Summary

Elektroporeringsbasert genetisk modifisering av primære humane pigmentepitelceller ved bruk av Tornerose Transposon-systemet

Published: February 04, 2021
doi:

Summary

Vi har utviklet en protokoll for å transfektere primære humane pigmentepitelceller ved elektroporering med genet som koder for pigmentepitelavledet faktor (PEDF) ved hjelp av Tornerose (SB) transposonsystemet. Vellykket transfeksjon ble demonstrert ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), immunoblotting og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).

Abstract

Vårt stadig aldrende samfunn fører til en økende forekomst av nevrodegenerative sykdommer. Så langt er de patologiske mekanismene utilstrekkelig forstått, og hindrer dermed etableringen av definerte behandlinger. Cellebaserte additive genterapier for økt ekspresjon av en beskyttende faktor anses som et lovende alternativ for å medisinere nevrodegenerative sykdommer, for eksempel aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Vi har utviklet en metode for stabilt uttrykk av genet som koder for pigmentepitel-avledet faktor (PEDF), som er karakterisert som et nevrobeskyttende og antiangiogent protein i nervesystemet, inn i genomet til primære humane pigmentepitelceller (PE) ved hjelp av Tornerose (SB) transposonsystemet. Primære PE-celler ble isolert fra menneskelige donorøyne og opprettholdt i kultur. Etter å ha nådd sammenløp ble 1 x 104 celler suspendert i 11 μL resuspenderingsbuffer og kombinert med 2 μL av en renset løsning inneholdende 30 ng hyperaktiv SB (SB100X) transposaseplasmid og 470 ng PEDF transposon plasmid. Genmodifisering ble utført med et kapillær elektroporeringssystem ved bruk av følgende parametere: to pulser med en spenning på 1.100 V og en bredde på 20 ms. Transfiserte celler ble overført til kulturplater som inneholdt medium supplert med føtalt bovint serum; Antibiotika og antimykotika ble tilsatt ved første medium utveksling. Vellykket transfeksjon ble demonstrert i uavhengig utførte eksperimenter. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) viste økt ekspresjon av PEDF-transgenet . PEDF-sekresjonen var signifikant forhøyet og forble stabil, evaluert ved immunblotting, og kvantifisert ved enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). SB100X-mediert overføring tillot en stabil PEDF-genintegrasjon i genomet til PE-celler og sikret kontinuerlig sekresjon av PEDF , noe som er kritisk for utviklingen av en cellebasert gentilskuddsterapi for å behandle AMD eller andre retinale degenerative sykdommer. Videre indikerte analyse av integrasjonsprofilen til PEDF-transposonet til humane PE-celler en nesten tilfeldig genomisk fordeling.

Introduction

Avansert alder er beskrevet å være den viktigste risikoen for nevrodegenerative sykdommer. Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), en polygen sykdom som fører til alvorlig synstap hos pasienter eldre enn 60 år, tilhører de fire vanligste årsakene til blindhet og synshemming1 og forventes å øke til 288 millioner mennesker i 20402. Dysfunksjoner av retinalpigmentepitelet (RPE), et enkelt lag med tettpakkede celler som ligger mellom choriocapillaris og retinale fotoreceptorer, bidrar til patogenesen av AMD. RPE oppfyller flere oppgaver som er avgjørende for en normal retinal funksjon3 og utskiller en rekke vekstfaktorer og faktorer som er avgjørende for å opprettholde den strukturelle integriteten til netthinnen og choriocapillaris, og støtter dermed fotoreseptoroverlevelse og gir grunnlag for sirkulasjon og tilførsel av næringsstoffer.

I sunne øyne er pigmentepitelavledet faktor (PEDF) ansvarlig for å balansere effekten av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og beskytter nevroner mot apoptose, forhindrer endotelcelleproliferasjon og stabiliserer kapillærendotelet. Et forskjøvet VEGF-til-PEDEF-forhold er relatert til okulær neovaskularisering, som ble observert i dyremodeller4,5 samt i prøver av pasienter med koroidal neovaskularisering (CNV) på grunn av AMD og proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den forbedrede VEGF-konsentrasjonen er målet for dagens standardbehandling. Anti-VEGF-legemidlene bevacizumab, ranibizumab, aflibercept og senest brolucizumab forbedrer synsstyrken hos omtrent en tredjedel av CNV-pasientene eller rettere stabiliserer synet i 90% av tilfellene11,12,13. De hyppige, ofte månedlige, intravitreale injeksjonene bærer imidlertid risikoen for bivirkninger14, svekker pasientetterlevelsen og representerer en betydelig økonomisk byrde for helsevesenet15. Videre reagerer en viss prosentandel av pasientene (2% -20%) ikke eller reagerer bare dårlig på anti-VEGF-terapien16,17,18,19. Disse negative sammenhengene nødvendiggjør utvikling av alternative behandlinger, f.eks. intraokulære implantater, celle- og/eller genterapeutiske tilnærminger.

Genterapi har utviklet seg som lovende behandling for arvelige og ikke-arvelige sykdommer og har til hensikt å gjenopprette ikke-funksjonelle gensekvenser eller undertrykke funksjonsfeil. For polygene sykdommer, hvor identifisering og erstatning av årsaksfaktorene knapt er mulig, tar strategier sikte på kontinuerlig levering av en beskyttende faktor. Når det gjelder AMD, er det utviklet forskjellige additive terapier, for eksempel stabilt ekspresjon av endostatin og angiostatin 20, VEGF-antagonisten løselig fms-lignende tyrosinkinase-1 (sFLT-1) 21,22, komplementregulerende proteinklynge av differensiering 59 (CD59) 23 eller PEDF 24,25 . Øyet, og spesielt netthinnen, er et utmerket mål for en genbasert medisinering på grunn av den lukkede strukturen, god tilgjengelighet, liten størrelse og immunprivilegi, noe som muliggjør en lokalisert levering av lave terapeutiske doser og gjør transplantasjoner mindre utsatt for avvisning. Videre muliggjør øyet ikke-invasiv overvåking, og netthinnen kan undersøkes ved hjelp av forskjellige bildebehandlingsteknikker.

Virale vektorer er, på grunn av deres høye transduksjonseffektivitet, det viktigste kjøretøyet for å levere terapeutiske gener til målceller. Avhengig av hvilken virusvektor som brukes, er det imidlertid beskrevet forskjellige bivirkninger, for eksempel immun- og inflammatoriske responser26, mutagene og onkogene effekter 27,28 eller spredning i andre vev29. Praktiske begrensninger inkluderer en begrenset emballasjestørrelse30, samt vanskeligheter og kostnader forbundet med produksjon av kliniske partier31,32. Disse ulempene har fremmet videreutvikling av ikke-virale, plasmidbaserte vektorer som overføres via lipo- / polyplexer, ultralyd eller elektroporering. Imidlertid blir genomisk integrasjon av transgenet i vertsgenomet vanligvis ikke fremmet med plasmidvektorer, noe som resulterer i et forbigående uttrykk.

Transposoner er naturlig forekommende DNA-fragmenter som endrer sin posisjon i genomet, en egenskap som er vedtatt for genterapi. På grunn av en aktiv integrasjonsmekanisme tillater transposonbaserte vektorsystemer et kontinuerlig og konstant uttrykk for det innsatte transgenet. Tornerosetransposonen, rekonstituert fra en gammel Tc1/mariner-type transposon funnet i fisk 33 og ytterligere forbedret ved molekylær evolusjon som resulterte i den hyperaktive varianten SB100X34, muliggjorde effektiv transposisjon i forskjellige primærceller og ble brukt til fenotypisk korreksjon i forskjellige sykdomsmodeller 35. For tiden er 13 kliniske studier initiert ved bruk av SB transposon-systemet. SB100X transposon-systemet består av to komponenter: transposonet, som består av genet av interesse flankert av terminale inverterte repetisjoner (TIR), og transposasen, som mobiliserer transposonet. Etter plasmid-DNA-levering til cellene binder transposasen TIR-ene og katalyserer eksisjonen og integrasjonen av transposonet i cellens genom.

Vi har utviklet en ikke-viral cellebasert additiv terapi for behandling av neovaskulær AMD. Tilnærmingen omfatter elektroporeringsbasert innsetting av PEDF-genet i primære pigmentepitelceller (PE) ved hjelp av SB100X transposonsystemet36,37,38. Den genetiske informasjonen til transposasen og PEDF er gitt på separate plasmider, og muliggjør dermed justering av det ideelle SB100X-til-PEDF transposonforholdet. Elektroporering utføres ved hjelp av et pipettebasert kapillærtransfeksjonssystem som er preget av en maksimert gapstørrelse mellom elektrodene samtidig som overflatearealet minimeres. Enheten ble vist å oppnå gode transfeksjonshastigheter i et bredt spekter av pattedyrceller 39,40,41. Den lille elektrodeoverflaten gir et jevnt elektrisk felt og reduserer de ulike bivirkningene av elektrolyse42.

Den anti-angiogene funksjonaliteten til PEDF utskilt av transfekterte pigmentepitelceller ble vist i forskjellige in vitro-eksperimenter som analyserte spiring, migrasjon og apoptose av humane navlestrengendotelceller43. I tillegg viste transplantasjon av PEDF-transfekterte celler i en kaninmodell av hornhinnen neovaskularisering44 samt en rottemodell av CNV43,45,46 nedgang i neovaskularisering.

Her beskriver vi en detaljert protokoll for stabil innsetting av PEDF-genet i primære humane RPE-celler via SB100X transposon-systemet ved hjelp av et kapillærtransfeksjonssystem. De transfiserte cellene ble holdt i kultur i 21 dager og deretter analysert i form av PEDF-genuttrykk ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) og i form av PEDF-proteinsekresjon ved immunoblotting og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA, figur 1).

Protocol

Donorøyne hos mennesker ble innhentet fra Aachen Cornea Bank ved Øyeavdelingen (Universitetssykehuset RWTH Aachen) etter å ha innhentet informert samtykke i samsvar med Helsinkideklarasjonens protokoller. Prosedyrer for innsamling og bruk av prøver fra mennesker er godkjent av institusjonens etiske komité. 1. Isolering av primære humane RPE-celler Legg ut sterile verneklær og hansker. Plasser en steril drapering under en laminær strøm. Plasser sterile forberedelses…

Representative Results

Dyrking og elektroporering av primære humane RPE-cellerVi har vist at såing av et tilstrekkelig antall primære RPE-celler av animalsk opprinnelse muliggjør dyrking og vekst til et integrert monolag av pigmenterte, sekskantede celler36,37,48. Deres evne til å danne tette kryss, å utvise fagocytisk aktivitet og å uttrykke spesifikke markørgener in vitro<sup class="xref"…

Discussion

I vårt prosjekt tar vi sikte på ikke-viral produksjon av genmodifiserte primære humane RPE-celler som kontinuerlig overuttrykker og utskiller en effektiv faktor for å bruke de transfiserte cellene som langsiktig terapeutisk for etablering og vedlikehold av et beskyttende miljø. Vi har etablert introduksjonen av genet som koder for PEDF, et allestedsnærværende uttrykt multifunksjonelt protein med antiangiogene og nevrobeskyttende funksjoner. Protokollen beskrevet her kan brukes til stabilt og reproduserbart transfe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av EUs syvende rammeprogram for forskning, teknologisk utvikling og demonstrasjon, tilskuddsavtale nr. 305134. Zsuzsanna Izsvák ble finansiert av Det europeiske forskningsrådet, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Forfatterne vil gjerne takke Anna Dobias og Antje Schiefer (Øyeavdelingen, Universitetssykehuset RWTH Aachen) for utmerket teknisk støtte, og Aachen Cornea Bank (Øyeavdelingen, Universitetssykehuset RWTH Aachen) for å gi den menneskelige donorøyne.

Materials

Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Colibri Forceps Geuder, Heidelberg, Germany G-18950
Curved Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18856
Disposable Scalpel (No. 11) Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor  Geuder, Heidelberg, Germany G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Glass Pasteur Pipettes Brand, Wertheim, Germany 747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress  Fink-Walter, Merchweiler, Germany 321063
Sterile Gloves Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) Corning, Corning, NY 351007
Sterile Surgical Gown Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 150628
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Inverted Microscope Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ Biochrom, Berlin, Germany L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane Cytiva, Marlborough, MA 10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) BioProducts, Middletown, MD AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) Qiagen, Hilden, Germany 34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) 
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) Agilent Dako, Santa Clara, CA P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) Abcam, Cambridge, United Kingdom ab6721
Human PEDF ELISA Kit  BioProducts, Middletown, MD PED613
LAS-3000 Imaging System Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Roche Life Science, Penzberg, Germany 12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl) Roche Life Science, Penzberg, Germany 4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658004
Ni-NTA Superflow Qiagen, Hilden, Germany 30410
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1645050
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 51304
Reverse Transcription System  Promega, Madison, WI A3500
RNase-Free DNase Set Qiagen, Hilden, Germany 79254
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104
Rocking Shaker Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1704150
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054

References

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina – The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD – from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C – Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Play Video

Cite This Article
Johnen, S., Harmening, N., Marie, C., Scherman, D., Izsvák, Z., Ivics, Z., Walter, P., Thumann, G. Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System. J. Vis. Exp. (168), e61987, doi:10.3791/61987 (2021).

View Video