Summary
De experimentele procedures voor het uitvoeren van covalente etikettering op basis van diethylpyrocarbonaat met massaspectrometrische detectie worden beschreven. Diethylpyrocarbonaat wordt eenvoudig gemengd met het eiwit- of eiwitcomplex van belang, wat leidt tot de wijziging van oplosmiddeltoegankelijke aminozuurresiduen. De gemodificeerde residuen kunnen worden geïdentificeerd na proteolytische vergisting en vloeistofchromatografie/massaspectrometrieanalyse.
Abstract
Het karakteriseren van de hogere ordestructuur van een eiwit is essentieel voor het begrijpen van de functie ervan. Massaspectrometrie (MS) is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor dit doel, vooral voor eiwitsystemen die moeilijk te bestuderen zijn met traditionele methoden. Om de structuur van een eiwit door MS te bestuderen, worden specifieke chemische reacties uitgevoerd in een oplossing die de structurele informatie van een eiwit in zijn massa codeert. Een bijzonder effectieve aanpak is het gebruik van reagentia die covalent oplosmiddel toegankelijke aminozuur zijketens wijzigen. Deze reacties leiden tot massatoestijgingen die kunnen worden gelokaliseerd met een resolutie op residuniveau in combinatie met proteolytische spijsvertering en tandemmassaspectrometrie. Hier beschrijven we de protocollen die verband houden met het gebruik van diethylpyrocarbonaat (DEPC) als een covalent labelend reagens samen met MS-detectie. DEPC is een zeer elektrofiele molecule die tot 30% van de residuen in het gemiddelde eiwit kan labelen, waardoor een uitstekende structurele resolutie wordt geboden. DEPC is met succes samen met MS gebruikt om structurele informatie te verkrijgen voor kleine single-domain eiwitten, zoals β2-microglobuline, voor grote multidomeineiwitten, zoals monoklonale antilichamen.
Introduction
Eiwitten zijn essentiële biomoleculen in vrijwel elk fysiologisch proces. De verscheidenheid aan functies die eiwitten uitvoeren, is mogelijk vanwege de structuren die ze aannemen en de interacties die ze hebben met andere biomoleculen. Om de eiwitfunctie op een dieper niveau te begrijpen, zijn biochemische en biofysische hulpmiddelen nodig om deze belangrijke structurele kenmerken en interacties op te helderen. Traditioneel hebben röntgenkristallografie, cryogene elektronenmicroscopie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie het gewenste atoomniveaudetail opgeleverd om de eiwitstructuur te onthullen. Talrijke eiwitsystemen kunnen echter niet door deze technieken worden ondervraagd vanwege slecht kristallisatiegedrag, beperkte eiwitbeschikbaarheid, overmatige monster heterogeniteit of moleculaire gewichtsbeperkingen. Bijgevolg zijn er nieuwere analysemethoden ontstaan die deze beperkingen overwinnen. Een van de opkomende technieken die eiwit structurele informatie kan leveren is massaspectrometrie.
Massaspectrometrie (MS) meet de massa-op-ladingverhouding (m/z) van een molecuul, dus eiwit hogere orde structurele informatie moet worden verkregen door de gewenste structurele informatie te coderen in de massa van het eiwit. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om deze informatie te coderen, waaronder waterstof-deuteriumuitwisseling (HDX)1,2,3,4, chemische crosslinking (XL)5,6en covalente etikettering (CL)7,8,9,10. In HDX worden backboneamidewaterstofen uitgewisseld door iets massievere deuteriums tegen snelheden die afhankelijk zijn van de toegankelijkheid van oplosmiddelen en de mate van H-binding. De omvang van HDX kan worden gelokaliseerd door het eiwit snel te verteren tot peptidefragmenten voordat deze fragmenten worden gescheiden en gemeten door de massaspectrometer of door het eiwit te scheiden in een top-down experiment. Het bepalen van de wisselkoers geeft meer inzicht in eiwitdynamiek. HDX heeft bewezen een waardevol hulpmiddel te zijn voor het karakteriseren van de eiwitstructuur, ondanks uitdagingen in verband met ruguitwisseling en de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur om de reproduceerbaarheid te maximaliseren. Bij XL-MS worden eiwitten gereageerd met bi-functionele reagentia die naast elkaar vloeiende residuzijdeketens binnen een bepaald eiwit of tussen twee eiwitten met elkaar verbinden. Daarbij kan XL-MS afstandsbeperkingen bieden die kunnen worden gebruikt om de eiwitstructuur te karakteriseren. De gebieden van het eiwit die met elkaar verbonden zijn, kunnen worden geïdentificeerd door proteolytische spijsvertering gevolgd door vloeistofchromatografie (LC)-MS-analyse. Hoewel XL-MS een veelzijdig hulpmiddel is dat is gebruikt om een verscheidenheid aan eiwitcomplexen te bestuderen, waaronder in cellen, is de identificatie van de XL-producten een uitdaging en vereist het gespecialiseerde software.
CL-MS is onlangs naar voren gekomen als een aanvullend en soms alternatief op MS gebaseerd hulpmiddel om eiwitstructuur en interacties te bestuderen. Bij CL-MS wordt een eiwit- of eiwitcomplex covalent gewijzigd met een monofunctioneel reagens dat kan reageren met aan oplosmiddel blootgestelde zijketens (figuur 1). Door de modificatieomvang van een eiwit- of eiwitcomplex onder verschillende omstandigheden te vergelijken, kunnen conformatieveranderingen, bindingsplaatsen en eiwit-eiwitinterfaces worden onthuld. Na de CL-reactie kan sitespecifieke informatie, vaak op het niveau van één aminozuur, worden verkregen met behulp van typische bottom-up proteomics-workflows waarin eiwitten proteolytisch worden verteerd, peptidefragmenten worden gescheiden door LC en gemodificeerde locaties worden geïdentificeerd met behulp van tandem-MS (MS/MS). De rijke geschiedenis van bioconjugaatchemie heeft tal van reagentia beschikbaar gemaakt voor CL-MS-experimenten. CL-reagentia vallen in twee algemene categorieën: i) specifiek en ii) niet-specifiek. Specifieke reagentia reageren met één functionele groep (bijv. vrije aminen)8,10 en zijn gemakkelijk te implementeren, maar ze hebben de neiging om beperkte structurele informatie te verstrekken. Niet-specifieke reagentia reageren met een breed scala aan zijketens, maar vereisen vaak gespecialiseerde apparatuur zoals lasers of synchrotronbronnen om deze zeer reactieve soorten te produceren. Hydroxylradicalen zijn het meest gebruikte niet-specifieke reagens, dat is toegepast in hydroxylradicalenvoetafdruk (HRF)7,11,12,13 experimenten om een breed scala aan eiwitten en eiwitcomplexen onder verschillende omstandigheden te bestuderen.
Onze onderzoeksgroep heeft met succes een ander relatief niet-specifiek reagens genaamd diethylpyrocarbonaat (DEPC) gebruikt om eiwitstructuur en interacties te bestuderen in de context van CL-MS-experimenten14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC biedt de eenvoud van specifieke etiketteerreagentia (d.w.z. er is geen gespecialiseerde apparatuur nodig om de reacties uit te voeren), terwijl het reageert met maximaal 30% van de aminozuren in het gemiddelde eiwit. Als een zeer elektrofiele reagens is DEPC in staat om te reageren met de N-terminus en de nucleofiele zijketens van cysteïne, histidine, lysine, tyrosine, serine en threonineresiduen. Meestal wordt een enkel product van deze reacties gegenereerd, wat resulteert in een massatoename van 72,02 Da. Dit ene type product staat in contrast met de tot 55 verschillende producten die kunnen worden geproduceerd wanneer eiwitten reageren met hydroxylradicalen7. Een dergelijke eenvoudige chemie vergemakkelijkt de identificatie van gelabelde sites.
Hier bieden we protocollen voor het gebruik van OP DEPC gebaseerde CL-MS om eiwitstructuur en interacties te bestuderen. Details in verband met reagensbereiding, DEPC-eiwitreacties, eiwitverteringsomstandigheden, LC-MS- en MS/MS-parameters en gegevensanalyse worden beschreven. We tonen ook het nut van DEPC-etikettering aan door voorbeeldresultaten te geven van eiwit-metaal-, eiwit-ligand- en eiwit-eiwitinteracties, evenals eiwitten die structurele veranderingen ondergaan bij verhitting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Eiwit- en reagensbereiding
OPMERKING: Dit protocol bevat een voorbeeldworkflow voor het labelen van een eiwit met DEPC. Sommige vermelde aandoeningen en reagensconcentraties kunnen variëren op basis van het eiwit van keuze.
- Bereid alle reagensoplossingen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
- Bereid een eiwitoplossing van de gewenste concentratie, meestal in het bereik van tientallen μM, in een 10 mM 3-(N-morpholino)propaansulfonzuur (MOPS) buffer bij pH 7,4. U kunt ook een bestaande eiwitoplossing voor bufferuitwisseling bereiden in een pH van 10 mM 7,4 MOPS als het monster een nucleofiele buffer bevat die reactief zou zijn met DEPC. Andere buffers (bijv. fosfaatgebufferde zoutoplossing) kunnen ook worden gebruikt, zolang ze geen nucleofiele functionele groepen hebben.
- Bereid een 100 mM DEPC-oplossing in droog acetonitril (ACN) door 1,45 μL van de standaard 6,9 M DEPC-oplossing in 98,55 μL van de ACN te gieten.
OPMERKING: Er is niet één set concentraties die met elk eiwit zal werken, hoewel de optimale concentraties kunnen worden geschat op basis van het aantal Zijne en Lys-residuen23. Reageer bijvoorbeeld met 50 μL van een 50 μM β2-microglobulineoplossing het eiwit met 0,2 μL van de 100 mM DEPC voor een uiteindelijke DEPC-concentratie van 200 μM (gelijk aan 4x de eiwitconcentratie) om de gewenste molaire verhouding te garanderen met behulp van dit algemene voorbeeld (Tabel 1). DEPC-etikettering is een2e orde reactie, dus het veranderen van de concentratie van eiwitten of DEPC in het reactiemengsel zal de etiketteringssnelheid veranderen. - Bereid 1 M imidazoloplossing door 10 mg imidazol te wegen en op te lossen in 146,9 μL HPLC-water.
2. Covalente etikettering van intact eiwit
- Stel de temperatuur van het waterbad in op 37 °C en wacht tot het bad een stabiele temperatuur heeft bereikt.
OPMERKING: Reagensconcentraties en -volumes voor een voorbeeldetiketteringsprotocol zijn te vinden in tabel 1. - Meng mopsbuffer en eiwitoplossing in een nieuwe microcentrifugebuis in de in tabel 1vermelde volumes .
- Voeg aan het eiwit en de buffer 0,2 μL van de DEPC-oplossing toe, zorg ervoor dat u de resulterende oplossing goed mengt en plaats vervolgens de buis met het reactiemengsel gedurende 1 minuut in het waterbad van 37 °C.
OPMERKING: Het toegevoegde volume ACN mag niet groter zijn dan 1% van het totale reactievolume om verstoring van de structuur van het eiwit tijdens de etiketteringsreactie te voorkomen. De reactietijd is aan de gebruiker, hoewel een reactie van 1 minuut onder de voorbeeldomstandigheden overlabeling en de potentiële hydrolyse van DEPC14minimaliseert. - Verwijder na 1 minuut de buis met het reactiemengsel uit het waterbad en doof de reactie met 1 μL van de 1 M imidazoloplossing om de resterende niet-geactiveerde DEPC op te ruimen.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie imidazol in het reactiemengsel moet gelijk zijn aan 50x de concentratie DEPC in het reactiemengsel. Dit zorgt ervoor dat de resterende niet-gerealiseerde DEPC wordt opgegraven.
3. Bereiding van eiwitvertering voor bottom-up LC-MS
OPMERKING: Kies spijsverteringsomstandigheden die vatbaar zijn voor het eiwit van belang. Veel voorkomende stappen zijn het ontvouwen van het eiwit en het verminderen en alkyleren van eventuele disulfidebindingen.
- Vouw het eiwit uit door een geschikt uitvouwreagens aan het reactiemengsel toe te voegen.
OPMERKING: Veel voorkomende ontvouwingsmiddelen zijn ACN, ureum en guanidinehydrochloride (GuHCl). - Bereid oplossingen van Tris(2-carboxyethyl)fosfine (TCEP) en iodoacetamide (IAM) voor door elk 5 mg te wegen en op te lossen in nieuwe microcentrifugebuizen in respectievelijk 174,4 en 270,3 μL van 10 mM pH 7,4 MOPS-buffer voor de reductie- en alkyleringsstappen.
- Verminder disulfidebindingen door 2 μL van de 100 mM TCEP (eindconcentratie van 2 mM in reactiemengsel) oplossing aan het reactiemengsel toe te voegen en gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur te reageren.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie TCEP moet gelijk zijn aan 40x de eiwitconcentratie per disulfidebinding die in de oplossing aanwezig is. - Alkylaat verminderde cysteïnes met 4 μL van de 100 mM IAM-oplossing (eindconcentratie van 4 mM in reactiemengsel) gedurende 30 minuten in het donker. IAM is lichtgevoelig en zal ontleden onder direct licht.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie IAM in oplossing moet tweemaal de concentratie zijn die voor TCEP wordt gebruikt, of 80x de eiwitconcentratie per disulfidebinding. - Verteer het eiwit met een geschikt enzym zoals trypsine of chymotrypsine. Een 10:1 eiwit:enzymverhouding voor een 3-uurs spijsvertering bij 37 °C met geïmmobiliseerd enzym bij een schudsnelheid van 300 slagen/min is meestal voldoende voor DEPC-gelabelde eiwitten. Zie Discussie.
- Scheid na de spijsvertering het geïmmobiliseerde enzym van de verteerde peptiden door centrifugeren bij 12.000 tpm gedurende 5 minuten.
- Analyseer het monster onmiddellijk met LC-MS/MS of flash-freeze het monster met vloeibare stikstof om monsterdegradatie en labelverlies te minimaliseren. Bewaar de flash-frozen monsters bij < -20 °C tot ze klaar zijn voor LC-MS/MS analyse.
4. LC-MS/MS-analyse
OPMERKING: Standaard LC-MS/MS-parameters voor bottom-up proteomica kunnen worden gebruikt om gelabelde locaties op de proteolytische peptidefragmenten te identificeren. Een algemeen voorbeeld wordt hieronder beschreven.
- Scheid de DEPC-gelabelde peptiden met behulp van een omgekeerde fase C18 stationaire fase. Gebruik een typische LC mobiele fase van twee oplosmiddelen: (A) water + 0,1% mierenzuur en (B) ACN + 0,1% mierenzuur met behulp van een gradiënt (bijv. figuur 2) om de beste scheiding van peptiden te bereiken.
OPMERKING: De scheidingstijd kan worden geoptimaliseerd op basis van de complexiteit van het monster en het mobiele fasedebiet is afhankelijk van het gebruik van capillaire of nano LC. - Gebruik een massaspectrometer die in staat is om online LC-MS en MS/MS te doen om DEPC-modificatielocaties op het peptide te identificeren. In onze experimenten hebben we met succes verschillende soorten massaspectrometers gebruikt. Elke massaspectrometer die in staat is om automatisch MS/MS van veel peptiden uit te voeren tijdens een LC-MS-analyse, moet geschikt zijn. Relevante MS-parameters zijn: ESI-bronspanning = -4000 V voor reguliere ESI; -2000 V voor nanospray; Orbitrap resolutie = 60.000; Dynamische uitsluitingsduur = 30 s; MS/MS-activeringstype: CID, ETD of beide; Massascanbereik = 200-2.000; Automatische gain control = 4.0E5 (MS1 in Orbitrap) en 5.0E4 (MS2 in lineaire quadrupole ionenvanger).
- Laad en injecteer het verteerd, gelabeld eiwitmonster in het LC-systeem en start de LC-MS/MS-acquisitie. Als het monster is bevroren, ontdooi dan vóór de analyse. Leid het LC-effluent de eerste 5 minuten om naar afval om te voorkomen dat overmatige zouten in de ESI-bron komen.
OPMERKING: Over het algemeen wordt een injectielus van 5 μL gebruikt, waardoor ongeveer 2,5 μg eiwit op de LC-MS/MS kan worden toegediend. Dit is afhankelijk van de belastingsomstandigheden van de LC om de monsterinjector niet te verstoppen.
5. Gegevensanalyse
- Identificeer DEPC-labellocaties en kwantificeer peptidepiekgebieden met behulp van geschikte software voor de massaspectrometer die wordt gebruikt.
- Neem DEPC-toevoeging (72,02 Da) en carbamidomethylatie (57,02 Da) op als variabele wijzigingen. Aanvullende zoekparameters voor de MS/MS-analyse zijn als volgt: Maximale gemiste kloven = 3; Fragmentionen = b en y; Precursor m/z tolerantie = 10 ppm (deze waarde moet hoger zijn als een quadrupole ion trap mass spectrometer wordt gebruikt); Fragment m/z tolerantie = 0,5 Da (deze waarde moet lager zijn als een massaspectrometer met hoge resolutie wordt gebruikt voor een productsonscan); Voorloperlading = 1-4.
OPMERKING: Verschillende databasezoekalgoritmen hebben verschillende scoresystemen en velen kunnen moeite hebben met het identificeren van DEPC-gemodificeerde peptiden omdat wijzigingsniveaus laag kunnen zijn. Het aanpassen van de score cutoff kan nodig zijn om meer gelabelde peptiden te identificeren. Als dat het vraag is, moet handmatige ondervraging van de MS/MS-gegevens worden gebruikt om laag scorende peptiden te verifiëren. Het product van de hydrolyse van het DEPC-label is niet opgenomen in het zoeken naar gegevens omdat de gehydrolyseerde DEPC niet langer reageert op nucleofiele zijketens. - Modificatiepercentages op residuniveau bepalen met behulp van de chromatografische piekgebieden van de gewijzigde en ongewijzigde versies van de peptiden.
OPMERKING: Elk peptide dat het gewijzigde residu van belang bevat, moet in aanmerking worden genomen en alle ladingstoestanden die zijn opgenomen, moeten in alle gemeten monsters aanwezig zijn. Peptiden met verschillende ionisatie-efficiëntie en eluting op verschillende tijdstippen zorgt ervoor dat deze waarde een relatieve in plaats van absolute maat is voor de wijziging van een specifieke locatie.
waarbij Ai,z het piekgebied vertegenwoordigt van een bepaald peptide (i) dat het residu van belang bevat en rekening houdt met alle gedetecteerde ladingstoestanden (z). - Bepaal of een etiketteringswijziging tussen een controle- en experimenteel monster significant is met behulp van statistische evaluatie. Drie repliceermetingen voor elk monster zijn typisch en t-tests worden meestal gebruikt met betrouwbaarheidsintervallen van 95 of 99%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identificeren van DEPC modificatiesites en wijzigingspercentages
Massatoevoeging als gevolg van covalente etikettering kan worden gemeten op de a) intacte eiwit - en b) peptideniveaus8,9. Op intact niveau kan een verdeling van eiwitsoorten met verschillende aantallen etiketten worden verkregen uit directe analyse of LC-MS van gelabelde eiwitmonsters. Om structurele informatie met een hogere resolutie te verkrijgen (d.w.z. sitespecifieke etiketteringsgegevens), moeten metingen worden uitgevoerd op peptideniveau. Na de etiketterings- en blusstappen worden de gelabelde eiwitten onderworpen aan bottom-up proteomische analyse (d.w.z. disulfidereductie, alkylering, proteolytische spijsvertering en LC-MS/MS). Figuur 3 laat zien hoe de met DEPC gelabelde locaties worden geïdentificeerd en hun modificatieniveaus worden berekend voor een DEPC CL-MS-experiment op het eiwit β-2-microglobuline (β2m)21. MS/MS wordt gebruikt om de gelabelde peptiden te sequencen en hun DEPC-gelabelde locaties te lokaliseren, terwijl wijzigingspercentages worden berekend op basis van hun relatieve piekgebieden in geëxtraheerde ionenchromatogrammen (zie figuur 3A).
Eiwitoppervlak in kaart brengen met DEPC CL-MS
Vanwege de relatie tussen eiwittopologie en etiketteringssnelheid is DEPC gebruikt om veranderingen in de eiwitstructuur van hogere orde (HOS) te bestuderen en eiwitinteractieplaatsen8,9te identificeren . Een voorbeeld is het effect van Cu(II) binding op de structuur van β2m. DEPC modificatiesnelheidscoëfficiënten van peptidefragmenten van niet-gebonden β2m en Cu(II)-gebonden β2m (b2m-Cu) kunnen worden gemeten (Tabel 2) door de DEPC-concentraties te variëren en kinetische plots van de tweede orde14,24te genereren . De DEPC-reactiviteit van residuen in β2m-Cu onthult significante veranderingen in de etiketteringssnelheid voor His31, Ser33 en Thr4, terwijl andere locaties, waaronder verschillende Zijn residuen, statistisch onveranderd zijn. Deze gegevens komen overeen met het feit dat Zijn31, maar niet andere Zijn residuen in β2m, Cu bindt die structurele veranderingen veroorzaakt in de buurt van His31 (d.w.z. Ser33) en in de buurt van het N-eindpunt (d.w.z. Thr4) (Figuur 4)14,26,27.
DEPC CL-MS voor het identificeren van wijzigingen in HOS
DEPC-etikettering met MS-detectie is ook een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van HOS-veranderingen in eiwitten, wat belangrijke implicaties heeft voor eiwittherapeutische geneesmiddelen, die momenteel het snelst groeiende segment van de farmaceutische markt zijn28. DEPC CL kan specifieke eiwitgebieden identificeren die structurele veranderingen ondergaan bij thermische en oxidatieve stress18. Nadat β2m is blootgesteld aan hittestress, zijn veel residuen die een significante afname van de etiketteringsomvang ondergaan (N-eindpunt, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58) geclusterd aan één kant van het eiwit, wat suggereert dat dit gebied van het eiwit een conformatieverandering ondergaat of mogelijk aggregatie bemiddelt (figuur 5A). Naast deze residuen vormen andere residuen met een afname van de etikettering (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) een cluster op een ander gezicht van het eiwit, wat aangeeft dat de door oxidatie veroorzaakte conformatieveranderingen elders optreden (Figuur 5B). Ander werk van onze groep heeft ook aangetoond dat DEPC CL-MS plaatsen van conformationele veranderingen in hittestress monoklonale antilichaamtherapieën kan detecteren en identificeren20.
DEPC CL-MS om eiwit-eiwit interacties te bestuderen
Inzicht in eiwit-eiwit interactie sites en aggregatie interfaces voor amyloïde-vormende eiwitten kan worden verkregen met behulp van DEPC etikettering ook9. Dalingen van de modificatieniveaus van residuen bij oligomeervorming kunnen de bindende interfaces onthullen. DEPC CL-MS werd gebruikt om de pre-amyloïde oligomeren van β2m te karakteriseren, het eiwit dat amyloïden vormt in dialysegerelateerde amyloïdose29, na het initiëren van amyloïdevorming met Cu(II)15,16,26. Als we de DEPC-reactiviteit van het β2m-monomeer vergelijken met het pre-amyloïde β2m-dimer dat 2 uur na toevoeging van Cu(II) wordt gevormd, blijkt dat negen residuen een afname van de etikettering ondergaan, terwijl zes residuen geen verandering of lichte toename van de etikettering ondergaan (figuur 6A). Bij het in kaart brengen van deze veranderingen op de β2m is het onmiddellijk duidelijk dat de dimerinterface betrekking heeft op de ABED-β-sheets van β2m monomeren (Figuur 6B)15.
DEPC CL-MS om eiwit-ligandbinding te bestuderen
Ligandbinding aan eiwitten leidt tot een afname van de oplosmiddeltoegankelijkheid van residuen die interageren met het ligand, en CL-MS op basis van DEPC kan worden gebruikt om ligandbindende plaatsen op eiwitten te identificeren. De bindingsplaatsen van epigallocatechin-3-gallaat (EGCG) op β2m onder amyloïdevormende omstandigheden kunnen bijvoorbeeld worden geïdentificeerd door significante afnames van DEPC-etikettering bij de residuen begraven door EGCG-binding. In aanwezigheid van ECGC hebben Lys6 en Lys91 lagere DEPC-modificatiepercentages (figuur 7), en deze residuen zijn geclusterd in één gebied van het eiwit, wat wijst op residubescherming als gevolg van ligandbinding. Het N-eindpunt, Thr4 en His31 ondergaan ondertussen een toename van de etiketteringsomvang (figuur 7), die wijzen op door ECGC veroorzaakte structurele veranderingen en suggereren dat de Cu(II) bindingsplaatsen op β2m (N-eindpunt en His31)14,30,31 kunnen worden verstoord als gevolg van ECGC-binding32. Bovendien zijn de bindingsplaatsen van de andere twee kleine molecuulremmers van β2m amyloïdevorming, rifamycine SV en doxycycline, geïdentificeerd met behulp van CL-MS19. In deze studie waren de resultaten van DEPC-etikettering alleen echter niet voldoende om de bindingslocaties met voldoende structurele resolutie in kaart te brengen. Resultaten van drie verschillende CL-reagentia, namelijk DEPC, BD en 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide - glycine ethylester (EDC/GEE) paar waren nodig om de bindingsplaatsen beter te lokaliseren19.
Verbetering van de structurele resolutie en vermindering van label scrambling
Hoewel DEPC-etikettering de vorming van een covalente binding veroorzaakt, kan labelverlies als gevolg van hydrolyse optreden, vooral voor Ser-, Thr- en Tyr-residuen (figuur 8). Labelverlies kan worden geminimaliseerd door de tijd tussen DEPC CL-reactie en LC-MS-analyse te verkorten met behulp van korte proteolytische spijsverteringen (bijv. 2 uur spijsvertering met geïmmobiliseerde enzymen) in plaats van nachtelijke spijsverteringen. Snelle spijsvertering resulteert in meer gemodificeerde residuen die worden gemeten, waardoor de hoeveelheid eiwit structurele informatie toeneemt. Een 2 uur durende spijsvertering met geïmmobiliseerd chymotrypsine leidt bijvoorbeeld consequent tot de identificatie van meer door de DEPC gemodificeerde residuen in β2m (figuur 9)17. Bij een nachtelijke spijsvertering wordt ongeveer 75% van de Ser-, Thr-, Tyr-, His- en Lys-residuen in β2m gedetecteerd, maar wanneer de tijd tussen etikettering en LC-MS wordt verminderd met behulp van een 2 uur spijsvertering, wordt 95% van deze residuen in β2m gedetecteerd. De meeste nieuw ontdekte gemodificeerde residuen zijn Tyr en Thr residuen die gevoelig zijn voor hydrolyse.
In de loop van ons werk met DEPC hebben we gemerkt dat in sommige eiwitten Cys-residuen die afkomstig zijn van disulfidebindingen worden gewijzigd door DEPC, hoewel de disulfidebindingen intact zijn tijdens de DEPC-etiketteringsreacties. Een dergelijke etikettering van Cys-residuen vindt plaats omdat vrije thiolen kunnen reageren met andere gemodificeerde residuen in oplossing (figuur 10), wat leidt tot zogenaamde "label scrambling" omdat de carbethoxy-groep wordt overgebracht naar het Cys-residu. Label scrambling verlaagt de modificatieniveaus bij andere residuen en geeft onjuiste eiwitstructuurinformatie. Om te voorkomen dat het etiket klautert, moeten de vrije Cys thiolen direct na disulfidereductie volledig worden gealkaldeerd33.
Figuur 1: Covalente labeling-mass spectrometrie (CL-MS). Een monofunctioneel reagens wordt gebruikt om oplosmiddeltoegankelijke aminozuren te wijzigen en kan worden gebruikt om sitespecifieke informatie te verstrekken over conformationele veranderingen of interactie-interfaces in eiwitten (bovenste versus onderste afbeelding). Het gemodificeerde eiwit wordt proteolytisch verteerd en de resulterende peptiden worden geanalyseerd door middel van vloeistofchromatografie (LC) in combinatie met MS en tandem MS (MS/MS). Figuur is aangepast van Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spectrometrie voor het bestuderen van eiwitstructuur en interacties. Methoden 144, 79-93 (2018). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Gebruikt volume (μL) | Concentratie in oplossing (μM) | |
| Eiwit (100 μM, MOPS) | 50 | 50 |
| MOPS (10 mM, pH 7,4) | 48.8 | n.v.t |
| DEPC (100 mM) | 0.2 | 200 (=4x[eiwit]) |
| Imidazol (1 M) | 1 | 10.000 (=50x[DEPC]) |
| Totaal volume | 100 |
Tabel 1. Algemeen DEPC-labelingprotocol.
Figuur 2. Voorbeeld LC-gradiënt voor scheiding van peptiden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Illustratie van hoe DEPC gelabelde sites worden geïdentificeerd en hun wijzigingsniveaus worden berekend. Na DEPC-etikettering en proteolytische vertering wordt (A) LC-MS-analyse van het verteerd eiwit uitgevoerd. Piekgebieden van (B) niet-gelabelde en (C) gelabelde peptiden in een chromatogram worden gebruikt om het labelpercentage te berekenen. Tijdens LC-MS worden peptiden onderworpen aan CID MS/MS. Tandemmassaspectra van (D) niet-gelabelde en (E) & (F) gelabelde peptiden verkregen op specifieke bewaartijden worden gebruikt voor peptide sequencing en identificatie van DEPC gelabelde sites. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| residu | b2m | b2m-Cu |
| Thr4 | 0.082 ± 0.004 | 0.052 ± 0.009 |
| Zijn13 | 0.041 ± 0.003 | 0.033 ± 0.005 |
| Zijn31 | 0.010 ± 0.001 | 0,003 ± 0,001 |
| Ser33 | 0.010 ± 0.002 | 0,004 ± 0,001 |
| Zijn51 | 0.036 ± 0.003 | 0.030 ± 0.004 |
| Ser88 | 0.029 ± 0.007 | 0.020 ± 0.006 |
Tabel 2 Locatiespecifieke DEPC-wijzigingscoëfficiënten (k, M-1s-1) voor b2m bij afwezigheid en aanwezigheid van Cu(II).
Figuur 4 De DEPC CL-MS gebruiken om het effect te bepalen van Cu(II) binding op de structuur van β2m: (A) Eiwitoppervlak mapping van de residuen met significante dalingen van de DEPC-etiketteringssnelheden (blauw), wat wijst op veranderingen in hun oplosmiddeltoegankelijkheid bij Cu(II) binding, en die zonder significante veranderingen in etiketteringssnelheid (magenta) (PDB-toetredingscode 1JNJ). (B) Voorbeeld van plaatsspecifieke kinetische plots van de tweede orde van de reactie van β2m met verschillende concentraties DEPC in aanwezigheid en afwezigheid van Cu(II). De labeling rate coefficient (k) kan worden verkregen uit de helling van de kinetische plot. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Covalente etiketteringsresultaten voor gestreste vs. inheemse β2m: (A) Hittestress - verwarming bij 75 °C gedurende 24 uur en (B) oxidatieve stress - met 3% H2O2 gedurende 24 uur. Significante veranderingen in wijzigingspercentages worden weergegeven in blauw (afname van etikettering) en rood (toename van etikettering), terwijl residuen zonder significante etiketteringsveranderingen in lichtgroen worden weergegeven (PDB-toetredingscode 1JNJ). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6 De DEPC CL-MS gebruiken om de dimer-interface voor de pre-amyloïde dimer van β2m te bepalen: (A) Samenvatting van de wijzigingen in het DEPC-wijzigingsniveau voor gemodificeerde residuen in het monomeer (d.w.z. t = 0) en dimer 2 uur na toevoeging van Cu(II). Residuen met een significante afname van de etiketteringsomvang worden aangeduid met een asterisk (*). B) Covalente etiketteringsresultaten in kaart gebracht op de β2m-structuur. Residuen met verlaagde etikettering worden blauw weergegeven en residuen zonder wijzigingen of lichte verhogingen van de etikettering worden in rood weergegeven (PDB-toetredingscode 1LDS). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7 Covalente etiketteringsresultaten voor EGCG-gebonden versus ongebonden b2m. De DEPC-wijzigingspercentages worden weergegeven voor de weergegeven residuen. Statistisch significante verschillen in het covalente etiketteringspercentage worden aangeduid met een asterisk (*). Verhogingen in etikettering bij ECGC-binding worden in rood weergegeven, terwijl dalingen in blauw worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8 DEPC covalente etiketteerreacties (nucleofiele acylsubstitutie) en labelverlies (hydrolyse van carbethoxyleerde residuen) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9 In kaart brengen van de gemeten modificatieplaatsen op β2m. (A) Gelabelde plaatsen na conventionele nachtelijke spijsvertering, en (B) gelabelde plaatsen na een 2 uur spijsvertering met geïmmobiliseerde chymotrypsine. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10 Verondersteld mechanisme van DEPC label scrambling (Cys capture of carbethoxylated His) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen
Er moeten verschillende punten met betrekking tot het experimentele ontwerp worden overwogen om betrouwbare etiketteringsresultaten te garanderen. Ten eerste, om eiwitetikettering te maximaliseren, is het noodzakelijk om buffers met sterk nucleofiele groepen (bijv. Tris) te vermijden, omdat ze kunnen reageren met DEPC en de mate van etikettering kunnen verlagen. Het is ook denkbaar dat dergelijke buffers kunnen reageren met gelabelde residuen, waardoor het etiket wordt verwijderd en dus structurele informatie verloren gaat. We raden MOPS aan als buffer, maar fosfaat gebufferde zoutoplossing werkt ook. Ten tweede moet dithiothreitol worden vermeden voor het verminderen van disulfidebindingen, omdat de vrije thiolen in dit reagens kunnen reageren met gelabelde residuen en de DEPC-wijziging kunnen verwijderen. Dezelfde chemie is de reden waarom het essentieel is om verminderde disulfiden te alkyleren, omdat vrije Cys intra-eiwitetiket scrambling kunnen veroorzaken33. Ten derde is de blusstap met imidazol (protocolstap 2.4) van cruciaal belang voor het stoppen van de etiketteringsreactie, zodat de resterende DEPC niet kan blijven reageren met het eiwit.
Het is ook belangrijk om te begrijpen dat de DEPC-etiketteringsreactie 2e-orde is, wat betekent dat het veranderen van de eiwit- of DEPC-concentratie de mate van etikettering zal beïnvloeden. We hebben empirisch vastgesteld dat een 4:1 DEPC:eiwitconcentratieverhouding een redelijke waarde is wanneer het eiwit een concentratie heeft in de 10's van μM-bereik, omdat het de neiging heeft om door etikettering veroorzaakte structurele veranderingen te vermijden14. De optimale DEPC:eiwitconcentratieverhouding is echter zowel eiwitafhankelijk als concentratieafhankelijk, en sommige eiwitten hebben hogere verhoudingen nodig om voldoende etikettering te bereiken. De optimale DEPC-concentratie om de structurele verstoring van het etiketteren van een bepaald eiwit te minimaliseren, kan worden geschat op basis van het aantal oplosmiddelen dat zijn en Delys-residuen toegankelijk maakt23.
Om variabiliteit in etiketteringsbereiken als gevolg van reagensdegradatie in de loop van de tijd te voorkomen, moeten de controle- en experimentele reacties idealiter op dezelfde dag worden uitgevoerd. DEPC ondergaat snelle hydrolyse bij blootstelling aan water en zal ook tijdens de opslag afbreken, dus goede laboratoriumpraktijken en behandeling met reagentia zijn essentieel. Wanneer de DEPC-voorraadfles niet in gebruik is, moet deze in een desiccator worden bewaard.
Wijzigingen en probleemoplossing
Omdat DEPC CL een kinetisch gecontroleerde reactie is, worden de etiketteringssnelheid, en dus het wijzigingsniveau, gecontroleerd door eiwit- en reagensconcentraties, etiketteringstijd en temperatuur. Zoals hierboven aangegeven, wordt DEPC CL vaak gedurende 1 minuut uitgevoerd bij 37 °C met een DEPC-eiwitkiezenverhouding van 4 tot 1. Bij deze molaire verhouding (4x) kunnen eiwitten veilig worden geëtiketteerd zonder structurele verstoringen14. DEPC: eiwitkiezenverhoudingen die groter zijn dan 4 kunnen voor sommige eiwitten worden gebruikt, en niet verrassend hogere DEPC-concentraties resulteren in uitgebreidere etikettering en meer structurele informatie. De veiligste manier om hogere DEPC-concentraties te gebruiken zonder de structuur te storen , is het genereren van dosisresponspercelen waarin de reactiviteit van de proteolytische fragmenten van een eiwit wordt gemeten als functie van de DEPC-concentratie (zie figuur 4B)14,24. Deze aanpak kan echter tijdrovend zijn, omdat het meerdere metingen vereist. Onlangs hebben we aangetoond dat de optimale DEPC-concentratie kan worden geschat voor een bepaald eiwit uit het aantal en SASA van zijn en Leie residuen in dat eiwit23. In recent werk hebben we ook alternatieve manieren voorgesteld om te beoordelen of de structuur van een eiwit niet verstoord is tijdens CL9,24.
Proteolytische spijsvertering is ook een belangrijke stap in DEPC CL-MS, omdat de peptiden die worden gegenereerd, het mogelijk maken om structurele informatie te lokaliseren na LC-MS / MS-analyse. Over het algemeen zijn serine proteasen zoals trypsine en chymotrypsine effectief voor de eiwitvertering. Trypsine wordt vaker gebruikt vanwege de decolleté-efficiëntie en specificiteit aan de C-terminale kant van Lys- en Arg-residuen. Trypsine splijt echter meestal niet na DEPC-gelabelde Lys-residuen, waardoor een gemist decolleté ontstaat bij gelabelde Lys-residuen die soms de gegevensanalyse kunnen bemoeilijken. De activiteit van chymotrypsine, die zich splitst na omvangrijke hydrofobe residuen, wordt meestal niet beïnvloed door DEPC-etikettering, maar dit enzym heeft een lagere decolleté-efficiëntie en specificiteit dan trypsine. Bovendien kan chymotrypsine voor eiwitten met talrijke hydrofobe residuen verschillende korte peptidefragmenten genereren die moeilijk los kunnen zijn en detecteren onder standaard LC-MS-omstandigheden.
LC-ESI-MS/MS analyses van eiwitverteringen vereisen een stabiele elektrospray om betrouwbare semiquantitatieve resultaten te verkrijgen. Capillaire en nano LC zijn veelgebruikte scheidingsplatforms waar efficiënte scheiding kan worden verkregen met kleine hoeveelheden eiwitten. Onze ervaring is echter dat capillaire LC betrouwbaardere kwantitatieve informatie (d.w.z. modificatieniveaus) biedt dan nano-LC vanwege de hogere monsterhoeveelheden die worden gebruikt. Voor grote eiwitten die worden verteerd in een groot aantal gelabelde en niet-gelabelde peptiden, kan coelutie van peptiden met vergelijkbare hydrofobiciteit optreden. In deze gevallen moeten langere LC-gradiënten worden gebruikt voor betere scheidingen.
Snelle en efficiënte MS/MS is belangrijk voor een goede sequentiedekking en identificatie van de labelsite. Massaspectrometers met viervoudige ionenvallen zijn hiervoor uitstekende instrumenten. Over het algemeen is CID een veel voorkomende en zeer effectieve methode voor peptidedissociatie; we hebben echter gevallen waargenomen van DEPC-label scrambling tijdens CID van gelabelde peptideionen, wat resulteert in ambiguïteit bij het labelen van site-identiteit34. In deze enigszins zeldzame gevallen biedt ETD informatie die betrouwbaarder is. Daarom kan, indien mogelijk, het afwisselen tussen beide dissociatietechnieken nuttig zijn. Omdat DEPC veel verschillende residutypen kan labelen, is het gebruikelijk dat isomeren van een bepaald peptidefragment worden gegenereerd die verschillen in de zijketen die wordt gewijzigd. Vaak kunnen deze peptide-isomeren worden gescheiden door LC, hoewel ze de neiging hebben om op zeer vergelijkbare tijden te elute. Met deze waarschijnlijkheid moet rekening worden gehouden bij het instellen van uitsluitingstijden van MS/MS tijdens geautomatiseerde LC-MS/MS-analyses. Meestal moeten kortere dan gebruikelijke uitsluitingstijden worden gebruikt.
Beperkingen
Hoewel DEPC CL-MS enorm gunstig is voor het bestuderen van eiwitstructuur en interacties, en er aanzienlijke vooruitgang is geboekt om een breed scala aan eiwitsystemen aan te pakken, blijven er enkele beperkingen van deze techniek bestaan. Als de etiketteringsomstandigheden niet goed zijn geoptimaliseerd (bijv. door een te hoge DEPC-concentratie te gebruiken), kan overetikettering de eiwitstructuur aanstieren en resulteren in onjuiste structurele informatie14,23,24. Bovendien wordt de nauwkeurigheid en nauwkeurigheid van de gemeten modificatieniveaus beïnvloed door verschillende factoren, waaronder labelverlies als monsters te lang zitten vóór LC-MS-analyse en fouten in de chemische etiketteringsstappen. Consistentie in elke experimentele stap is belangrijk voor betrouwbare resultaten. Een van de meer uitdagende problemen die momenteel verband houden met OP DEPC gebaseerde CL-MS is software voor gegevensanalyse. Direct beschikbare data-analyseprogramma's zijn niet geoptimaliseerd om peptiden met lage modificatiepercentages met succes te identificeren (bijv. < 1%). Bijgevolg hebben we gespecialiseerde software ontwikkeld en gebruikt om peptiden met lage modificatieniveaus gemakkelijk te identificeren18.
Hoewel DEPC CL-MS een matige eiwitstructuurresolutie kan bieden, kan een gedetailleerde 3D-structuur niet worden verkregen uit de etiketteringstechniek. Onlangs zijn enkele structurele voorspellingsinstrumenten op basis van labelgegevens ontwikkeld35,36. Er zijn echter meer ontwikkelingen nodig om DEPC-etiketteringsresultaten optimaal op te nemen met computationele modellering om de eiwitstructuur te voorspellen.
Betekenis in vergelijking met alternatieve methoden
De structurele resolutie die mogelijk is met OP DEPC gebaseerde CL-MS is matig in vergelijking met technieken zoals röntgenkristallografie of NMR, dus het is het meest geschikt om de techniek te vergelijken met HDX-MS, XL-MS en andere CL-MS, of footprinting, benaderingen. Zoals in de inleiding werd vermeld, is CL-MS complementair aan HDX-MS omdat het informatie biedt over de zijketens van residuen in een eiwit, terwijl HDX-MS rapporteert over de structuur en dynamiek van de ruggengraat. Deze complementariteit maakt het mogelijk de twee technieken samen te gebruiken om meer structurele informatie te verkrijgen , zoals is aangetoond door verschillende groepen37,38,39,40,41. Een op DEPC gebaseerd idee dat relevant is voor CL-MS op basis van DEPC is de synergetische informatie die beschikbaar is wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met HDX-MS22. Vanwege de etiketteringstermijnen die aan de twee technieken zijn gekoppeld, kan CL-MS op basis van DEPC vaak ambiguïteit verduidelijken met eiwitgebieden die een verminderde HDX ondergaan. Verminderde HDX kan het gevolg zijn van verminderde oplosmiddeltoegankelijkheid als gevolg van binding of verminderde eiwitdynamiek. DEPC-reacties zijn inherent 2-3 ordes van grootte langzamer dan HDX-reacties, dus DEPC-etikettering wordt grotendeels niet beïnvloed door veranderingen in eiwitdynamiek zolang ze niet gepaard gaan met veranderingen in de toegankelijkheid van oplosmiddelen.
CL-MS heeft enkele voordelen ten opzichte van HDX-MS-experimenten in die tijd dat het klauteren van etiketten en het verlies van etiketten minimaal zijn wanneer de juiste voorzorgsmaatregelen worden genomen. In HDX-experimenten is labelverlies of terugruil een standaardkenmerk van de techniek, en snelle spijsverteringen en LC-scheidingen bij een lage pH zijn pogingen om dit probleem te minimaliseren. Het is echter belangrijk om te erkennen dat het probleem met de uitwisseling aan de achterkant wordt gecompenseerd door het hogere aantal gelabelde sites dat meestal wordt gemeten in HDX-MS. Het labelen van scrambling is een groter probleem in HDX-MS omdat er dan onjuiste informatie zou worden verkregen, dus de analyseomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd om deze bezorgdheid te minimaliseren.
XL-MS en CL-MS hebben vergelijkbare voordelen met betrekking tot labelverlies en scrambling, omdat beide betrekking hebben op de vorming van een covalente binding die robuust genoeg is om te blijven tijdens de spijsvertering en LC-MS-analyses. Sequencing en identificatie van cross-linked peptiden is echter uitdagender dan voor covalent gelabelde peptiden, waarvoor het gebruik van gespecialiseerde software vereist is. Een belangrijk voordeel dat XL-MS heeft ten opzichte van CL-MS is het vermogen om afstandsbeperkingen te bieden, wat waardevol kan zijn bij het voorspellen of beperken van mogelijke eiwitstructuren. CL-MS-gegevens zijn gebruikt om eiwitstructuurvoorspelling36,42,43te vergemakkelijken, maar dit gebied vereist meer werk om zijn potentieel volledig te bereiken.
In vergelijking met andere CL-MS-methoden, waaronder die welke specifieke of niet-specifieke etiketteringsreagentia gebruiken, heeft DEPC enkele voor- en nadelen. Net als methoden die aminozuurspecifieke reagentia gebruiken, is DEPC-etikettering eenvoudig; het reagens hoeft alleen aan het monster van belang te worden toegevoegd. Deze eenvoud staat in contrast met methoden zoals snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) of hrf op basis van synchrotron die geavanceerde lichtbronnen vereisen om hydroxylradicalen te produceren. In tegenstelling tot methoden die specifieke reagentia gebruiken, kan DEPC zes verschillende aminozuren en het N-eindpunt labelen, waardoor het een hogere structurele resolutie kan bieden. Het aantal residuen dat door DEPC kan worden geëtiketteerd, is echter kleiner dan het aantal dat kan worden geoxideerd door hydroxylradicalen, dus de structurele resolutie die kan worden verkregen door CL-MS op basis van DEPC is lager. Een praktische vertakking van minder residuen die door DEPC worden geëtiketteerd, is dat het gebruik van het reagens soms niet alle gewenste structurele informatie biedt, en dus kan het profiteren van het gebruik in combinatie met andere etiketteerreagentia. We hebben onlangs de waarde aangetoond van het gebruik van DEPC samen met het reagenspaar 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)/glycine ethylether (GEE), dat glutamaat- en aspartaatresiduen kan labelen19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs erkennen steun van de National Institutes of Health (NIH) onder Grant R01 GM075092. De Thermo Orbitrap Fusion massaspectrometer die werd gebruikt om enkele van de hier beschreven gegevens te verkrijgen, werd verworven met fondsen van de National Institutes of Health grant S10OD010645.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
References
- Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
- Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
- Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
- Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
- Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
- Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
- Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
- Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
- Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
- Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
- Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
- Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
- Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
- Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
- Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
- Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
- Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
- Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
- Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
- Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
- Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
- Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
- Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
- Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
- Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
- Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
- Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
- Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
- Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
- Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
- Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
- Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
- Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
- Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
- Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
- Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
- Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
- Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).
