Målet med denne protokollen er å muliggjøre sømløs CRISPR/Cas9-redigering av C. elegans-genomet ved hjelp av monterte ribonukleoproteinkomplekser og dpy-10 co-CRISPR-markøren for screening. Denne protokollen kan brukes til å gjøre en rekke genetiske modifikasjoner i C. elegans, inkludert innsettinger, slettinger, generstatninger og codon-substitusjoner.
Det bakterielle Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-assosiert proteinsystem (Cas) har blitt utnyttet av forskere for å studere viktige biologisk relevante problemer. Crispr/Cas genomredigeringsmetodens enestående kraft gjør det mulig for forskere å redigere ethvert locus etter eget valg, og dermed legge til rette for økt forståelse av genfunksjon. Flere metoder for redigering av C. elegans-genomet av CRISPR/Cas9 er beskrevet tidligere. Her diskuterer og demonstrerer vi en metode som benytter in vitro montert ribonucleoproteinkomplekser og dpy-10 co-CRISPR-markøren for screening. Spesielt i denne artikkelen går vi gjennom den trinnvise prosessen med å introdusere for tidlig stoppkokoner i C. elegans rbm-3.2-genet ved homologistyrt reparasjon ved hjelp av denne metoden for CRISPR / Cas9-redigering. Denne relativt enkle redigeringsmetoden kan brukes til å studere funksjonen til ethvert gen av interesse og tillater generering av homozygot-redigerte C. elegans ved CRISPR / Cas9-redigering på mindre enn to uker.
Teknologien Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) muliggjør effektiv målrettet genomredigering i et bredt spekter av organismer1,2,3,4. CRISPR-systemet ble først oppdaget som en del av en prokaryotisk antiviral immunrespons5,6,7. Type II CRISPR-systemet bruker en endonuklease som Cas9, en transaktiverende RNA (tracrRNA) og en kort, mål DNA-spesifikk 20-nukleotid lang guide CRISPR RNA (crRNA) for å gjenkjenne en “NGG” Protospacer Tilstøtende motiv (PAM) og gjøre en dobbeltstrenget pause i målet DNA5,6,7,8,9,10,11,12. Denne dobbeltstrengede pausen er anerkjent som en lesjon av det cellulære DNA-reparasjonsmaskineriet. Følgelig kan den genererte dobbeltstrengede pausen repareres av en av to veier – i) Ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) eller ii) Homology-rettet reparasjon (HDR)13. NHEJ er ofte feilutsatt, og derfor, når denne banen brukes til å reparere det dobbeltstrengede bruddet i mål-DNA-et, forårsaker det ofte inaktiverende mutasjoner (innsettinger, slettinger) i genet av interesse. På den annen side, ved å levere en eksogen reparasjonsmal med homologi til hver side av dobbeltstrengsbruddet, kan det cellulære DNA-reparasjonsmaskineriet rettes til å bruke HDR til å reparere pausen13. HDR-metoden muliggjør dermed presis redigering av ethvert locus av interesse.
En rekke CRISPR/Cas9 genredigeringsprotokoller er beskrevet for C. elegans14,15,16,17,18,19,20. De mest brukte CRISPR/Cas9-redigeringsmetodene i C. elegans inkluderer både kloningsbaserte og kloningsfrie protokoller for å generere reparasjonsmaler for CRISPR/Cas9-redigering14,15,16,17,18,19,20. Denne protokollen drøfter i detalj en kloningsfri CRISPR/Cas9-redigeringsprotokoll basert på bruk av dpy-10 som co-CRISPR-markør for screening. Inntil nå bruker den eneste detaljerte C. elegans-fokuserteCRISPR / Cas9-redigeringsvideoprotokollen som eksisterer en fluorescerende markør for screening21. Bruk av fluorescerende markør for screening krever imidlertid tilgang til et fluorescensmikroskop, som mange laboratorier ved små primært undergraduate institusjoner (PUIer) kan finne vanskelig å få tilgang til. Det er oppmuntrende å merke seg at positive korrelative resultater er oppnådd i tidligere studier mellom ormer som bærer fluorescerende markører og tilstedeværelsen av redigeringen21,22. Imidlertid er ytterligere studier nødvendige for å bestemme den generelle effektiviteten til fluorescensbasert screeningmetode for redigering av et bredt utvalg av loci med forskjellige guide RNAer og reparasjonsmaler. Til slutt, siden plasmidkodingen for disse fluorescerende markørene danner ekstrakromosomale matriser, produseres variabel fluorescens ofte fra disse matrisene som kan gjøre positive vanskelig å identifisere23. Derfor, selv om fluorescensbasert screeningmetode kan være nyttig å ta i bruk, kan de ovennevnte problemene begrense anvendbarheten.
Hvis du bruker en CO-CRISPR-markør som produserer en synlig fenotype, reduseres antallet avkom som må screenes, betraktelig for å finne en positivt redigert orm23,24,25,26,27,28. Det er viktig at fenotypene som produseres av disse markørene lett kan oppdages under et enkelt dissekeringsmikroskop23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Dpy-10 co-CRISPR-markøren er en av de best karakteriserte og mye brukte co-CRISPR-markørene for å utføre C. elegans CRISPR / Cas9 genomredigering24,27. Derfor vil denne artikkelen diskutere metoden for å utføre CRISPR / Cas9-redigering i C. elegans ved hjelp av direkte levering av ribonukleoproteinkomplekser med dpy-10 som en co-CRISPR-markør27,35. I denne metoden består den forberedte redigeringsinjeksjonsblandingen av en godt karakterisert dpy-10 crRNA og dpy-10 reparasjonsmal for å formidle genereringen av en observerbar dominerende “roller” (Rol) fenotype som er overdratt av en kjent heterozygot dpy-10(cn64) mutasjon i dpy-10-genet 24,27,29. Når den er tilstede i sin homozygote tilstand, forårsaker dpy-10 (cn64) mutasjonen en dumpy (Dpy) fenotype som produserer kortere og stouter ormer24,29. Rol-fenotypen formidles av nøyaktig innsetting av den medfølgende dpy-10-reparasjonsmalen i en enkelt kopi av dpy-10-genet ved HDR-mediert CRISPR/Cas9-redigering. Derfor indikerer utseendet til Rol C. elegans en vellykket injeksjon samt en vellykket HDR-mediert redigeringshendelse i cellene til den injiserte ormen. Siden crRNA og reparasjonsmalen til målgenet av interesse er i samme injeksjonsblanding med dpy-10 crRNA og dpy-10 reparasjonsmal, er det en god sjanse for at de identifiserte Rol-ormene også samtidig ble redigert på målgenet av interesse. Derfor blir disse Rol-ormene deretter screenet for redigering av interesse ved teknikker som polymerasekjedereaksjon (PCR) (for redigeringer større enn 50 bp) eller av PCR etterfulgt av begrensningsfordøyetid (for redigeringer mindre enn 50 bp).
Fordelene ved å bruke denne metoden for genomredigering er: i) CRISPR-redigeringer kan genereres ved en relativt høy effektivitet (2% til 70%) ved hjelp av denne metoden27; ii) reparasjonsmalene og guide RNAene som brukes i denne metoden innebærer ikke kloning, og reduserer dermed tiden som kreves for deres generasjon; iii) ved å montere ribonukleoproteinkomplekser in vitro, konsentrasjonene av de monterte redigeringskompleksene kan opprettholdes relativt konstant, og dermed forbedre reproduserbarheten; iv) noen guide RNAer som ikke klarer å generere redigeringer når uttrykt fra plasmider har vist seg å fungere for CRISPR / Cas9 genomredigering når den leveres som in vitro transkribert crRNAs27; v) inkludert dpy-10 co-CRISPR markøren muliggjør enkel screening ved hjelp av et dissekerende mikroskop og reduserer antall avkom som må screenes for å finne positive24,27; og vi) DNA-sekvensering verifiserte homozygot-redigerte ormlinjer kan oppnås ved denne metoden innen et par uker19,27.
Utmerkede bokkapitler knyttet til mange forskjellige C. elegans CRISPR-metoder har blitt publisert14,15,16,17,18,19,20,43. Demonstrasjonen av dpy-10 co-CRISPR-metoden i et videoformat i en laboratorieinnstilling mangler imidlertid for øyeblikket. I denne artikkelen beskriver og demonstrerer vi prosessen med å bruke dpy-10 co-CRISPR-metoden for å redigere et representativt målgen kalt rbm-3.2, et putativt RNA-bindende protein (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). Spesielt beskriver vi i detalj metoden for å introdusere tre for tidlig stopp codons innenfor C. elegans rbm-3.2 genet ved hjelp av in vitro montert ribonucleoprotein komplekser og en eksogent levert lineær enkeltstrenget reparasjon mal. Disse studiene har vært vellykkede med å generere den første C. elegans CRISPR-stammen med for tidlig stoppkokoner i rbm-3.2-genet. Siden ikke mye er kjent om funksjonen til dette genet i C. elegans, vil denne stammen tjene som et nyttig verktøy for å dissekere funksjonen til RMB-3.2. Denne metoden kan også vedtas for å gjøre innsettinger, substitusjoner og slettinger ved ethvert locus i C. elegans-genomet.
Vi har brukt protokollen ovenfor til å redigere flere gener i tillegg til rbm-3.2. Vår redigeringseffektivitet for forskjellige loci-, guide-RNAer og reparasjonsmaler (enkeltstrengede og dobbeltstrengede) har variert mellom 2% og 58% (data ikke vist). Den observerte redigeringseffektiviteten kan sammenlignes med den tidligere rapporterte redigeringseffektiviteten på 2 % til 70 % for denne protokollen27. Vi har også lykkes i å bruke denne teknikken til å gjøre genslettinger. Ved hjelp av to crRNAer erstattet vi et gen som er nær 6 kb i lengde med kodesekvensen for grønt fluorescerende protein (GFP) (data ikke vist). For dette eksperimentet ble omtrent 14% av Rol F1-ormene som ble analysert funnet å være positive for gensletting og erstatning med GFP (data ikke vist). Det kreves imidlertid flere eksperimenter for å bestemme maksimal lengde på gensletting og erstatninger som kan utføres ved hjelp av denne teknikken.
Denne teknikken kan brukes til å gjøre innsettinger som er omtrent 1,6 kB i lengde19. En nylig studie har vist at for å lage innsettinger som er over 1,6 kb lange ved hjelp av denne protokollen, kan generering av to dobbeltstrengsbrudd og bruk av reparasjonsmaler med lengre homologiarmer muliggjøre innsetting av mye større fragmenter av DNA (~ 10 Kb)28. Alternativt kan flere runder med genredigering med denne protokollen utføres for å generere større redigeringer. Andre plasmidbaserte C. elegans CRISPR/Cas9 genredigeringsprotokoller kan også tas i bruk for CRISPR-eksperimenter som involverer innsetting av DNA-fragmenter større enn 1,6 kb46,47,48.
Før du bruker denne protokollen for genredigering, er det nødvendig å sikre at genet av interesse ikke er knyttet til dpy-10 locus på kromosom II. Når det gjelder et målgen som er knyttet til dpy-10, kan det være problematisk å skille dpy-10-mutasjonen bort fra din redigering av interesse. Derfor, i tilfelle at genet av interesse er knyttet til dpy-10 locus, Andre co-CRISPR-markører som unc-58 (X-kromosom), unc-22 eller zen-4 (kromosomIV) og Ben-1 eller pha-1 (kromosom III) som er plassert på forskjellige kromosomer, kan brukes24,25,26,28. Data fra Meyer-laboratoriet viser at Ben-1- og zen-4-mutasjoner kan brukes som vellykkede co-CRISPR-markører for screening med denne metoden28. Det er imidlertid viktig å merke seg at bruk av zen-4 og pha-1 som co-CRISPR-markører nødvendiggjør å utføre CRISPR-eksperimentet i ikke-wild-type zen-4(cle10ts) eller pha-1(e2123ts) bakgrunn henholdsvis26,28. Videre kan CRISPR-eksperimenter som involverer noen co-CRISPR-markører som Ben-1 kreve tilberedning av spesialplater (f.eks. plater som inneholder benzimidazol)28. Vi har med hell brukt unc-58 co-CRISPR-markøren til å screene for positive redigeringer for et gen som er knyttet til dpy-10 ved hjelp av denne metoden (data ikke vist). Mutasjonen uk-58(e665) gir en synlig fenotype (lammelse) som effektivt kan brukes til å screene for positivt redigerte ormer24. Alternativt, hvis tilgang til et fluorescerende mikroskop er tilgjengelig, kan et fluorescerende merket gtbp-1-gen også brukes som en co-CRISPR-markør for denne protokollen19.
For høy redigeringseffektivitet mens du bruker denne metoden for genomredigering, må redigeringsstedet være innenfor 10 til 30 baser fra Cas9-skjæreområdet. Hvis redigeringsområdet er over 30 baser unna Cas9-skjæreområdet, faller redigeringseffektiviteten drastisk19,35,37. En nylig studie fra Meyer-laboratoriet har imidlertid vist at å lage to dobbeltstrengspauser på avstand fra hverandre kan muliggjøre innsetting av redigeringer langt borte fra Cas9-kuttet nettsted ved hjelp av denne protokollen28.
I gjeldende protokoll ble reparasjonsmalen utformet slik at alle de tre innsatte stoppkokonene vises i samme leseramme. En alternativ strategi for å lage nullmutanter vil imidlertid være å bruke en universell 43-basers lang knock-in STOP-IN-kassett som tidligere er beskrevet50. Viktigst, denne kassetten har stopp codons i alle de tre mulige leserammer og forårsaker frameshift mutasjoner. Dette er en spesielt nyttig strategi for å generere nullmutanter når feil eller ufullstendig reparasjon skjer på redigeringsområdet.
Til slutt, på grunn av sin korte varighet og de siste fremskrittene i denne metoden, er dette en utmerket metode for rutinemessige laboratorieforsøk som involverer tilsetning av korte immunogene epitopkoder, fluorescerende koder, gjør gensletting, generstatninger og codon-substitusjoner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av oppstartsfond fra Universitetet i Tulsa (TU) og TU Faculty Development Summer Fellowship tildelt Jyoti Iyer. Vi vil takke Chemistry Summer Undergraduate Research Program (CSURP) og Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) for å tildele stipender til studentene som er involvert i denne studien. Vi vil gjerne anerkjenne Ms. Caroline Dunn for hennes tekniske assistanse. Til slutt vil vi takke Dr. Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter og Saili Moghe for deres kritiske kommentarer til dette manuskriptet.
Barcoded DNA sequencing tubes | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Premixed | N/A |
Cas9 protein | PNA Bio | CP01 | Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C |
crRNAs | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | N/A | Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |
ECoRI | New England Biolabs | R3101S | Stored at -30 °C |
Minelute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | Spin columns stored at 4 °C |
MyTaq Redmix | Meridian Bioscience | BIO-25043 | Stored at -30 °C |
Primers | IDT | N/A | Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
Proteinase K | Gold Bio | P-480-SL4 | Stored at -30 °C |
Repair template oligos | IDT | N/A | 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
tracrRNA | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | U-002005-50 | Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |