Vi har utviklet en protokoll for å transfektere primære humane pigmentepitelceller ved elektroporering med genet som koder for pigmentepitelavledet faktor (PEDF) ved hjelp av Tornerose (SB) transposonsystemet. Vellykket transfeksjon ble demonstrert ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), immunoblotting og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).
Vårt stadig aldrende samfunn fører til en økende forekomst av nevrodegenerative sykdommer. Så langt er de patologiske mekanismene utilstrekkelig forstått, og hindrer dermed etableringen av definerte behandlinger. Cellebaserte additive genterapier for økt ekspresjon av en beskyttende faktor anses som et lovende alternativ for å medisinere nevrodegenerative sykdommer, for eksempel aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Vi har utviklet en metode for stabilt uttrykk av genet som koder for pigmentepitel-avledet faktor (PEDF), som er karakterisert som et nevrobeskyttende og antiangiogent protein i nervesystemet, inn i genomet til primære humane pigmentepitelceller (PE) ved hjelp av Tornerose (SB) transposonsystemet. Primære PE-celler ble isolert fra menneskelige donorøyne og opprettholdt i kultur. Etter å ha nådd sammenløp ble 1 x 104 celler suspendert i 11 μL resuspenderingsbuffer og kombinert med 2 μL av en renset løsning inneholdende 30 ng hyperaktiv SB (SB100X) transposaseplasmid og 470 ng PEDF transposon plasmid. Genmodifisering ble utført med et kapillær elektroporeringssystem ved bruk av følgende parametere: to pulser med en spenning på 1.100 V og en bredde på 20 ms. Transfiserte celler ble overført til kulturplater som inneholdt medium supplert med føtalt bovint serum; Antibiotika og antimykotika ble tilsatt ved første medium utveksling. Vellykket transfeksjon ble demonstrert i uavhengig utførte eksperimenter. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) viste økt ekspresjon av PEDF-transgenet . PEDF-sekresjonen var signifikant forhøyet og forble stabil, evaluert ved immunblotting, og kvantifisert ved enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). SB100X-mediert overføring tillot en stabil PEDF-genintegrasjon i genomet til PE-celler og sikret kontinuerlig sekresjon av PEDF , noe som er kritisk for utviklingen av en cellebasert gentilskuddsterapi for å behandle AMD eller andre retinale degenerative sykdommer. Videre indikerte analyse av integrasjonsprofilen til PEDF-transposonet til humane PE-celler en nesten tilfeldig genomisk fordeling.
Avansert alder er beskrevet å være den viktigste risikoen for nevrodegenerative sykdommer. Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), en polygen sykdom som fører til alvorlig synstap hos pasienter eldre enn 60 år, tilhører de fire vanligste årsakene til blindhet og synshemming1 og forventes å øke til 288 millioner mennesker i 20402. Dysfunksjoner av retinalpigmentepitelet (RPE), et enkelt lag med tettpakkede celler som ligger mellom choriocapillaris og retinale fotoreceptorer, bidrar til patogenesen av AMD. RPE oppfyller flere oppgaver som er avgjørende for en normal retinal funksjon3 og utskiller en rekke vekstfaktorer og faktorer som er avgjørende for å opprettholde den strukturelle integriteten til netthinnen og choriocapillaris, og støtter dermed fotoreseptoroverlevelse og gir grunnlag for sirkulasjon og tilførsel av næringsstoffer.
I sunne øyne er pigmentepitelavledet faktor (PEDF) ansvarlig for å balansere effekten av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og beskytter nevroner mot apoptose, forhindrer endotelcelleproliferasjon og stabiliserer kapillærendotelet. Et forskjøvet VEGF-til-PEDEF-forhold er relatert til okulær neovaskularisering, som ble observert i dyremodeller4,5 samt i prøver av pasienter med koroidal neovaskularisering (CNV) på grunn av AMD og proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den forbedrede VEGF-konsentrasjonen er målet for dagens standardbehandling. Anti-VEGF-legemidlene bevacizumab, ranibizumab, aflibercept og senest brolucizumab forbedrer synsstyrken hos omtrent en tredjedel av CNV-pasientene eller rettere stabiliserer synet i 90% av tilfellene11,12,13. De hyppige, ofte månedlige, intravitreale injeksjonene bærer imidlertid risikoen for bivirkninger14, svekker pasientetterlevelsen og representerer en betydelig økonomisk byrde for helsevesenet15. Videre reagerer en viss prosentandel av pasientene (2% -20%) ikke eller reagerer bare dårlig på anti-VEGF-terapien16,17,18,19. Disse negative sammenhengene nødvendiggjør utvikling av alternative behandlinger, f.eks. intraokulære implantater, celle- og/eller genterapeutiske tilnærminger.
Genterapi har utviklet seg som lovende behandling for arvelige og ikke-arvelige sykdommer og har til hensikt å gjenopprette ikke-funksjonelle gensekvenser eller undertrykke funksjonsfeil. For polygene sykdommer, hvor identifisering og erstatning av årsaksfaktorene knapt er mulig, tar strategier sikte på kontinuerlig levering av en beskyttende faktor. Når det gjelder AMD, er det utviklet forskjellige additive terapier, for eksempel stabilt ekspresjon av endostatin og angiostatin 20, VEGF-antagonisten løselig fms-lignende tyrosinkinase-1 (sFLT-1) 21,22, komplementregulerende proteinklynge av differensiering 59 (CD59) 23 eller PEDF 24,25 . Øyet, og spesielt netthinnen, er et utmerket mål for en genbasert medisinering på grunn av den lukkede strukturen, god tilgjengelighet, liten størrelse og immunprivilegi, noe som muliggjør en lokalisert levering av lave terapeutiske doser og gjør transplantasjoner mindre utsatt for avvisning. Videre muliggjør øyet ikke-invasiv overvåking, og netthinnen kan undersøkes ved hjelp av forskjellige bildebehandlingsteknikker.
Virale vektorer er, på grunn av deres høye transduksjonseffektivitet, det viktigste kjøretøyet for å levere terapeutiske gener til målceller. Avhengig av hvilken virusvektor som brukes, er det imidlertid beskrevet forskjellige bivirkninger, for eksempel immun- og inflammatoriske responser26, mutagene og onkogene effekter 27,28 eller spredning i andre vev29. Praktiske begrensninger inkluderer en begrenset emballasjestørrelse30, samt vanskeligheter og kostnader forbundet med produksjon av kliniske partier31,32. Disse ulempene har fremmet videreutvikling av ikke-virale, plasmidbaserte vektorer som overføres via lipo- / polyplexer, ultralyd eller elektroporering. Imidlertid blir genomisk integrasjon av transgenet i vertsgenomet vanligvis ikke fremmet med plasmidvektorer, noe som resulterer i et forbigående uttrykk.
Transposoner er naturlig forekommende DNA-fragmenter som endrer sin posisjon i genomet, en egenskap som er vedtatt for genterapi. På grunn av en aktiv integrasjonsmekanisme tillater transposonbaserte vektorsystemer et kontinuerlig og konstant uttrykk for det innsatte transgenet. Tornerosetransposonen, rekonstituert fra en gammel Tc1/mariner-type transposon funnet i fisk 33 og ytterligere forbedret ved molekylær evolusjon som resulterte i den hyperaktive varianten SB100X34, muliggjorde effektiv transposisjon i forskjellige primærceller og ble brukt til fenotypisk korreksjon i forskjellige sykdomsmodeller 35. For tiden er 13 kliniske studier initiert ved bruk av SB transposon-systemet. SB100X transposon-systemet består av to komponenter: transposonet, som består av genet av interesse flankert av terminale inverterte repetisjoner (TIR), og transposasen, som mobiliserer transposonet. Etter plasmid-DNA-levering til cellene binder transposasen TIR-ene og katalyserer eksisjonen og integrasjonen av transposonet i cellens genom.
Vi har utviklet en ikke-viral cellebasert additiv terapi for behandling av neovaskulær AMD. Tilnærmingen omfatter elektroporeringsbasert innsetting av PEDF-genet i primære pigmentepitelceller (PE) ved hjelp av SB100X transposonsystemet36,37,38. Den genetiske informasjonen til transposasen og PEDF er gitt på separate plasmider, og muliggjør dermed justering av det ideelle SB100X-til-PEDF transposonforholdet. Elektroporering utføres ved hjelp av et pipettebasert kapillærtransfeksjonssystem som er preget av en maksimert gapstørrelse mellom elektrodene samtidig som overflatearealet minimeres. Enheten ble vist å oppnå gode transfeksjonshastigheter i et bredt spekter av pattedyrceller 39,40,41. Den lille elektrodeoverflaten gir et jevnt elektrisk felt og reduserer de ulike bivirkningene av elektrolyse42.
Den anti-angiogene funksjonaliteten til PEDF utskilt av transfekterte pigmentepitelceller ble vist i forskjellige in vitro-eksperimenter som analyserte spiring, migrasjon og apoptose av humane navlestrengendotelceller43. I tillegg viste transplantasjon av PEDF-transfekterte celler i en kaninmodell av hornhinnen neovaskularisering44 samt en rottemodell av CNV43,45,46 nedgang i neovaskularisering.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for stabil innsetting av PEDF-genet i primære humane RPE-celler via SB100X transposon-systemet ved hjelp av et kapillærtransfeksjonssystem. De transfiserte cellene ble holdt i kultur i 21 dager og deretter analysert i form av PEDF-genuttrykk ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) og i form av PEDF-proteinsekresjon ved immunoblotting og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA, figur 1).
I vårt prosjekt tar vi sikte på ikke-viral produksjon av genmodifiserte primære humane RPE-celler som kontinuerlig overuttrykker og utskiller en effektiv faktor for å bruke de transfiserte cellene som langsiktig terapeutisk for etablering og vedlikehold av et beskyttende miljø. Vi har etablert introduksjonen av genet som koder for PEDF, et allestedsnærværende uttrykt multifunksjonelt protein med antiangiogene og nevrobeskyttende funksjoner. Protokollen beskrevet her kan brukes til stabilt og reproduserbart transfe…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av EUs syvende rammeprogram for forskning, teknologisk utvikling og demonstrasjon, tilskuddsavtale nr. 305134. Zsuzsanna Izsvák ble finansiert av Det europeiske forskningsrådet, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Forfatterne vil gjerne takke Anna Dobias og Antje Schiefer (Øyeavdelingen, Universitetssykehuset RWTH Aachen) for utmerket teknisk støtte, og Aachen Cornea Bank (Øyeavdelingen, Universitetssykehuset RWTH Aachen) for å gi den menneskelige donorøyne.
Isolation of primary human RPE cells | |||
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
Electroporation of primary human RPE cells | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
2x SDS Sample Buffer | |||
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |