Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR/Cas9 Redigering af C. elegans rbm-3.2 Genet ved hjælp af dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker og Samlet Ribonucleoprotein Complexes.

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62001
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Tulsa
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokol er at muliggøre problemfri CRISPR /Cas9 redigering af C. elegans genom ved hjælp af samlede ribonucleoprotein komplekser og dpy-10 co-CRISPR markør til screening. Denne protokol kan bruges til at foretage en række genetiske modifikationer i C. elegans herunder indsættelser, sletninger, generstatninger og codon substitutioner.

Abstract

Den bakterielle Clustered Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associeret protein (Cas) system er blevet udnyttet af forskere til at studere vigtige biologisk relevante problemer. Crispr/Cas genomredigeringsmetodens enestående effekt gør det muligt for forskere præcist at redigere enhver græshoppe efter eget valg og derved lette en øget forståelse af genfunktion. Flere metoder til redigering af C. elegans genomet af CRISPR / Cas9 er blevet beskrevet tidligere. Her diskuterer og demonstrerer vi en metode, der anvender in vitro-samlede ribonucleoproteinkomplekser og dpy-10 co-CRISPR-markøren til screening. Specifikt gennemgår vi i denne artikel den trinvise proces med at introducere for tidlige stop codons i C. elegans rbm-3.2-genet ved homologi-rettet reparation ved hjælp af denne metode til CRISPR / Cas9-redigering. Denne relativt enkle redigeringsmetode kan bruges til at studere funktionen af ethvert interessegen og giver mulighed for generering af homozygot-redigerede C. elegans af CRISPR / Cas9 redigering på mindre end to uger.

Introduction

Den clustered regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associeret protein (Cas) teknologi muliggør effektiv målrettet genomredigering i en bred vifte af organismer1,2,3,4. CRISPR-systemet blev først opdaget som en del af et prokaryote antiviralt immunrespons5,6,7. Type II CRISPR-systemet bruger en endonuclease som Cas9, en transaktiverende RNA (tracrRNA) og en kort DNA-specifik 20-nukleotid lang guide CRISPR RNA (crRNA) til at genkende en "NGG" Protospacer Tilstødende Motiv (PAM) og gøre en dobbeltstrenget pause i målet DNA5,6,7,8,9,10,11,12. Denne dobbeltstrengede pause er anerkendt som en læsion af de cellulære DNA-reparationsmaskiner. Derfor kan den genererede dobbeltstrengede pause repareres af en af to veje- i) Ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) eller ii) Homology-rettet reparation (HDR)13. NHEJ er ofte fejlbehæftet, og derfor, når denne vej bruges til at reparere den dobbeltstrengede pause i mål-DNA'et, forårsager det ofte inaktiverende mutationer (indsættelser, sletninger) i interessegen. På den anden side, ved at levere en udefrakommende reparation skabelon med homology til begge sider af dobbelt-streng pause, den cellulære DNA reparation maskiner kan instrueres til at bruge HDR til at reparere pause13. HDR-metoden muliggør således præcis redigering af ethvert locus af interesse.

En række CRISPR/Cas9-genredigeringsprotokoller er blevet beskrevet for C. elegans14,15,16,17,18,19,20. De mest anvendte CRISPR/Cas9-redigeringsmetoder i C. elegans omfatter både kloningsbaserede og kloningsfrie protokoller til generering af reparationsskabeloner til CRISPR/Cas9-redigering14,15,16,17,18,19,20. Denne protokol diskuterer i detaljer en kloningsfri CRISPR/Cas9-redigeringsprotokol baseret på brug af dpy-10 som co-CRISPR-markør til screening. Indtil nu, den eneste detaljerede C. elegans-fokuseretCRISPR / Cas9 redigering video protokol, der findes udnytter en fluorescerende markør for screening21. Men ved hjælp af en fluorescerende markør til screening kræver adgang til et fluorescensmikroskop, som mange laboratorier på små primært bachelorinstitutioner (PUI' er) kan have svært ved at få adgang til. Det er opmuntrende at bemærke , at der er opnået positive korrelative resultater i tidligere undersøgelser mellem orme , der bærer fluorescerende markører, og tilstedeværelsen af redigering21,22. Der er dog behov for yderligere undersøgelser for at bestemme den samlede effektivitet af den fluorescensbaserede screeningsmetode til redigering af en lang række loci med forskellige vejledning RNA'er og reparationsskabeloner. Endelig, da plasmider kodning for disse fluorescerende markører danner ekstrakromosom arrays, variabel fluorescens er ofte fremstillet af disse arrays, der kan gøre positiver vanskeligt at identificere23. Selv om den fluorescensbaserede screeningsmetode kan være nyttig at anvende, kan ovennævnte spørgsmål derfor begrænse dens anvendelighed.

Brug af en co-CRISPR-markør, der producerer en synlig fænotype, reducerer i høj grad antallet af afkom, der skal screenes for at finde en positivt redigeret orm23,24,25,26,27,28. Det er vigtigt, at de fænotyper, der produceres af dissemarkører,let kan detekteres under et simpelt dissekeringmikroskop23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Dpy-10 co-CRISPR markør er en af de bedst karakteriserede og udbredte co-CRISPR markører til udførelse af C. elegans CRISPR / Cas9 genom redigering24,27. Derfor vil denne artikel diskutere metoden til udførelse af CRISPR / Cas9 redigering i C. elegans ved hjælp af direkte levering af ribonucleoprotein komplekser med dpy-10 som en co-CRISPR markør27,35. I denne metode består den forberedte redigeringsindsprøjtningsblanding af en velkarakteriseret dpy-10 crRNA og dpy-10 reparationsskabelon for at mægle i generationen af en observerbar dominerende "roller" (Rol) fænotype, der tildeles af en kendt heterozygot dpy-10(cn64) mutation inden for dpy-10 genet 24,27,29. Når den er til stede i sin homozygoøse tilstand, forårsager dpy-10(cn64) mutationen en dumpy (Dpy) fænotype, der producerer kortere og stouter orme24,29. Rol-fænotypen medieres ved nøjagtig indsættelse af den medfølgende dpy-10 reparationsskabelon i en enkelt kopi af dpy-10-genet ved HDR-medieret CRISPR/Cas9-redigering. Derfor indikerer udseendet af Rol C. elegans en vellykket injektion samt en vellykket HDR-medieret redigeringshændelse i den injicerede orm celler. Da crRNA og reparationsskabelonen for målgen af interesse er i samme injektionsblanding med dpy-10 crRNA- og dpy-10-reparationsskabelonen, er der en god chance for, at de identificerede Rol-orme også samtidig blev redigeret ved målgen af interesse. Derfor screenes disse Rol orme derefter for redigering af interesse ved teknikker som polymerasekædereaktion (PCR) (til redigeringer større end 50 bp) eller af PCR efterfulgt af begrænsning fordøjelse (for redigeringer mindre end 50 bp).

Fordelene ved at bruge denne metode til genomredigering er: i) CRISPR-redigeringer kan genereres med en relativt høj effektivitet (2% til 70%) ved hjælp af denne metode27; ii) reparationsskabelonerne og vejledningsRNA'erne, der anvendes i denne metode, indebærer ikke kloning, hvorved den tid, der kræves til deres generation, reduceres. iii) ved at samle ribonucleoproteinkomplekser in vitrokan koncentrationerne af de samlede redigeringskomplekser opretholdes relativt konstant og derved forbedre reproducerbarheden; iv) nogle vejledende RNA'er, der undlader at generere redigeringer, når de udtrykkes fra plasmider, har vist sig at arbejde for CRISPR/Cas9-genomredigering, når de leveres som in vitro transskriberede crRNAs27; v) herunder dpy-10 co-CRISPR-markøren muliggør nem screening ved hjælp af et dissekeringmikroskop og reducerer antallet af afkom, der skal screenes for at finde positive24,27; og vi) DNA sekventering verificeret homozygot-redigeret orm linjer kan opnås ved denne metode inden for et par uger19,27.

Fremragende bog kapitler vedrørende mange forskellige C. elegans CRISPR metoder er blevet offentliggjort14,15,16,17,18,19,20,43. Demonstrationen af co-CRISPR-metoden dpy-10 i et videoformat i laboratorieindstilling mangler dog i øjeblikket. I denne artikel beskriver og demonstrerer vi processen med at bruge dpy-10 co-CRISPR-metoden til at redigere et repræsentativt målgen ved navn rbm-3.2, et putativt RNA-bindende protein (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  Specifikt beskriver vi her i detaljer metoden til at indføre tre for tidlige stop codons inden for C. elegans rbm-3.2 genet ved hjælp af in vitro samlet ribonucleoprotein komplekser og en exogent leveret lineær enkeltstrenget reparation skabelon. Disse undersøgelser har haft succes med at generere den første C. elegans CRISPR stamme med for tidlig stop codons i rbm-3.2 genet. Da der i øjeblikket ikke er meget kendt med hensyn til funktionen af dette gen i C. elegans, vil denne stamme tjene som et nyttigt værktøj til dissekere funktionen af RMB-3.2. Denne metode kan også anvendes til at foretage indsættelser, udskiftninger, og sletninger på ethvert græshoppe inden for C. elegans genom.

Protocol

Denne protokol for CRISPR/Cas9-genomredigering blev godkendt af University of Tulsa Institutional Biosafety Committee efter NIH's retningslinjer. Gennem hele denne protokol blev steril teknik praktiseret. Alle trin i denne protokol blev udført ved hjælp af reagenser, der var fri for nukleaser. Der blev sørget særligt for at forhindre RNase-forurening såsom rengøringshandsker samt arbejdsområder og udstyr (f.eks. pipetter, udvendigt glasvarer osv.) med en RNase-dekontaminerende opløsning.

1. crRNA design

  1. Find PAM, der gør det muligt for Cas9 at skære tættest på redigeringswebstedet.
    1. PAM-grunden er 5'-NGG-3'.
    2. Husk, at PAM kan være på begge dele af DNA' et.
  2. Vælg 20 bp i 5' slutningen af PAM som crRNA-sekvens.
    BEMÆRK: Den faktiske crRNA-sekvens, der syntetiseres af kommercielle virksomheder, er længere end 20 bp, da den har en ekstra generisk sekvens, der automatisk føjes til den målspecifikke 20 bp crRNA-sekvens af syntetiserende selskab. Med hensyn til virkninger uden for målet har nylige undersøgelser ikke fundet off-target virkninger af Cas9 i C. elegans36,37,38,39,40. Desuden er de resulterende CRISPR-redigerede stammer overhalet. Derfor er vi ikke meget bekymrede over off-target effekter af de designede crRNAs. Onlinewebsteder, herunder http://genome.sfu.ca/crispr/ og http://crispor.tefor.net/ , kan dog bruges til at finde og vælge de crRNAs med de mindst off-target effekter38,41. crRNAs, der slutter med et G eller GG , og dem med mere end 50 % GC-indhold forventes at være mere effektive19,23,42.
  3. Bestil mindst 10 nmol af crRNA fra et selskab (f.eks. IDT, Horizon Discovery osv.).
    1. Når den lyophilized crRNA ankommer, opbevares det på -30 ° C indtil dagen for mikroinjektionen.
    2. På dagen for udførelsen af mikroinjektionen drejes det lyophilized crRNA ved maksimal hastighed (17.000 x g) i et minut og genbruges det i 5 mM Tris-Cl (pH 7.4) for at lave en 8 μg/μL lager af crRNA.
    3. Opbevar det ubrugte crRNA-lager, der er frosset ved -80 °C.

2. Reparation skabelon design

  1. Download en sekvensmanipulationssoftware (f.eks. CLC-sekvensfremviser, APE, Snapgene, Vector NTI osv.). Vi bruger CLC sekvens viewer version 8.0 (Qiagen), da det er brugervenligt og kan downloades gratis.
  2. Indsæt sekvensen af mål-DNA'et af interesse i sekvensfremviseren.
  3. Reparationsskabelonens retning påvirker redigeringseffektiviteten28. For at indsætte en reparation sekvens til 5 'ende af PAM, designe en enkelt-strandet reparation skabelon med DNA-sekvens fra samme DNA-streng, hvor PAM sekvens er placeret (protospacer streng)28. Mens for at indsætte en reparation sekvens til 3 'ende af PAM, designe en enkelt-strandet reparation skabelon med DNA-sekvens fra DNA-strengen, der ikke bærer PAM sekvens (afstandsstreng)28.
  4. Vælg 35 basispar sekvens med uafbrudt homologi på begge sider (i 5' og 3' ende) af redigeringen.
  5. Mutere eller slette PAM for at forhindre skæring af reparationsskabelonen eller det redigerede genomiske DNA af Cas9.
    1. Hvis mutation af PAM ikke er mulig, indføre flere tavse mutationer tæt på 5 'ende af PAM for at forhindre skæring af reparation skabelon eller redigeret genomisk DNA.
    2. Sørg for kun at indføre tavse mutationer af PAM, hvis det er til stede i en exonic region.
    3. Kontroller codonbrugsfrekvensen for at sikre, at den muterede codon indføres med en frekvens, der kan sammenlignes med den oprindelige ikke-muterede codon (f.eks. https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). I nogle tilfælde er det muligvis ikke muligt at indføre den muterede codon med samme frekvens som den ikke muterede codon. Men for at gøre mutationer af et par aminosyrer forventer vi ikke, at ekspressionsniveauet for det mutante protein ændres væsentligt.
  6. Hvis redigeringen er lille (f.eks. mutation af nogle få baser), skal du introducere et unikt begrænsningssted tæt på redigeringen af tavs mutagenese. Vi bruger http://heimanlab.com/cut2.html til at finde begrænsning websteder, der kan indføres ved tavs mutagenese.
    1. Kontroller codon-brugsfrekvensen for at sikre, at den muterede codon introduceres med en frekvens, der kan sammenlignes med den oprindelige ikke-muterede codon. Som nævnt ovenfor er dette ikke altid muligt. Men for eksperimenter, der involverer mutationer af nogle få aminosyrer, forventer vi ikke, at ekspressionsniveauet for det mutante protein ændres væsentligt.
  7. Syntetisere og købe lineære enkeltstrengede reparationsskabeloner til HDR som 4 nmol ultramer oligos.
  8. Brug den lyfile oligonucleotidreparationsskabelon i nukleasefrit vand for at fremstille et 1 μg/μL-lager af reparationsskabelonen og opbevare det ved -30 °C, indtil den anvendes yderligere.

3. Screening primer design

  1. Ved hjælp af CLC-sekvensfremviser eller andre lignende applikationer skal du designe 20 til 23 basispar fremad og omvendte primere på begge sider af redigeringen, så de producerer et bånd på mellem 400 og 600 basispar ved PCR-forstærkning.
    1. For større indsættelser, der er flere kilobaser i størrelse, design den forreste primer, der skal placeres lige uden for den venstre homology arm af reparationsskabelonen. Design den omvendte primer, der skal placeres i selve reparationsskabelonen. I dette tilfælde vil et PCR-produkt kun blive opnået i tilfælde af positivt redigerede orme.
    2. Hvis du vil identificere homozygodede orme til længere indsættelser, skal du forstærke hele indsættelsesområdet ved at designe frem- og omvendte primere, der er placeret uden for indsættelseskrydsene.
  2. Test primerne, og optimer PCR-forholdene med vildt genomisk DNA, før du bruger primerne til genotyping.
    1. Sørg for, at der produceres et enkelt bånd af forventet størrelse ved PCR-forstærkning af det genomiske DNA (hvor det er relevant).

4. Forberedelse af unge voksne orme til injektion

  1. Pluk L2-L3 fase C. eleganer på en frisk bakteriel græsplæne på en MYOB plade og inkubere ved 20 °C natten over.
    BEMÆRK: Protokollen for fremstilling af MYOB plader kan findes her: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/
  2. På dagen for mikroinjektion skal du vælge unge voksne orme med færre end 10 embryoner i livmoderen for at injicere.

5. Forberedelse af injektionsmikset

  1. Injektionsblandingen forberedes i samme rækkefølge som vist i tabel 1 i sterile nukleasefrie rør.
    BEMÆRK: Komponenterne i injektionsmikset kan skaleres ned til 5 μL injektionsblandinger (i stedet for 20 μL), hvis fremtidige injektioner med denne blanding ikke forventes.
  2. Bland injektionsmikset ved pipettering.
  3. Inkuberes injektionsblandingen ved 37 °C i 15 minutter for at samle ribonukleoproteinkomplekser.
  4. Indsprøjtningsblandingen drejes ved 4 °C ved 17.000 x g i 5 minutter.

6. Microinjection i C. elegans gonad

  1. Udfør mikroinjektion af CRISPR-injektionsblandingen i C. elegans gonad, som beskrevet i Iyer et al. 201943.
    1. Indsprøjt ca. 30 orme med CRISPR-injektionsblanding. Den ubrugte injektionsblanding kan genbruges ved opbevaring ved 4 °C i en periode på ca. 6 måneder uden tab af effektivitet49.
    2. Indsprøjt begge gonad arme, hvis det er muligt. Injicerede orme betragtes som P 0-generationen.

7. Injiceret orm opsving og overførsel

  1. Efter mikroinjektion skal du flytte de mikroinjectederede P0 orme ved hjælp af en orm-pick til en 60 mm MYOB agarplade sået med OP50 E. coli og lad dem komme sig ved stuetemperatur i ca. en time.
    1. Bemærk, at genvindingstemperaturen afhænger af genotypen af de injicerede orme. For eksempel kan det være nødvendigt at komme ormen til ormgenvinding ved en anden temperatur for temperaturfølsomme stammer.
  2. Ved hjælp af en platin wire orm pick, overføre hver injiceret orm på en enkelt seedet 35 mm MYOB agar petri plade og give dem mulighed for at lægge æg ved 20 °C indtil den næste dag.
    1. Bemærk, at nogle orme vil dø som følge af skade fra mikroinjektionsproceduren. Vælg kun de orme, der er i live og udviser bevægelse.
  3. Efter 24 timer overføres de injicerede orme til nye individuelle plader (1 orm pr. Plade).

8. Picking C. eleganer til screening

  1. 3 til 4 dage ved 20 °C efter injektionen blev udført, overvåge alle de plader, der indeholder afkom af de injicerede orme ved hjælp af en dissekering mikroskop.
  2. Identificer plader, der har F1 afkom udstiller rulle (Rol) og dumpy (Dpy) fænotyper. En Dpy fænotype er, hvor orme synes kortere og stouter end kontrol orme på samme udviklingsmæssige fase (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10). Plader med Rol og Dpy orme repræsenterer plader, hvor F1 afkom er blevet redigeret med dpy-10(cn64) mutation at være til stede i sin heterozygode eller homozygot tilstand, henholdsvis.
  3. Vælg pladerne med de mest rullende og dumpy orme til screening.
  4. Enkelt ud 50 til 100 F1 Rol orme fra disse plader til deres egne individuelle plader (1 orm pr plade) og give dem mulighed for at lægge æg.
    1. Tillad L4-iscenesat F1 Rol orme til at lægge æg og producere afkom (F2) i 1 til 2 dage.

9. Enkelt orm lysis og PCR

  1. Efter at have produceret F2 i 1 til 2 dage overføres hver enkeltF1 Rol mor til 2,5 μL lysisbuffer (tabel 2) med en fortynding på 1:100 på 20 mg/mL Proteinase K.
  2. Frys rørene ved -30 °C i 20 minutter. Ormene kan opbevares på dette stadium i en længere periode indtil yderligere analyse.
  3. Udfør enkelt orm lysis på en PCR termocykelr med følgende betingelser: 60 °C i 1 time, 95 °C i 15 min og hold ved 4 °C.
  4. Følgende reagenser tilsættes direkte til 2,5 μL af den lysede orm, der indeholder PCR-rør: 12,5 μL af 2x PCR-blanding indeholdende dNTPs, DNA polymerase, MgCl2 og læssefarve, 1 μL på 10 μM fremad primer, 1 μL på 10 μM omvendt primer og sterilt vand til 22,5 μL. Den samlede volumen af hver PCR-reaktion er 25 μL.
    BEMÆRK: I tilfælde af screening af flere F1-orme er det hurtigere og mere bekvemt at lave en PCR-master-mix til flere reaktioner og tilføje 22,5 μL af master-mixet til hvert lysisrør.
  5. Konfigurer PCR-reaktioner på en termocykel med følgende betingelser: 95 °C i 1 minut, 35 cyklusser på 95 °C i 15 s, 55 °C for 15 s (optimer for hvert primersæt), 72 °C i 1 minut (optimer for hvert mål-DNA)44. Hold reaktioner ved 4 °C.

10. Begrænsning fordøjelse og agarose gel elektroforese

BEMÆRK: En begrænsning fordøjelse er kun nødvendig, mens screening for små redigeringer (mindre end 50 bp).

  1. Overfør 10 μL af PCR-DNA'et fra trin 9 til et nyt rør.
  2. Der tilsættes mellem 2 og 4 enheder af restriktionsenzym og 1x begrænsningsenzymbuffer (1,5 μL af 10x reaktionsbuffer) pr. 15 μL-reaktion.
  3. Inkuber ved 37 °C (eller ved anden enzymspecifik temperatur) i 2 timer (kortere inkubationstider kan være mulige med hurtigtvirkende enzymer).
  4. Varme inaktiverer begrænsningen ved opvarmning af PCR-rørene ved 65 °C (eller anden enzymspecifik temperatur) i 10 til 15 minutter.
  5. Læg hele reaktionen fra hvert PCR-rør i en enkelt brønd af en 1%-2% agarosegel og kør gel ved 110 mA, indtil korrekt båndadskillelse er opnået.
    BEMÆRK: Vi bruger en PCR-blanding, der allerede har et læssefarve inkluderet til visualisering, mens du kører på en agarosegel. Denne blanding forstyrrer ikke begrænsningen fordøjelse reaktion og er derfor praktisk at bruge til screening mange orme på én gang.

11. Identificer positivt redigerede orme

  1. Visualiser agarose geler under UV-lys (for ethidiumbromid geler) til at opdage DNA-bånd størrelser.
    BEMÆRK: Positivt redigerede orme vil vise et ekstra dna-bånd i den forventede størrelse på grund af redigering ved hjælp af reparationsskabelonen, der bærer begrænsningsstedet på det ønskede locus i ormens genom. F1 rulle orme forventes at være heterozygot for redigering og forventes derfor at udstille tre bands (en vild-type uncut PCR produkt og to mindre fragmenter fra den redigerede cut PCR produkt). Selvom det er sjældent, skal det bemærkes, at homozygoter opstår lejlighedsvis.
  2. Gem alle de originale positivt redigerede plader, indtil tilstedeværelsen af redigeringen er bekræftet af Sanger sekventering.

12. Homozygose redigering af interesse

  1. Vælg mellem 8 og 12 vilde udseende ikke-rullende F2 orme fra de respektive positivt redigeret F1 Rol orm plader og give dem mulighed for at lægge æg og producere afkom i 1 til 2 dage.
    BEMÆRK: Da C. elegans er selvbefrugtende hermafroditer, hvis den redigerede allele ikke påvirker levedygtighed eller udvikling, bør andelen af forventede homozygote mutanter være ca. 25%. Ikke-rullende F2 orme skal være vild-type for dpy-10 græshoppe. Picking ikke-rullende orme gør det muligt for generering af redigerede orme, der har mistet dpy-10(cn64) mutation og kun har mutationen på dit gen af interesse.
    1. Bemærk, at dpy-10 genet er til stede på kromosom II. Hvis dit gen af interesse er knyttet til dpy-10, kan du ikke være i stand til nemt at adskille dpy-10 mutation væk fra dit gen af interesse.
  2. Udfør trin 9 til 11 for at identificere homozygoe ormlinjer.

13. Bekræft redigering ved sekventering

  1. Når homozygoe orme er identificeret, udføre lysis og PCR som beskrevet i trin 9.
    1. Konfigurer mindst 3 PCR-reaktioner for hver homozygot linje, der skal sekvenseres.
  2. Rense PCR-reaktionerne ved hjælp af et PCR-rensningssæt.
  3. Mål DNA-koncentrationen ved hjælp af et nanodråbespektrofotometer.
  4. Send prøve med den respektive frem primer til Sanger sekventering. Sørg for, at den fremadrettede primer er designet til at være mindst 50 baser væk fra den redigering, der skal sekvenseres.
  5. Analyser rækkefølgen af resultaterne ved hjælp af sekvensanalysesoftware for at bekræfte tilstedeværelsen af redigeringen.

Representative Results

rbm-3.2 er et putativt RNA-bindende protein, der har homology til human kavalergangsstimuleringsfaktor subunit 2 tau variant (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). RBM-3.2-proteinet blev identificeret som en bindende partner til Protein Fosphatase 1 (GSP-1) og dets regulatorer Inhibitor-2 (I-2SZY-2) og SDS-22 i en tidligere undersøgelse, der identificerede disse proteiner som nye regulatorer af C. elegans centriole duplication (data ikke vist)45. I øjeblikket er meget lidt kendt med hensyn til funktionen af rbm-3.2 genet i C. elegans. Derfor, for yderligere at undersøge den biologiske rolle C. elegans rbm-3.2 genet, rbm-3.2-null allele rbm-3.2 (ok688) blev opnået fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC).

Desværre, ud over at besidde en sletning af hele rbm-3.2 genet, rbm-3.2 (ok688) allele resulterer også i en delvis sletning af en overlappende gen, rbm-3.1, hvilket komplicerer genetisk analyse. Derfor, for præcist at undersøge den rolle, rbm-3.2 genet i C. elegans, vi brugte CRISPR / Cas9 redigering til at indføre tre for tidligt stop codons meget tæt på starten af C. elegans rbm-3.2 kodning region, forlader overlappende rbm-3.1 genet intakt.

For at introducere disse for tidlige stop codons i C. elegans rbm-3.2 genet designede vi en crRNA med et PAM-motiv, der var placeret på den modsatte streng (skabelonstreng) af DNA ( Figur1A). Den Cas9 cut site var placeret 6 baser væk fra rbm-3,2 start codon ATG. For at indføre for tidligt stop codons i rbm-3.2 genet designede vi en reparationsskabelon med følgende fem hovedkarakteristika: 1) 35 baser af uafbrudt hyldest til rbm-3.2 opstrøms rbm-3.2 start codon (venstre homologiarm) 2) En kort strækning af baser, der indeholder PAM-motivet, blev slettet 3) Et EcoRI-begrænsningssted blev introduceret umiddelbart efter starten codon til screening 4) Den anden og den tredje codons af rbm-3.2 blev slettet, og tre stop codons blev indført efter den femte RBM-3.2 codon for at stoppe oversættelsen af rbm-3,2 mRNA 5) 35 baser af uafbrudt hyldest til den første intron af rbm-3.2 blev medtaget nedstrøms af redigering (højre homology arm) ( Figur1B).

Injektionsblandingen til dette CRISPR-eksperiment blev forberedt som angivet i tabel I. Injektionsblandingen blev inkuberet ved 37 °C i 15 minutter for at samle ribonukleoproteinkomplekser. Blandingen blev derefter centrifugeret og læsset ind i den trak mikroinjection nål. Microinjection i C. elegans gonad blev udført som beskrevet i Iyer et al. 201943.

Figur 2 viser den eksperimentelle tidslinje for generering af redigerede C. elegans ved hjælp af denne protokol. Selvom vi typisk injicerer 30 orme til hvert CRISPR-eksperiment, injicerer nogle laboratorier færre orme (mellem 10 og 20) for hvert CRISPR-eksperiment. Da injektion af flere orme øger sandsynligheden for at finde positive redigeringer, foretrækker vi at injicere et større antal orme. Mange laboratorier vælger "jackpot" brød (plader med mere end 50% Rol og Dpy afkom) til screening. Det er vores erfaring efter at have udført flere CRISPR eksperimenter, selvom jackpot brød opstår lejlighedsvis, de fleste gange, kommer de Rol orme, der er plukket til screening, ofte fra mange forskellige P0-plader, der hver består af et par Rol-afkom. Ingen jackpot brød blev opnået i dette eksperiment.

I alt screenede vi det genomiske DNA fra 73 F1 Rol orme, der blev opnået fra 7 injicerede P0 orme for tilstedeværelsen af redigeringen. Sekvenserne af screeningsgrunde og deres placeringer med hensyn til start codon af rbm-3.2 genet er repræsenteret i figur 3A. Gennem vores analyse viste det sig, at 7 ud af 73 F1-orme var positive for redigeringen (9,5 %) ( Figur3B). Uredigerede orme viste et enkelt DNA-fragment på 445 bp ved EcoRI fordøjelse. Mens orme, der transporterer en for tidlig stop codon i rbm-3.2 genet udstillet to fragmenter af 265 bp og 166 bp henholdsvis på EcoRI fordøjelse. Heterozygot-redigerede orme viste tre fragmenter på EcoRI fordøjelse: en vild-type uredigeret DNA-fragment af 445 bp og to DNA-fragmenter af 265 bp og 166 bp henholdsvis fra den redigerede kopi af rbm-3.2 genet.

For at identificere orme, der bærer homozygoe redigeringer, overførte vi 12 F2 orme fra de identificerede positive F1 heterozygoter på nye individuelle plader og tillod dem at producere afkom (F3). F2 orme blev derefter screenet for homozygosity som beskrevet tidligere. 6 ud af 12 (50%) screenede orme viste sig at være homozygot for vores redigering af interesse (Figur 4A). Det genomiske DNA fra en identificeret homozygotret ormlinje blev brugt til at opsætte en DNA-sekventeringsreaktion. DNA sekventering analyse bekræftede tilstedeværelsen af redigering i sin homozygode tilstand (Figur 4B). Generelt er det gavnligt at sekvens flere homozygot orm linjer for at sikre, at alle homozygot-redigerede orm linjer udviser den samme fænotype (hvis null-mutation producerer en bestemt fænotype). Desuden kan det også være nødvendigt at validere gen knockouts ved hjælp af en udtryksbaseret analyse såsom vestlige blotting eller RT-PCR eller via fænotype analyse. Dette skyldes, at det er muligt, at der på trods af indførelsen af for tidligt stop codons i begyndelsen af genet, kan være en alternativ ATG til stede nedstrøms for for tidligt stop codons. Denne ATG kan bruges til at indlede proteinudtryk, hvilket resulterer i et delvist funktionelt afkortet protein.

Reagens Koncentration Diskenhed, der skal tilføjes
Cas9 protein i nucleasefrit vand med 20% glycerol 2 μg/μL 5 μL
tracrRNA i 5 mM Tris-Cl pH 7,5 4 μg/μL 5 μL
dpy-10 crRNA i 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 0,4 μL
rbm-3,2 crRNA i 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 1 μL
dpy-10 reparation skabelon i steril nuclease-fri vand 500 ng/μL 0,55 μL
rbm-3,2 reparation skabelon i steril nuclease-fri vand 1 μg/μL 2,2 μL
KCl i sterilt nukleasefrit vand 1 M 0,5 μL
sterilt nukleasefrit vand - 5.35 μL

Tabel 1: Komponenter i injektionsblandingen til CRISPR/Cas9-redigering med ribonucleoproteinkomplekser og dpy-10 som co-CRISPR-markør. Brug sterile teknikker og RNase-fri reagenser, mens du foretager injektion mix. Bemærk, at sterilt, ikke-DEPC-behandlet nukleasefrit vand blev brugt til at lave injektionsblandingen.

Reagens Koncentration Diskenhed, der skal tilføjes
KCl 1 M 5 mL
Tris-HCl pH 8,3 1 M 1 mL
MgCl2 1 M 250 μL
NP-40 (eller IGEPAL CA-630) 100% 450 μL
Mellem-20 100% 450 μL
Gelatine 2% 500 μL
Vand - 92,35 mL

Tabel 2: Worm lysis buffer opskrift. Ormen lysis buffer kan laves i bulk, autoklavet, filtreret og aliquoted til langtidsopbevaring (BEMÆRK: lysis bufferen kan opbevares i over et år ved stuetemperatur). Tilsæt en 1:100 fortynding af 20 mg/mL proteinase K til ormen lysis buffer lige før hver brug.

Figure 1
Figur 1: Skematisk viser crRNA og reparation skabelon design til rbm-3.2 for tidlig stop CRISPR. A. Skematisk visning af kodning og skabelon tråde af rbm-3.2 genet med crRNA sekvens og PAM motiv sekvens placeret på skabelonen streng. B. Skematisk repræsenterer de forskellige egenskaber ved reparation skabelon, der blev syntetiseret til at indføre tre for tidligt stop codons i rbm-3.2 genet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentel tidslinje for generering af homozygodede C. elegans af CRISPR/Cas9 redigering ved hjælp af formonterede ribonucleoproteinkomplekser og dpy-10 som co-CRISPR-markør. En dag-for-dag opdeling af de trin, der skal udføres for at generere homozygot-redigeret C. elegans ved hjælp af denne metode til CRISPR / Cas9 redigering. Kort sagt blev 30 orme injiceret med CRISPR-redigeringsblandingen ved hjælp af mikroinjektion og adskilt på individuelle MYOB-plader sået med OP50 E. coli. Efter 24 timer blev de injicerede P0 orme overført til friske nye MYOB-plader og fik lov til at fortsætte med at lægge æg. På dag 3 og 4 efter mikroinjektion blev pladerne undersøgt for tilstedeværelsen af Rol F1 orme. Pladerne med det maksimale antal Rol og Dpy F1 orme blev valgt og 73 F1 Rol orme (vi vælger normalt mellem 50 til 100 F1 Rol orme pr CRISPR eksperiment) blev singled på nye individuelle MYOB plader (1 orm pr plade) og lov til at lægge æg i ca 2 dage. På dag 6 efter mikroinjektion blev ormlyater fremstillet af F1 orme, der havde produceret afkom (F2) og blev screenet for tilstedeværelsen af redigeringen af PCR efterfulgt af begrænsning fordøjelse med EcoRI og agarose gel elektroforese. På dag 7, 12 ikke-Rol, ikke-Dpy F2 orme blev overført fra de positive plader på nye individuelle plader og lov til at producere afkom (F3). På dag 9 blev F 2-ormene screenet for homozygositet af redigeringen som beskrevet tidligere. På dag 10 blev orm lysis, PCR og PCR oprydning udført for de homozygode F3 orme og DNA-koncentrationen blev målt ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer. På dag 11 blev Sanger sekventeringsreaktioner sat op til positive prøver, og reaktionerne blev sendt til DNA-sekventering. På dag 12 blev sekventeringsresultaterne analyseret, og tilstedeværelsen af redigeringen blev verificeret ved hjælp af en sekvensanalysesoftware (f.eks. CLC-sekvensfremviser). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Screening for C. eleganer, der er heterozygottede for rbm-3.2 for tidligt stop codons. Agarose gel elektroforese billeder af C. elegans genomisk PCR DNA fordøjet med EcoRI. 73 individuelle F1 orme blev genotyped og screenet for tilstedeværelsen af rbm-3.2 edit. Røde tal og stjerner angiver positivt redigerede orme. Alle de 7 identificerede positivt redigerede C. elegans var heterozygote til redigeringen, da de udviste et vildt type uredigeret DNA-fragment på 445 bp og to DNA-fragmenter af henholdsvis 265 bp og 166 bp fra den redigerede kopi af rbm-3.2 genet ved EcoRI-fordøjelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Identifikation og kontrol af homozygoterede C. eleganer, der bærer rbm-3.2 premature stop codons. A. Screening for C. elegans, der er homozygot for rbm-3,2 for tidligt stop codons. Agarose gel elektroforese billeder af C. elegans genomisk DNA fordøjet med EcoRI. 12 individuelle F2 orme fra positive plader blev genotyped og screenet for homozygosity af rbm-3.2 edit. Rød: homozygot-redigerede orme. 6 ud af de 12 screenede F2 orme (50%) var homozygot for rbm-3,2 for tidligt stop codons. Der var ikke noget PCR-produkt til orm 7. B. Bekræftelse af indsættelsen af for tidlig stop codons i rbm-3.2 ved DNA sekventering. Skematisk viser sammenligningen af DNA og protein sekvenser af uredigerede og redigerede homozygoter. Analyse af DNA sekventeringsresultater af genomisk DNA fra homozygote-redigerede orme bekræftede tilstedeværelsen af de tre for tidlige stop codons i rbm-3.2 genet ved CRISPR / Cas9 redigering. Alle de resulterende aminosyreændringer efter CRISPR/Cas9-redigering er angivet med enten røde bogstaver eller røde stjerner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi har brugt ovenstående protokol til at redigere flere gener udover rbm-3.2. Vores redigeringseffektivitet for forskellige loci, guide RNA'er og reparationsskabeloner (enkeltstrengede og dobbeltstrengede) har varieret mellem 2% og 58% (data ikke vist). De observerede redigeringseffektiviteter kan sammenlignes med de tidligere rapporterede redigeringseffektiviteter på 2 % til 70 % for denne protokol27. Vi har også haft succes med at bruge denne teknik til at gøre gen sletninger. Ved hjælp af to crRNAs erstattede vi et gen, der er tæt på 6 kb i længden med kodningssekvensen for grønt fluorescerende protein (GFP) (data, der ikke er vist). Til dette eksperiment viste det sig, at ca. 14 % af de Rol F 1-orme, der blev analyseret, var positive for gensletning og udskiftning med GFP (data, der ikke blev vist). Der kræves dog yderligere eksperimenter for at bestemme den maksimale længde af gensletninger og udskiftninger, der kan udføres ved hjælp af denne teknik.

Denne teknik kan bruges til at foretage indsættelser, der er omkring 1,6 kb i længden19. En nylig undersøgelse har vist, at for at gøre indsættelser, der er over 1,6 kb i længden ved hjælp af denne protokol, generere to dobbelt-streng pauser og ved hjælp af reparation skabeloner med længere homology arme kan gøre det muligt at indsætte meget større fragmenter af DNA (~ 10 Kb)28. Alternativt kan der udføres flere runder af genredigering med denne protokol for at generere større redigeringer. Andre plasmidbaserede C. elegans CRISPR/Cas9-genredigeringsprotokoller kan også anvendes til CRISPR-eksperimenter , der involverer indsættelse af DNA-fragmenter større end 1,6 kb46,47,48.

Før du bruger denne protokol til genredigering, er det nødvendigt at sikre, at genet af interesse ikke er knyttet til dpy-10 græshoppe på kromosom II. I tilfælde af et mål gen er knyttet til dpy-10, kan det være problematisk at adskille dpy-10 mutation væk fra din redigering af interesse. I tilfælde af at interessegen er knyttet til dpy-10-locus, kan andre co-CRISPR-markører som unc-58 (X-kromosom),unc-22 eller zen-4 (kromosomIV) og ben-1 eller pha-1 (kromosom III), der er placeret på forskellige kromosomer, anvendes24,25,26,28. Data fra Meyer lab viser, at ben-1 og zen-4 mutationer kan bruges som succesfulde co-CRISPR markører til screening med denne metode28. Det er dog vigtigt at bemærke, at brug af zen-4 og pha-1 som co-CRISPR markører kræver at udføre CRISPR eksperiment i ikke-vilde-type zen-4 (cle10ts) eller pha-1(e2123ts) baggrunde henholdsvis26,28. Crispr-eksperimenter med visse CO-CRISPR-markører som ben-1 kan desuden kræve fremstilling af specielle plader (f.eks. plader, der indeholder benzimidazol)28. Vi har med succes brugt unc-58 co-CRISPR-mærket til at screene for positive redigeringer for et gen, der er knyttet til dpy-10 ved hjælp af denne metode (data ikke vist). UNC-58(e665) mutationen giver en synlig fænotype (lammelse), der effektivt kan bruges til at screene for positivt redigerede orme24. Alternativt, hvis adgang til et fluorescerende mikroskop er tilgængeligt, kan et fluorescerende mærket gtbp-1-gen også bruges som co-CRISPR-markør for denne protokol19.

For en høj redigeringseffektivitet, mens du bruger denne metode til genomredigering, skal redigeringsstedet være inden for 10 til 30 baser fra Cas9-skærestedet. Hvis redigeringsstedet er over 30 baser væk fra Cas9-skærestedet, falder redigeringseffektiviteten drastisk19,35,37. Men en nylig undersøgelse fra Meyer lab har vist, at skabe to dobbelt-streng pauser i en afstand fra hinanden kan gøre det muligt at indsætte redigeringer langt væk fra Cas9 cut site ved hjælp af denne protokol28.

I den aktuelle protokol er reparationsskabelonen designet, så alle tre indsatte stop codons vises i samme læseramme. Men en alternativ strategi for at skabe null-mutanter ville være at bruge en universel 43-baser lang knock-in STOP-IN kassette, der er blevet beskrevet tidligere50. Vigtigere, denne kassette har stop codons i alle de tre mulige læserammer og forårsager frameshift mutationer. Dette er en særlig nyttig strategi til generering af null-mutanter, når der sker forkert eller ufuldstændig reparation på redigeringsstedet.

Afslutningsvis vil jeg sige, at dette på grund af dens korte varighed og de seneste fremskridt inden for denne metode er en fremragende metode til rutinemæssige laboratorieforsøg, der involverer tilsætning af korte immunogene epitoptags, fluorescerende tags, fremstilling af gensletninger, generstatninger og codonsubstitutioner.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af University of Tulsa (TU) start-up midler og TU Faculty Development Summer Fellowship tildelt Jyoti Iyer. Vi vil gerne takke Kemi Summer Undergraduate Research Program (CSURP) og Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) for tildeling af stipendier til de studerende, der er involveret i denne undersøgelse. Vi vil gerne anerkende Miss Caroline Dunn for hendes tekniske hjælp. Endelig vil vi gerne takke Drs. Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter og Saili Moghe for deres kritiske kommentarer til dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Barcoded DNA sequencing tubes Eurofins Genomics SimpleSeq Kit Premixed N/A
Cas9 protein PNA Bio CP01 Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs Horizon Discovery/ GE Dharmacon N/A Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
EcoRI New England Biolabs R3101S Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit Qiagen 28004 Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix Meridian Bioscience BIO-25043 Stored at -30 °C
Primers IDT N/A Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K Gold Bio P-480-SL4 Stored at -30 °C
Repair template oligos IDT N/A 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA Horizon Discovery/ GE Dharmacon U-002005-50 Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  2. Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annual Review of Biochemistry. 83, 409-439 (2014).
  3. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of Programmable Nucleases for Genome Engineering. Journal of Molecular Biology. 428 (5), 963-989 (2016).
  4. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  5. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  6. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Almendros, C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 155 (3), 733-740 (2009).
  9. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  10. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  11. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  12. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. CRISPR, Methods in Molecular Biology. 1311, Humana Press. New York, NY. 7-75 (2015).
  13. Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
  14. Frøkjær-Jensen, C. Exciting prospects for precise engineering of Caenorhabditis elegans genomes with CRISPR/Cas9. Genetics. 195 (3), 635-642 (2013).
  15. Waaijers, S., Boxem, M. Engineering the Caenorhabditis elegans genome with CRISPR/Cas9. Methods. 68 (3), 381-388 (2014).
  16. Xu, S. The application of CRISPR-Cas9 genome editing in Caenorhabditis elegans. Journal of Genetics and Genomics. 42 (8), 413-421 (2015).
  17. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  18. Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
  19. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121, 86-93 (2017).
  20. Kim, H. M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106 (2019).
  21. Prior, H., MacConnachie, L., Martinez, J. L., Nicholl, G. C., Beg, A. A. A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins. Journal of Visualized Experiments. (134), e57518 (2018).
  22. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly efficient, rapid and Co-CRISPR-independent genome editing in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (11), 3693-3698 (2017).
  23. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
  24. Arribere, J. A., Bell, R. T., Fu, B. X., Artiles, K. L., Hartman, P. S., Fire, A. Z. Efficient marker-free recovery of custom genetic modifications with CRISPR/Cas9 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (3), 837-846 (2014).
  25. Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  26. Ward, J. D. Rapid and precise engineering of the Caenorhabditis elegans genome with lethal mutation co-conversion and inactivation of NHEJ repair. Genetics. 199 (2), 363-377 (2015).
  27. Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  29. Levy, A. D., Yang, J., Kramer, J. M. Molecular and genetic analyses of the Caenorhabditis elegans dpy-2 and dpy-10 collagen genes: a variety of molecular alterations affect organismal morphology. Molecular Biology of the Cell. 4 (8), 803-817 (1993).
  30. Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55 (4), 555-565 (1988).
  31. Schnabel, H., Schnabel, R. An organ-specific differentiation gene, pha-1, from Caenorhabditis elegans. Science. 250 (4981), 686-688 (1990).
  32. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Research. 22 (9), 1762-1763 (1994).
  33. Chalfie, M., Thomson, J. N. Structural and functional diversity in the neuronal microtubules of Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 93 (1), 15-23 (1982).
  34. Severson, A. F., Hamill, D. R., Carter, J. C., Schumacher, J., Bowerman, B. The aurora-related kinase AIR-2 recruits ZEN-4/CeMKLP1 to the mitotic spindle at metaphase and is required for cytokinesis. Current Biology. 10 (19), 1162-1171 (2000).
  35. Paix, A., Schmidt, H., Seydoux, G. Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs. Nucleic Acids Research. 44 (15), 128 (2016).
  36. Chiu, H., Schwartz, H. T., Antoshechkin, I., Sternberg, P. W. Transgene-free genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas. Genetics. 195 (3), 1167-1171 (2013).
  37. Paix, A., et al. Scalable and versatile genome editing using linear DNAs with microhomology to Cas9 Sites in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1347-1356 (2014).
  38. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  39. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nature Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
  40. Friedland, A. E., Tzur, Y. B., Esvelt, K. M., Colaiácovo, M. P., Church, G. M., Calarco, J. A. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
  41. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  42. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PloS One. 9 (5), e98186 (2014).
  43. Iyer, J., DeVaul, N., Hansen, T., Nebenfuehr, B. Using microinjection to generate genetically modified Caenorhabditis elegans by CRISPR/Cas9 editing. Microinjection, Methods in Molecular Biology. 1874, 431-457 (2019).
  44. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  45. Peel, N., Iyer, J., Naik, A., Dougherty, M. P., Decker, M., O'Connell, K. F. Protein phosphatase 1 down regulates ZYG-1 levels to limit centriole duplication. PLoS Genetics. 13 (1), 1006543 (2017).
  46. Dickinson, D. J., Pani, A. M., Heppert, J. K., Higgins, C. D., Goldstein, B. Streamlined genome engineering with a self-excising drug selection cassette. Genetics. 200 (4), 1035-1049 (2015).
  47. Norris, A. D., Kim, H. M., Colaiácovo, M. P., Calarco, J. A. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans with a toolkit of dual-marker selection cassettes. Genetics. 201 (2), 449-458 (2015).
  48. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  49. Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA Donor Molecules Greatly Improves Precision Genome Editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (2), (2020).
  50. Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3607-3616 (2018).

Tags

Genetik Udgave 166 CRISPR/Cas9 C. elegans ribonucleoprotein komplekser genom engineering rbm-3.2 genredigering microinjection CRISPR screening
CRISPR/Cas9 Redigering af <em>C. elegans rbm-3.2</em> Genet ved hjælp af <em>dpy-10</em> Co-CRISPR Screening Marker og Samlet Ribonucleoprotein Complexes.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, A., Bergwell, M., Smith, E.,… More

Smith, A., Bergwell, M., Smith, E., Mathew, D., Iyer, J. CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.. J. Vis. Exp. (166), e62001, doi:10.3791/62001 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter