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Chemistry

Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/61983
Automatic Translation
1, 1, *1,2, *3
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

Os procedimentos experimentais para a realização de rotulagem covalente à base de diethylpirocarbonato com detecção espectrométrica em massa são descritos. O dietilpirocarbonato é simplesmente misturado com o complexo de proteínas ou proteínas de interesse, levando à modificação de resíduos de aminoácidos acessíveis solventes. Os resíduos modificados podem ser identificados após a digestão proteolítica e a análise da cromatografia líquida/espectrometria de massa.

Abstract

Caracterizar a estrutura de alta ordem de uma proteína é essencial para entender sua função. A espectrometria de massa (MS) emergiu como uma ferramenta poderosa para este fim, especialmente para sistemas proteicos difíceis de estudar pelos métodos tradicionais. Para estudar a estrutura de uma proteína por MS, reações químicas específicas são realizadas em solução que codifica as informações estruturais de uma proteína em sua massa. Uma abordagem particularmente eficaz é o uso de reagentes que modificam covalentemente cadeias laterais de aminoácidos acessíveis de solvente. Essas reações levam a aumentos de massa que podem ser localizados com resolução de nível de resíduo quando combinados com digestão proteolítica e espectrometria de massa tandem. Aqui, descrevemos os protocolos associados ao uso de diethylpirocarbonato (DEPC) como um reagente de rotulagem covalente juntamente com a detecção de MS. O DEPC é uma molécula altamente eletrofílica capaz de rotular até 30% dos resíduos na proteína média, proporcionando assim excelente resolução estrutural. O DEPC tem sido usado com sucesso junto com a MS para obter informações estruturais para pequenas proteínas de domínio único, como β2-microglobulina, para grandes proteínas multi-domínio, como anticorpos monoclonais.

Introduction

Proteínas são biomoléculas essenciais em praticamente todos os processos fisiológicos. A variedade de funções que as proteínas realizam são possíveis devido às estruturas que adotam e às interações que têm com outras biomoléculas. Para entender a função proteica em um nível mais profundo, ferramentas bioquímicas e biofísicas são necessárias para elucidar essas importantes características e interações estruturais. Tradicionalmente, a cristalografia de raios-X, a microscopia eletrônica criogênica e a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) forneceram o detalhe desejado do nível atômico para revelar a estrutura proteica. No entanto, inúmeros sistemas proteicos não podem ser interrogados por essas técnicas devido ao mau comportamento de cristalização, disponibilidade limitada de proteínas, heterogeneidade excessiva da amostra ou limitações de peso molecular. Consequentemente, surgiram novos métodos de análise que superam essas limitações. Entre as técnicas emergentes que podem fornecer informações estruturais proteicas está a espectrometria de massa.

A espectrometria de massa (MS) mede a relação massa-carga (m/z) de uma molécula, de modo que informações estruturais de alta ordem proteica devem ser obtidas codificando as informações estruturais desejadas na massa da proteína. Várias abordagens para codificar essas informações foram desenvolvidas, incluindo troca de deutério de hidrogênio (HDX)1,2,3,4, crosslinking químico (XL)5,6, e rotulagem covalente (CL)7,8,9,10. Em HDX, os hidrogênios de amido de espinha dorsal são trocados por deutérios ligeiramente mais massivos a taxas que dependem da acessibilidade solvente e da extensão de ligação H. A extensão do HDX pode ser localizada digerindo rapidamente a proteína em fragmentos de peptídeos antes de separar e medir esses fragmentos pelo espectrômetro de massa ou dissolvendo a proteína em um experimento de cima para baixo. Determinar a taxa de câmbio fornece mais informações sobre a dinâmica das proteínas. A HDX provou ser uma ferramenta valiosa para caracterizar a estrutura proteica, apesar dos desafios associados à troca traseira e da necessidade de equipamentos especializados para maximizar a reprodutibilidade. No XL-MS, as proteínas são reagidas com reagentes bifuncionais que ligam covalentemente cadeias laterais de resíduos dentro de uma determinada proteína ou entre duas proteínas. Ao fazer isso, o XL-MS pode fornecer restrições de distância que podem ser usadas para caracterizar a estrutura proteica. As regiões da proteína que estão cruzadas podem ser identificadas pela digestão proteolítica seguida de cromatografia líquida (LC)-MS. Embora o XL-MS seja uma ferramenta versátil que tem sido usada para estudar uma variedade de complexos proteicos, incluindo células internas, a identificação dos produtos XL é desafiadora e requer software especializado.

O CL-MS emergiu recentemente como uma ferramenta complementar e às vezes alternativa baseada em MS para estudar a estrutura e as interações proteicas. Em CL-MS, um complexo proteico ou proteico é covalentemente modificado com um reagente monofuncional que pode reagir com cadeias laterais expostas a solventes(Figura 1). Comparando as extensões de modificação de um complexo proteico ou proteico em diferentes condições, mudanças de conformação, locais de ligação e interfaces proteína-proteína podem ser reveladas. Após a reação cl, informações específicas do local, muitas vezes no nível único de aminoácidos, podem ser obtidas usando fluxos de trabalho típicos de proteômica de baixo para cima em que as proteínas são digeridas proteolíticos, fragmentos de peptídeos são separados por LC e locais modificados são identificados usando ms tandem (MS/MS). A rica história da química bioconjugada disponibilizou numerosos reagentes para experimentos cl-ms. Os reagentes CL se enquadram em duas categorias gerais: (i) específicas e (ii) não específicas. Reagentes específicos reagem com um único grupo funcional (por exemplo, aminas livres)8,10 e são fáceis de implementar, mas tendem a fornecer informações estruturais limitadas. Reagentes não específicos reagem com uma ampla gama de cadeias laterais, mas muitas vezes requerem equipamentos especializados, como lasers ou fontes síncrotrons para produzir essas espécies altamente reativas. Os radicais hidroxil são os reagentes não específicos mais utilizados, tendo sido aplicados em pegada radical hidroxil (HRF)7,11,12,13 experimentos para estudar uma ampla gama de proteínas e complexos proteicos sob uma variedade de condições.

Nosso grupo de pesquisa utilizou com sucesso outro reagente relativamente não específico chamado dietilpiroto (DEPC) para estudar estrutura proteica e interações no contexto dos experimentos cl-ms14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. O DEPC oferece a simplicidade de reagentes de rotulagem específicos (ou seja, nenhum equipamento especializado é necessário para realizar as reações), ao mesmo tempo em que reage com até 30% dos aminoácidos na proteína média. Como um reagente altamente eletrofílico, o DEPC é capaz de reagir com os resíduos n-terminus e as cadeias laterais nucleofílicas de cisteína, histidina, lise, tyrosina, serina e resíduos de threonina. Normalmente, um único produto dessas reações é gerado, resultando em um aumento em massa de 72,02 Da. Este único tipo de produto contrasta com os até 55 produtos diferentes que podem ser produzidos quando as proteínas reagem com radicais hidroxil7. Tal química simples facilita a identificação de locais rotulados.

Aqui, fornecemos protocolos para o uso do CL-MS baseado em DEPC para estudar estrutura e interações proteicas. Detalhes associados à preparação de reagentes, reações de proteínas DEPC, condições de digestão proteica, parâmetros LC-MS e MS/MS e análise de dados são descritos. Também demonstramos a utilidade da rotulagem DEPC, fornecendo exemplos de interações proteína-metal, proteína-ligante e proteína-proteína, bem como proteínas submetidas a mudanças estruturais após o aquecimento.

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Protocol

1. Preparação de proteínas e reagentes

NOTA: Este protocolo inclui um fluxo de trabalho de exemplo para rotular uma proteína com DEPC. Algumas condições e concentrações de reagentes listadas podem variar de acordo com a proteína escolhida.

  1. Prepare todas as soluções de reagente em tubos de microcentrifus de 1,5 mL.
  2. Prepare uma solução proteica de concentração desejada, geralmente na faixa de dezenas de μM, em um tampão de ácido propanesulfônico de 10 mM 3-(N-morpholino)em pH 7.4. Alternativamente, prepare uma solução proteica existente de troca de buffer em 10 mM pH 7.4 MOPS se a amostra contiver um tampão nucleofílico que seria reativo com DEPC. Outros buffers (por exemplo, soro fisiológico tampão fosfato) também podem ser usados, desde que não tenham grupos funcionais nucleofílicos.
  3. Prepare uma solução DEPC de 100 mM em acetonitrilo seco (ACN) pipetando 1,45 μL da solução de 6,9 M DEPC em 98,55 μL da ACN.
    NOTA: Não há um conjunto de concentrações que funcionem com todas as proteínas, embora as concentrações ideais possam ser estimadas com base no número de resíduos dele e lys23. Por exemplo, com 50 μL de uma solução de 50 μM β2-microglobulina, reaja a proteína com 0,2 μL do DEPC de 100 mM para uma concentração final de DEPC de 200 μM (igual a 4x a concentração de proteína) para garantir a razão molar desejada usando este exemplo geral(Tabela 1). A rotulagem DEPC é uma reaçãode 2ª ordem, portanto, mudar a concentração de proteína ou DEPC na mistura de reação mudará a taxa de rotulagem.
  4. Prepare a solução de imidazol de 1 M, pesando 10 mg de imidazol e dissolvendo-se em 146,9 μL de água de grau HPLC.

2. Rotulagem covalente de proteína intacta

  1. Coloque a temperatura do banho de água para 37 °C e espere o banho atingir uma temperatura estável.
    NOTA: Concentrações e volumes de reagentes para um protocolo de rotulagem de exemplo podem ser encontrados na Tabela 1.
  2. Em um novo tubo de microcentrifuuge, misture o tampão MOPS e a solução de proteínas em volumes listados na Tabela 1.
  3. À proteína e ao tampão adicione 0,2 μL da solução DEPC, certificando-se de misturar adequadamente a solução resultante e, em seguida, coloque o tubo contendo a mistura de reação no banho de água de 37 °C por 1 minuto.
    NOTA: O volume adicionado pela ACN não deve exceder 1% do volume total de reação para evitar perturbação da estrutura da proteína durante a reação de rotulagem. O tempo de reação cabe ao usuário, embora uma reação de 1 minuto sob as condições de exemplo minimize o sobrelabelamento e a potencial hidrólise do DEPC14.
  4. Após 1 minuto, remova o tubo contendo a mistura de reação do banho de água e sacie a reação com 1 μL da solução de imidazol de 1 M para ressarcê-lo o DEPC não redigido restante.
    NOTA: A concentração final de imidazol na mistura de reação deve ser igual a 50x da concentração de DEPC na mistura de reação. Isso garantirá que o DEPC não redigido seja redigido.

3. Preparação de digestão de proteína para LC-MS de baixo para cima

NOTA: Escolha condições de digestão que sejam favoráveis à proteína de interesse. As etapas comuns envolvem o desdobramento da proteína e a redução e aprisão de quaisquer ligações de dissulfeto.

  1. Desdobre a proteína adicionando um reagente desdobrado apropriado à mistura de reação.
    NOTA: Os agentes comuns incluem acn, ureia e cloridrato de guanidina (GuHCl).
  2. Prepare soluções de Tris(2-carboxyethyl)fospfina (TCEP) e iodoacetamida (IAM) pesando 5 mg de cada e dissolvendo-as em novos tubos de microcentrifuuge em 174,4 e 270,3 μL de 10 mM pH 7,4 mops tampão, respectivamente, para a redução e 270,3 μL de 10 mM pH 7,4 mops tampão, respectivamente, para a redução e a alquilação.
  3. Reduza as ligações de dissulfeto adicionando 2 μL da solução de 100 mM TCEP (concentração final de 2 mM na mistura de reação) à mistura de reação e reagindo por 3 minutos à temperatura ambiente.
    NOTA: A concentração final de TCEP deve ser igual a 40x da concentração proteica por ligação dissulfeto presente na solução.
  4. Os cisteínas reduzidas de alquila com 4 μL da solução IAM de 100 mM (concentração final de 4 mM na mistura de reação) por 30 minutos no escuro. O IAM é sensível à luz e se decompõe sob luz direta.
    NOTA: A concentração final do IAM na solução deve ser o dobro da concentração utilizada para TCEP, ou 80x a concentração de proteína por ligação de dissulfeto.
  5. Digerir a proteína com uma enzima apropriada, como trippsina ou chymotripsina. Uma razão de proteína de 10:1:enzima para uma digestão de 3 horas a 37 °C com enzima imobilizada a uma taxa de agitação de 300 golpes/min é tipicamente suficiente para proteínas rotuladas pelo DEPC. Veja discussão.
  6. Após a digestão, separe a enzima imobilizada dos peptídeos digeridos por centrifugação a 12.000 rpm por 5 minutos.
  7. Analise a amostra imediatamente por LC-MS/MS ou congele flash a amostra com nitrogênio líquido para minimizar a degradação da amostra e a perda do rótulo. Armazene as amostras congeladas a < -20 °C até estar pronta para análise de LC-MS/MS.

4. Análise LC-MS/MS

NOTA: Os parâmetros padrão LC-MS/MS para proteômica de baixo para cima podem ser usados para identificar locais rotulados nos fragmentos de peptídeos protelíticos. Um exemplo geral é descrito abaixo.

  1. Separe os peptídeos rotulados pelo DEPC usando uma fase inversa C18 estacionária. Use uma fase móvel LC típica de dois solventes: (A) água + 0,1% ácido fórmico e (B) ACN + 0,1% ácido fórmico usando um gradiente (por exemplo, Figura 2) para alcançar a melhor separação dos peptídeos.
    NOTA: O tempo de separação pode ser otimizado com base na complexidade da amostra, e a taxa de fluxo de fase móvel depende se o capilar ou nano LC é usado.
  2. Use um espectrômetro de massa capaz de fazer LC-MS e MS/MS on-line para identificar os locais de modificação do DEPC no peptídeo. Em nossos experimentos, usamos com sucesso vários tipos de espectrômetros de massa. Qualquer espectrômetro de massa capaz de realizar automaticamente MS/MS de muitos peptídeos durante uma análise LC-MS deve ser adequado. Os parâmetros de MS relevantes incluem: tensão de origem ESI = -4000 V para ESI regular; -2000 V para nanospray; Resolução Orbitrap = 60.000; Duração de exclusão dinâmica = 30 s; Tipo de ativação MS/MS: CID, ETD ou ambos; Faixa de varredura em massa = 200-2.000; Controle automático de ganho = 4.0E5 (MS1 no Orbitrap) e 5.0E4 (MS2 na armadilha de íon quadrupole linear).
  3. Carregue e injete a amostra de proteína digerida e rotulada no sistema LC e inicie a aquisição da LC-MS/MS. Se a amostra tiver sido congelada, descongele antes da análise. Desvie o efluente LC para o lixo durante os primeiros 5 minutos para evitar que sais excessivos entrem na fonte ESI.
    NOTA: Um laço de injeção de 5 μL é geralmente utilizado, permitindo a injeção de aproximadamente 2,5 μg de proteína para o LC-MS/MS. Isso depende das condições de carregamento da LC para não entupir o injetor amostral.

5. Análise de dados

  1. Identifique os sites de etiquetas DEPC e quantifique as áreas de pico do peptídeo usando um software apropriado para o espectrômetro de massa que é usado.
  2. Inclua adição de DEPC (72.02 Da) e carbamidometilação (57,02 Da) como modificações variáveis. Os parâmetros adicionais de pesquisa para a análise de MS/MS são os seguintes: Decotes máximos perdidos = 3; Tipos de íons de fragmentação = b e y; Tolerância precursora m/z = 10 ppm (este valor deve ser maior se um espectrômetro de massa de armadilha de íon quadrupole for usado); Tolerância de fragmento m/z = 0,5 Da (este valor deve ser menor se um espectrômetro de massa de alta resolução for usado para uma varredura de íons do produto); Carga precursora = 1-4.
    NOTA: Diferentes algoritmos de pesquisa de banco de dados têm sistemas de pontuação diferentes, e muitos podem ter dificuldade em identificar peptídeos modificados pelo DEPC porque os níveis de modificação podem ser baixos. O ajuste do corte de pontuação pode ser necessário para identificar peptídeos mais rotulados. Nesse caso, o interrogatório manual dos dados de MS/MS deve ser usado para verificar peptídeos de baixa pontuação. O produto da hidrólise do selo DEPC não está incluído na pesquisa de dados porque o DEPC hidrolisado não é mais reativo em relação às cadeias laterais nucleofílicas.
  3. Determine percentuais de modificação em nível de resíduo utilizando as áreas de pico cromatográficas das versões modificadas e não modificadas dos peptídeos.
    NOTA: Qualquer peptídeo contendo o resíduo modificado de interesse deve ser considerado e todos os estados de carga que estão incluídos devem estar presentes em todas as amostras medidas. Peptídeos com diferentes eficiências de ionização e eluição em diferentes momentos faz com que esse valor seja uma medida relativa e não absoluta da modificação de um local específico.
    Equation 1
    onde Ai,z representa área de pico de qualquer peptídeo (i) que contenha o resíduo de interesse e considere todos os estados de carga detectados (z).
  4. Determinar se uma mudança de rotulagem entre uma amostra de controle e experimental é significativa por meio da avaliação estatística. Três medidas de replicação para cada amostra são típicas, e os testes t são mais comumente utilizados com intervalos de confiança de 95 ou 99%.

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Representative Results

Identificação de locais de modificação do DEPC e percentagens de modificação
A adição em massa devido à rotulagem covalente pode ser medida nos (a) níveis de proteína intacta e (b) peptídeo8,9. No nível intacto, uma distribuição de espécies proteicas com diferentes números de rótulos pode ser obtida a partir de análise direta ou LC-MS de amostras de proteínas rotuladas. Para obter informações estruturais de maior resolução (ou seja, dados de rotulagem específicos do local), as medições devem ser realizadas no nível do peptídeo. Após as etapas de rotulagem e saciamento, as proteínas rotuladas são submetidas à análise proteômica de baixo para cima (ou seja, redução de dissulfeto, alquilação, digestão proteolítica e LC-MS/MS). A Figura 3 mostra como os locais rotulados pelo DEPC são identificados e seus níveis de modificação são calculados para um experimento DEPC CL-MS na proteína β-2-microglobulina (β2m)21. MS/MS é usado para sequenciar os peptídeos rotulados e identificar seus locais rotulados de DEPC, enquanto as porcentagens de modificação são calculadas a partir de suas áreas de pico relativas em cromatógrafos de íons extraídos (Ver Figura 3A).

Mapeamento da superfície proteica usando DEPC CL-MS
Devido à relação entre topologia proteica e taxa de rotulagem, o DEPC tem sido usado para estudar mudanças na estrutura de proteínas de alta ordem (HOS) e identificar locais de interação proteica8,9. Um exemplo é o efeito da ligação de Cu(II) na estrutura de β2m. Os coeficientes de taxa de modificação de DEPC de fragmentos de peptídeos de β2m e cu(II)-bound β2m (b2m-Cu) podem ser medidos(Tabela 2) por variadas concentrações DEPC e gerando parcelas cinéticas de segundaordem 14,24. A reatividade de resíduos de DEPC em β2m-Cu revela mudanças significativas na taxa de rotulagem para His31, Ser33 e Thr4, enquanto outros locais, incluindo diferentes Seus resíduos, são estatisticamente inalterados. Esses dados são consistentes com o fato de que His31, mas não outros resíduos em β2m, liga causando alterações estruturais perto de His31 (ou seja, Ser33) e perto do N-terminus (ou seja, Thr4) (Figura 4)14,26,27.

DEPC CL-MS para identificação de alterações no HOS
A rotulagem DEPC com detecção de MS também é uma ferramenta valiosa para caracterizar mudanças de HOS nas proteínas, o que tem implicações importantes para a terapêutica proteica, que atualmente é o segmento que mais cresce no mercado farmacêutico28. O DEPC CL pode identificar regiões proteicas específicas que sofrem alterações estruturais após o estresse térmico e oxidativo18. Após β2m ser exposto ao estresse térmico, muitos resíduos que sofrem reduções significativas nas extensões de rotulagem (N-terminus, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58) são agrupados em um lado da proteína, sugerindo que esta região da proteína sofre uma alteração conformacional ou possivelmente media a agregação(Figura 5A). Além desses resíduos, após a proteína ser exposta ao estresse oxidativo, outros resíduos com diminuição na rotulagem (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) formam um aglomerado em outra face da proteína, indicando que as alterações conformais induzidas pela oxidação ocorrem em outros lugares(Figura 5B). Outros trabalhos do nosso grupo também mostraram que o DEPC CL-MS pode detectar e identificar locais de alterações conformais na terapêutica de anticorpos monoclonais estressadas pelo calor20.

DEPC CL-MS para estudar interações proteína-proteína
A visão dos locais de interação proteína-proteína e as interfaces de agregação de proteínas formadoras de amiloides podem ser obtidas utilizando rotulagem DEPC também9. A diminuição dos níveis de modificação dos resíduos na formação de oligômeros pode revelar as interfaces de ligação. O DEPC CL-MS foi utilizado para caracterizar os oligômeros pré-amilóides de β2m, que é a proteína que forma amiloides em amiloidose relacionada à diálise29, após iniciar a formação amiloide com Cu(II)15,16,26. Comparar a reatividade DEPC do monômero β2m com o dimer pré-amilóide de β2m que é formado 2 h após a adição de Cu(II) mostra que nove resíduos sofrem diminuição na rotulagem, enquanto seis resíduos não sofrem alterações ou leves aumentos na rotulagem(Figura 6A). Ao mapear essas alterações no β2m, é imediatamente evidente que a interface dimer envolve a β-folhas ABED de monômeros de β2m(Figura 6B)15.

DEPC CL-MS para estudar a ligação proteína-ligante
A ligação ligante às proteínas leva a diminuição da acessibilidade solvente de resíduos que interagem com o ligante, e o CL-MS baseado em DEPC pode ser usado para identificar locais de ligação de ligantes em proteínas. Por exemplo, os locais de vinculação de epigallocatechin-3-gallate (EGCG) em β2m sob condições de formação amiloide podem ser identificados por reduções significativas na rotulagem DEPC nos resíduos enterrados pela ligação EGCG. Na presença do ECGC, Lys6 e Lys91 possuem percentuais de modificação de DEPC mais baixos(Figura 7),e esses resíduos são agrupados em uma região da proteína, indicando proteção de resíduos devido à ligação de ligas. O N-terminus, Thr4 e His31, entretanto, sofrem aumentos nas extensões de rotulagem (Figura 7), que são indicativos de alterações estruturais induzidas pelo ECGC e sugerem que os sítios de ligação cu(II) em β2m (N-terminus e His31)14,30,31 podem ser interrompidos como resultado da vinculação ECGC32. Além disso, os locais de ligação dos outros dois inibidores de pequenas moléculas de formação amiloide de β2m, rifamycina SV e doxiciclina, foram identificados utilizando CL-MS19. Neste estudo, porém, os resultados da rotulagem DA DEPC por si só não foram suficientes para mapear os locais de vinculação com resolução estrutural suficiente. Os resultados de três reagentes cl diferentes, ou seja, DEPC, BD, e 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide - éster etílico glicina (EDC/GEE) foram necessários para identificar melhor os locais de ligação19.

Melhorando a resolução estrutural e reduzindo a redução da estrutura
Embora a rotulagem DEPC cause a formação de um vínculo covalente, a perda de rótulos devido à hidrólise pode ocorrer, especialmente para resíduos de Ser, Thr e Tyr(Figura 8). A perda do rótulo pode ser minimizada diminuindo o tempo entre a reação de CL de DEPC e a análise de LC-MS usando digestões proteolíticas curtas (por exemplo, digestão de 2 h com enzimas imobilizadas) em vez de digestões noturnas. Digestões rápidas resultam em mais resíduos modificados sendo medidos, aumentando a quantidade de informações estruturais proteicas. Por exemplo, uma digestão de 2h com chymotripsina imobilizada leva consistentemente à identificação de mais resíduos modificados por DEPC em β2m(Figura 9)17. Com uma digestão noturna cerca de 75% dos resíduos de Ser, Thr, Tyr, His e Lys em β2m são detectados, mas quando o tempo entre rotulagem e LC-MS é reduzido usando uma digestão de 2 h, 95% desses resíduos em β2m são detectados. A maioria dos resíduos modificados recém-detectados são resíduos de Tyr e Thr que são propensos à hidrólise.

Ao longo do nosso trabalho com o DEPC, notamos que em algumas proteínas, os resíduos de Cys que a partir de ligações de dissulfeto são modificados pelo DEPC, embora as ligações de dissulfeto estejam intactas durante as reações de rotulagem do DEPC. Essa rotulagem de resíduos de Cys ocorre porque os tiois livres podem reagir com outros resíduos modificados na solução(Figura 10),levando à chamada "mistura de rótulos", uma vez que o grupo carbethoxy é transferido para o resíduo de Cys. A redução de rótulos diminui os níveis de modificação em outros resíduos e fornece informações estruturais proteicas incorretas. Para evitar a mistura de rótulos, os thiols Cys gratuitos devem ser totalmente alquilados logo após a redução do dissulfeto33.

Figure 1
Figura 1: Espectrometria de massa de rotulagem covalente (CL-MS). Um reagente monofuncional é usado para modificar aminoácidos acessíveis solventes e pode ser usado para fornecer informações específicas do local sobre alterações conformais ou interfaces de interação em proteínas (imagem superior vs. inferior). A proteína modificada é digerida proteolítico, e os peptídeos resultantes são analisados por cromatografia líquida (LC) em conjunto com MS e tandem MS (MS/MS). A figura foi adaptada de Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spectrometria para Estudo da Estrutura e Interações Proteicas. Métodos 144, 79-93 (2018). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Volume utilizado (μL) Concentração na Solução (μM)
Proteína (100 μM, MOPS) 50 50
MOPS (10 mM, pH 7.4) 48.8 n/a
DEPC (100 mM) 0.2 200 (=4x[proteína])
Imidazol (1 M) 1 10.000 (=50x[DEPC])
Total Volume 100

Mesa 1. Protocolo geral de rotulagem DEPC.

Figure 2
Figura 2. Exemplo de gradiente LC para separação de peptídeos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 Ilustração de como os sites rotulados pelo DEPC são identificados e seus níveis de modificação são calculados. Após a rotulagem DEPC e digestão proteolítica, (A) é realizada a análise LC-MS da proteína digerida. As áreas de pico de (B) peptídeos não rotulados e (C) em um cromatógrafo são usadas para calcular a porcentagem de rotulagem. Durante o LC-MS, os peptídeos são submetidos a CID MS/MS. Espectros de massa tandem de (D) não rotulados e (E) & (F) peptídeos rotulados obtidos em momentos específicos de retenção são usados para sequenciamento de peptídeos e identificação de locais rotulados DEPC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

resíduo b2m b2m-Cu
Thr4 0,082 ± 0,004 0,052 ± 0,009
Seu 13 0,041 ± 0,003 0,033 ± 0,005
Seu 31 0.010 ± 0.001 0.003 ± 0.001
Ser33 0.010 ± 0.002 0.004 ± 0.001
Seu 51 0.036 ± 0,003 0.030 ± 0.004
Ser88 0.029 ± 0,007 0.020 ± 0.006

Tabela 2 Coeficientes de taxa de modificação DEPC específicos do local (k, M-1s-1) para b2m na ausência e presença de Cu(II).

Figure 4
Figura 4 Utilizando o DEPC CL-MS para determinar o efeito da vinculação de Cu(II) na estrutura de β2m: (A) Mapeamento de superfície proteica dos resíduos com reduções significativas nas taxas de rotulagem DEPC (azul), indicando alterações em sua acessibilidade solvente na ligação cu(II) e aqueles sem alterações significativas na taxa de rotulagem (magenta) (código de adesão PDB 1JNJ). (B) Exemplo de tramas cinéticas de segunda ordem específicas do local da reação de β2m com diferentes concentrações de DEPC na presença e ausência de Cu(II). O coeficiente da taxa de rotulagem (k) pode ser obtido a partir da inclinação da trama cinética. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 Resultados de rotulagem covalente para estresse vs. β2m nativo: (A) Estresse térmico - aquecimento a 75 °C para 24 h e (B) estresse oxidativo - com 3% H2O2 para 24 h. Mudanças significativas nos percentuais de modificação são mostradas em azul (diminuição da rotulagem) e vermelho (aumento na rotulagem), enquanto resíduos sem alterações significativas de rotulagem são mostrados em verde pálido (código de adesão PDB 1JNJ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 Usando o DEPC CL-MS para determinar a interface dimer para o dimer pré-amilóide de β2m: (A) Resumo das alterações de nível de modificação de DEPC para resíduos modificados no monômero (i.e., t = 0) e dimer 2 h após adicionar Cu(II). Resíduos com reduções significativas na extensão da rotulagem são denotados por um asterisco (*). (B) Resultados de rotulagem covalente mapeados na estrutura de β2m. Resíduos com rotulagem reduzida são mostrados em azul e resíduos sem alterações ou pequenos aumentos na rotulagem são mostrados em vermelho (código de adesão PDB 1LDS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 Resultados de rotulagem covalent para B2m vinculado ao EGCG vs. unbound. Os percentuais de modificação do DEPC são mostrados para os resíduos exibidos. Diferenças estatisticamente significativas na porcentagem de rotulagem covalente são denotadas por um asterisco (*). Aumentos na rotulagem na ligação ECGC são mostrados em vermelho, enquanto as reduções são mostradas em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8 Reações de rotulagem covalente DEPC (substituição de aciila nucleofílica) e perda de rótulo (hidrólise de resíduos carbetoxilados) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9 Mapeamento dos locais de modificação medidos em β2m. (A) Locais rotulados após digestão noturna convencional, e (B) locais rotulados após uma digestão de 2 h com chymotripsina imobilizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10 Mecanismo hipotético de scrambling de etiqueta DEPC (Captura de Cys de carbethoxylated His) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Passos críticos
Vários pontos relativos ao design experimental devem ser considerados para garantir resultados confiáveis de rotulagem. Primeiro, para maximizar a rotulagem de proteínas, é necessário evitar buffers com grupos fortemente nucleofílicos (por exemplo, Tris) porque eles podem reagir com o DEPC e diminuir a extensão da rotulagem. Também é concebível que tais tampões possam reagir com resíduos rotulados, causando a remoção do rótulo e, portanto, a perda de informações estruturais. Recomendamos MOPS como um tampão, mas o soro fisco tampão também funciona. Em segundo lugar, dithiothreitol deve ser evitado para a redução de ligações de dissulfeto, pois os tiols livres neste reagente podem reagir com resíduos rotulados e remover a modificação da DEPC. É por isso que é essencial alquilar dissulfetos reduzidos porque os Cys livres podem causar rótulo intra-proteína scrambling33. Em terceiro lugar, a etapa de saciamento com imidazol (Protocolo passo 2.4) é fundamental para parar a reação de rotulagem para que qualquer DEPC restante seja incapaz de continuar a reagir com a proteína.

Também é importante perceber que a reação de rotulagem do DEPC é de2ª ordem, o que significa que a mudança da proteína ou da concentração de DEPC afetará a extensão da rotulagem. Descobrimos empiricamente que uma relação de concentração de proteínas 4:1 É um valor razoável quando a proteína tem uma concentração na faixa de 10 μM, pois tende a evitar quaisquer alterações estruturais induzidas por rotulagem14. No entanto, a razão ideal de concentração de proteínas é dependente de proteínas, bem como dependente de concentração, e algumas proteínas requerem maiores proporções para alcançar rotulagem suficiente. A concentração ideal de DEPC para minimizar a perturbação estrutural da rotulagem de uma determinada proteína pode ser estimada a partir do número de resíduos de solventes acessíveis Dele e Lys23.

Para evitar a variabilidade nas extensões de rotulagem devido à degradação do reagente ao longo do tempo, o controle e as reações experimentais devem ser realizadas idealmente no mesmo dia. O DEPC sofre hidrólise rápida quando exposto à água e se degrada durante o armazenamento também, de modo que boas práticas laboratoriais e manuseio de reagentes são fundamentais. Quando não estiver em uso, a garrafa de estoque DEPC deve ser armazenada em um desiccador.

Modificações e solução de problemas
Como o DEPC CL é uma reação cineticamente controlada, a taxa de rotulagem e, portanto, o nível de modificação, são controlados por concentrações de proteínas e reagentes, tempo de rotulagem e temperatura. Como indicado acima, muitas vezes o DEPC CL é realizado por 1 minuto a 37 °C com uma razão de molar de DEPC para proteína de 4 a 1. Nesta relação molar (4x), as proteínas podem ser rotuladas com segurança sem perturbações estruturais14. As relações molar de proteínas de DEPC que são maiores que 4 podem ser usadas para algumas proteínas, e não surpreendentemente maiores concentrações de DEPC resultam em rotulagem mais extensa e informações mais estruturais. A maneira mais segura de usar concentrações de DEPC mais elevadas sem estrutura perturbada é gerar parcelas de dose-resposta nas quais a reatividade dos fragmentos protelíticos de uma proteína são medidos em função da concentração de DEPC (ver Figura 4B)14,24. No entanto, essa abordagem pode ser demorada, pois requer múltiplas medições. Recentemente, demonstramos que a concentração ideal de DEPC pode ser estimada para uma determinada proteína do número e sasa de resíduos Dele e Lys nessa proteína23. Em trabalhos recentes, também sugerimos formas alternativas de avaliar que a estrutura de uma proteína não é perturbada durante a CL9,24.

A digestão proteolítica também é um passo importante no DEPC CL-MS, pois os peptídeos gerados permitem que se localize informações estruturais após a análise de LC-MS/MS. Em geral, proteases de serina, como trippsina e chymotripsina são eficazes para a digestão proteica. A trippsina é mais comumente usada devido à sua eficiência e especificidade no lado terminal C dos resíduos lys e Arg. No entanto, a trippsina geralmente não se acovarda após resíduos de Lys rotulados pela DEPC, causando decote perdido em resíduos rotulados de Lys que às vezes podem complicar a análise de dados. A atividade da chymotrypsina, que se acovarda após resíduos hidrofóbicos volumosos, normalmente não é afetada pela rotulagem DEPC, mas esta enzima tem menor eficiência e especificidade do decote do que a trippsina. Além disso, para proteínas com numerosos resíduos hidrofóbicos, a chymotrippsina pode gerar vários fragmentos de peptídeos curtos que podem ser difíceis de separar e detectar sob condições padrão de LC-MS.

As análises LC-ESI-MS/MS de digestão de proteínas requer um eletrospray estável para obter resultados semiquantitativos confiáveis. Capilares e nano LC são plataformas de separação comumente usadas onde a separação eficiente pode ser obtida com pequenas quantidades de proteína. No entanto, em nossa experiência, a LC capilar fornece informações quantitativas mais confiáveis (ou seja, níveis de modificação) do que nano LC devido às maiores quantidades de amostra que são usadas. Para grandes proteínas que são digeridas em um grande número de peptídeos rotulados e sem rótulo, a coelução de peptídeos com hidrofóbica semelhante pode acontecer. Nestes casos, gradientes de LC mais longos devem ser usados para melhores separações.

MS/MS rápido e eficiente é importante para uma boa cobertura de sequência e identificação do site de etiquetas. Espectrômetros de massa com armadilhas de íons quadrupoles são excelentes instrumentos para este fim. Geralmente, o CID é um método comum e altamente eficaz para dissociação de peptídeos; no entanto, observamos casos de rotulagem DEPC embaralhadas durante cid de íons de peptídeo rotulados, resultando em ambiguidade na rotulagem da identidade do site34. Nestes casos um tanto raros, o ETD fornece informações mais confiáveis. Consequentemente, se possível, alternar entre ambas as técnicas de dissociação pode ser útil. Como o DEPC pode rotular muitos tipos diferentes de resíduos, é comum que os isômeros de um determinado fragmento de peptídeo sejam gerados que diferem na cadeia lateral que é modificada. Muitas vezes, esses isômeros de peptídeos podem ser separados por LC, embora eles tendem a eluto em momentos muito semelhantes. Essa probabilidade deve ser considerada ao definir os tempos de exclusão de MS/MS durante análises automatizadas de LC-MS/MS. Normalmente, devem ser usados tempos de exclusão mais curtos do que o habitual.

Limitações
Embora o DEPC CL-MS seja tremendamente benéfico para estudar a estrutura e as interações proteicas, e progressos significativos foram feitos para abordar uma grande variedade de sistemas proteicos, algumas limitações dessa técnica permanecem. Se as condições de rotulagem não forem bem otimizadas (por exemplo, utilizando uma concentração muito alta de DEPC), a rotulagem excessiva pode perturbar a estrutura proteica e resultar em informações estruturais imprecisas14,23,24. Além disso, a precisão e precisão dos níveis de modificação medidos é afetada por vários fatores, incluindo perda de rótulos se as amostras se sentarem muito tempo antes da análise lc-MS e erros nas etapas de rotulagem química. A consistência em cada etapa experimental é importante para resultados confiáveis. Um dos problemas mais desafiadores atualmente associados ao CL-MS baseado em DEPC é o software de análise de dados. Os programas de análise de dados prontamente disponíveis não são otimizados para identificar com sucesso peptídeos com baixos percentuais de modificação (por exemplo, < 1%). Consequentemente, desenvolvemos e usamos softwares especializados para permitir que peptídeos com baixos níveis de modificação sejam facilmente identificados18.

Embora o DEPC CL-MS possa fornecer resolução estrutural de proteína moderada, uma estrutura 3D detalhada não pode ser obtida a partir da técnica de rotulagem. Recentemente, algumas ferramentas de previsão estrutural baseadas em dados de rotulagem foramdesenvolvidas 35,36. No entanto, mais desenvolvimentos são necessários para incorporar de forma ideal os resultados de rotulagem DEPC com modelagem computacional para prever a estrutura proteica.

Significância em comparação com métodos alternativos
A resolução estrutural possível com CL-MS baseada em DEPC é moderada quando comparada a técnicas como cristalografia de raios-X ou NMR, por isso é mais apropriado comparar a técnica com hdx-ms, XL-MS e outras abordagens cl-MS, ou footprinting. Como foi mencionado na introdução, o CL-MS é complementar ao HDX-MS porque fornece informações sobre as cadeias laterais de resíduos em uma proteína, enquanto o HDX-MS relata a estrutura e a dinâmica da coluna vertebral. Essa complementaridade permite que as duas técnicas sejam utilizadas em conjunto para obter informações mais estruturais, como tem sido demonstrado por diversos grupos37,38,39,40,41. Uma ideia emergente relevante para o CL-MS baseado em DEPC é a informação sinérgica que está disponível quando é usada em conjunto com o HDX-MS22. Devido aos prazos de rotulagem associados às duas técnicas, o CL-MS baseado em DEPC pode frequentemente esclarecer a ambiguidade com regiões proteicas que sofrem com a diminuição do HDX. A diminuição do HDX pode surgir da redução da acessibilidade dos solventes devido à vinculação ou diminuição da dinâmica proteica. As reações de DEPC são inerentemente 2-3 ordens de magnitude mais lentas do que as reações HDX, por isso a rotulagem DEPC não é afetada em grande parte por mudanças na dinâmica proteica, desde que não sejam acompanhadas por mudanças na acessibilidade de solventes.

O CL-MS tem algumas vantagens sobre os experimentos HDX-MS nesse rótulo e a perda de rótulos são mínimas quando as precauções apropriadas são tomadas. Em experimentos HDX, perda de rótulo ou back-exchange é uma característica padrão da técnica, e digestões rápidas e separações de LC em pH baixo são tentativas de minimizar esse problema. É importante reconhecer, porém, que a questão da troca de fundos é contrabalançada pelo maior número de sites rotulados que normalmente são medidos em HDX-MS. A rotulagem é um problema maior no HDX-MS porque informações incorretas seriam obtidas, por isso as condições de análise devem ser otimizadas para minimizar essa preocupação.

XL-MS e CL-MS têm vantagens semelhantes no que diz respeito à perda de rótulos e à scrambling, pois ambos envolvem a formação de um vínculo covalente que é robusto o suficiente para permanecer durante a digestão e as análises de LC-MS. O sequenciamento e identificação de peptídeos transversais, no entanto, é mais desafiador do que para peptídeos covalentemente rotulados, exigindo o uso de software especializado. Uma das principais vantagens que a XL-MS tem sobre o CL-MS é sua capacidade de fornecer restrições de distância, que podem ser valiosas ao prever ou reduzir possíveis estruturas proteicas. Os dados do CL-MS têm sido usados para facilitar a previsão da estrutura proteica36,42,43, mas esta área requer mais trabalho para atingir plenamente seu potencial.

Quando comparado com outros métodos cl-ms, incluindo aqueles que usam reagentes de rotulagem específicos ou não específicos, o DEPC tem algumas vantagens e desvantagens. Como métodos que usam reagentes específicos de aminoácidos, a rotulagem DEPC é simples; o reagente só precisa ser adicionado à amostra de interesse. Essa simplicidade contrasta com métodos como oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) ou HRF baseada em síncrotron que requerem fontes de luz sofisticadas para produzir radicais hidroxil. Ao contrário dos métodos que usam reagentes específicos, o DEPC pode rotular seis aminoácidos diferentes e o N-terminus, permitindo-lhe fornecer maior resolução estrutural. No entanto, o número de resíduos que podem ser rotulados pelo DEPC é menor do que o número que pode ser oxidado por radicais hidroxil, de modo que a resolução estrutural obtida pelo CL-MS baseado em DEPC é menor. Uma ramificação prática de menos resíduos que estão sendo rotulados pelo DEPC é que o uso do reagente às vezes não fornece todas as informações estruturais desejadas, e assim pode beneficiar-se de ser usado em conjunto com outros reagentes de rotulagem. Recentemente demonstramos o valor do uso do DEPC juntamente com o par de reagentes 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimida (EDC)/glycine ethyl éter (GEE), que pode rotular resíduos de glutamato e aspartato19.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores reconhecem o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o Grant R01 GM075092. O espectrômetro de massa Thermo Orbitrap Fusion usado para adquirir alguns dos dados aqui descritos foi adquirido com recursos do Instituto Nacional de Saúde s10OD010645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706

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Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa
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