Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Ковалентная маркировка диэтилпирокарбонатом для изучения структуры белка высшего порядка с помощью масс-спектрометрии

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/61983
Automatic Translation
1, 1, *1,2, *3
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

Описаны экспериментальные процедуры выполнения ковалентной маркировки на основе диэтилпирокарбоната с масс-спектрометрическим детектированием. Диэтилпирокарбонат просто смешивают с интересуемым белком или белковым комплексом, что приводит к модификации доступных растворителю аминокислотных остатков. Модифицированные остатки могут быть идентифицированы после протеолитического сбраживания и анализа жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии.

Abstract

Характеристика структуры белка более высокого порядка имеет важное значение для понимания его функции. Масс-спектрометрия (МС) стала мощным инструментом для этой цели, особенно для белковых систем, которые трудно изучать традиционными методами. Чтобы изучить структуру белка с помощью MS, в растворе проводят специфические химические реакции, которые кодируют структурную информацию белка в его массу. Одним из особенно эффективных подходов является использование реагентов, которые ковалентно модифицируют доступные растворителям боковые цепи аминокислот. Эти реакции приводят к увеличению массы, которое может быть локализовано с разрешением на уровне остатка в сочетании с протеолитическим сбраживанием и тандемной масс-спектрометрией. Здесь мы описываем протоколы, связанные с использованием диэтилпирокарбоната (DEPC) в качестве ковалентного реагента маркировки вместе с обнаружением РС. DEPC представляет собой высокоэлектрофильной молекулу, способную маркировать до 30% остатков в среднем белке, тем самым обеспечивая отличное структурное разрешение. DEPC успешно используется вместе с MS для получения структурной информации для небольших однодоменные белки, такие как β2-микроглобулин, к крупным многодоменные белки, такие как моноклональные антитела.

Introduction

Белки являются важными биомолекулами практически в каждом физиологическом процессе. Разнообразие функций, которые выполняют белки, возможно из-за структур, которые они принимают, и взаимодействий, которые они имеют с другими биомолекулами. Чтобы понять функцию белка на более глубоком уровне, необходимы биохимические и биофизические инструменты для выяснения этих важных структурных особенностей и взаимодействий. Традиционно рентгеновская кристаллография, криогенная электронная микроскопия и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) обеспечивали желаемую детализацию на атомном уровне для выявления структуры белка. Однако многочисленные белковые системы не могут быть опрошены этими методами из-за плохого поведения кристаллизации, ограниченной доступности белка, чрезмерной гетерогенности образца или ограничений молекулярной массы. Следовательно, появились новые методы анализа, которые преодолевают эти ограничения. Среди новых методов, которые могут предоставить структурную информацию белка, является масс-спектрометрия.

Масс-спектрометрия (MS) измеряет отношение массы к заряду молекулы (m/z), поэтому структурная информация белка более высокого порядка должна быть получена путем кодирования желаемой структурной информации в массу белка. Было разработано несколько подходов к кодированию этой информации, включая водородно-дейтериевый обмен (HDX)1,2,3,4,химическое сшивание (XL)5,6и ковалентную маркировку (CL)7,8,9,10. В HDX магистральные амидные водороды обмениваются немного более массивными дейтериями со скоростью, которая зависит от доступности растворителей и степени H-связи. Степень HDX может быть локализована путем быстрого переваривания белка в пептидные фрагменты перед разделением и измерением этих фрагментов масс-спектрометром или путем диссоциации белка в эксперименте сверху вниз. Определение обменного курса дает дальнейшее понимание динамики белка. HDX оказался ценным инструментом для характеристики структуры белка, несмотря на проблемы, связанные с обратным обменом и необходимостью специализированного оборудования для максимизации воспроизводимости. В XL-MS белки реагируют с бифункциональными реагентами, которые ковалентно связывают соседние боковые цепи остатка внутри данного белка или между двумя белками. При этом XL-MS может обеспечить ограничения расстояния, которые могут быть использованы для характеристики структуры белка. Области белка, которые являются сшитыми, могут быть идентифицированы с помощью протеолитического пищеварения с последующим анализом жидкостной хроматографии (LC)-MS. В то время как XL-MS является универсальным инструментом, который использовался для изучения различных белковых комплексов, в том числе внутри клеток, идентификация продуктов XL является сложной задачей и требует специализированного программного обеспечения.

CL-MS появился в последнее время как дополнительный, а иногда и альтернативный инструмент на основе MS для изучения структуры и взаимодействий белка. В CL-MS белок или белковый комплекс ковалентно модифицируют монофункциональным реагентом, который может реагировать с боковыми цепями, подвергающимися воздействию растворителя(рисунок 1). Сравнивая степени модификации белка или белкового комплекса в различных условиях, можно выявить конформационные изменения, сайты связывания и белково-белковые интерфейсы. После реакции CL сайт-специфическая информация, часто на уровне одной аминокислоты, может быть получена с использованием типичных рабочих процессов протеомики снизу вверх, в которых белки протеолитически перевариваются, пептидные фрагменты разделяются LC, а модифицированные участки идентифицируются с использованием тандема MS (MS / MS). Богатая история химии биоконъюгатов сделала многочисленные реагенты доступными для экспериментов CL-MS. Реагенты CL делятся на две общие категории: (i) специфические и (ii) неспецифические. Специфические реагенты реагируют с одной функциональной группой (например, свободными аминами)8,10 и легко реализуются, но они, как правило, предоставляют ограниченную структурную информацию. Неспецифические реагенты реагируют с широким спектром боковых цепей, но часто требуют специализированного оборудования, такого как лазеры или синхротронные источники для получения этих высокореактивных видов. Гидроксильные радикалы являются наиболее часто используемым неспецифическим реагентом, поскольку были применены в гидроксильных радикалах (HRF)7,11,12,13 экспериментов для изучения широкого спектра белков и белковых комплексов в различных условиях.

Наша исследовательская группа успешно использовала другой относительно неспецифический реагент под названием диэтилпирокарбонат (DEPC) для изучения структуры и взаимодействий белка в контексте экспериментов CL-MS14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC предлагает простоту специфических реагентов маркировки (т.е. для выполнения реакций не требуется специализированное оборудование), реагируя при этом с 30% аминокислот в среднем белке. Как высокоэлектрофильный реагент, DEPC способен реагировать с N-концем и нуклеофильными боковыми цепями цистеина, гистидина, лизина, тирозина, серина и остатков треонина. Как правило, образуется один продукт этих реакций, в результате чего увеличивается масса на 72,02 Да. Этот единственный тип продукта контрастирует с 55 различными продуктами, которые могут быть получены, когда белки реагируют с гидроксильными радикалами7. Такая простая химия облегчает идентификацию маркированных участков.

Здесь мы предоставляем протоколы для использования CL-MS на основе DEPC для изучения структуры и взаимодействий белка. Описаны детали, связанные с препаратом реагента, реакциями DEPC-белка, условиями переваривания белка, параметрами LC-MS и MS/MS, а также анализом данных. Мы также демонстрируем полезность маркировки DEPC, приводя примеры результатов взаимодействия белка-металла, белка-лиганда и белка-белка, а также белков, претерпевающих структурные изменения при нагревании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Препарат белка и реагента

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол включает в себя пример рабочего процесса для маркировки белка с помощью DEPC. Некоторые условия и концентрации реагентов могут варьироваться в зависимости от выбранного белка.

  1. Приготовьте все растворы реагентов в микроцентрифужных пробирках по 1,5 мл.
  2. Готовят белковый раствор нужной концентрации, обычно в диапазоне десятков мкМ, в буфере 10 мМ 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (МОПС) при рН 7,4. Альтернативно, готовят буферно-обменный существующий белковый раствор в 10 мМ рН 7,4 MOPS, если образец содержит нуклеофильный буфер, который будет реакционноспособным с DEPC. Другие буферы (например, фосфатно-буферный физиологический раствор) также могут быть использованы, если они не имеют нуклеофильных функциональных групп.
  3. Готовят раствор DEPC 100 мМ в сухом ацетонитриле (ACN) путем пипетирования 1,45 мкл запасного 6,9 М РАСТВОРА DEPC в 98,55 мкл ACN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не существует единого набора концентраций, которые будут работать с каждым белком, хотя оптимальные концентрации могут быть оценены на основе количества остатков His и Lys23. Например, с 50 мкл раствора β2-микроглобулина 50 мкМ реагируют на белок с 0,2 мкл из 100 мМ DEPC для конечной концентрации DEPC 200 мкМ (равной 4x концентрации белка) для обеспечения желаемого молярного соотношения с использованием этого общего примера(таблица 1). Маркировка DEPC представляет собой реакцию2-го порядка, поэтому изменение концентрации белка или DEPC в реакционной смеси изменит скорость маркировки.
  4. Готовят 1 М раствора имидазола, взвешивая 10 мг имидазола и растворяя в 146,9 мкл воды класса ВЭЖХ.

2. Ковалентная маркировка интактного белка

  1. Установите температуру водяной бани на 37 °C и дождитесь, пока ванна достигнет стабильной температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации и объемы реагентов для примера протокола маркировки можно найти в таблице 1.
  2. В новой микроцентрифужной трубке смешайте буфер MOPS и белковый раствор в объемах, перечисленных в таблице 1.
  3. К белку и буферу добавляют 0,2 мкл раствора DEPC, убедившись, что полученный раствор правильно перемешивают, а затем помещают трубку, содержащую реакционную смесь, на водяную баню при 37 °C на 1 минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем добавленного ACN не должен превышать 1% от общего объема реакции, чтобы избежать возмущения структуры белка во время реакции маркировки. Время реакции остается за пользователем, хотя 1-минутная реакция в условиях примера минимизирует чрезмерную маркировку и потенциальный гидролиз DEPC14.
  4. Через 1 минуту вынимают трубку, содержащую реакционную смесь, с водяной бани и гасят реакцию 1 мкл раствора имидазола 1 М для удаления оставшегося нереактированного DEPC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация имидазола в реакционной смеси должна быть в 50 раз больше концентрации DEPC в реакционной смеси. Это обеспечит сохранение нереактированного DEPC.

3. Подготовка белкового переваривания к восходящему LC-MS

ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте условия пищеварения, которые поддаются интересуя белку. Общие шаги включают в себя развертывание белка и уменьшение и алкилирование любых дисульфидных связей.

  1. Расверните белок, добавив в реакционную смесь соответствующий разворачивающийся реагент.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общие разворачивающие агенты включают ACN, мочевину и гуанидин гидрохлорид (GuHCl).
  2. Готовят растворы трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) и йодоацетамида (IAM), взвешивая по 5 мг каждого и растворяя их в новых микроцентрифужных пробирках в 174,4 и 270,3 мкл буфера pH 7,4 MOPS 10 мМ соответственно для этапов восстановления и алкилирования.
  3. Уменьшают дисульфидные связи путем добавления 2 мкл раствора TCEP 100 мМ (конечная концентрация 2 мМ в реакционной смеси) в реакционную смесь и взаимодействия в течение 3 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация TCEP должна быть в 40 раз больше концентрации белка на дисульфидную связь, присутствующая в растворе.
  4. Алкилат восстановленных цистеинов с 4 мкл раствора 100 мМ ИАМ (конечная концентрация 4 мМ в реакционной смеси) в течение 30 минут в темноте. IAM светочувствительна и разлагается при прямом освещении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация IAM в растворе должна быть в два раза выше концентрации, используемой для TCEP, или в 80 раз выше концентрации белка на дисульфидную связь.
  5. Переваривайте белок с помощью соответствующего фермента, такого как трипсин или химотрипсин. Соотношение белка:фермент 10:1 для 3-часового пищеварения при 37 °C с иммобилизованным ферментом со скоростью встряхивания 300 ударов в минуту обычно достаточно для белков, меченых DEPC. См. раздел Обсуждение.
  6. После пищеварения отделяют иммобилизованный фермент от переваренные пептиды центрифугированием при 12 000 об/мин в течение 5 минут.
  7. Немедленно проанализируйте образец с помощью LC-MS/MS или заморозьте образец жидким азотом, чтобы свести к минимуму деградацию образца и потерю этикетки. Храните замороженные образцы при температуре < -20 °C до готовности к анализу LC-MS/MS.

4. Анализ LC-MS/MS

ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные параметры LC-MS/MS для протеомики снизу вверх могут быть использованы для идентификации меченых участков на фрагментах протеолитических пептидов. Ниже приведен общий пример.

  1. Отделите меченые DEPC пептиды, используя стационарную фазу C18 с обратной фазой. Используйте типичную подвижную фазу LC из двух растворителей: (A) воды + 0,1% муравьиной кислоты и (B) ACN + 0,1% муравьиной кислоты с использованием градиента (например, Фиг.2)для достижения наилучшего разделения пептидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время разделения может быть оптимизировано в зависимости от сложности образца, а скорость потока подвижной фазы зависит от того, используется ли капиллярный или нано LC.
  2. Используйте масс-спектрометр, способный выполнять онлайн-LC-MS и MS/MS для идентификации участков модификации DEPC на пептиде. В наших экспериментах мы успешно использовали несколько типов масс-спектрометров. Любой масс-спектрометр, способный автоматически выполнять MS/MS многих пептидов в ходе анализа LC-MS, должен быть подходящим. Соответствующие параметры MS включают: напряжение источника ESI = -4000 В для обычного ESI; -2000 В для нанораспросыка; Разрешение орбитрапа = 60 000; Продолжительность динамического исключения = 30 с; Тип активации MS/MS: CID, ETD или и то, и другое; Диапазон массового сканирования = 200-2 000; Автоматическая регулировка усиления = 4,0E5 (MS1 в Orbitrap) и 5,0E4 (MS2 в линейной квадрупольной ионной ловушке).
  3. Загрузите и введйте переваренный, меченый образец белка в систему LC и начните сбор LC-MS / MS. Если образец был заморожен во вспышке, разморозить перед анализом. Отводите сточные воды LC в отходы в течение первых 5 минут, чтобы избежать попадания избыточных солей в источник ESI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используется инъекционная петля объемом 5 мкл, позволяющая впрыскивать приблизительно 2,5 мкг белка в LC-MS/MS. Это зависит от условий нагрузки ЛК, чтобы не засорять инжектор образца.

5. Анализ данных

  1. Идентификация участков маркировки DEPC и количественная оценка пиковых областей пептидов с помощью соответствующего программного обеспечения для используемого масс-спектрометра.
  2. Включают добавление DEPC (72,02 Da) и карбамидометилирование (57,02 Da) в качестве переменных модификаций. Дополнительные параметры поиска для анализа MS/MS следующие: Максимальное количество пропущенных расщеплений = 3; Типы ионов фрагментов = b и y; Допуск предшественника m/z = 10 ppm (это значение должно быть выше, если используется масс-спектрометр квадрупольной ионной ловушки); Допуск фрагмента m/z = 0,5 Da (это значение должно быть ниже, если для сканирования ионов продукта используется масс-спектрометр высокого разрешения); Заряд предшественника = 1-4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные алгоритмы поиска в базах данных имеют разные системы оценки, и многие из них могут испытывать трудности с идентификацией пептидов, модифицированных DEPC, поскольку уровни модификации могут быть низкими. Корректировка отсечения оценки может потребоваться для выявления более меченых пептидов. Если это так, то ручной опрос данных MS / MS следует использовать для проверки низкоскоростных пептидов. Продукт гидролиза метки DEPC не включается в поиск данных, поскольку гидролизованный DEPC больше не реагирует по отношению к нуклеофильным боковым цепям.
  3. Определить процент модификации уровня остатка, используя хроматографические пиковые области модифицированных и немодифицированных версий пептидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой пептид, содержащий модифицированный остаток, представляющий интерес, должен быть рассмотрен, и все включенные состояния заряда должны присутствовать во всех измеренных образцах. Пептиды, имеющие различную эффективность ионизации и элюирование в разное время, заставляют это значение быть относительной, а не абсолютной мерой модификации конкретного сайта.
    Equation 1
    где Ai,z представляет пиковую область любого данного пептида (i), который содержит интересующая остаток и учитывает все обнаруженные состояния заряда (z).
  4. Определите, является ли изменение маркировки между контрольной и экспериментальной выборкой значительным, используя статистическую оценку. Три реплицированных измерения для каждого образца являются типичными, и t-тесты чаще всего используются с 95 или 99% доверительными интервалами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Определение участков модификации DEPC и процентов модификаций
Массовое добавление за счет ковалентной маркировки может быть измерено на (а) интактном белке и (б) пептидных уровнях8,9. На интактном уровне распределение белковых видов с различным количеством меток может быть получено из прямого анализа или LC-MS меченых белковых образцов. Для получения структурной информации с более высоким разрешением (т.е. данных маркировки для конкретного участка) измерения должны проводиться на пептидном уровне. После этапов маркировки и гашения меченые белки подвергаются протеомному анализу снизу вверх (т.е. восстановлению дисульфидов, алкилированию, протеолитическому сбраживанию и LC-MS/MS). На рисунке 3 показано, как идентифицируются сайты, меченые DEPC, и рассчитываются уровни их модификации для эксперимента DEPC CL-MS на белковом β-2-микроглобулине (β2m)21. MS/MS используется для секвенации меченых пептидов и точного определения их участков, меченых DEPC, в то время как процент модификации рассчитывается по их относительным пиковым областям в извлеченных ионных хроматограммах (см. Рисунок 3A).

Картирование поверхности белка с помощью DEPC CL-MS
Из-за взаимосвязи между топологией белка и скоростью маркировки DEPC был использован для изучения изменений в структуре белка более высокого порядка (HOS) и выявления сайтов взаимодействия белков8,9. Примером может быть влияние связывания Cu(II) на структуру β2m. Коэффициенты модификации DEPC пептидных фрагментов из несвязанные β2m и Cu(II)-связанные β2m (b2m-Cu) могут быть измерены(Таблица 2)путем изменения концентраций DEPC и получения кинетических графиков второго порядка14,24. Реакционная способность DEPC остатков в β2m-Cu показывает значительные изменения скорости маркировки для His31, Ser33 и Thr4, в то время как другие участки, включая различные его остатки, статистически не изменились. Эти данные согласуются с тем фактом, что His31, но не другие Его остатки в β2m, связывают Cu, вызывая структурные изменения вблизи His31 (т.е. Ser33) и вблизи N-конечного (т.е. Thr4)(рисунок 4)14,26,27.

DEPC CL-MS для выявления изменений в HOS
Маркировка DEPC с обнаружением РС также является ценным инструментом для характеристики изменений HOS в белках, что имеет важные последствия для белковой терапии, которая в настоящее время является самым быстрорастущим сегментом фармацевтического рынка28. DEPC CL может идентифицировать специфические белковые области, которые претерпевают структурные изменения при термическом и окислительном стрессе18. После того, как β2m подвергается тепловому стрессу, многие остатки, которые подвергаются значительному снижению протяженности маркировки (N-концевая область, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58), группируются на одной стороне белка, предполагая, что эта область белка претерпевает конформационные изменения или, возможно, опосредует агрегацию(рисунок 5A). В дополнение к этим остаткам, после того, как белок подвергается окислительному стрессу, другие остатки со снижением маркировки (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) образуют кластер на другой стороне белка, что указывает на то, что вызванные окислением конформационные изменения происходят в другом месте(рисунок 5B). Другая работа нашей группы также показала, что DEPC CL-MS может обнаруживать и идентифицировать участки конформационных изменений в терапии моноклональными антителами с тепловым стрессом20.

DEPC CL-MS для изучения белково-белковых взаимодействий
Понимание сайтов белково-белкового взаимодействия и интерфейсов агрегации для амилоид-образующих белков может быть получено с использованием маркировки DEPC, а также9. Снижение уровней модификации остатков при образовании олигомеров может выявить связующие интерфейсы. DEPC CL-MS был использован для характеристики преамилоидных олигомеров β2m, которые являются белком, образующим амилоиды при амилоидозе, связанном с диализом29,после инициирования образования амилоида с Cu(II)15,16,26. Сравнение реакционной способности DEPC мономера β2m с предамилоидным димером β2m, который образуется через 2 ч после добавления Cu(II), показывает, что девять остатков подвергаются снижению маркировки, в то время как шесть остатков не подвергаются изменению или незначительному увеличению маркировки(рисунок 6A). При отображении этих изменений на β2m сразу видно, что димерный интерфейс включает в себя ABED β листы мономеров β2m(рисунок 6B)15.

DEPC CL-MS для изучения связывания белка с лигандами
Связывание лигандов с белками приводит к снижению доступности растворителя остатков, взаимодействующих с лигандом, а CL-MS на основе DEPC может быть использован для идентификации лиганд-связывающих сайтов на белках. Например, места связывания эпигаллокатехин-3-галлата (EGCG) на β2m в условиях амилоидообразующего может быть идентифицированы по значительному снижению маркировки DEPC на остатках, захороненных связыванием EGCG. В присутствии ECGC Lys6 и Lys91 имеют более низкие проценты модификации DEPC(рисунок 7),и эти остатки группируются в одной области белка, что указывает на защиту остатка из-за связывания лигандов. N-конец, Thr4 и His31, между тем, подвергаются увеличению протяженности маркировки(рисунок 7),что свидетельствует о структурных изменениях, вызванных ECGC, и предполагает, что сайты связывания Cu(II) на β2m (N-конец и His31)14,30,31 могут быть нарушены в результате связывания ECGC32. Кроме того, сайты связывания двух других ингибиторов амилоида β2m, рифамицина SV и доксициклина, были идентифицированы с использованием CL-MS19. Однако в этом исследовании одних только результатов маркировки DEPC было недостаточно для отображения мест связывания с достаточным структурным разрешением. Результаты трех различных реагентов CL, а именно DEPC, BD и 1-этил-3-(3-(диметиламино)пропил)карбодиимид-глицинэтиловый эфир (EDC/GEE), были необходимы для лучшего определения сайтов связывания19.

Улучшение структурного разрешения и уменьшение скремблирования этикеток
Несмотря на то, что маркировка DEPC вызывает образование ковалентной связи, может произойти потеря метки из-за гидролиза, особенно для остатков Ser, Thr и Tyr(рисунок 8). Потеря метки может быть сведена к минимуму за счет уменьшения времени между реакцией DEPC CL и анализом LC-MS с использованием коротких протеолитических сбраживаний (например, 2-часовое пищеварение с иммобилизованными ферментами), а не ночных перевариваний. Быстрое пищеварение приводит к измерению более модифицированных остатков, увеличивая количество структурной информации белка. Например, 2-ч сбраживание иммобилизованным химотрипсином последовательно приводит к выявлению большего количества DEPC-модифицированных остатков в β2m(Рисунок 9)17. При ночном пищеварении обнаруживается около 75% остатков Ser, Thr, Tyr, His и Lys в β2m, но когда время между маркировкой и LC-MS сокращается с помощью 2-часового пищеварения, обнаруживается 95% этих остатков в β2m. Большинство вновь обнаруженных модифицированных остатков являются остатками Tyr и Thr, которые склонны к гидролизу.

В ходе нашей работы с DEPC мы заметили, что в некоторых белках остатки Cys, которые из дисульфидных связей модифицируются DEPC, хотя дисульфидные связи остаются нетронутыми во время реакций маркировки DEPC. Такая маркировка остатков Cys происходит потому, что свободные тиолы могут вступить в реакцию с другими модифицированными остатками врастворе (фиг.10),что приводит к так называемому «скремблированию этикетки», поскольку карбетоксигруппа переносится в остаток Cys. Скремблирование меток снижает уровни модификации на других остатках и обеспечивает неверную структурную информацию белка. Чтобы избежать скремблирования этикетки, свободные тиолы Cys должны быть полностью алкилированы сразу после восстановления дисульфида33.

Figure 1
Рисунок 1:Ковалентная маркировка-масс-спектрометрия (CL-MS). Монофункциональный реагент используется для модификации аминокислот, доступных растворителям, и может быть использован для предоставления специфической для сайта информации о конформационных изменениях или взаимодействиях в белках (верхнее и нижнее изображение). Модифицированный белок протеолитически переваривается, а полученные пептиды анализируются с помощью жидкостной хроматографии (ЛК) совместно с РС и тандемом МС (МС/МС). Рисунок был адаптирован из Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spectrometry for Study Protein Structure and Interactions. Методы 144,79-93 (2018). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Используемый объем (мкл) Концентрация в растворе (мкМ)
Белок (100 мкМ, MOPS) 50 50
МОПС (10 мМ, рН 7,4) 48.8 н/д
DEPC (100 мМ) 0.2 200 (=4x[белок])
Имидазол (1 М) 1 10 000 (=50x[DEPC])
Общий объем 100

Таблица 1. Общий протокол маркировки DEPC.

Figure 2
Рисунок 2. Пример градиента LC для разделения пептидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3 Иллюстрация того, как идентифицируются сайты, маркированные DEPC, и рассчитываются уровни их модификации. После маркировки DEPC и протеолитического переваривания проводится (А) LC-MS анализ перевариваемого белка. Пиковые области (B) немаркированных и (C) меченых пептидов в хроматограмме используются для расчета процента маркировки. Во время LC-MS пептиды подвергаются воздействию CID MS/MS. Тандемные масс-спектры (D) немаркированных и (E) и (F) меченых пептидов, полученных в определенное время удержания, используются для секвенирования пептидов и идентификации меченых DEPC сайтов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

остаток б2м b2m-Cu
Thr4 0.082 ± 0.004 0.052 ± 0.009
Его13 0,041 ± 0,003 0.033 ± 0.005
Его31 0.010 ± 0.001 0,003 ± 0,001
Сер33 0.010 ± 0.002 0,004 ± 0,001
Его51 0,036 ± 0,003 0.030 ± 0.004
Сер88 0,029 ± 0,007 0.020 ± 0.006

Таблица 2 Коэффициенты модификации DEPC для конкретного участка (k, M-1с-1)для b2m при отсутствии и наличии Cu(II).

Figure 4
Рисунок 4 Использование DEPC CL-MS для определения влияния связывания Cu(II) на структуру β2m: (A) Отображение поверхности белка остатков со значительным снижением скорости маркировки DEPC (синий), что указывает на изменения их доступности растворителя при связывании Cu(II), и тех, которые не имеют существенных изменений в скорости маркировки (пурпурный) (код присоединения PDB 1JNJ). (B) Пример специфических для сайта кинетических графиков реакции β2m с различными концентрациями DEPC в присутствии и отсутствии Cu(II). Коэффициент скорости маркировки (k) может быть получен из наклона кинетического графика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5 Результаты ковалентной маркировки для напряжения по сравнению с нативным β2m: (A) Тепловой стресс - нагревание при 75 °C в течение 24 ч и (B) окислительный стресс - с 3%H2O2 в течение 24 ч. Значительные изменения в процентах модификации показаны синим (уменьшение маркировки) и красным (увеличение маркировки), в то время как остатки без существенных изменений маркировки показаны бледно-зеленым цветом (код присоединения PDB 1JNJ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6 Использование DEPC CL-MS для определения димерного интерфейса для преамилоидного димера β2m: (A) Сводка изменений уровня модификации DEPC для модифицированных остатков в мономере (т.е. t = 0) и димере через 2 ч после добавления Cu(II). Остатки со значительным уменьшением протяженности маркировки обозначаются звездочкой (*). (B) Результаты ковалентной маркировки, нанесенные на структуру β2m. Остатки с уменьшенной маркировкой показаны синим цветом, а остатки без изменений или незначительного увеличения маркировки показаны красным цветом (код присоединения PDB 1LDS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7 Результаты ковалентной маркировки для EGCG-связанных и несвязанным b2m. Процент модификации DEPC показан для отображаемых остатков. Статистически значимые различия в проценте ковалентной маркировки обозначаются звездочкой (*). Увеличение маркировки при связывании ECGC показано красным цветом, а уменьшение показано синим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8 Реакции ковалентной маркировки DEPC (нуклеофильное ацилзамещение) и потеря метки (гидролиз карбэтоксилированных остатков) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9 Картирование измеренных участков модификации на β2m. (A) Меченые участки после обычного ночного пищеварения и (B) меченые участки после 2-х ч пищеварения с иммобилизованным химотрипсином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10 Гипотетический механизм скремблирования меток DEPC (захват Cys карбэтоксилированного His) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги
Для обеспечения надежных результатов маркировки следует учитывать несколько моментов, касающихся экспериментального проектирования. Во-первых, чтобы максимизировать маркировку белка, необходимо избегать буферов с сильно нуклеофильными группами (например, Tris), потому что они могут реагировать с DEPC и снижать степень маркировки. Также возможно, что такие буферы могут реагировать с мечеными остатками, вызывая удаление метки и, следовательно, потерю структурной информации. Мы рекомендуем MOPS в качестве буфера, но фосфатный буферизованный физиологический раствор также работает. Во-вторых, следует избегать дитиотрейтола для восстановления дисульфидных связей, поскольку свободные тиолы в этом реагенте могут вступают в реакцию с мечеными остатками и удалять модификацию DEPC. Эта же химия является причиной того, почему важно алкилатно восстановленные дисульфиды, потому что свободный Cys может вызвать скремблирование внутрибелковой метки33. В-третьих, этап закалки имидазолом (этап протокола 2.4) имеет решающее значение для остановки реакции маркировки, поэтому любой оставшийся DEPC не может продолжать реагировать с белком.

Также важно понимать, что реакция маркировки DEPC имеет2-й порядок, что означает, что изменение концентрации белка или DEPC повлияет на степень маркировки. Мы эмпирически обнаружили, что соотношение 4:1 DEPC:концентрация белка является разумным значением, когда белок имеет концентрацию в диапазоне 10 мкМ, поскольку оно имеет тенденцию избегать любых структурных изменений, вызванных маркировкой14. Однако оптимальное соотношение DEPC:концентрация белка зависит как от белка, так и от концентрации, и некоторые белки требуют более высоких соотношений для достижения достаточной маркировки. Оптимальная концентрация DEPC для минимизации структурного возмущения маркировки данного белка может быть оценена по количеству растворителей, доступных ги и lys остатков23.

Чтобы избежать изменчивости в степени маркировки из-за деградации реагентов с течением времени, контрольные и экспериментальные реакции в идеале должны проводиться в один и тот же день. DEPC подвергается быстрому гидролизу при воздействии воды и будет разлагаться во время хранения, поэтому хорошая лабораторная практика и обработка реагентов являются ключевыми. Если бутылка DEPC не используется, ее следует хранить в адсорбаторе.

Изменения и устранение неполадок
Поскольку DEPC CL является кинетически контролируемой реакцией, скорость маркировки и, следовательно, уровень модификации контролируются концентрациями белка и реагентов, временем маркировки и температурой. Как указано выше, часто DEPC CL выполняют в течение 1 минуты при 37 °C с молярным отношением DEPC к белку 4 к 1. При этом молярном соотношении (4x) белки могут быть безопасно помечены без структурных возмущений14. DEPC: молярные соотношения белка, которые превышают 4, могут быть использованы для некоторых белков, и неудивительно, что более высокие концентрации DEPC приводят к более обширной маркировке и большей структурной информации. Наиболее безопасным способом использования более высоких концентраций DEPC без возмущающей структуры является создание графиков «доза-реакция», в которых реакционная способность протеолитических фрагментов белка измеряется в зависимости от концентрации DEPC (см. Рисунок 4B)14,24. Однако такой подход может занять много времени, так как требует нескольких измерений. Недавно мы продемонстрировали, что оптимальная концентрация DEPC может быть оценена для данного белка по количеству и SASA остатков His и Lys в этом белке23. В недавней работе мы также предложили альтернативные способы оценки того, что структура белка не возмущается во время CL9,24.

Протеолитическое сбраживание также является важным шагом в DEPC CL-MS, так как генерируемые пептиды позволяют локализовать структурную информацию после анализа LC-MS / MS. В целом, сериновые протеазы, такие как трипсин и химотрипсин, эффективны для переваривания белка. Трипсин чаще используется из-за его эффективности расщепления и специфичности на стороне С-концевого ряда остатков Lys и Arg. Тем не менее, трипсин обычно не расщепляется после помеченных DEPC остатков Lys, вызывая пропущенное расщепление на меченых остатках Lys, что иногда может усложнить анализ данных. Активность химотрипсина, который расщепляется после громоздких гидрофобных остатков, обычно не зависит от маркировки DEPC, но этот фермент имеет более низкую эффективность и специфичность расщепления, чем трипсин. Кроме того, для белков с многочисленными гидрофобными остатками химотрипсин может генерировать несколько коротких пептидных фрагментов, которые могут быть трудно разделены и обнаружены в стандартных условиях LC-MS.

Анализ белковых перевариваний LC-ESI-MS/MS требует стабильного электрораскрытия для получения надежных полуквалифицитивных результатов. Капиллярные и нано LC являются широко используемыми сепарационными платформами, где эффективное разделение может быть получено с небольшим количеством белка. Однако, по нашему опыту, капиллярный LC предоставляет более надежную количественную информацию (т. Е. Уровни модификации), чем нано LC из-за более высоких количеств образцов, которые используются. Для крупных белков, которые перевариваются в большое количество меченых и немаркированных пептидов, может произойти коэлюция пептидов с аналогичной гидрофобностью. В этих случаях для лучшего разделения следует использовать более длинные градиенты LC.

Быстрый и эффективный MS/MS важен для хорошего покрытия последовательностей и идентификации сайта этикетки. Масс-спектрометры с квадрупольными ионными ловушками являются отличными инструментами для этой цели. Как правило, CID является распространенным и высокоэффективным методом диссоциации пептидов; однако мы наблюдали случаи скремблирования меток DEPC во время CID меченых пептидных ионов, что приводило к неоднозначности в маркировке идентичности сайта34. В этих несколько редких случаях ETD предоставляет более надежную информацию. Следовательно, если это возможно, может быть полезно чередование обоих методов диссоциации. Поскольку DEPC может маркировать множество различных типов остатков, обычно образуются изомеры данного фрагмента пептида, которые отличаются в боковой цепи, которая модифицируется. Во многих случаях эти изомеры пептидов могут быть разделены LC, хотя они, как правило, элюют в очень похожее время. Эту вероятность следует учитывать при установке времени исключения MS/MS во время автоматизированного анализа LC-MS/MS. Как правило, следует использовать более короткое, чем обычно, время исключения.

Ограничения
В то время как DEPC CL-MS чрезвычайно полезен для изучения структуры и взаимодействий белка, и был достигнут значительный прогресс в решении широкого спектра белковых систем, некоторые ограничения этого метода остаются. Если условия маркировки недостаточно оптимизированы (например, использование слишком высокой концентрации DEPC), чрезмерная маркировка может нарвать структуру белка и привести к неточной структурной информации14,23,24. Кроме того, на точность и прецизионность измеренных уровней модификации влияет несколько факторов, включая потерю этикетки, если образцы слишком долго находятся до анализа LC-MS, и ошибки на этапах химической маркировки. Последовательность в каждом экспериментальном этапе важна для надежных результатов. Одной из наиболее сложных проблем, связанных в настоящее время с CL-MS на основе DEPC, является программное обеспечение для анализа данных. Легкодоступные программы анализа данных не оптимизированы для успешной идентификации пептидов с низким процентом модификации (например, < 1%). Следовательно, мы разработали и использовали специализированное программное обеспечение, позволяя легко идентифицировать пептиды с низкими уровнямимодификации18.

Несмотря на то, что DEPC CL-MS может обеспечить умеренное структурное разрешение белка, детальная 3D-структура не может быть получена из метода маркировки. В последнее время были разработаны некоторые инструменты структурного прогнозирования на основе данных маркировки35,36. Тем не менее, требуется больше разработок для оптимального включения результатов маркировки DEPC с вычислительным моделированием для прогнозирования структуры белка.

Значимость по сравнению с альтернативными методами
Структурное разрешение, возможное с CL-MS на основе DEPC, является умеренным по сравнению с такими методами, как рентгеновская кристаллография или ЯМР, поэтому наиболее целесообразно сравнить метод с HDX-MS, XL-MS и другими подходами CL-MS или footprinting. Как упоминалось во введении, CL-MS дополняет HDX-MS, поскольку он предоставляет информацию о боковых цепочках остатков в белке, тогда как HDX-MS сообщает о структуре и динамике магистрали. Эта взаимодополняемость позволяет использовать эти два метода вместе для получения большей структурной информации, как было показано несколькими группами37,38,39,40,41. Новой идеей, относящейся к CL-MS на основе DEPC, является синергетическая информация, которая доступна при ее использовании в сочетании с HDX-MS22. Из-за временных рамок маркировки, связанных с двумя методами, CL-MS на основе DEPC часто может прояснить неопределенность с белковыми областями, которые подвергаются снижению HDX. Снижение HDX может возникать либо из-за снижения доступности растворителя из-за связывания, либо из-за снижения динамики белка. Реакции DEPC по своей природе на 2-3 порядка медленнее, чем реакции HDX, поэтому маркировка DEPC в значительной степени не зависит от изменений в динамике белка, если они не сопровождаются изменениями доступности растворителя.

CL-MS имеет некоторые преимущества перед экспериментами HDX-MS в том, что скремблирование этикеток и потеря этикеток минимальны при принятии соответствующих мер предосторожности. В экспериментах HDX потеря этикетки или обратный обмен является стандартной особенностью техники, а быстрое пищеварение и разделение LC при низком рН являются попытками минимизировать эту проблему. Однако важно признать, что проблема обратного обмена уравновешивается более высоким количеством помеченных сайтов, которые обычно измеряются в HDX-MS. Скремблирование маркировки является более крупной проблемой в HDX-MS, потому что тогда будет получена неправильная информация, поэтому условия анализа должны быть оптимизированы, чтобы свести к минимуму эту проблему.

XL-MS и CL-MS имеют аналогичные преимущества в отношении потери меток и скремблирования, поскольку оба включают образование ковалентной связи, которая достаточно надежна, чтобы оставаться во время пищеварения и анализа LC-MS. Однако секвенирование и идентификация сшитых пептидов является более сложной задачей, чем для ковалентно меченых пептидов, что требует использования специализированного программного обеспечения. Одним из ключевых преимуществ XL-MS перед CL-MS является его способность обеспечивать ограничения расстояния, которые могут быть полезны при прогнозировании или сужении возможных белковых структур. Данные CL-MS были использованы для облегчения прогнозирования структуры белка36,42,43,но эта область требует больше работы, чтобы полностью раскрыть свой потенциал.

По сравнению с другими методами CL-MS, включая те, которые используют специфические или неспецифические реагенты маркировки, DEPC имеет некоторые преимущества и недостатки. Как и методы, в которые используются аминокислотно-специфические реагенты, маркировка DEPC проста; реагент нужно только добавить к интересующее образцу. Эта простота контрастирует с такими методами, как быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP) или HRF на основе синхротронов, которые требуют сложных источников света для производства гидроксильных радикалов. В отличие от методов, в которые используются специфические реагенты, DEPC может маркировать шесть различных аминокислот и N-концевую цепь, что позволяет ей обеспечивать более высокое структурное разрешение. Однако количество остатков, которые могут быть помечены DEPC, меньше, чем количество, которое может быть окислено гидроксильными радикалами, поэтому структурное разрешение, получаемое CL-MS на основе DEPC, ниже. Одним из практических последствий меньшего количества остатков, маркируемых DEPC, является то, что использование реагента иногда не дает всей желаемой структурной информации, и поэтому он может извлечь выгоду из использования в сочетании с другими маркировочными реагентами. Недавно мы продемонстрировали ценность использования DEPC вместе с парой реагентов 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC)/глицинэтиловый эфир (GEE), который может маркировать остатки глутамата и аспартата19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы признают поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH) в рамках гранта R01 GM075092. Масс-спектрометр Thermo Orbitrap Fusion, используемый для получения некоторых данных, описанных здесь, был приобретен на средства Гранта Национального института здравоохранения S10OD010645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Tags

Химия выпуск 172 Масс-спектрометрия ковалентная маркировка структура белка высшего порядка белково-лигандные комплексы белковые комплексы диэтилпирокарбонат доступная для растворителя площадь поверхности
Ковалентная маркировка диэтилпирокарбонатом для изучения структуры белка высшего порядка с помощью масс-спектрометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, … More

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e61983, doi:10.3791/61983 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter