Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/61983
Automatic Translation
1, 1, *1,2, *3
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

Kütle spektrometrik tespiti ile dietilptirokarbonat bazlı kovalent etiketlemenin gerçekleştirilmesi için deneysel prosedürler açıklanmıştır. Dietilpyrokarbonat, solvent erişilebilir amino asit kalıntılarının değiştirilmesine yol açan, ilgi çekici protein veya protein kompleksi ile basitçe karıştırılır. Modifiye kalıntılar proteolitik sindirim ve sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizinden sonra tanımlanabilir.

Abstract

Bir proteinin yüksek sıralı yapısını karakterize etmek, işlevini anlamak için gereklidir. Kütle spektrometresi (MS), özellikle geleneksel yöntemlerle incelenmesi zor protein sistemleri için bu amaç için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bir proteinin yapısını MS ile incelemek için, bir proteinin yapısal bilgilerini kütlesine kodlayan çözeltide spesifik kimyasal reaksiyonlar gerçekleştirilir. Özellikle etkili bir yaklaşım, solvent erişilebilir amino asit yan zincirlerini kovalent olarak değiştiren reaktifler kullanmaktır. Bu reaksiyonlar, proteolitik sindirim ve tandem kütle spektrometresi ile birleştirildiğinde kalıntı düzeyinde çözünürlükle lokalize edilebilen kütle artışlarına yol açar. Burada, dietilpyrokarbonat (DEPC) kullanımıyla ilişkili protokolleri MS algılaması ile birlikte bir kurdent etiketleme reaktifi olarak açıklıyoruz. DEPC, ortalama proteindeki kalıntıların% 30'una kadar etiketleme yapabilen ve böylece mükemmel yapısal çözünürlük sağlayan son derece elektrofilik bir moleküldür. DEPC, MS ile birlikte β2-mikroglobulin gibi küçük tek etki alanı proteinleri için monoklonal antikorlar gibi büyük çok alanlı proteinlere yapısal bilgi elde etmek için başarıyla kullanılmıştır.

Introduction

Proteinler hemen hemen her fizyolojik süreçte temel biyomoleküllerdir. Proteinlerin gerçekleştirdiği fonksiyonların çeşitliliği, benimsedikleri yapılar ve diğer biyomoleküllerle olan etkileşimleri nedeniyle mümkündür. Protein fonksiyonunu daha derin bir düzeyde anlamak için, bu önemli yapısal özellikleri ve etkileşimleri aydınlatmak için biyokimyasal ve biyofiziksel araçlara ihtiyaç vardır. Geleneksel olarak, X-ışını kristalografisi, kriyojenik elektron mikroskopisi ve nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi protein yapısını ortaya çıkarmak için istenen atom seviyesi detayını sağlamıştır. Bununla birlikte, zayıf kristalleşme davranışı, sınırlı protein mevcudiyeti, aşırı numune heterojenliği veya moleküler ağırlık sınırlamaları nedeniyle çok sayıda protein sistemi bu tekniklerle sorgulanamaz. Sonuç olarak, bu sınırlamaların üstesinden gelen daha yeni analiz yöntemleri ortaya çıkmıştır. Protein yapısal bilgilerini sağlayabilecek gelişen teknikler arasında kütle spektrometresi de yer alıyor.

Kütle spektrometresi (MS) bir molekülün kütle-şarj (m/z) oranını ölçtİğİnden, istenen yapısal bilgilerin proteinin kütlesine kodlanarak protein daha yüksek sıralı yapısal bilgiler elde edilmelidir. Bu bilgileri kodlamak için hidrojen-döteryum değişimi (HDX) 1,2 ,3,4,kimyasal çapraz bağlama (XL)5,6ve kurcalama etiketleme (CL) 7 , 8,9,10dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. HDX'te omurga ortası hidrojenler, solvent erişilebilirliğine ve H-bonding kapsamına bağlı oranlarda biraz daha büyük döteryumlarla değiştirilir. HDX'in kapsamı, bu parçaları kütle spektrometresi ile ayırmadan ve ölçmeden önce proteini peptit parçalarına hızla sindirerek veya yukarıdan aşağıya bir deneyde proteini ayırarak lokalize edilebilir. Değişim hızının belirlenmesi protein dinamikleri hakkında daha fazla bilgi sağlar. HDX, geri değişimle ilgili zorluklara ve tekrarlanabilirliği en üst düzeye çıkarmak için özel ekipman ihtiyacına rağmen protein yapısını karakterize etmek için değerli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. XL-MS'de proteinler, belirli bir protein içindeki veya iki protein arasındaki bitişik kalıntı yan zincirlerini aktif olarak bağlayan iki fonksiyonel reaktiflerle reaksiyona sokulur. Bunu yaparken XL-MS, protein yapısını karakterize etmek için kullanılabilecek mesafe kısıtlamaları sağlayabilir. Proteinin çapraz bağlı bölgeleri proteolitik sindirim ve ardından sıvı kromatografisi (LC)-MS analizi ile tanımlanabilir. XL-MS, iç hücreler de dahil olmak üzere çeşitli protein komplekslerini incelemek için kullanılan çok yönlü bir araç olsa da, XL ürünlerinin tanımlanması zordur ve özel yazılım gerektirir.

CL-MS son zamanlarda protein yapısını ve etkileşimlerini incelemek için tamamlayıcı ve bazen alternatif MS tabanlı bir araç olarak ortaya çıkmıştır. CL-MS'te, bir protein veya protein kompleksi, solvent maruz kalan yan zincirlerle reaksiyona girebilen tek fonksiyonlu bir reaktif ile birlikte değiştirilir (Şekil 1). Bir protein veya protein kompleksinin modifikasyon kapsamları farklı koşullar altında karşılaştırılarak, konformasyon değişiklikleri, bağlama bölgeleri ve protein-protein arayüzleri ortaya çıkabilir. CL reaksiyonu sonrasında, genellikle tek amino-asit düzeyinde, proteinlerin proteolitik olarak sindirildiği, peptit parçalarının LC ile ayrıldığı ve modifiye edilen bölgelerin tandem MS (MS/MS) kullanılarak tanımladığı tipik aşağıdan yukarıya proteomik iş akışları kullanılarak meydana özgü bilgiler elde edilebilir. Biyokonjuge kimyanın zengin tarihi, CL-MS deneyleri için çok sayıda reaktifi kullanıma sunmuştur. CL reaktifleri iki genel kategoriye ayrılır: (i) spesifik ve (ii) spesifik olmayan. Spesifik reaktifler tek bir fonksiyonel grupla (örneğin, serbest aminler)8,10 ile reaksiyona girilir ve uygulanması kolaydır, ancak sınırlı yapısal bilgi sağlama eğilimindedirler. Spesifik olmayan reaktifler çok çeşitli yan zincirlerle reaksiyona girer, ancak genellikle bu yüksek reaktif türleri üretmek için lazerler veya senkrotron kaynakları gibi özel ekipmanlar gerektirir. Hidroksil radikalleri, çeşitli koşullar altında çok çeşitli proteinleri ve protein komplekslerini incelemek için hidroksil radikal ayak izi (HRF)7,11,12,13 deneylerinde uygulanan, en sık kullanılan spesifik olmayan reaktiftir.

Araştırma grubumuz, CL-MS deneyleri14 , 15 , 16 ,17 , 18 , 19,20 , 21 , 22,23,24,25bağlamında protein yapısını ve etkileşimlerini incelemek için dietilpyrokarbonat (DEPC) adı verilen nispeten spesifik olmayan başka bir reaktifibaşarıylakullanmıştır. DEPC, ortalama proteindeki amino asitlerin% 30'una kadar reaksiyona girerken, belirli etiketleme reaktiflerinin basitliğini sunar (yani, reaksiyonları gerçekleştirmek için özel bir ekipman gerekmez). Son derece elektrofilik bir reaktif olarak DEPC, sistein, histidin, lizin, tirozin, serin ve threonine kalıntılarının N-terminus ve nükleofilik yan zincirleri ile reaksiyona girer. Tipik olarak, bu reaksiyonların tek bir ürünü üretilir ve 72.02 Da'lık bir kütle artışına neden edilir. Bu tek ürün türü, proteinler hidroksil radikalleri ile reaksiyona girdiğinde üretilebilen 55 farklı ürünle tezat oluşturur7. Bu tür basit kimya, etiketli sitelerin tanımlanmasını kolaylaştırır.

Burada, protein yapısını ve etkileşimlerini incelemek için DEPC tabanlı CL-MS kullanımına yönelik protokoller sunuyoruz. Reaktif hazırlama, DEPC-protein reaksiyonları, protein sindirim koşulları, LC-MS ve MS/MS parametreleri ve veri analizi ile ilgili ayrıntılar açıklanmıştır. Ayrıca protein-metal, protein-ligand ve protein-protein etkileşimlerinin yanı sıra ısıtma sırasında yapısal değişikliklere uğrayan proteinlerden örnek sonuçlar sağlayarak DEPC etiketlemesinin faydasını gösteriyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Protein ve reaktif hazırlama

NOT: Bu protokol, bir proteini DEPC ile etiketlemek için örnek bir iş akışı içerir. Listelenen bazı koşullar ve reaktif konsantrasyonları tercih proteinine göre değişebilir.

  1. Tüm reaktif çözümlerini 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerde hazırlayın.
  2. pH 7.4'te 10 mM 3-(N-morfolino)propansülonik asit (MOPS) tamponunda, genellikle onlarca μM aralığında istenen konsantrasyonda bir protein çözeltisi hazırlayın. Alternatif olarak, numune DEPC ile reaktif olacak bir nükleofilik tampon içeriyorsa, 10 mM pH 7.4 MOPS'de bir tampon değişimi mevcut protein çözeltisi hazırlayın. Diğer tamponlar (örneğin fosfat tamponlu salin), nükleofilik fonksiyonel grupları olmadığı sürece de kullanılabilir.
  3. 6,9 M DEPC'lik stok çözeltisinin 1,45 μL'lik kısmını ACN'nin 98,55 μL'sine pipetle ederek kuru asetonitrilde (ACN) 100 mM DEPC çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Her proteinle çalışacak bir konsantrasyon kümesi yoktur, ancak optimal konsantrasyonlar His ve Lys kalıntılarının sayısına göre tahmin edilebilir23. Örneğin, 50 μM β2-mikroglobulin çözeltisinin 50 μL'si ile, bu genel örneği kullanarak istenen moler oranını sağlamak için 200 μM 'lik (protein konsantrasyonunun 4x'ine eşit) nihai bir DEPC konsantrasyonu için proteini100mM DEPC'nin 0,2 μL'si ile reaksiyona sokun ( Tablo 1 ). DEPC etiketleme 2nd sipariş reaksiyonudur, bu nedenle reaksiyon karışımındaki protein veya DEPC konsantrasyonunun değiştirilmesi etiketleme oranını değiştirecektir.
  4. 10 mg imidazol tartarak ve 146,9 μL HPLC sınıfı suda çözünerek 1 M imidazol çözeltisi hazırlayın.

2. Bozulmamış proteinin kovalent etiketlemesi

  1. Su banyosu sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın ve banyonun sabit bir sıcaklığa ulaşmasını bekleyin.
    NOT: Örnek bir etiketleme protokolü için reaktif konsantrasyonları ve hacimleri Tablo 1'de bulunabilir.
  2. Yeni bir mikrosantrifüj tüpünde, MOPS tamponu ve protein çözeltisi tablo 1'delistelenen hacimlerde karıştırın.
  3. Protein ve tampona DEPC çözeltisinin 0,2 μL'lik kısmını ekleyin, elde edilen çözeltiyi düzgün bir şekilde karıştırdığından emin olun ve ardından reaksiyon karışımını içeren tüpü 1 dakika boyunca 37 °C su banyosuna yerleştirin.
    NOT: Etiketleme reaksiyonu sırasında proteinin yapısının pertürbasyonunu önlemek için eklenen ACN hacmi toplam reaksiyon hacminin% 1'ini geçmemelidir. Reaksiyon süresi kullanıcıya bağlıdır, ancak örnek koşullar altında 1 dakikalık bir reaksiyon üst üste binmeyi ve DEPC14'ünpotansiyel hidrolizini en aza indirir.
  4. 1 dakika sonra, reaksiyon karışımını içeren tüpü su banyosundan çıkarın ve kalan yayınlanmamış DEPC'yi temizlemek için reaksiyonun 1 M imidazol çözeltisinin 1 μL'si ile söndürülür.
    NOT: Reaksiyon karışımındaki son imidazol konsantrasyonu, reaksiyon karışımındaki DEPC konsantrasyonunun 50 katına eşit olmalıdır. Bu, kalan yayınlanmamış DEPC'nin atılmasını sağlar.

3. Aşağıdan yukarıya LC-MS için protein sindiriminin hazırlanması

NOT: İlgi çekici proteine uygun sindirim koşullarını seçin. Yaygın adımlar, proteinin ortaya çıkmasını ve herhangi bir disülfid bağın azaltılmasını ve alkilasyona sokulduğlarını içerir.

  1. Reaksiyon karışımına uygun bir açma reaktifi ekleyerek proteini açın.
    NOT: Yaygın açılma ajanları ACN, üre ve guanidin hidroklorür (GuHCl) içerir.
  2. Azaltma ve alkilasyon adımları için sırasıyla 10 mM pH 7.4 MOPS tamponunun 174.4 ve 270.3 μL'sinde her biri 5 mg tartarak ve yeni mikrosantrifüj tüplerinde çözerek Tris (2-karboksit)fosfin (TCEP) ve iodoasetamid (IAM) çözeltileri hazırlayın.
  3. Reaksiyon karışımına 100 mM TCEP (reaksiyon karışımında 2 mM'lik son konsantrasyon) çözeltisinin 2 μL'sini ekleyerek ve oda sıcaklığında 3 dakika reaksiyona sokarak disülfid bağları azaltın.
    NOT: TCEP'in son konsantrasyonu, çözeltide bulunan disülfid bağ başına protein konsantrasyonunun 40 kat'ına eşit olmalıdır.
  4. Alkilat, karanlıkta 30 dakika boyunca 100 mM IAM çözeltisinin 4 μL'si (reaksiyon karışımında 4 mM'lik son konsantrasyon) ile sisteinleri azalttı. IAM ışığa duyarlıdır ve doğrudan ışık altında ayrışır.
    NOT: Çözeltideki IAM'nin son konsantrasyonu, TCEP için kullanılan konsantrasyonun iki katı veya disülfid bağı başına protein konsantrasyonunun 80 katı olmalıdır.
  5. Proteini tripsin veya chymotrypsin gibi uygun bir enzimle sindirin. 37 °C'de 3 saatlik bir sindirim için 10:1 protein:enzim oranı, 300 vuruş/dakika sallama hızında hareketsiz enzim ile tipik olarak DEPC etiketli proteinler için yeterlidir. Bkz. Tartışma.
  6. Sindirimden sonra, hareketsiz enzimi sindirilmiş peptitlerden 5 dakika boyunca 12.000 rpm'de santrifüjleme ile ayırın.
  7. Numuneyi LC-MS/MS ile hemen analiz edin veya numune bozulmasını ve etiket kaybını en aza indirmek için numuneyi sıvı nitrojenle flaşla dondurun. Flaşla dondurulmuş numuneleri LC-MS/MS analizine hazır olana kadar -20 °C'< saklayın.

4. LC-MS/MS Analizi

NOT: Aşağıdan yukarıya proteomik için standart LC-MS/MS parametreleri, proteolitik peptit parçalarındaki etiketli bölgeleri tanımlamak için kullanılabilir. Genel bir örnek aşağıda özetlenmiştir.

  1. TERS fazlı C18 sabit faz kullanarak DEPC etiketli peptitleri ayırın. İki çözücünün tipik bir LC mobil fazını kullanın: peptitlerin en iyi ayrımını elde etmek için bir gradyan (örneğin, Şekil 2) kullanarak su + % 0.1 formik asit ve (B) ACN +% 0.1formik asit.
    NOT: Ayırma süresi numune karmaşıklığına göre optimize edilebilir ve mobil faz akış hızı kılcal veya nano LC kullanılıp kullanılmadığına bağlıdır.
  2. Peptit üzerindeki DEPC değişiklik alanlarını tanımlamak için çevrimiçi LC-MS ve MS/MS yapabilen bir kütle spektrometresi kullanın. Deneylerimizde, çeşitli kütle spektrometrelerini başarıyla kullandık. LC-MS analizi sırasında birçok peptitin MS/MS'ini otomatik olarak gerçekleştirebilen herhangi bir kütle spektrometresi uygun olmalıdır. İlgili MS parametreleri şunlardır: Normal ESI için ESI kaynak voltajı = -4000 V; Nanospray için -2000 V; Orbitrap çözünürlüğü = 60.000; Dinamik dışlama süresi = 30 s; MS/MS etkinleştirme türü: CID, ETD veya her ikisi; Toplu tarama aralığı = 200-2.000; Otomatik Kazanç Kontrolü = 4.0E5 (Orbitrap'ta MS1) ve 5.0E4 (doğrusal dörtlü iyon tuzağında MS2).
  3. Sindirilmiş, etiketlenmiş protein örneğini LC sistemine yükleyip enjekte edin ve LC-MS/MS alımını başlatın. Numune flaşla dondurulduysa, analizden önce çözün. Aşırı tuzların ESI kaynağına girmesini önlemek için LC atık sularını ilk 5 dakika çöpe atın.
    NOT: LC-MS/MS'e yaklaşık 2,5 μg protein enjeksiyonu için izin verilen 5 μL enjeksiyon döngüsü genellikle kullanılır. Bu, örnek enjektörü tıkamamak için LC'nin yükleme koşullarına bağlıdır.

5. Veri analizi

  1. DEPC etiket sitelerini tanımlayın ve kullanılan kütle spektrometresi için uygun yazılımı kullanarak peptit tepe alanlarını ölçün.
  2. Değişken değişiklikler olarak DEPC ekleme (72.02 Da) ve karbamidometiltion (57.02 Da) ekleyin. MS/MS analizi için ek arama parametreleri aşağıdaki gibidir: En fazla kaçırılan bölünme = 3; Parça iyon türleri = b ve y; Öncül m/z toleransı = 10 ppm (dörtlü iyon bindirme kütle spektrometresi kullanılıyorsa bu değer daha yüksek olmalıdır); Parça m/z toleransı = 0,5 Da (ürün iyon taraması için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanılıyorsa bu değer daha düşük olmalıdır); Öncül ücret = 1-4.
    NOT: Farklı veritabanı arama algoritmaları farklı puanlama sistemlerine sahiptir ve değişiklik düzeyleri düşük olabileceği için birçoğu DEPC tarafından değiştirilmiş peptitleri tanımlamakta zorlanabilir. Daha etiketli peptitleri tanımlamak için puan kesmenin ayarlanması gerekebilir. Öyleyse, düşük puanlı peptitleri doğrulamak için MS/MS verilerinin manuel olarak sorgulanması kullanılmalıdır. DEPC etiketinin hidroliz ürünü veri aramasına dahil değildir, çünkü hidrolizli DEPC artık nükleofilik yan zincirlere karşı reaktif değildir.
  3. Peptitlerin değiştirilmiş ve değiştirilmemiş sürümlerinin kromatografik tepe alanlarını kullanarak kalıntı düzeyinde değişiklik yüzdelerini belirleyin.
    NOT: Değiştirilmiş faiz kalıntılarını içeren herhangi bir peptit dikkate alınmalı ve dahil edilen tüm ücret durumları ölçülen tüm örneklerde bulunmalıdır. Farklı iyonlaşma verimliliklerine sahip ve farklı zamanlarda elde edilmesi gereken peptitler, bu değerin belirli bir sitenin değiştirilmesinin mutlak ölçüsü yerine göreceli olmasına neden olur.
    Equation 1
    burada Ai,z, ilgi kalıntısını içeren ve algılanan tüm ücret durumlarını (z) dikkate alan herhangi bir peptitin (i) tepe alanını temsil eder.
  4. İstatistiksel değerlendirme kullanarak denetim ve deneysel örnek arasındaki etiketleme değişikliğinin anlamlı olup olmadığını belirleyin. Her örnek için üç çoğaltma ölçümü tipiktir ve t testleri en sık %95 veya %99 güven aralıklarıyla kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DEPC değişiklik sitelerini ve değişiklik yüzdelerini belirleme
Katvalent etiketlemeye bağlı kütle ilavesi (a) bozulmamış protein ve (b) peptit seviyeleri8,9olarak ölçülebilir. Sağlam düzeyde, etiketli protein örneklerinin doğrudan analizinden veya LC-MS'inden farklı sayıda etikete sahip protein türlerinin dağılımı elde edilebilir. Daha yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler (yani bölgeye özgü etiketleme verileri) elde etmek için ölçümlerin peptit düzeyinde yapılması gerekir. Etiketleme ve söndürme adımlarından sonra, etiketli proteinler aşağıdan yukarıya proteomik analize tabi tutulur (örneğin, disülfid azaltma, alkilasyon, proteolitik sindirim ve LC-MS / MS). Şekil 3, DEPC etiketli sitelerin nasıl tanımlendiğini ve bunların modifikasyon seviyelerinin protein β-2-mikroglobulin (β2m)21üzerinde bir DEPC CL-MS deneyi için nasıl hesaplandıklarını göstermektedir. MS/MS, etiketli peptitleri sıralamak ve DEPC etiketli sitelerini belirlemek için kullanılırken, değişiklik yüzdeleri ayıklanan iyon kromatogramlarındaki göreli tepe alanlarından hesaplanır (Bkz. Şekil 3A).

DEPC CL-MS kullanarak protein yüzey haritalaması
Protein topolojisi ve etiketleme oranı arasındaki ilişki nedeniyle, DEPC protein yüksek sıra yapısındaki (HOS) değişiklikleri incelemek ve protein etkileşim alanlarını tanımlamak için kullanılmıştır8,9. Cu(II) bağlamasının β2m yapısı üzerindeki etkisi buna bir örnektir. İlişkisiz β2m ve Cu(II) bağlı β2m (b2m-Cu) peptit parçalarının DEPC değişiklik hızı katsayıları, DEPC konsantrasyonlarını değiştirerek ve ikinci dereceden kinetik arsalar oluşturarak ölçülebilir (Tablo 2)14,24. β2m-Cu'daki kalıntıların DEPC reaktivitesi His31, Ser33 ve Thr4 için önemli etiketleme oranı değişikliklerini ortaya getirirken, farklı O'nun kalıntıları da dahil olmak üzere diğer siteler istatistiksel olarak değişmemektedir. Bu veriler, His31'in, ancak β2m'deki diğer O'nun kalıntılarının, Cu'yu His31 (yani, Ser33) ve N-terminus (yani Thr4) yakınında yapısal değişikliklere neden olan bağlaması gerçeğiyle tutarlıdır (Şekil 4)14,26,27.

HOS'taki değişiklikleri tanımlamak için DEPC CL-MS
MS algılamalı DEPC etiketleme, şu anda ilaç pazarının en hızlı büyüyen segmenti olan protein terapötikleri için önemli etkileri olan proteinlerdeki HOS değişikliklerini karakterize etmek için de değerli bir araçtır28. DEPC CL, termal ve oksidatif stres üzerine yapısal değişikliklere uğrayan belirli protein bölgelerini tanımlayabilir18. β2m ısı stresine maruz kaldıktan sonra, etiketleme kapsamlarında önemli düşüşler yaşayan birçok kalıntı (N-terminus, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58) proteinin bir tarafında kümelenir, bu da proteinin bu bölgesinin konformasyonsal bir değişikliğe uğradığını veya muhtemelen toplamada aracılık ettiğini gösterir (Şekil 5A). Bu kalıntılara ek olarak, protein oksidatif strese maruz kaldıktan sonra, etiketlemede azalma olan diğer kalıntılar (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) proteinin başka bir yüzünde bir küme oluşturur ve oksidasyon kaynaklı konformasyon değişikliklerinin başka bir yerde meydana geldiğini gösterir(Şekil 5B). Grubumuzun diğer çalışmaları da DEPC CL-MS'in ısı stresli monoklonal antikor terapötiklerindeki konformasyon değişikliklerinin yerlerini tespit edebildiği ve tanımlayabildiği gösterilmiştir20.

DEPC CL-MS protein-protein etkileşimlerini incelemek için
Protein-protein etkileşim alanları ve amiloid oluşturan proteinler için toplama arayüzleri hakkında de DEPC etiketlemesi kullanılarak elde edilebilir9. Oligomer oluşumunda kalıntıların modifikasyon seviyelerindeki azalmalar bağlama arayüzlerini ortaya getirebilir. DEPC CL-MS, Diyalize bağlı amiloidoz29'daamiloid oluşturan protein olan β2m'nin amiloid öncesi oligomerlerini karakterize etmek için kullanıldı Cu(II)15 , 16,26ile amiloid oluşumunu başlattıktan sonra. β2m monomerin DEPC reaktivitesini Cu(II) ekledikten sonra 2 saat oluşan amiloid öncesi β2m dimer ile karşılaştırmak, dokuz kalıntının etiketlemede azalmaya uğradığını, altı kalıntının etiketlemede hiçbir değişiklik veya hafif artışa uğramadığını gösterir(Şekil 6A). Bu değişiklikleri β2m'de haritaladıktan sonra, dimer arayüzünün β2m monomerlerin ABED β yapraklarını içerdiği hemen açıktır (Şekil 6B)15.

DEPC CL-MS protein-ligand bağlamayı incelemek için
Ligand proteinlere bağlanma, ligand ile etkileşime giren kalıntıların çözücü erişilebilirliğinde azalmalara yol açar ve DEPC tabanlı CL-MS proteinler üzerindeki ligand bağlayıcı bölgeleri tanımlamak için kullanılabilir. Örneğin, amiloid oluşturan koşullar altında β2m'deki epigallocatechin-3-gallate (EGCG) bağlama bölgeleri, EGCG bağlaması ile gömülen kalıntılarda DEPC etiketlemesinde önemli düşüşlerle tanımlanabilir. EKGC varlığında, Lys6 ve Lys91 daha düşük DEPC modifikasyon yüzdelerine sahiptir (Şekil 7) ve bu kalıntılar proteinin bir bölgesinde kümelenir ve ligand bağlanmasına bağlı kalıntı korumasını gösterir. Bu arada N-terminus, Thr4 ve His31, ECGC kaynaklı yapısal değişikliklerin göstergesi olan etiketleme kapsamlarında artışa uğrar (Şekil 7) ve β2m (N-terminus ve His31) 14,30,31'dekiCu(II) bağlama alanlarının ECGC bağlama32'ninbir sonucu olarak bozulabileceğini göstermektedir. Ek olarak, β2m amiloid oluşumunun diğer iki küçük molekül inhibitörünün, rifamycin SV ve doksiksin'in bağlama bölgeleri CL-MS19kullanılarak tanımlanmıştır. Ancak bu çalışmada, DEPC etiketlemesinden elde edilen sonuçlar tek başına bağlayıcı bölgeleri yeterli yapısal çözünürlükle haritalamak için yeterli değildi. Depc, BD ve 1-etil-3-(3-(dimetilmino)propil)karbodiimid - glisin etil ester (EDC /GEE) çifti olmak üzere üç farklı CL reaktifinden elde edilen sonuçlar, bağlama alanlarını daha iyi belirlemek için gerekliydi19.

Yapısal çözünürlüğün iyileştirilmesi ve etiket karıştırmanın azaltılması
DEPC etiketlemesi kovalent bir bağın oluşumuna neden olsa da, özellikle Ser, Thr ve Tyr kalıntıları için hidroliz nedeniyle etiket kaybı meydana gelebilir (Şekil 8). Etiket kaybı, gece sindirimi yerine kısa proteolitik sindirimler (örneğin, hareketsiz enzimlerle 2 saat sindirim) kullanılarak DEPC CL reaksiyonu ile LC-MS analizi arasındaki sürenin azaltılmasıyla en aza indirilebilir. Hızlı sindirim, protein yapısal bilgi miktarını artırarak daha fazla modifiye kalıntının ölçülmelerine neden olur. Örneğin, hareketsiz chymotrypsin ile 2 saat sindirim sürekli olarak β2m (Şekil 9)17'dedaha fazla DEPC modifiye kalıntının tanımlanmasına yol açar. β2m'deki Ser, Thr, Tyr, His ve Lys kalıntılarının yaklaşık% 75'i bir gecede sindirim ile tespit edilir, ancak etiketleme ve LC-MS arasındaki süre 2 saatlik bir sindirim kullanılarak azaltıldığında, β2m'deki bu kalıntıların% 95'i tespit edilir. Yeni tespit edilen modifiye kalıntıların çoğu hidroliz eğilimli Tyr ve Thr kalıntılarıdır.

DEPC ile çalışmalarımız boyunca, bazı proteinlerde, DEPC etiketleme reaksiyonları sırasında disülfid bağların bozulmamış olmasına rağmen, disülfid bağlardan gelen kis kalıntılarının DEPC tarafından değiştirildiğini fark ettik. Cys kalıntılarının bu şekilde etiketlenebilmesi, serbest tiyoollerin çözeltideki diğer değiştirilmiş kalıntılarla reaksiyona gelebilmesi nedeniyle meydana gelir (Şekil 10), karbetoksi grubu Cys kalıntısına aktarıldığı için "etiket karıştırma" olarak adlandırılır. Etiket karıştırma, diğer kalıntılardaki modifikasyon seviyelerini azaltır ve yanlış protein yapısal bilgileri sağlar. Etiket karıştırmayı önlemek için, serbest Cys tiyolleri disülsit azaltma33'denhemen sonra tamamen alkilleştirilmelidir.

Figure 1
Şekil 1: Katalent etiketleme-kütle spektrometresi (CL-MS). Monofunksiyonel reaktif, solventle erişilebilir amino asitleri değiştirmek için kullanılır ve proteinlerdeki konformasyonel değişiklikler veya etkileşim arayüzleri (üst ve alt görüntü) hakkında bölgeye özgü bilgiler sağlamak için kullanılabilir. Modifiye protein proteolitik olarak sindirilir ve elde edilen peptitler MS ve tandem MS (MS/MS) ile birlikte sıvı kromatografisi (LC) ile analiz edilir. Şekil, Protein Yapısı ve Etkileşimlerini İncelemek için Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spektrometresi'nden uyarlanmıştır. Yöntem 144, 79-93 (2018). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kullanılan Hacim (μL) Çözeltide Konsantrasyon (μM)
Protein (100 μM, MOPS) 50 50
PASPASLAR (10 mM, pH 7.4) 48.8 Yok
DEPC (100 mM) 0.2 200 (=4x[protein])
Imidazol (1 M) 1 10.000 (=50x[DEPC])
Toplam Birim 100

Tablo 1. Genel DEPC etiketleme protokolü.

Figure 2
Şekil 2. Peptitlerin ayrılması için örnek LC gradyanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3 DEPC etiketli sitelerin nasıl tanımlanıp değişiklik düzeylerinin hesaplandıklarının çizimi. DEPC etiketlemesi ve proteolitik sindirimden sonra (A) Sindirilen proteinin LC-MS analizi yapılır. Bir kromatogramdaki (B) etiketsiz ve (C) etiketli peptitlerin tepe alanları etiketleme yüzdesini hesaplamak için kullanılır. LC-MS sırasında peptitler CID MS/MS'e tabi tutulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

artık b2m b2m-Cu
Thr4 0,082 ± 0,004 0,052 ± 0,009
Onun13 0,041 ± 0,003 0,033 ± 0,005
His31 0,010 ± 0,001 0,003 ± 0,001
Ser33 0,010 ± 0,002 0,004 ± 0,001
His51 0,036 ± 0,003 0,030 ± 0,004
Ser88 0,029 ± 0,007 0,020 ± 0,006

Tablo 2 Cu(II) yokluğunda ve varlığında b2m içinmeydanaözgü DEPC değişiklik oranı katsayıları (k, M-1 s -1).

Figure 4
Şekil 4 Cu(II) bağlamasının β2m yapısı üzerindeki etkisini belirlemek için DEPC CL-MS'i kullanmak: (A) DEPC etiketleme oranlarında (mavi) önemli düşüşler olan kalıntıların protein yüzey haritalaması, Cu(II) bağlamasında çözücü erişilebilirliklerindeki değişiklikleri ve etiketleme oranında (macenta) (PDB katılım kodu 1JNJ) önemli bir değişiklik olmayanları gösterir. (B) Cu(II)'nin varlığında ve yokluğunda farklı DEPC konsantrasyonlarına sahip β2m reaksiyonunun meydana özgü ikinci sıra kinetik çizimleri. Etiketleme oranı katsayısı (k) kinetik arsanın eğiminden elde edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5 Stresli ve doğal β2m için katalent etiketleme sonuçları: (A) Isı stresi - 24 saat için 75 °C'de ısıtma ve (B) oksidatif stres -24saat için% 3 H 2 O2. Değişiklik yüzdelerindeki önemli değişiklikler mavi (etiketlemede azalma) ve kırmızı (etiketlemede artış) olarak gösterilirken, önemli etiketleme değişikliği olmayan kalıntılar soluk yeşilde gösterilir (PDB katılım kodu 1JNJ). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6 β2m'lik amiloid öncesi dimer için dimer arabirimini belirlemek için DEPC CL-MS'yi kullanma: (A) Monomerdeki değiştirilmiş kalıntılar için DEPC değişiklik düzeyi değişikliklerinin özeti (örneğin, t = 0) ve Cu(II) ekledikten sonra dimer 2 h. Etiketleme derecesinde önemli düşüşler olan kalıntılar yıldız işareti (*) ile gösterilir. (B) β2m yapısında eşlenen katalizen etiketleme sonuçları. Etiketlemesi azalmış kalıntılar mavi, etiketlemede değişiklik veya hafif artış olmayan kalıntılar kırmızı renkte gösterilir (PDB katılım kodu 1LDS). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7 EGCG'ye bağlı ve ilişkisiz b2m için tutarlı etiketleme sonuçları. Görüntülenen kalıntılar için DEPC değişiklik yüzdeleri gösterilir. Tanımlayıcı etiketleme yüzdesinde istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar yıldız işareti (*) ile gösterilir. ECGC bağlaması üzerine etiketlemedeki artışlar kırmızı, düşüşler ise mavi renkte gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8 DEPC kovalent etiketleme reaksiyonları (nükleofilik acil ikame) ve etiket kaybı (karbetil ilelenmiş kalıntıların hidrolizi) Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9 β2m'de ölçülen modifikasyon sitelerinin haritalandırılması. (A) Geleneksel gece sindirimi sonrası etiketli siteler ve (B) hareketsiz chymotrypsin ile 2 saat sindirimden sonra siteleri etiketledi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10 DEPC etiket karıştırma hipotezize mekanizması (Karbetoksillenmiş His cys yakalama) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritik Adımlar
Güvenilir etiketleme sonuçları sağlamak için deneysel tasarımla ilgili çeşitli noktalar göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, protein etiketlemeyi en üst düzeye çıkarmak için, depc ile reaksiyona girebilecekleri ve etiketleme kapsamını düşürebilecekleri için güçlü nükleofilik gruplara (örneğin Tris) sahip tamponlardan kaçınmak gerekir. Bu tür tamponların etiketli kalıntılarla reaksiyona neden olabileceği, etiketin çıkarılmasına ve dolayısıyla yapısal bilgi kaybına neden olabileceği de düşünülebilir. Mops'u tampon olarak öneriyoruz, ancak fosfat tamponlu salin de çalışıyor. İkincisi, disülfid bağların azaltılması için dithiothreitol kaçınılmalıdır, çünkü bu reaktifteki serbest tiyoller etiketli kalıntılarla reaksiyona sokabilir ve DEPC değişikliğini kaldırabilir. Bu aynı kimya, azaltılmış disülfitleri alkilasyona neden etmenin neden olduğudur, çünkü serbest Cys protein içi etiketin karıştırılmasına neden olabilir33. Üçüncü olarak, imidazol ile söndürme adımı (Protokol adım 2.4), etiketleme reaksiyonu durdurmak için kritik öneme sahiptir, böylece kalan herhangi bir DEPC proteinle reaksiyona devam edemez.

DEPC etiketleme reaksiyonunun 2nd sıra olduğunu takdir etmek de önemlidir, yani protein veya DEPC konsantrasyonunun değiştirilmesi etiketlemenin kapsamını etkileyecektir. Ampirik olarak, protein 10'lar μM aralığında bir konsantrasyona sahip olduğunda 4:1 DEPC:protein konsantrasyon oranının makul bir değer olduğunu bulduk, çünkü etiketleme kaynaklı yapısal değişikliklerden kaçınma eğilimindedir14. Bununla birlikte, optimum DEPC:protein konsantrasyon oranı proteine bağlı olduğu kadar konsantrasyona da bağlıdır ve bazı proteinler yeterli etiketlemeyi elde etmek için daha yüksek oranlara ihtiyaç duyar. Belirli bir proteinin etiketlenmesinde yapısal pertürbasyonu en aza indirmek için en uygun DEPC konsantrasyonu, erişilebilen solvent sayısı23olarak tahmin edilebilir.

Zaman içinde reaktif bozulmasına bağlı olarak etiketleme kapsamlarında değişkenlik olmaması için, kontrol ve deneysel reaksiyonlar ideal olarak aynı gün yapılmalıdır. DEPC suya maruz kaldığında hızlı hidrolizden geçer ve depolama sırasında da bozulur, bu nedenle iyi laboratuvar uygulamaları ve reaktif kullanımı çok önemlidir. Kullanılmadığında, DEPC stok şişesi bir kurutucuda saklanmalıdır.

Değişiklikler ve Sorun Giderme
DEPC CL kinetik olarak kontrol edilen bir reaksiyon olduğundan, etiketleme oranı ve dolayısıyla modifikasyon seviyesi protein ve reaktif konsantrasyonları, etiketleme süresi ve sıcaklık tarafından kontrol edilir. Yukarıda belirtildiği gibi, genellikle DEPC CL 37 °C'de 1 dakika boyunca DEPC ila protein azı oranı 4 ila 1 arasında yapılır. Bu azı dişi oranında (4x), proteinler yapısal pertürbasyonlar olmadan güvenle etiketlenebilir14. DEPC:4'ten büyük protein azı dişleri oranları bazı proteinler için kullanılabilir ve şaşırtıcı derecede yüksek olmayan DEPC konsantrasyonları daha kapsamlı etiketleme ve daha yapısal bilgilerle sonuçlanır. Daha yüksek DEPC konsantrasyonlarını perturbing yapısı olmadan kullanmanın en güvenli yolu, bir proteinin proteolitik parçalarının reaktivitesinin DEPC konsantrasyonunun bir işlevi olarak ölçüldüğü doz-yanıt çizimleri oluşturmaktır (bkz. Şekil 4B)14,24. Ancak, bu yaklaşım birden fazla ölçüm gerektirdiği için zaman alıcı olabilir. Son zamanlarda, en uygun DEPC konsantrasyonunun, O ve Lys kalıntılarının sayısından ve SASA'sından belirli bir protein için tahmin edilebileceğini gösterdik23. Son çalışmalarda, cl9,24sırasında bir proteinin yapısının bozulmadığını değerlendirmek için alternatif yollar önerdik.

Proteolitik sindirim de DEPC CL-MS'de önemli bir adımdır, çünkü üretilen peptitler LC-MS/MS analizinden sonra yapısal bilgileri lokalize etmeye izin verir. Genel olarak tripsin ve chymotrypsin gibi serine proteazlar protein sindirimi için etkilidir. Tripsin, Lys ve Arg kalıntılarının C terminali tarafında bölünme verimliliği ve özgüllüğü nedeniyle daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, trypsin genellikle DEPC etiketli Lys kalıntılarından sonra bölünmez, bu da etiketli Lys artıklarında bazen veri analizini zorlaştırabilecek özlenmiş bölünmeye neden olur. Hacimli hidrofobik kalıntılardan sonra bölünen chymotrypsin aktivitesi tipik olarak DEPC etiketlemesinden etkilenmez, ancak bu enzim tripinden daha düşük bölünme verimliliğine ve özgüllüğe sahiptir. Ek olarak, çok sayıda hidrofobik kalıntıya sahip proteinler için, chymotrypsin, standart LC-MS koşullarında ayrılması ve tespit edilmesi zor olabilen birkaç kısa peptit parçası üretebilir.

Protein sindirmelerinin LC-ESI-MS/MS analizleri, güvenilir yarı-niteliksel sonuçlar elde etmek için kararlı bir elektrospray gerektirir. Kılcal damarlar ve nano LC, az miktarda proteinle verimli ayırmanın elde edilebildiği yaygın olarak kullanılan ayırma platformlarıdır. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, kılcal damar LC, kullanılan daha yüksek numune miktarları nedeniyle nano LC'den daha güvenilir nicel bilgi (yani modifikasyon seviyeleri) sağlar. Çok sayıda etiketli ve etiketsiz peptit içine sindirilen büyük proteinler için, benzer hidrofobikliğe sahip peptitlerin kolüzyasyonu olabilir. Bu durumlarda, daha iyi ayırmalar için daha uzun LC gradyanları kullanılmalıdır.

Hızlı ve verimli MS/MS, iyi sıra kapsamı ve etiket sitesi tanımlaması için önemlidir. Dörtlü iyon tuzaklarına sahip kütle spektrometreleri bu amaç için mükemmel araçlardır. Genel olarak, CID peptit ayrışması için yaygın ve son derece etkili bir yöntemdir; bununla birlikte, etiketli peptit iyonlarının CID'si sırasında DEPC etiket karıştırma vakalarını gözlemledik, bu da etiketleme sitesi kimliğinde belirsizlik ile sonuçlandı34. Bu biraz nadir durumlarda, ETD daha güvenilir bilgiler sağlar. Sonuç olarak, mümkünse, her iki ayrışma tekniği arasında alternatif olmak yardımcı olabilir. DEPC birçok farklı kalıntı türünü etiketleyebildiğinden, belirli bir peptit parçasının izomerlerinin değiştirilen yan zincirde farklılık gösteren oluşturulması yaygındır. Çoğu zaman, bu peptit izomerleri LC ile ayrılabilir, ancak çok benzer zamanlarda elute olma eğilimindedirler. Otomatik LC-MS/MS analizleri sırasında MS/MS hariç tutma süreleri ayarlandığında bu olasılık göz önünde bulundurulmalıdır. Genellikle, normalden daha kısa dışlama süreleri kullanılmalıdır.

Sınırlama
DEPC CL-MS protein yapısını ve etkileşimlerini incelemek için son derece faydalı olsa da ve çok çeşitli protein sistemlerini ele almak için önemli ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, bu tekniğin bazı sınırlamaları devam etmektedir. Etiketleme koşulları iyi optimize edilmiş değilse (örneğin, çok yüksek bir DEPC konsantrasyonu kullanarak), aşırı etiketleme protein yapısını bozabilir ve yanlış yapısal bilgilere neden olabilir14,23,24. Buna ek olarak, ölçülen modifikasyon seviyelerinin doğruluğu ve hassasiyeti, numunelerin LC-MS analizinden çok önce oturması ve kimyasal etiketleme adımlarındaki hatalar da dahil olmak üzere etiket kaybı da dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden etkilenir. Her deneysel adımda tutarlılık güvenilir sonuçlar için önemlidir. Şu anda DEPC tabanlı CL-MS ile ilişkili daha zorlu sorunlardan biri veri analizi yazılımıdır. Hazır veri analizi programları, düşük modifikasyon yüzdelerine sahip peptitleri başarıyla tanımlamak için optimize edilmemiştir (örneğin, %< 1). Sonuç olarak, düşük modifikasyon seviyelerine sahip peptitlerin kolayca tanımlanmasını sağlamak için özel bir yazılım geliştirdik ve kullandık18.

DEPC CL-MS orta proteinli yapısal çözünürlük sağlayabilse de etiketleme tekniğinden detaylı bir 3D yapı elde edilemez. Son zamanlarda, etiketleme verilerine dayalı bazı yapısal tahmin araçları geliştirilmiştir35,36. Bununla birlikte, protein yapısını tahmin etmek için DEPC etiketleme sonuçlarını hesaplamalı modelleme ile en iyi şekilde dahil etmek için daha fazla gelişme gerekir.

Alternatif Yöntemlere Kıyasla Önemi
DEPC tabanlı CL-MS ile mümkün olan yapısal çözünürlük, X-ışını kristalografisi veya NMR gibi tekniklerle karşılaştırıldığında orta düzeydedir, bu nedenle tekniği HDX-MS, XL-MS ve diğer CL-MS veya ayak izi yaklaşımlarıyla karşılaştırmak en uygunudur. Girişte de belirtildiği gibi, CL-MS HDX-MS'in tamamlayıcısıdır, çünkü bir proteindeki kalıntıların yan zincirleri hakkında bilgi sağlarken, HDX-MS omurga yapısı ve dinamikleri hakkında rapor vermektedir. Bu tamamlayıcılık,37 , 38,39,40 ,41gibi birkaç grup tarafından gösterildiği gibi, daha fazla yapısal bilgi elde etmek için iki tekniğin birliktekullanılmasınaizin verir. DEPC tabanlı CL-MS ile ilgili ortaya çıkan bir fikir, HDX-MS22ile birlikte kullanıldığında kullanılabilen sinerjik bilgilerdir. İki teknikle ilişkili etiketleme zaman dilimleri nedeniyle, DEPC tabanlı CL-MS genellikle HDX'in azaldığı protein bölgeleriyle belirsizliği netleştirebilir. Hdx'in azalması, bağlanma veya protein dinamiklerinin azalması nedeniyle çözünebilirliğin azalmasından kaynaklanabilir. DEPC reaksiyonları doğal olarak HDX reaksiyonlarından 2-3 büyüklük sırası daha yavaştır, bu nedenle DEPC etiketlemesi, solvent erişilebilirliğindeki değişikliklere eşlik etmedikleri sürece protein dinamiklerindeki değişikliklerden büyük ölçüde etkilenmez.

CL-MS'in HDX-MS denemelerine göre bazı avantajları vardır, bu etiket karıştırma ve etiket kaybı uygun önlemler alındığında minimumdur. HDX deneylerinde etiket kaybı veya geri değişim tekniğin standart bir özelliğidir ve düşük pH'daki hızlı sindirimler ve LC ayrımları bu sorunu en aza indirmeye yönelik girişimlerdir. Bununla birlikte, geri değişim sorununun genellikle HDX-MS ile ölçülen daha yüksek sayıda etiketli siteyle dengelendiğini fark etmek önemlidir. Etiketleme karıştırma HDX-MS'te daha büyük bir sorundur, çünkü daha sonra yanlış bilgiler elde edilir, bu nedenle bu endişeyi en aza indirmek için analiz koşulları optimize edilmelidir.

XL-MS ve CL-MS, etiket kaybı ve karıştırma açısından benzer avantajlara sahiptir, çünkü her ikisi de sindirim ve LC-MS analizleri sırasında kalacak kadar sağlam bir bağın oluşumunu içerir. Bununla birlikte, çapraz bağlı peptitlerin dizilimi ve tanımlanması, özel yazılımların kullanılmasını gerektiren, yaygın olarak etiketlenmiş peptitlerden daha zordur. XL-MS'in CL-MS'e göre sahip olduğu önemli avantajlardan biri, olası protein yapılarını tahmin ederken veya daraltırken değerli olabilecek mesafe kısıtlamaları sağlama yeteneğidir. CL-MS verileri protein yapısı tahmini36,42,43kolaylaştırmak için kullanılmıştır, ancak bu alan potansiyeline tam olarak ulaşmak için daha fazla çalışma gerektirir.

Belirli veya spesifik olmayan etiketleme reaktifleri kullananlar da dahil olmak üzere diğer CL-MS yöntemleriyle karşılaştırıldığında, DEPC'nin bazı avantajları ve dezavantajları vardır. Amino aside özgü reaktifleri kullanan yöntemler gibi, DEPC etiketlemesi de basittir; reaktifin yalnızca ilgi örneğine eklenmesi gerekir. Bu basitlik, hidroksil radikalleri üretmek için sofistike ışık kaynakları gerektiren proteinlerin hızlı fotokimyasal oksidasyonu (FPOP) veya senkrotron bazlı HRF gibi yöntemlerle tezat oluşturur. Belirli reaktifleri kullanan yöntemlerin aksine, DEPC altı farklı amino asit ve N-terminus etiketleyebilir ve daha yüksek yapısal çözünürlük sağlamasını sağlar. Bununla birlikte, DEPC tarafından etiketlenebilen kalıntı sayısı hidroksil radikaller tarafından oksitlenebilen sayıdan daha azdır, bu nedenle DEPC tabanlı CL-MS ile elde edilebilen yapısal çözünürlük daha düşüktür. DEPC tarafından etiketlenen daha az kalıntının pratik bir sonucu, reaktifin kullanılmasının bazen istenen tüm yapısal bilgileri sağlamaması ve bu nedenle diğer etiketleme reaktifleriyle birlikte kullanılmasından yararlanabilmesidir. Son zamanlarda glutamat ve aspartat kalıntılarını etiketleyebilen reaktif çifti 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (EDC)/glisin etil eter (GEE) ile birlikte DEPC kullanmanın değerini gösterdik19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, Grant R01 GM075092 kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH) destek kabul ediyorlar. Burada açıklanan verilerin bir kısmını elde etmek için kullanılan Thermo Orbitrap Fusion kütle spektrometresi, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi S10OD010645'ten alınan fonlarla elde edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Tags

Kimya Sayı 172 Kütle spektrometresi katalent etiketleme protein yüksek düzen yapısı protein-ligand kompleksleri protein kompleksleri dietilptirokarbonat solventle erişilebilir yüzey alanı
Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, … More

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e61983, doi:10.3791/61983 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter