Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Trinvis celle såning på Tessellated stilladser til undersøgelse spirende blodkar

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61995
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Manipuleret væv er stærkt afhængige af ordentlige vaskulære netværk til at levere vitale næringsstoffer og gasser og fjerne metabolisk affald. I dette arbejde skaber en trinvis såningsprotokol af endotelceller og støtteceller højt organiserede vaskulære netværk i en højoverførselshastighedsplatform til undersøgelse af udvikling af fartøjsadfærd i et kontrolleret 3D-miljø.

Abstract

Det kardiovaskulære system er en central aktør i menneskets fysiologi, der giver næring til de fleste væv i kroppen; forskellige størrelser, strukturer, fænotyper og ydeevne afhængigt af hvert enkelt perfunderet væv. Området for vævsteknik, som har til formål at reparere eller erstatte beskadigede eller manglende kropsvæv, er afhængig af kontrolleret angiogenese for at skabe en ordentlig vaskularisering inden for de manipulerede væv. Uden et vaskulært system kan tykke konstruerede konstruktioner ikke næres tilstrækkeligt, hvilket kan resultere i celledød, dårlig engraftment og i sidste ende fiasko. Således, forståelse og kontrol af adfærd manipuleret blodkar er en enestående udfordring på området. Dette arbejde præsenterer et højoverførselssystem, der giver mulighed for oprettelse af organiserede og repeterbare fartøjsnetværk til at studere fartøjsadfærd i et 3D-stilladsmiljø. Denne totrins såningsprotokol viser, at fartøjer i systemet reagerer på stilladstopografien og udviser karakteristisk spiringsadfærd afhængigt af rumgeometrien, hvor fartøjerne bor. De opnåede resultater og forståelse fra dette højoverførselssystem kan anvendes til at informere bedre 3D bioprintede stilladskonstruktionsdesign, hvor fremstilling af forskellige 3D-geometrier ikke hurtigt kan vurderes, når der anvendes 3D-udskrivning som grundlag for cellulære biologiske miljøer. Desuden kan forståelsen fra dette høje gennemløbssystem anvendes til forbedring af hurtig lægemiddelscreening, den hurtige udvikling af samkulturmodeller og undersøgelse af mekaniske stimuli på blodkardannelse for at uddybe kendskabet til det vaskulære system.

Introduction

Vævsteknikken udvikler sig hurtigt i retning af fremstilling af konstruerede konstruktioner til erstatning for manglende eller beskadigede organer og væv1. Der er dog endnu ikke opnået fuldt funktionelle konstruktioner, da det fortsat er en enestående udfordring at generere operationelle vaskulære netværk til vævsernæring. Uden korrekt vaskularisering er manipuleret væv begrænset til en passiv diffusionstransport af ilt og næringsstoffer, der begrænser den maksimale levedygtige vævstykkelse til diffusionsgrænsen, ca. 200 μm2. Sådanne tykkelser er ikke egnede til at reparere store vævsdefekter eller til fuld organfremstilling, hvilket gør tilstedeværelsen af funktionelt vaskulært netværk til en obligatorisk egenskab for funktionelle og implantable væv3.

Det vaskulære system består af en bred vifte af blodkar, med forskellige størrelser, fænotyper og organisation, tæt relateret til værtsvævet. Forståelse af adfærd, reaktion og migration beslutninger truffet af udviklingslandene og spirende fartøjer kan instruere deres integration i manipuleret væv4. I øjeblikket er den mest almindelige tilgang til oprettelse af in vitro vaskulære netværk at kombinere endotelceller (ECs) med støtteceller (SCs, med evnen til at differentiere sig til vægmalericeller), seedet i et tredimensionelt mikromiljø. Dette miljø giver kemiske og fysiske signaler, så cellerne kan fastgøres, formere sig og samle sig i fartøjsnetværk2,5,6,7,8. Når SCs er medkulturerede, udskiller de ekstracellulære matrixproteiner (ECM), samtidig med at de yder mekanisk støtte til EC'erne, som danner de rørformede strukturer. Desuden fremmer en krydsinteraktion mellem begge celletyper tubulogenese, karspiring og migration ud over SCs modning og differentiering i α glatte muskelaktilkende (αSMA) vægmalericeller4. Udvikling af fartøjsnetværk studeres oftest i 3D-miljøer, der er skabt ved hjælp af hydrogeler, porøse polymere stilladser eller en kombination heraf. Sidstnævnte mulighed giver ligeledes et cellevenligt miljø og den nødvendige mekaniske støtte til både cellerne og ECM9.

Der er udført en stor mængde arbejde for at undersøge vaskulær udvikling, herunder fælles dyrkning af cellerne på hydrogels10, hydrogels-stilladskombinationer11,12, 2D-platforme og mikrofluidiske anordninger13. Hydrogels kan dog let deformeres af de celleudførte kræfter14, mens 2D- og mikrofluidics-systemer ikke genskaber et tættere på naturen-miljø for at opnå en mere ekstrapolatablerespons 15,16. At forstå, hvordan dannende fartøjer reagerer på deres omgivende miljø, kan give kritisk indsigt, der kan give mulighed for fremstilling af konstruerede miljøer med evnen til at styre skibets udvikling på en forudsigelig måde. Forståelse vaskulære dannelse fænomener er især afgørende for at holde trit med den hurtige fremkomsten af submicron-til-mikron skala fabrikation teknikker, såsom stereolitografi, digital projektion litografi, kontinuerlig flydende interface produktion, 3D smelte-elektro jetwriting, løsning baseret 3D elektro jet skriftligt, og nye bioprint teknikker17,18,19,20,21. Tilpasning af kontrollen af disse mikrofabrikationsteknikker med en uddybet forståelse af vaskulær biologi er nøglen til skabelsen af en passende manipuleret vaskulatur til et målvæv.

Her præsenterer vi et 3D-system til at studere reaktionen fra nye dannende og spirende fartøjer på den omgivende stilladsgeometri, observere deres spire oprindelse og efterfølgende migration22. Ved at bruge 3D stilladser med tessellated rum geometrier, og en to-trins såning teknik, lykkedes det os at skabe højt organiserede vaskulære netværk i en klar og nem at analysere mode. De tessellerede geometrier giver et højgennemstrømningssystem med individuelle enheder, der indeholder fartøjer, der reagerer på deres lokale miljø. Ved hjælp af flerfarvede ECs sporede vi spiredannelsesoprindelse og efterfølgende migrationsmønstre, korreleret med rumgeometrien og SCs-placeringen22.

Selvom den foreslåede protokol er blevet forberedt til at analysere virkningerne af geometriske signaler på vaskulæriseringsadfærd, kan denne tilgang udvides og anvendes på en række nye applikationer. Det tessellerede stillads og de let billedlige netværk giver mulighed for en enkel analyse af forskellige ECs og SCs interaktion, tilføjelse af specifikke organceller og deres interaktion med de vaskulære netværk, lægemiddeleffekt på vaskulære netværk og meget mere. Vores foreslåede systemresultater er meget alsidige og af enkel fabrikation og forarbejdning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tessellated stillads fabrikation

BEMÆRK: Fotolithografi er en udbredt teknik, der kræver specialiseret udstyr, der typisk er anbragt i et nanofabrik/laboratorium. Den metode, der er fastsat i denne protokol, blev generaliseret så meget som muligt for publikum; det kan dog være nødvendigt med mindre ændringer af procedurerne afhængigt af det udstyr, der er til rådighed for læseren. Vi anbefaler, at du udfører disse procedurer i et rent rum på et nanofabrik for at sikre den højeste proceskvalitet. Før du begynder, få adgang til en maske-aligner (eller nogle UV-eksponering set-up), en spin coater, kogeplader, et opløsningsmiddel vaskestation, en fotomaske, og en plasma renere. De opløsningsmidler og kemikalier, der anvendes i proceduren, er farlige, så vær yderst omhyggelig med at undgå kemisk eksponering. Når du designer fotomasken, skal du identificere, hvilken størrelse siliciumskiver og fotomasker der er kompatible med spin-coateren og maske-aligneren. Derudover er fotoresisten placeret mod kanterne af siliciumskiver typisk deformeret fra håndtering; derfor gøre design mod centrum af wafer.

  1. Forbered stilladser ved hjælp af en fotolitografiteknik med den valgte geometri af interesse.
    1. Før spin belægning, rengør silicium wafer. Dette kan gøres med plasmarensning eller en opløsningsmiddelbaseret teknik. Hvis plasmarensningen finder du, skal du følge instrumentets standardprocedure for at få detaljerede oplysninger. Spray med komprimeret nitrogengas og undersøg waferen for at sikre, at den er fri for snavs før spin-coating. Dette vaffel vil fungere som det substrat, som stilladserne er skabt på.
      BEMÆRK: For de bedste resultater starter med en frisk wafer. Wafere kan genbruges, men skal være fri for gamle fotoresist, overfladefejl og snavs. Det er nyttigt at bruge wafer-pincet til håndtering.
    2. Centrer en siliciumskiver på spin-coater chucken ved hjælp af en guide. Drej kortvarigt waferen for at sikre, at den er korrekt centreret på spændepatronen, juster efter behov, indtil den er korrekt centreret. Dette skal gøres, hver gang en wafer placeres på spin-coateren. Dispenser 1-4 mL af lift-off reagenset på waferen (dette afhænger af waferens størrelse). Ca. 2 mL lift-off reagens fungerer godt for en 4-tommer wafer.
      1. Indstil spin-coater sprede hastighed ved 500 omdrejninger i minuttet i 5 sekunder, og spin-hastighed til 1000 omdrejninger i 30 sekunder, derefter dreje lift-off reagens. Undersøg waferen for at sikre, at den har en jævn belægning over waferen. Alt snavs tilbage på wafer vil være meget indlysende på dette punkt. Eventuelle stilladser i et område med snavs vil sandsynligvis være ubrugelige. Efter spinbelægning overføres til en kogeplade og bages i 1 minut ved 200 °C.
    3. Gentag det foregående trin to gange mere for i alt tre belægninger.
    4. Spin-coat lift-off reagensbelagt silicium wafer med SU-8 2050 fotoresist indtil opnå en tykkelse på ca 100 μm.
      1. 1 mL modstandsstæng for hver 25 mm substratdiameter.
        BEMÆRK: Pas på at undgå bobler, mens du hælder modstanden. For SU-8 2050, hælde ca en 2-tommer diameter cirkel, når du bruger en 4-tommer silicium wafer fungerer godt.
      2. Spin-coat SU-8 2050. Spred med en hastighed på 500 omdrejninger i minuttet i 5 sekunder, efterfulgt af en spin hastighed mellem 1700 til 1800 omdrejninger i minuttet for at opnå ca 100 μm tykkelse.
      3. Valgfrit: Efter spinding skal de spin coatede vafler afgases natten over på en plan overflade, der er beskyttet mod lys før forbagningen. Dette kan bidrage til at befri modstå af eventuelle bobler og tillade fejl til niveau ud.
        BEMÆRK: Modstandens faktiske tykkelse og de resulterende stilladser kan variere med brugerfejl og udstyrsparametre. Derfor bør tykkelsen af stilladserne verificeres senere i trin 1.6. Rediger spin coating procedurer i overensstemmelse hermed for at opnå den ønskede tykkelse.
    5. Før eksponeringen forbehandles vaflerne ved 65 °C i 10 min. og derefter 95 °C i 40-50 min. Før eksponering testes modstandens overflade ved at trykke på kanten med et par pincet for at sikre, at den ikke længere er klæbrig/tyktflydende. Det er nyttigt at trække wafer ud af kogepladen og lad den køle af i 0,5-1 minutter, før du vurderer klæbrigheden.
      BEMÆRK: Langsomme temperaturrampetider (opvarmning og køling) kan hjælpe med at forhindre vridning af stilladserne.
  2. Fotoresisten udsættes for UV-lys (350-400 nm) gennem en fotomaske med en eksponeringsenergi på 215-240 mJ/cm2 for en modstandstykkelse på 85 - 110 μm. Se fotoresistproducentens retningslinjer for anbefalede sammenhænge mellem energitykkelser.
    1. Sørg for, at eksponeringen er korrekt kalibreret, så energien verificeres. Juster eksponeringstiden efter behov for at opnå den ønskede eksponeringsenergi. Desuden kan maske aligners give mulighed for forskellige eksponeringstilstande: vakuumkontakt, hård kontakt, blød kontakt og nærhedskontakt (specifikke udtryk kan variere). Generelt vil disse påvirke opløsningen og funktionsjusteringen. Forfatterne brugte typisk en "hård kontakt" mode.
    2. For små funktioner eller flere lag, hvor tilpasningen vil sagen, overveje eksponeringstilstande og maske aligner procedurer mere omhyggeligt. Sørg for at overveje modstandens højde, når du justerer tykkelsesværdien. Se standardprocedurerne for din maske-aligner for at få oplysninger om driften.
      BEMÆRK: Fotomaskens design bestemmer stilladsernes størrelse, rumgeometri og antallet af stilladser, der opnås pr. parti. Brugen af et hårdt glas eller kvarts fotomaske vil give den højeste opløsning; En blød polymer transparent filmfotomaske kan dog generelt bruges til disse store funktionsstørrelser (> 10 μm). Brugen af en filmfotomaske kan føre til topografiske træk langs stilladsporernes z-akse som følge af dårligere funktionsopløsning. Dette kan potentielt have indflydelse på celleadfærd. Kontroller den ønskede løsning rådføre sig med hvem der producerer fotomasken for at sikre, at den ønskede opløsning opnås.
  3. Waferen bages umiddelbart efter UV-eksponering ved 65 °C i 2-5 minutter og derefter ved 95 °C i 8-10 minutter.
  4. Udvikle stilladser til at fjerne ubebyggede modstå.
    1. Fordyb stilladserne ved hjælp af et lavt volumen SU-8 udvikleropløsning i 7-10 minutter for at opløse enhver uudviklet modstand.
    2. Skyl med isopropylalkohol (IPA).
    3. Tør wafer med komprimeret nitrogen.
      BEMÆRK: Pas på, at stilladserne ikke frigives for tidligt under trin 1.4. Lave mængder af udvikler og skånsom håndtering er nødvendige for at opnå dette.
  5. Efter udvikling bages vaflerne ved 150 °C i 15 min.
    BEMÆRK: Når kogepladen er færdig, kan det være en fordel at slukke for kogepladen, så vaflerne kan køle meget langsomt af, så de ikke fordrejer/krøller de sidste stilladser.
  6. Valgfrit: Efter den hårde bage og før lift-off, vurdere stillads tykkelse, da stilladser stadig skal forsigtigt klæbes til overfladen af wafer. I forbindelse med denne procedure fungerer kontaktprofilering godt. der kan dog anvendes en passende metode.
  7. Løft stilladserne af waferen.
    1. Nedsænk stilladserne i SU-8-udvikleren, så de straks løfter waferen af. Hvis stilladser ikke løftes af, skal du forsigtigt skubbe stilladserne med et par wafer-pincet.
    2. Fjern overskydende udvikler.
    3. Overfør stilladserne i ny beholder og nedsænkes i isopropylalkohol. Skyl i IPA i mindst 6 gange for at sikre, at alle udviklere er blevet fjernet.
  8. Lufttørre stilladserne i mindst en uge før brug.

2. Stillads fibronectin belægning

  1. Til desinfektion nedsænkes stilladserne i 70% ethanol (v/v) i mindst 15 minutter, og der vaskes 2 gange i fosfatstødpudesalsallinje (PBS) før brug.
    ADVARSEL: SU-8 stilladserne er skrøbelige og kan nemt gå i stykker. Håndtering anbefales ved hjælp af stumpe og buede spids tang, og de bør håndteres med største omhu. Lettere håndtering kan opnås ved at nedsænke stilladserne i væske for at undgå elektrostatiske interaktioner mellem stilladserne og overfladen.
  2. Der fremstilles en fortynding på 50 μg/mL human fibronectin i PBS, og stilladserne dækkes ved hjælp af protein adsorption.
    1. 1,5 μL fibronectinbestandopløsning (1 mg/ml) blandes med 28,5 μL PBS pr. stillads, der skal sås. Forbered helst kun en fibronectinfortynding, der skal bruges til alle stilladser for at undgå pipetteringsfejl.
      1. For 10 stilladser blandes 15 μL lagerfibronectinopløsning i 285 μL PBS, svarende til i alt 300 μL μL μg/mL fibronectinfortynding.
    2. Stilladserne anbringes sparsomt oven på en hydrofobisk overflade (dvs. ikke-vævskultur (nonTC) 10 cm skål) og hvert stillads dækkes med 30 μL af fibronectinfortyndingen, der fremstilles i trin 2.2.1.
      ADVARSEL: Sørg for, at der ikke er bobler fanget i stilladsrummene. Hvis der er bobler til stede, kan de fjernes ved forsigtigt at ryste stilladset i dråben eller lette pipetter.
    3. Pladens låg udskiftes, og de fibronectindækkede stilladser anbringes i en inkubator med 37 °C og 100 % fugtighed i mindst en time.
    4. Efter inkubation skylles stilladserne i PBS let for at fjerne fibronectinrester. Stilladserne kan opbevares i PBS ved 4 °C i op til en uge før brug.

3. Endotelceller såning

  1. Forbered EF-medium ved at blande det basale medium med dets korrespondent medium kit komponenter, herunder en antibiotisk opløsning (Pen / Strep), føtal kvæg serum (FBS), og endotelcelle væksttilskud, som angivet af producenten.
  2. Lav en human fedt mikrovaskulær endotelcelle (HAMEC) suspension i EF-medium med en koncentration på 4 x 106 celler/mL.
    BEMÆRK: Realtidsbilleddannelse kan udføres, hvis de anvendte endotelceller tidligere transfected til at udtrykke et fluorescerende protein, eller forfarvet ved hjælp af en ikke-giftig cytoplasmisk membran farvestof (yderligere benævnt ECs).
  3. Brug pincet, placere en fibronectin-belagt stillads per brønd på en nonTC 24-godt plade godt.
  4. Dæk hvert stillads med 25 μL dråber af HAMEC-suspensionen. Pas på ikke at lade suspensionen flyde væk fra stilladset, da det kan hindre celle vedhæftning.
  5. Læg låget på pladen og læg den i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2 og 100% fugtighed. Lad inkubere i mindst 60 minutter og højst 90 minutter.
    BEMÆRK: Under inkubationen forbedrer placering af pladen på en orbital shaker i inkubatoren celletilbehøret på stilladsets vægge. Orbital shakeren bør indstilles til højst 5 omdrejninger i minuttet.
  6. Efter inkubation fyldes hver brønd med 700 μL EF-medium ved hjælp af en pipette.
    BEMÆRK: Forvent at se ECs i bunden af brønden, da nogle af cellerne ikke tillægger stilladset og falder gennem stilladsets hulrum.
  7. Inkubat de endoteliserede stilladser, indtil EF-sammenløbet kan observeres ved hjælp af fluorescerende mikroskopi på stilladsets vægge (ved brug af mærkede ECs) eller i 3 dage (ved brug af ikke-mærkede ECs), hvilket giver tilstrækkelig tid til at opnå EF-sammenløb. Skift mediet hver anden dag.

4. Støtte celle såning og co-kultur

  1. Forbered tandpulp stamcelle (DPSC) medium (DPSCm) ved at blande 500 ml lavglukose Dulbecco modificerede Eagle medium (lav glukose DMEM), 57,5 ml FBS, 5,75 ml ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 5,75 ml GlutaMAX og 5,75 ml penicillin-streptomycin-nystatinopløsning.
  2. Overfør de endoteliserede stilladser til en ny ikke-TC 24-brønds plade for at kassere EC'er, der er fastgjort til brøndenes bund ved hjælp af pincet.
    1. Kassér alle medier fra den aktuelle plade ved hjælp af en 1 mL pipette eller vakuumsugning. Pas på ikke at påføre vakuum lige på stilladset.
    2. Placer et stillads per brønd, helst i midten af brønden for at undgå at løbe væske mod væggene på grund af overfladespændingseffekter. Tør området omkring stilladset med let vakuum, men undgå fuldstændig tørring af stilladset.
  3. Forbered en DPSC suspension i fibrin pre-gel løsning.
    1. Thrombin- og fibrinogenbestandsopløsninger fortyndes med PBS, indtil der opnås en endelig koncentration på henholdsvis 5 U/mL og 15 mg/mL.
    2. Forbered en 8 x 106 DPSC/mL suspension i 5 U/mL thrombin fortynding og fordel i individuelle eppendorfs 12,5 μL af nævnte suspension per stillads, der skal sås.
    3. Sæt en 5-50 μL pipette (eller lignende) til 12,5 μL og fyld den med fibrinogenopløsningen på 15 mg/mL.
    4. Uden at fjerne spidsen skal du indstille pipetten til 25 μL. Materialet i spidsen skal hæves og efterlade et tomt volumen mod spidsens åbning.
    5. Tryk langsomt på stemplet, indtil væsken når spidsens åbning, men ikke lækker ud. Hold stemplet i denne position, og sæt spidsen i et af de mikrocentrifugerør, der indeholder cellerne i thrombinaffjedring, og sørg for, at spidsen er i kontakt med væsken.
      ADVARSEL: Den fibrin crosslinking vil begynde umiddelbart efter thrombin og fibrinogen kommer i kontakt. Følgende trin skal udføres hurtigt.
    6. Slip forsigtigt stemplets knap, og træk celleaffjedringen ind i spidsen. Bland begge materialer grundigt, så bobledannelsen undgås.
  4. Pak hurtigt de blandede materialer oven på et endoteliseret stillads. Gentag de foregående trin for hvert stillads, og sørg for altid at ændre spidser mellem anvendelser for at undgå uventet fibrin geldannelse i spidsen.
  5. Pladens låg udskiftes, og stilladserne inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 og 100% fugtighed i 30 minutter.
  6. Efter inkubation fyldes hver brønd med 1 mL 1:1 DPSC og EF-medium.
    1. Kultur i 1 uge, skiftende medium hver anden dag.
    2. Under kulturen skal du fjerne mediet fra brønden og billedet konstruererne ved hjælp af et konfokalt mikroskop på forskellige tidspunkter for at studere den vaskulære udvikling eller enhver anden parameter af interesse.
      BEMÆRK: Dette trin kan kun udføres, hvis eksperimentet udføres ved hjælp af mærkede EC'er. Se trin 6 - BEMÆRK for yderligere afklaring.

5. Immunfluorescerende farvning for karakteristiske vaskulære markører

BEMÆRK: Følgende trin kan udføres i de samme brønde, hvor konstruktionerne blev dyrket. Det er afgørende altid at sikre, at løsningerne helt dækker stilladserne. Desuden anbefales det, når det er muligt, at udføre trinene på en orbital shaker, selvom det ikke er obligatorisk.

  1. På dag 7 skal du kassere mediet fra brøndene og skylle stilladserne ved at tilføje PBS til brøndene og fjerne det ved hjælp af vakuum.
  2. Ret stilladserne ved at tilføje 4% paraformaldehyd i 20 minutter. Vask i PBS 3 gange, 5 minutter pr vask.
  3. Gennemtræng de faste celler ved hjælp af 0,3% Triton-X i PBS (v/v) i 15 minutter. Vask i PBS 3 gange, 5 minutter pr vask.
  4. Forbered en 5% kvæg serum albumin (BSA) i PBS (w / v) blokering løsning og dække stilladser. Lad ved stuetemperatur i 1 time.
    BEMÆRK: Alle de nødvendige løsningsmængder afhænger af antallet af stilladser, der skal farves. Forbered løsningerne efter behov, og hold de angivne koncentrationer.
  5. Forbered og påfør den primære antistoffer farvning løsning .
    1. Fortyndet kanin anti-von Willebrand faktor (vWF) antistof 1:150 og mus anti-SMA antistof 1:50 i frisk blokering løsning.
      BEMÆRK: Andre endotelceller markører, såsom CD31 eller VE-Cadherin kan bruges.
    2. Stilladserne dækkes med den primære antistofopløsning, og der opbevares 4 °C natten over. Vask i PBS tre gange, 5 minutter pr vask.
  6. Forbered og påfør den sekundære antistoffer farvning løsning.
    1. Fortyndet ged anti-mus Cy3 antistof 1:150 og ged anti-kanin Alexa-Fluor 488 1:400 i PBS.
    2. Dæk stilladserne med den sekundære antistofopløsning, og inkuber i mindst 3 timer ved stuetemperatur eller ved 4 °C natten over. Vask 3 gange i PBS, 5 minutter pr vask. Hold farvede stilladser i 0,3% PFA i PBS (v/ v) i op til en måned.

6. Stillads konfokal billeddannelse og fartøjsudviklingsanalyse

BEMÆRK: Følgende trin kan udføres på de faste og farvede stilladser på det valgte sidste tidspunkt eller, hvis der blev anvendt fluorescerende celler, i cellekulturperioden uden at skulle afslutte forsøget. For sidstnævnte anbefales det at fastsætte specifikke tidsfrister; dette arbejde viser dag 0 (før SCs såning), og dag 1, 3, 5 og 7 efter SCs såning (Figur 3A).

  1. Billede stilladserne ved hjælp af et konfokalt mikroskop med en 5X linse og et zoom på 0,5 og det fulde z-område af stilladset. Dette vil gøre det muligt at fange 9 separate rum til de firkantede og cirkulære geometrier eller 8 fulde rum til den sekskantede geometri. Billede lysstofrøret og det transmitterede lys for at få både fartøjets netværksstruktur og rumgeometrien (Figur 3A).
  2. Brug ImageJ (eller enhver anden billedbehandlingssoftware), beskære hvert enkelt rum; for denne proces er det kun de vaskulære netværksmarkører, der er relevante. Fjern beholdere, der ikke er placeret inde i rumområdet. Opret en maksimal intensitetsprojektion, og gem hvert enkelt beskåret rum som et TIFF-billede.
    1. Tryk på Filer > Åbn i ImageJ, og vælg det ønskede TIFF-billede, der indeholder flere rum. Billedet skal have mindst to kanaler, det lysstofrørsbaserede fartøjsnetværk og det transmitterede lysbillede.
    2. Vælg værktøjet Polygonmarkering på værktøjslinjen. Vælg den transmitterede lyskanal. Klik på et af hjørnerne af det sekskantede rum, ved grænsefladen mellem rumområdet og stilladsvæggen, vil dette starte maskedefinitionen. Fortsæt med at klikke på de næste hjørner i rækkefølge, indtil det første hjørne er markeret, og lukke masken.
      BEMÆRK: Denne forklaring gælder for et sekskantet rum. Når rummet enten er firkantet eller cirkulært, skal du bruge henholdsvis rektanglet eller det ovale værktøj til at oprette en passende maske. Uanset formen skal du altid montere masken for at følge stilladsets indervæg.
    3. Klik på Analyser > værktøjer > ROI Manager. Klik på knappen Tilføj i ROI Manager (ROI, region of interest) for at gemme den oprettede maske. Den nye maske vises på listen i venstre side. Dette trin gør det muligt for analysen at være konsistent mellem forskellige billeder.
      BEMÆRK: I ROI Manager er det muligt at gemme en fil med alle de oprettede masker ved at klikke på Flere > Gem. Vælg et navn og en placering i vinduet Gem valg, og gem .roi-filen. Hvis du vil hente masken, skal du klikke på Flere > Åbn i ROI Manager og vælge den ønskede .roi-fil.
    4. Vælg billedet af netværket for lysstofrør , og klik på Rediger > Ryd udenfor. Kun billedet i masken forbliver, mens resten elimineres.
    5. Klik på Billede > Dupliker, mens det ryddede netværksbillede er åbent. Skriv navnet på billedet i pop op-vinduet Dupliker. Hvis duplikeret hyperstack er markeret, skal du fjerne markeringen af den og klikke på OK. Der vil blive skabt et nyt billede, der kun indeholder de beskårne lysstofrørsnetværk.
    6. Gem det beskårne billede ved at klikke på Gem som > Gem som > . Vælg navn og mappe , og klik på OK.
  3. Analyser den vaskulære udvikling på de beskårne billeder.
    1. Download og installer den analytiske gratis software AngioTool, som giver kvantitative værktøjer til at kvantificere en række vaskulære parametre. Softwaren kan fås på følgende adresse https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. Indstil skaleringsværdien for billederne for at opnå resultater i millimeterenheder og indlæse et billede.
      1. Klik på fanen Indstilling, og udfyld afstanden i pixel og afstand i mm med repræsentative værdier fra de trufne billeder. Ved hjælp af de billedparametre, der er nævnt ovenfor, er de værdier, der skal udfyldes, 400 pixel pr. 1 mm.
      2. Tryk på knappen Åbn billede, og søg efter billedet af interesse.
    3. Vælg analyseparametrene for at kvantificere fartøjsudviklingen under fanen Analyse.
      1. Under feltet Fartøjets diameter og intensitet skal du fravælge en eventuel nuværende markør fra den øverste områdevælger og aktivere den markør, der repræsenterer tallet 3.
      2. Under feltet Beholderdiameter og -intensitet skal du på bundområdevælgeren flytte den nederste områdemarkør til 60 og lade producenten med høj afstand være 255.
      3. Aktiver boksen Fjern små partikler, og sæt markøren til 100.
      4. Vælg navnet på og placeringen af den opslagsarkfil,hvor resultaterne skal gemmes, under feltet Lagringsindstillinger , og tryk på knappen Kør analyse. Hvis billedboksen Gem resultat er markeret, genererer og gemmer Angiotool et nyt JPEG-billede, der viser fartøjets netværks kvantificerede parametre.
        BEMÆRK: For hver udført analyse uden at ændre navnet på opslagsarket tilføjes en ny række nederst i filen med de nyerhvervede resultater.
  4. Organiser dataene, og kør en statistisk analyse.
    1. For alle de behandlede billeder skal du vælge interesseparameteren fra spread sheetet (f.eks. fartøjets samlede længde og fartøjsområdet)og indtaste dem i en statistisk analysesoftware for at studere de opnåede resultater korrekt (Figur 3C).

7. Time lapse imaging for spirende oprindelse afsløring og migration tracking

  1. Alternativt kan du dyrke stilladserne i inkubatoren som beskrevet i trin 4.6 sætte et konfokalt mikroskopkulturkammer til 37 °C, 5% CO2 og 100% fugtighed.
    1. Sæt pladen med de fuldt seedede stilladser i konfokal mikroskopkammeret, og sæt billedparametrene til de ønskede værdier.
    2. Indstil billedtagningsintervallet til 30 minutter og den samlede billedtid på 72 timer. Dette vil gøre det muligt at køre tiden bortfalder helt uden behov for en medium ændring.
      ADVARSEL: Hvis der ønskes længere tidsforskydning, skal der foretages en omhyggelig positionskalibrering for at kunne hente det oprindelige billedsted, da mediumændringer kræver, at pladen fjernes fra konfokale inkubatoren og ind i den sterile biologiske emhætte.
      BEMÆRK: EC'ers løsrivelse fra stilladsvæggene og dannelsen af rørformede strukturer starter inden for den første time efter, at SCs såning (trin 4) og kan tage op til 50 timer at gennemføre. Efter den første rørdannelse begynder nye spirer at migrere ind i rummet fra de omkringliggende fartøjer. Spiring og efterfølgende netværk remodeling vil fortsætte i hele eksperimentet ca indtil dag 10, når fartøjet netværk bliver stabil22. Brug disse oplysninger til at vælge startpunktet for tidsforskydning og tidstrinnet i overensstemmelse hermed.
  2. Gem den fuldstændige tidsforskydningsfilmfil som en TIFF-sekvens.
  3. Åbn ImageJ, klik på Filer > Importer > billedsekvens, og vælg filerne. Dette åbner din TIFF-sekvens som en film.
  4. Åbn plug-in'en Manuel sporing ved at klikke på Plugins > Manuel sporing. Derpå åbnes vinduet Sporing.
  5. Overhold filmen, og vælg det fartøj, der skal spores. Vær opmærksom på dens oprindelse og migration.
  6. Aktiver feltet Vis parametre , og angiv de 30 minutter for tidsintervallet. X/y-kalibreringen afhænger af den pixelmængde, der vælges under afbildningen.
  7. Fortsæt med manuelt at spore de spirende fartøjer fra stilladskonturen.
    1. Tryk på knappen Tilføj spor. Tryk på placeringen af det fartøj, der skal spores, på filmens første ramme. Derefter ændres filmen automatisk til det næste billede.
    2. Klik på billedet af den anden ramme, hvor fartøjet er placeret. Igen ændres filmen automatisk til det næste billede.
    3. Fortsæt med det samme fartøj, indtil den fulde migrationssporing er afsluttet.
    4. Klik på overlejringsdr. Dermed åbnes en kopi af filmen med en prik, der repræsenterer sporingens aktuelle position, og en linje, der viser den forrige sti.
    5. Klik på knappen Slutspor for at afslutte registreringen af den aktuelle fartøjsbevægelse.
    6. Klik på knappen Tilføj spor igen for at starte forfra med et nyt fartøj. Når du gør dette, ændrer linje- og prikmærkerne automatisk deres farve for det nye fartøj. Gentag indtil alle ønskede fartøjer er sporet.
      BEMÆRK: X/y-placeringen, fartøjets hastighed og den bevægede afstand kan hentes fra pop op-vinduet Resultater. Hvert fartøj identificeres ved hjælp af dets spornummer i kolonnen længst til venstre. Disse data kan kopieres og indsættes i et opslagsark for at udføre yderligere analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den præsenterede protokol, ved hjælp af stereolitografi teknikker, giver mulighed for fremstilling af tessellated stilladser lavet af SU-8 fotoresist. Stilladser med tydelige rumgeometrier (firkanter, sekskanter og cirkler) og meget nøjagtige og repeterbare egenskaber blev opnået (Figur 1).

Figure 1
Figur 1: Repræsentative scanningselektronmikroskopibilleder af de tessellerede firkantede, cirkulære og sekskantede stilladsgeometrier (skalastang = 500 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Med en trinvis cellesåning (trin 2 til 4) blev de fabrikerede stilladser brugt til at skabe højt organiserede vaskulære netværk. Ved brug af en traditionel samtidig såning af både ECs og SCs manglede de resulterende fartøjer en klar organisation. Til dette blev stilladsfibronectinbelægningen udført (trin 2), stilladsets endoteliseringstrin blev sprunget over (trin 3), og DPSC og HAMEC blev samtidig co-seedet i fibrin gel (trin 4). På denne måde er cellerne homogent fordelt over stilladset (Figur 2, øverste række), hvilket resulterer i uforudsigelige og uorganiserede udviklede vaskulære netværk, der ikke ser ud til at interagere med det omgivende stillads. Omvendt giver for det første såning af ECs på stilladsvæggene en nøjagtig indledende endotelcellemønstre. Den senere tilsætning af SCs i en fibrin gel resulterer i en forudsigelig tubulogenese fænomen, med danner fartøjer nøje efter formen af stilladset væggen, og spirende nye fartøjer migrere ind i rummet plads(Figur 2, nederste række).

Figure 2
Figur 2:Vasculariseringssammenligning mellem samtidig vs. trinvis cellesåning. Repræsentative billeder af vaskulær udvikling i tessellated stilladser til en samtidig (øverste række) celle såning af ECs (rød) og SCs (grøn), og trin-wise celle såning (nederste række) på dag 1 og 5. Den trinvise såning resulterer i organiserede vaskulære netværk, der følger stilladsvæggene og spirer ind i rumrummet (skalastang: 100 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Når der anvendes lysstofrør, enten transfected eller farvet, kan fartøjerne afbildes i realtid uden at skulle rette og afslutte eksperimentet for hvert tidspunkt. Rødt fluorescerende protein, der udtrykker ECs (RFP-ECs), blev dyrket på sekskantede stilladser og afbildet efter såning (Figur 3A, dag 0). På dag 1 blev SCs tilføjet, og de vaskulære netværk blev afbildet hver anden dag for at kvantificere fartøjsudviklingen (Figur 3A, dag 1, 3, 5 og 7). For hvert tidspunkt blev der taget brede billeder af hele stilladset (Figur 3B). For hvert rum organiserede og interagerede fartøjerne hovedsageligt med celler placeret i deres indeslutning. Derfor blev hvert rum isoleret, og de overflødige fartøjer uden for rummet blev fjernet ved hjælp af ImageJ. De rene billeder i et enkelt rum blev derefter analyseret ved hjælp af Angiotool. Angiotool returnerede en regnearksfil, der indeholdt flere fartøjsparametre, og en visuel repræsentation af de vigtigste netværksegenskaber, såsom skelet, skæringspunkter og fartøjsoverflade. De opnåede data blev analyseret ved hjælp af den statistiske analysesoftware Prism, og der blev observeret en klar fartøjsvækst for den samlede fartøjslængde og -område i forsøgstiden (Figur 3C). Under et 1-ugers forsøg forventes fartøjerne at videreudvikle og udvides som vist i figur 3A og figur 2C. Faldende fartøjslængde eller -område, manglende dannelse af fartøjer pr. dag 3 eller fartøjer, der dannes som vist i den øverste række i figur 2, kan fortolkes som mislykkede forsøg.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative udviklingsbilleder og analyse af organiserede vaskulære netværk. SCs-tilføjelsen repræsenterer dag 0 i eksperimentet. På dag 1 efter SCs såning, frigøre ECs til rummet rummet og begynde at danne fartøjer, der vil fortsætte spiring og tilslutning på yderligere dage. (B) Der tages confocal-billedbehandlingstrin til analyse af vaskulære net (i) Der udtages et bredt konfokalt billede, der indeholder flere rum, ii) der beskæres et enkelt rum (mærket af den hvide stiplede sekskant), iii) derefter adskilles den vaskulære netværkskanal, og alle fartøjer uden for rumvæggene beskæres. Billedet i det enkelte rum analyseres ved hjælp af Angiotool og returnerer en liste over vaskulære parametre suppleret med visuelle markører, såsom fartøjsområdet (skitseret med gult), fartøjernes længde (vist med grønne linjer) og skæringspunkterne (markeret som blå prikker). (C) Sammenlignende resultater af fartøjets samlede længde og det samlede fartøjsområde i sekskantede rum på forskellige tidspunkter (resultaterne præsenteres som middel ± SD, n > 6; alle skalastænger: 200 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Ved hjælp af flerfarvede EC'er til at lette identifikation af en enkelt celle blev der udført en konfokal billedtid for at tillade sporing af et enkelt fartøj (Supplerende video 1). Fartøjerne blev observeret og sporet ved hjælp af Manual Tracking ImageJ plugin. Tipcellen blev valgt for hver ramme i filmen (Figur 4A), indtil fartøjet anastomosed med den omgivende vaskulatur. Som følge heraf genererede det manuelle sporings-plugin fartøjsstien i realtid, hvilket gjorde det muligt at observere fartøjets migration (Figur 4B).

Figure 4
Figur 4: Repræsentativ sporingaf spireskibe. Et spirende fartøj identificeres og spores ved hjælp af ImageJ-plugin Manuel sporing. Enden af fartøjet er markeret for hvert tidspunkt punkt at spore i realtid; den sort-hvide markør blev tilføjet for at vise det valgte fartøjets slutpunkt. (B) Den resulterende 2D-sporing af fartøjet, som behandles af ImageJ plugin, der viser det fjerneste punkt med en prik, og den dannede sti med en linje (skala bar = 200 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Modning af fartøjer, repræsenteret ved tilstedeværelsen af SMA+ SCs, kan let observeres i den foreslåede platform. Vasculaturer, der præsenterer et højere antal SMA+ SCs, repræsenterer et mere modent netværk, da SMA-udtryk korrelerer med fartøjsstabilisering over tid23. For de cirkulære, sekskantede og firkantede rum øges mængden af SMA+-SCs over tid (Figur 5A). På dag 3 viste alle former spredte SMA + SCs og uncomplex fartøjer med få eller ingen spirer overhovedet. På dag 7 viste alle former et rigt og komplekst vaskulært netværk med en højere tilstedeværelse af SMA+ SCs omkring fartøjerne. Desuden afslører billeder med højere forstørrelse en tættere tilstedeværelse af SMA+ SCS, der er sammen lokaliseret med dannede fartøjer, og som viser SCs rekruttering og differentiering omkring vaskulære strukturer (Figur 5B).

Figure 5
Figur 5: SMA+ SCs og blodkar stiger over tid. A) Glat muskel actin (rød) og vWF (fartøjer, grøn) er vist for vaskulære netværk i cirkulære, firkantede og sekskantede rum på dag 3 og dag 7. Både vasulaturudvidelse og SMA-udtrykkende støtteceller (SMA+ SCs) øges over tid, hvilket betyder en højere modning og kompleksitet af beholderen (skalastang = 200 μm). B) Repræsentative billeder af SMA+ SCS tættere akkumulering omkring fartøjer på dag 7. Kernerne (blå) i det sammensatte billede afslører tilstedeværelsen af SCS, der ikke udtrykker SMA-proteinet (skalastang = 50 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende video 1: Flerfarvede EC'ers tid bortfalder for sporing af fartøjers migration. Klik her for at downloade denne video.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Behovet for en rig vaskulatur i indlejret i manipuleret væv er afgørende for konstruere overlevelse og korrekt funktion1. Selvom teknik det vaskulære system har været i fokus for en enorm mængde forskning, er der meget tilbage at undersøge og forstå24. Især ved genskabelse af et bestemt væv skal mikrovasculaturen opføre sig og organisere i overensstemmelse hermed12. Den mest almindelige tilgang til generation af mikrovessels er co-seeding endotel og støtteceller i et passende 3D-miljø, der er kompatibelt med celletilbehør, spredning og kardannelse25. Denne metode resulterer ofte i stærkt uorganiserede netværk, hvilket gør det vanskeligt at studere den mikrovaskulære adfærd22. Her giver den præsenterede protokol et nyt værktøj, der genererer højt organiserede vaskulære netværk i et højoverførselssystem med fartøjer, der let kan spores og overvåges gennem tiden for at studere deres udvikling og adfærd. Den trinvise såning af EC'erne (trin 2-3), efterfulgt af SCs (trin 4), er kritiske skridt for at opnå sådanne organiserede netværk22. Derudover præsenterer denne teknik et ægte 3D-miljø til vaskulære modeller, hvor fartøjer kan migrere i de tre dimensioner og skabe relevante strukturer. I modsætning hertil tilbyder mere populære metoder til vaskulær modellering, såsom mikrofluidics systemer, kun en 2.5D vævsrepræsentation26.

Den foreslåede metode kan let ændres og anvendes til at studere mange forskellige faktorer, der påvirker fartøjets netværksudvikling og -adfærd. Fotolitografisk SU-8 harpiks stillads fabrikation er en fælles teknik med en imponerende alsidighed, der gør det muligt at skabe en bred vifte af former26,27, med potentiale til at designe strukturer, der ligner komplekse indfødte konstruktioner, såsom alveoler eller den jomfruelige enhed. Ikke desto mindre er en ulempe ved at bruge SU-8 dens lave bioabsorbabilitet27, hvilket gør platformen hovedsageligt et forskningsværktøj i stedet for et implantabelt væv. Dette kan dog forbedres ved at anvende biokompatible materialer, der kan krydslinke under UV/synligt lysbelysning, og 3D-printet ved hjælp af nøjagtige teknikker som stereolitografi29. De resulterende vaskulære konstruktioner kunne derefter implanteres i en dyremodel30. En anden begrænsning af systemet er stilladsets maksimale opnåelige tykkelse med høj detaljerøjagtighed, begrænset af stereolitografisk teknik31. Den foreslåede protokol er egnet til at skabe tynde stilladser, der kan repræsentere indfødte vævsstørrelser.

Denne platform giver mulighed for at undersøge flere variabler, der påvirker vaskulæriseringsfænomenerne4,32. For det første samspillet mellem forskellige typer EC'er og SCs og deres fartøjsdannelse, udvikling og modningskapacitet, som vides at være forskellige, når du bruger celler fra forskellige vævsoprindelse33. For det andet, effekten af vækstfaktorer, små molekyler og hæmmere på vaskulaturen, hvilket giver mulighed for en klar visualisering af deres virkning i realtid34,35. For det tredje tilsætning af andre celletyper, sfæroider eller organoider og deres kommunikation og interaktion med de dannende fartøjer36. Til dette udgør det foreslåede system et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af det mikrovaskulære system.

Fremtidige skridt vil drage fordel af det foreslåede system til at undersøge effekten af mekaniske stimuli, såsom interstitiel strømning og mekaniskstrækning 37,38, på den udviklende vaskulatur. Dette vil forhåbentlig kaste lys over nye aspekter, der vil udvide den nuværende viden og state-of-the-art forskning i vaskulær mekanobiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af midler fra University of Michigan - Israel Partnerskab for Forskning. Forfatterne vil gerne takke Uri Merdler, Lior Debbi og Galia Ben David for deres store hjælp og støtte, Nadine Wang, Ph.D. og Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. af Lurie Nanofabrication Facility ved University of Michigan, samt Luis Solorio, Ph.D. for oplysende diskussioner af fotolitografi teknikker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotool freeware NIH-CCR Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Bovine albumin serum Probumin Millipore 82-045-1
Dental pulp stem cells Lonza PT-5025
ECM media + bullet kit Sciencell #1001
Ethanol 96% Gadot-Group 64-17-5
Evicel fibrin sealant Johnson&Johnson EVB05IL Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions
GlutaMAX Gibco 35050061
Goat anti-mouse Cy3 antibody Jackson 115-166-072
Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 Thermo- Fisher Scientific A11034
Human adipose microvascular cells Sciencell #7200
Human fibronectin Sigma F0895-5MG Stock concentration: 1 mg/mL
ImageJ NIH Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isopropyl alcohol Gadot-Group 67-63-0
Lift-off reagent Kayaku Advanced Materials, Inc G112850 Commercial name Omnicoat
Low-glucose DMEM Biological Industries 01-050-1A
Mouse anti-SMA antibody Dako M0851
NEAA Gibco 11140068
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz SC-281692
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution Biological Industries 03-032-1B
Phospate buffered saline (PBS) Sigma P5368-10PAK
Rabbit anti-vWF antibody Abcam ab9378
Silicon wafer Silicon Valley Microelectronics (SVM) Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick
SU-8 2050 photoresist Kayaku Advanced Materials, Inc Y11058
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc Y020100
Tryton-X 100 BioLab LTD 57836

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
  2. Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
  3. Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
  4. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  5. Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
  6. Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  7. Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
  8. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
  9. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
  11. Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
  12. Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
  13. Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
  14. Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
  15. Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
  16. Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
  17. Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
  18. Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
  19. Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
  20. Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
  21. Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
  22. Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
  23. Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
  24. Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
  25. Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
  26. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
  27. Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
  28. Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
  29. Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
  30. Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  31. Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
  32. Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
  33. Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
  34. van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
  35. Nguyen, D. -H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  36. Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
  37. Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
  38. Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).

Tags

Bioengineering Microvasculature fartøjsmigrering analyseværktøj analyse af høj gennemstrømning angiogeneseanalyse vævsteknik
Trinvis celle såning på Tessellated stilladser til undersøgelse spirende blodkar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szklanny, A. A., Neale, D. B.,… More

Szklanny, A. A., Neale, D. B., Lahann, J., Levenberg, S. Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels. J. Vis. Exp. (167), e61995, doi:10.3791/61995 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter