradualmente del ovocito y se diluyen para prevenir cualquier posible efecto citotóxico. La desvitrificación, es decir, la formación de núcleos de hielo o cristales de hielo durante el calentamiento de una solución vitrificada o accidentalmente durante la auditoría, el transporte o el almacenamiento en vapor, es uno de los principales riesgos de la vitrificación58,59,60. Por lo tanto, para evitar la desvitrificación y las lesiones durante el calentamiento, se debe maximizar la diferencia de temperatura entre el primer y el último paso del proceso. Como muestran Seki y Mazur57 en ovocitos murinos sometidos a vitrificación y calentamiento a diferentes velocidades, cuanto más rápido sea el calentamiento, mayor será la supervivencia. El volumen y la temperatura del TS son los principales factores a controlar: el TS debe calentarse adecuadamente a 37 ° C (al menos 1 h antes del procedimiento), y la rejilla de nitrógeno líquido debe llenarse hasta el borde de su capacidad y colocarse lo más cerca posible del estereomitroscopio. El operador debe ser lo más rápido posible al transferir el portador de criopreservación del nitrógeno líquido al TS. Debido a la alta eficiencia de la vitrificación, se puede utilizar un protocolo de calentamiento universal independientemente del protocolo de congelación involucrado, lo que facilita la gestión de todos los ciclos de calentamiento incluso cuando los ovocitos se importan de un centro de FIV diferente61.

Dispositivos abiertos y riesgo de contaminación

El empleo de sistemas abiertos y la exposición directa de las muestras al nitrógeno líquido son necesarios para lograr las tasas de enfriamiento y calentamiento extremadamente altas que respaldan la efectividad de este protocolo. Aunque la vitrificación es un procedimiento que plantea un bajo riesgo de contaminación cruzada, ya que implica volúmenes muy pequeños y se lleva a cabo después de varios lavados de muestras que diluyen cualquier carga viral putativa, es esencial adoptar todas las medidas de precaución para aumentar su seguridad. Sobre la base de la evidencia actual, los sistemas cerrados no ofrecen una alternativa competitiva a los sistemas abiertos al menos para la vitrificación de ovocitos62,63. Para mantener la eficacia de los sistemas de vitrificación abiertos y minimizar los riesgos asociados con el contacto directo con el nitrógeno líquido, este último podría ser esterilizado por irradiación ultravioleta64,65. Alternativamente, se podrían utilizar tanques de almacenamiento de vapor, que se sabe que representan un menor riesgo de contaminación que los convencionales, pero han demostrado ser efectivos para preservar la viabilidad de los ovocitos66,67.

Importancia del monitoreo constante de los indicadores clave de rendimiento para los programas de vitrificación de ovocitos

En un laboratorio de FIV, el seguimiento de los indicadores clave de rendimiento (KPI) es esencial para el seguimiento y la mejora constante de los resultados68. En general, al definir los KPI para monitorear procesos y procedimientos, se deben considerar tres áreas principales: estructura, proceso y resultado. Los KPI estructurales miden la calidad del laboratorio de FIV delineando las características de los recursos físicos y humanos. Un ejemplo de un KPI estructural relacionado con la instalación en un programa de criopreservación podría ser el número de criotanks en relación con el número total de procedimientos de TAR que requieren criopreservación realizada en un período de tiempo determinado o el número de crio-tanques en relación con los metros cuadrados totales del crioroom. Sin embargo, los recursos humanos y, en particular, las habilidades del operador son de suma importancia cuando se trata de un procedimiento delicado como la vitrificación. De hecho, aunque extremadamente efectiva, la técnica de vitrificación es un procedimiento desafiante que involucra varias fases de procedimiento con tiempos estrictos que deben controlarse estrictamente: una cantidad muy pequeña de un medio significativamente viscoso debe manejarse durante un período muy corto.

Ninguna máquina de congelación con ajuste de parámetros de enfriamiento específicos está involucrada en el procedimiento; por lo tanto, la estandarización de los detalles del protocolo y la capacitación son esenciales. El proceso manual tiene estrictos requisitos de habilidad que deben cumplirse para obtener tasas de supervivencia celular consistentes y altamente reproducibles. Se debe proporcionar capacitación específica a cada operador novato para que sean competentes en el control de todos los puntos críticos del procedimiento, en particular, el tiempo de exposición de las muestras a los CPA y el manejo de las células en un medio altamente viscoso. Sin embargo, según Dessolle y coautores,69 la curva de aprendizaje para el procedimiento de vitrificación no debería ser tan larga incluso para los embriólogos jóvenes, ya que el logro de la competencia está limitado principalmente por los desafíos de manipulación. Una vez que se ha alcanzado la experiencia en vitrificación, el desempeño de cada operador individual debe verificarse de manera precisa y regular mediante el uso de KPI para evaluar regularmente el mantenimiento de los valores de competencia establecidos por los documentos de consenso70. Además, la confianza/competencia del operador debe ser comparable para no afectar a los resultados.

Los KPI de proceso miden qué tan bien funciona el laboratorio de FIV. Los protocolos y procedimientos de vitrificación y calentamiento deben llevarse a cabo de manera oportuna, y las fluctuaciones en las condiciones de cultivo deben minimizarse prestando especial atención al mantenimiento de la osmolaridad y la temperatura adecuadas para la preservación no solo de la competencia de desarrollo de ovocitos, sino también de la seguridad del operador al manipular nitrógeno líquido. Ejemplos de KPI de proceso son el porcentaje de lesiones del personal de laboratorio mientras se manipula nitrógeno líquido por número de procedimientos de FIV por año, el porcentaje de gametos / embriones perdidos / dañados durante los procedimientos de vitrificación / calentamiento y las auditorías por número de procedimientos por año.

Finalmente, los KPI de resultado miden la efectividad del laboratorio de FIV y generalmente se refieren a la supervivencia de ovocitos postcalentamiento definida como la proporción de ovocitos morfológicamente intactos en el momento de la ICSI (en caso de vitrificación de ovocitos, el valor de competencia debe ser >50% y el valor de referencia es 75%)70. Además, las tasas de fertilización (<10% más bajas que los ovocitos frescos inseminados en el centro de una población de pacientes comparable), el desarrollo embrionario (lo mismo que una población de pacientes comparable que usa ovocitos frescos) y la implantación (<10-30% más bajo que una población comparable de embriones frescos en el centro) son aplicables como KPI de resultado para ovocitos vitrificados70. Sin embargo, los resultados clínicos están más sujetos a características específicas de la pareja que a procedimientos clínicos defectuosos71,72.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Ninguno

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection
Equipment
Hot plate IVF TECH
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Vacuum Pump Cook K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) Cook K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish Corning 353803 Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes Falcon 352001 Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes Falcon 352003 Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12x75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator Eppendorf Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin thermoFisher Scietific 9988
Hyaluronidase Fujifilm Irvine Scientific 90101 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish Falcon 353653 Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb Sigma Aldrich Z111589-12EA 1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes Hunter Scientific PPB150-100PL Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm) Cook K-FPIP-1140-10BS-6 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm ) Cook K-FPIP-1130-10BS-7 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin Fujifilm Irvine Scientific 9988
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium Fujifilm Irvine Scientific 90126 HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm) Cook K-FPIP-1170-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit Fujifilm Irvine Scientific 90133-so 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit Coopersurgical Origio 42782001A VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper  holder
Gilson Pipetman Gilson F123601 p200
k-System Incubator Coopersurgical G210Invicell
Lab Markers Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack Kitazato Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope Leica Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack Eppendorf 30075331 Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium Fujifilm Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm) Corning 353802 Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid ThermoFisher Scietific 176740 Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well Oosafe OOPW-SW02 OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture Fujifilm Irvine Scientific 9305
SAtripping pipette tips (300µm) Cook K-FPIP-1300-10BS-5 PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit Fujifilm Irvine Scientific 90137-so 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)

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References

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Biología Número 175 Preservación de la fertilidad estimulación ovárica ovocito metafase II vitrificación calentamiento Indicadores clave de rendimiento (KPI)
Preservación de la fertilidad a través de la vitrificación de ovocitos: perspectivas clínicas y de laboratorio
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Maggiulli, R., Vaiarelli, A., Cimadomo, D., Giancani, A., Tacconi, L., Fabozzi, G., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives. J. Vis. Exp. (175), e61963, doi:10.3791/61963 (2021).

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