Summary
Nous décrivons ici le système RatWalker, construit en redessinant l’appareil MouseWalker pour s’adapter à l’augmentation de la taille et du poids des rats. Ce système utilise la réflexion interne totale frustrée (FTIR), la capture vidéo à grande vitesse et un logiciel d’analyse en libre accès pour suivre et quantifier les paramètres de marche.
Abstract
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative progressive causée par la perte de neurones dopaminergiques (DA) dans la substance noire pars compacta. Les anomalies de la démarche, y compris la diminution du balancement des bras, la vitesse de marche plus lente et des pas plus courts sont fréquentes chez les patients atteints de MP et apparaissent tôt dans l’évolution de la maladie. Ainsi, la quantification des schémas moteurs dans les modèles animaux de MP sera importante pour la caractérisation phénotypique au cours de l’évolution de la maladie et lors du traitement thérapeutique. La plupart des cas de MP sont idiopathiques; cependant, l’identification de formes héréditaires de MP a révélé des mutations génétiques et des variantes, telles que des mutations de perte de fonction dans Pink1 et Parkin, deux protéines impliquées dans le contrôle de la qualité mitochondriale qui pourraient être exploitées pour créer des modèles animaux. Alors que les souris sont résistantes à la neurodégénérescence lors de la perte de Pink1 et Parkin (délétion simple et combinée), chez le rat, le déficit en Pink1 mais pas en Parkin entraîne une perte de neurones DA nigraux et une déficience motrice. Ici, nous rapportons l’utilité de l’imagerie IRTF pour découvrir les changements de démarche chez les jeunes rats mâles (âgés de 2 mois) qui marchent librement avec une perte combinée de Pink1 et Parkin avant le développement d’une anomalie motrice visuelle apparente globale à mesure que ces rats vieillissent (observée à 4-6 mois), caractérisée par un traînement des membres postérieurs comme précédemment rapporté chez les rats Pink1 knockout (KO).
Introduction
La MP, le trouble neurodégénératif du mouvement lié à l’âge le plus courant, est causée par la perte de neurones DA dans la substance noire pars compacta. Cette perte de neurones DA nigraux et les entrées DA dans le striatum conduisent aux altérations de la fonction motrice observées chez les patients atteints de 1,2. Les caractéristiques motrices déterminantes des patients atteints de MP, connues collectivement sous le nom de parkinsonisme, comprennent la rigidité, les tremblements au repos, la bradykinésie, l’instabilité posturale et la micrographie3. De plus, les troubles de la marche, qui sont fréquents chez les patients atteints de MP, apparaissent tôt dans l’évolution de la maladie 1,4,5. Bien que certains modes de vie soient suggérés pour aider à ralentir la progression de la MP, comme une alimentation saine et l’exercice régulier, il n’existe actuellement aucun remède contre la MP, seulement des médicaments pour gérer les symptômes. Cela laisse place à la nécessité d’approfondir les recherches dans l’espoir d’améliorer les traitements. Ainsi, la caractérisation du schéma de démarche dans les modèles animaux MP est un outil crucial pour caractériser la pertinence du modèle ainsi que la façon dont les traitements thérapeutiques visant à contrôler la MP préviennent ou améliorent les déficiences motrices.
Il existe différents modèles animaux de MP qui ont été utilisés pour tester des traitements thérapeutiques, mais chacun a ses limites. Par exemple, des modèles animaux traités avec la neurotoxine 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) ont fourni une grande quantité d’informations sur les processus importants pour la perte de neurones DA nigraux et les adaptations striatales subséquentes, et ont souligné le rôle des mitochondries dans la pathogenèse de la MP; cependant, le contexte pathogénique du modèle MPTP est de nature toxique plutôt que neurodégénérative comme dans le6 humain. D’autres modèles inductibles chimiquement comprennent la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) et la roténone. Le 6-OHDA a été le premier agent utilisé pour induire la MP par accumulation sélective du médicament dans les neurones DA, ce qui finit par tuer les neurones et conduit à des symptômes semblables à ceux de la MP. Ce modèle a d’abord été utilisé pour le suivi de la déplétion en DA en examinant le comportement en réponse à l’amphétamine et à l’apomorphine7. Cette méthode d’induction de la MP s’est avérée utile pour le dépistage des agents pharmacologiques qui ont un impact sur l’AD et ses récepteurs8. Bien que le modèle 6-OHDA soit un excellent modèle pour suivre les déficits moteurs quantifiables, ce modèle ne montre pas comment la perte progressive de neurones et la formation de corps de Lewy affectent l’animal. L’autre méthode d’induction, la roténone, s’est avérée avoir une dégénérescence progressive des neurones nigrostriataux avec la perte de tyrosine hydroxylase et de transporteur DA, permettant un meilleur modèle pour suivre la perte de neurones au fil du temps9. Les rats traités à la roténone présentaient une bradykinésie, une instabilité posturale et une démarche instable10. Cependant, cette méthode s’est avérée très variable entre les différentes souches de rats, ce qui a suscité des doutes quant à savoir si la roténone est ou non un modèle fiable11,12,13. Bien qu’il ait été démontré que l’analyse de la marche est influencée par l’induction de la MP chez les rats, à ce jour, les modèles de rat de la MP génétiquement induite n’ont pas été facilement utilisés pour l’analyse de la marche en marchant librement sur une piste.
Une façon d’analyser la déficience motrice chez les rongeurs qui marchent librement est l’analyse cinématique de la démarche, qui peut être effectuée en utilisant l’imagerie FTIR. Cette méthode établie utilise un capteur tactile optique basé sur FTIR, qui enregistre et suit les empreintes des rongeurs lorsqu’ils descendent la piste14,15,16. Par rapport à d’autres méthodes, le FTIR ne dépend d’aucun marqueur sur le corps de l’animal qui pourrait interférer avec les empreintes de pattes. La génération des données vidéo produit des empreintes numériques des quatre membres qui peuvent être combinées pour créer un modèle de marche dynamique et reproductible pour divers modèles de rongeurs. Le principe de l’analyse de la démarche basée sur l’imagerie est de prendre chaque patte individuelle et de mesurer la zone de contact au fil du temps lorsque le rongeur descend la piste. Chaque position est représentée par une augmentation de la surface des pattes (dans la phase de freinage) et une diminution de la surface de la patte (dans la phase de propulsion). Ceci est procédé par la phase de balancement, c’est-à-dire lorsqu’aucun signal de patte n’est détecté. Après l’évaluation de la vidéo, plusieurs paramètres sont générés qui peuvent être utilisés pour comparer le modèle de type sauvage (WT) et le modèle. Quelques exemples de paramètres sont la longueur de marche (distance parcourue par la patte en un pas), la durée de la balançoire (durée pendant laquelle la patte n’est pas en contact avec la piste), la vitesse de balancement (longueur de pas en fonction de la durée de la balançoire) et le motif des pas (pas diagonaux, marches latérales ou pas de ceinture).
Pour démontrer l’utilité du FTIR pour découvrir les premiers changements de la démarche chez les rats, nous avons utilisé un modèle génétique de la MP chez le rat. Alors que la plupart des cas de MP sont idiopathiques; l’identification de formes héréditaires de MP a mis au jour des mutations génétiques et des variants, tels que des mutations de perte de fonction chez Pink1 et Parkin, deux protéines impliquées dans le contrôle de la qualité mitochondriale17, qui pourraient être exploitées pour créer des modèles animaux18. Malheureusement, les souris sont résistantes à la neurodégénérescence lors de la perte de ces protéines (simples et combinées)19,20,21. Chez le rat, le déficit en rose1 mais pas en parkin entraîne une perte de neurones DA nigraux et des déficiences motrices22, mais sans pénétration complète. Par conséquent, nous avons généré un modèle combiné de rat Pink1/Parkin double knockout (DKO), qui affiche le phénotype de traînage des membres postérieurs visuellement apparent signalé chez les rats mâles Pink1 KO22, mais maintenant à un taux plus élevé : 100% contre 30-50% des mâles entre 4-6 mois.
Bien que cette méthode fonctionne bien pour analyser les déficits moteurs chez les souris14, les spécifications du système d’imagerie FTIR pour tenir compte de la taille et du poids des rats n’étaient pas disponibles auparavant à des fins non commerciales. Nous expliquons ici comment construire le RatWalker, un système d’imagerie de la marche FTIR modifié inspiré du MouseWalker14, sauf adapté à la taille et au poids des rats. Ce système utilise un effet optique, FTIR, pour fournir une méthode permettant de visualiser et d’enregistrer ensuite les empreintes d’animaux à des fins d’analyse. Le contact du pied d’un animal avec le guide d’ondes optique (plate-forme) provoque une perturbation du trajet de la lumière, ce qui entraîne un effet de diffusion visible, qui est capturé à l’aide d’une vidéographie à haute vitesse de qualité domestique et d’un traitement à l’aide d’un logiciel libre. Cette étude démontre la puissance de l’imagerie IRTF dans l’étude des changements de démarche dans les modèles génétiques de MP chez le rat. Par exemple, alors que des changements moteurs visuellement apparents manifestes (c’est-à-dire le traînement des membres postérieurs) sont observés chez les rats DKO mâles à 4 mois au plus tôt, en utilisant le FTIR, nous sommes en mesure de découvrir des anomalies de la porte chez les rats DKO mâles à l’âge de 2 mois.
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Protocol
Toutes les études animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre médical de l’Université du Nebraska.
1. Appareil de marche
REMARQUE: Modélisé à partir du MouseWalker14, le RatWalker a été conçu avec des dimensions proportionnelles à la différence de longueur de pas entre les rats et les souris. Il se compose d’un rétroéclairage à éclairage latéral, d’une enceinte de passerelle, d’une passerelle de guide d’ondes optique, d’un miroir et d’une caméra (figure S1). Des bandes de LED, orientées en quinconce, ont été utilisées de chaque côté de la passerelle et des guides d’ondes de rétroéclairage pour accueillir le matériau supplémentaire. Les matériaux nécessaires à la construction de l’appareil de marche modifié se trouvent dans le tableau S1.
- Utilisez un rétroéclairage (Figure S2) pour créer une silhouette de l’animal qui est utilisée par le logiciel pour attribuer la position, la direction du mouvement et les qualités morphométriques. La construction est composée d’un panneau stratifié composé d’un diffuseur en acrylique, d’un guide d’ondes optique, d’un réflecteur et de bandes lumineuses LED assemblées dans un cadre en aluminium de série (tableau S1).
- Utilisez un enclos de passerelle (figure S3) pour guider l’animal le long de la plate-forme et dirigez-le vers la cage de la maison. La construction est constituée de feuilles d’acrylique transparentes soudées au solvant avec du dichlorométhane (tableau S2).
- Utilisez la passerelle (figure S4) pour fournir le support permettant de générer des empreintes éclairées. La passerelle est construite en acrylique transparent, qui est éclairé latéralement avec des LED à bande et logé dans un angle en aluminium (tableau S3).
- Placez un miroir (figure S5) directement sous la passerelle à un angle de 45 degrés pour refléter le dessous de la passerelle pour la vidéographie. Il est construit à partir d’un miroir en verre de 1/4 » d’épaisseur soutenu par de l’acrylique et de supports inclinés disposés en rangée (tableau S4).
- Effectuez une vidéographie à l’aide d’une caméra d’action haute vitesse de qualité domestique montée sur trépied.
2. Configuration de l’équipement
- Alignez le rétroéclairage, la passerelle et le miroir conformément à la figure S1, au-dessus d’un comptoir, d’un établi ou d’un chariot stable. Assurez-vous que chaque composant est centré par rapport à la passerelle.
- À l’aide d’un niveau, assurez-vous que les composants sont à plomb horizontal.
- Placez l’enceinte de la passerelle au-dessus de la passerelle.
- Nettoyez toutes les surfaces de contact avec de l’éthanol à 70 %. Assurez-vous d’utiliser une serviette non abrasive pour éviter de rayer la passerelle.
- Montez la caméra haute vitesse sur un trépied de 57 pouces et placez-la au milieu de la ligne du miroir, suffisamment espacée pour capturer toute la passerelle à l’intérieur du champ de vision. Dans le menu des paramètres vidéo, assurez-vous que la caméra haute vitesse est réglée sur l’acquisition linéaire en mode 1080p à 120 images par seconde (ips) avec tout type de réglage automatique ou d’optimisations désactivé.
- Branchez et allumez les bandes lumineuses LED pour le rétroéclairage et la passerelle. Il peut être nécessaire d’atténuer le rétroéclairage pour réduire la capture de l’arrière-plan.
3. Acclimatation des animaux
REMARQUE : Une semaine avant la première expérience, faites passer les animaux à travers l’appareil de marche modifié.
- Placez une cage domestique au terminus de la passerelle.
- Une fois l’enceinte installée et les lumières éteintes, placez le rat au bout de la passerelle en face de la cage de la maison et laissez-le traverser la passerelle de manière non forcée.
- Faites passer chaque rat à travers l’appareil de marche modifié plusieurs fois, jusqu’à ce qu’ils puissent traverser en douceur toute la passerelle.
- Répétez le processus deux jours avant l’expérience.
4. Procédure de marche
- Placez une cage à la fin de la passerelle avant le début de chaque course pour servir de signal positif au rat pour traverser la passerelle.
- Éteignez les lumières de la pièce, allumez la caméra et commencez à enregistrer plusieurs secondes avant que le rat ne soit placé sur la plate-forme.
REMARQUE: Assurez-vous d’utiliser une carte mémoire officiellement recommandée par le fabricant de l’appareil photo. Une carte mémoire non répertoriée peut toujours fonctionner, mais il n’est pas garanti de capturer à la fréquence d’images supposée. - Une fois l’enceinte installée, placez le rat au bout de la passerelle en face de la cage de la maison et laissez-le traverser la passerelle de manière non forcée.
- Arrêtez l’enregistrement une fois que l’animal atteint le terminus de la passerelle.
- Nettoyez la passerelle en utilisant de l’éthanol à 70 % et une serviette non abrasive entre les courses et après qu’un animal urine ou défèque, puis laissez l’éthanol s’évaporer avant d’introduire un autre animal.
- Faites passer les rats à travers la passerelle un total de 7 fois au cours de chaque période d’observation, en prenant les trois premiers passages qui marquent comme passant pour analyse.
- Marquez une course comme passant si l’animal fait quatre pas consécutifs ou plus en direction de la cage d’accueil sans interruption en raison du toilettage, de la pause ou des mouvements errants.
NOTE: Il est recommandé d’enregistrer la masse des animaux avant chaque série de mesures. Pour notre étude, WT (n = 7) et DKO (n = 8) pesaient respectivement 200,3 ± 21,67 g et 296,6 ± 3,85 g (p = 0,004, test t non apparié avec correction de Welch). Nous ne voyons pas de problème avec les rats de tout âge ou de toute taille.
5. Prétraitement vidéo
REMARQUE: Les vidéos capturées par la caméra haute vitesse sont rendues au format mp4 à 120 ips et une résolution de 1080p. Pour alléger la charge du logiciel analytique en aval, coupez d’abord les séquences inutiles et supprimez l’audio de chaque vidéo à l’aide du logiciel LosslessCut (version 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), puis convertissez le flux vidéo mp4 en une séquence d’images png à l’aide du logiciel open source FFmpeg (version 4.2, http://ffmpeg.org/). Remarque : d’autres formats sans perte tels que tiff peuvent être utilisés à la place de png.
- Créez un répertoire pour les vidéos sur un PC exécutant Windows 7 ou une version ultérieure, puis transférez les vidéos du périphérique de stockage de la caméra haute vitesse vers le répertoire nouvellement créé. En outre, copiez ffmpeg.exe au même emplacement.
- Dans LosslessCut, faites glisser les vidéos vers l’interface pour les ouvrir. Supprimez l’audio, définissez les points de coupe de début et de fin pour n’inclure que la partie analytiquement pertinente de la vidéo, définissez le format d’image de capture sur png et exportez. Une fois la vidéo exportée, renommez le fichier vidéo en utilisant n’importe quelle convention de nommage suivie de « _trimmed ».
- Pour convertir par lots les vidéos en séquences d’images, ouvrez une invite de commande, définissez le répertoire de travail sur l’emplacement des vidéos avec « cd [chemin vers le répertoire] », puis exécutez les commandes suivantes:
for %i in (*) do mkdir « %~ni_cropped »
for %i in (*) do mkdir « %~ni_trimmed »
for /f « tokens=1 delims=. » %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i « %a.MP4 » « %a/%a_%04d.png » - Une fois le traitement par lots terminé, ouvrez chaque séquence d’images dans ImageJ Fiji23 et recadrez la séquence à la région d’intérêt (ROI) englobant la zone du sol dans laquelle le rat est observé.
- Pour réduire l’arrière-plan de l’éclairage de la passerelle, augmentez l’équilibre des couleurs minimum du canal cyan à 76.
- Enregistrez en tant que séquence d’images et changez le suffixe « _trimmed » en « _cropped », en enregistrant les fichiers dans leur dossier « _cropped » respectif.
6. Traitement de la marche
NOTE: Les données de marche sont traitées et quantifiées à l’aide du logiciel disponible gratuitement, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)14.
- Décompressez et installez le logiciel MouseWalker sur un PC exécutant un environnement Windows 64 bits avec Microsoft Excel installé.
- Après avoir lancé MouseWalker.exe, effectuez un étalonnage initial de l’échelle pour chaque série d’exécutions. Chargez une séquence d’images et, à l’aide de points de repère ou d’une règle capturée dans la vidéo, mesurez deux points de distance connue. Calculez le nombre de pixels par centimètre dans l’image vidéo et entrez cette valeur dans la section des paramètres du formulaire de paramètres avec la fréquence d’images d’acquisition vidéo.
- De même, mesurez la tête, la queue et les pattes du rat pour déterminer la longueur de la tête, la largeur et la surface maximales de la queue, la surface minimale et maximale des pieds et d’autres caractéristiques nécessaires pour remplir la section des paramètres de suivi du formulaire de paramètres MouseWalker. Consultez http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ pour le manuel d’utilisation et d’autres documents.
- Pour obtenir les valeurs de surface corporelle, ouvrez la même séquence d’images dans ImageJ, dessinez une sélection décrivant le rat et effectuez un comptage de pixels par région d’intérêt (ROI).
- Paramètres et paramètres utilisés pour cette publication (figure S6).
REMARQUE : Les paramètres sont fournis à titre d’illustration et dépendent de l’échelle de la vidéo, du matériel d’acquisition et des conditions. Un étalonnage et un réglage du logiciel sont nécessaires chaque fois que la caméra ou l’équipement est repositionné. La capture d’un appareil de mesure dans l’acquisition améliore la précision et facilite l’étalonnage. - Après l’étalonnage, chargez chaque séquence d’images. La sélection automatique lancera l’attribution autonome des empreintes.
- Faites défiler chaque image de la séquence, en corrigeant manuellement les empreintes mal attribuées. Enregistrez une fois cette étape terminée.
- Enfin, sélectionnez évaluer pour traiter les données de position et de pression de l’empreinte. Une série de graphiques, d’images et d’une feuille de calcul avec des mesures quantitatives de la démarche seront exportées dans un dossier de résultats.
7. Analyse des données
- Utilisez la feuille de calcul exportée à la fin de chaque évaluation qui contient des données quantitatives sur la marche pour chaque essai. Concaténer les données de chaque exécution et la moyenne par rat. Tracez les données moyennes et testez la signification à l’aide de GraphPad Prism version 7.0a.
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Representative Results
Entretien de la colonie de rats
La génération et la caractérisation des rats KO simples Pink1 et Parkin ont été décrites précédemment22. Les rats KO simples Pink1 et Parkin ont été obtenus auprès de SAGE Labs (et maintenant disponibles chez Envigo). Les rats DKO ont été générés en croisant des rats Pink1-/- avec des rats Parkin-/- pour obtenir des rats Pink1+/-/Parkin+/-, qui ont été croisés pour obtenir des rats Pink1-/-/Parkin-/- (sera disponible chez Envigo). Pour confirmer la délétion de 26 pb dans Park6 (gène codant pour Pink1), le génotypage a été effectué en utilisant des amorces 5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3' avant et 5'-CCACCACCCACTACTTACT-3'. La délétion de 5 pb dans Park2 (gène codant pour Parkin) a été testée après amplification de l’ADN à l’aide d’un 5'-GGTGTCTTGGCTCAGTGTGA-3' avant et d’un 5'-GCCACCCAGAATAGCATCTC-3' inverse. Des échantillons amplifiés de réaction en chaîne par polymérase (PCR) ont été envoyés à ACGT Inc (Wheeling, IL) pour séquençage (figure S7). Tous les rats ont été gardés sur le fond Long Evans Hooded (LEH). Les rats DKO étaient viables et fertiles; cependant, il y avait un taux élevé de mortalité chez les mères DKO au moment de la parturition (environ 30%). Seuls des rats mâles ont été utilisés dans ces expériences. Les rats ont été gardés dans un environnement à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès libre à l’eau et au chow des rats.
Résultats
Pour servir d’exemple de l’utilité du système d’analyse de la marche FTIR pour les rats, adapté de14, nous avons effectué une analyse de la marche sur des rats mâles WT et Pink1/Parkin DKO à l’âge de 2 mois pour déterminer si l’utilisation de l’analyse cinématique de la marche pouvait révéler des déficiences motrices subtiles non observées avec la perception visuelle humaine avant l’apparition de problèmes de motricité globale à partir de 4 mois.
Semblable aux études précédentes sur la marche chez la souris14, le système FTIR adapté a pu afficher le motif d’empreinte créé par le rat marchant ainsi que le chemin créé par le centre du corps (Figure 1A). Malgré l’augmentation du poids des rats DKO par rapport à WT (figure 1B), la pression du pied appliquée à la surface de marche (visualisée sous forme de cartes thermiques), déterminée par les intensités du signal IRTF, n’a pas changé (figure 1C). Après avoir évalué plusieurs paramètres de marche en fonction de la vitesse de marche (figure 1D-H), nous avons observé que la vitesse de marche et la longueur des pas étaient similaires entre les rats WT et DKO (figure 1D). Cependant, la variation entre les rats WT et DKO est devenue apparente dans la phase de position et la durée de balancement à des vitesses de marche plus lentes (Figure 1E, F). La fraction du cycle de pas où la jambe est dans la phase de posture (durée / période de position) est le facteur de service, et ce paramètre met en évidence plus de temps passé dans la phase de balancement que dans la phase de posture à mesure que le facteur de service diminue, typique de la course (Figure 1G). Encore une fois, les différences sont mises en évidence à des vitesses plus faibles. De plus, alors que les vitesses de balancement augmentent avec l’augmentation de la vitesse chez les animaux WT, la corrélation est émoussée chez les rats DKO (Figure 1H).
L’analyse de la démarche FTIR a également permis de tracer les traces de phase de position de chaque patte par rapport au corps chez des rats marchant librement (Figure 2A, B). Les traces de position sont normalisées à la longueur du corps et sont définies comme la position du pied par rapport au centre du corps depuis le toucher de la patte (position extrême antérieure, AEP) jusqu’à la fin de la phase de position (position extrême postérieure, PEP). En comparant le positionnement de la patte, nous avons observé des changements significatifs dans l’AEP (membre postérieur gauche) et la PEP (membre postérieur droit), suggérant que le membre postérieur gauche est plus proche du corps lors de l’atterrissage de la patte (AEP), tandis que le membre postérieur droit est plus éloigné du corps lors du décollage de la patte (PEP) chez DKO par rapport aux rats WT (Figure 2C).
Plusieurs paramètres supplémentaires ont été significativement modifiés chez les rats DKO par rapport à WT. En particulier, des changements dans les modèles de balancement des membres postérieurs ont été découverts. La vitesse de balancement des membres postérieurs gauche et droit a augmenté chez les rats DKO par rapport aux rats WT (figure 3A), tandis que la durée de balancement des membres postérieurs gauche et droit a diminué (figure 3B). Il convient de noter que la longueur des pas n’a pas été modifiée (figure 4).
Graphique 1. Analyse du modèle d’empreinte et des paramètres d’étape. Modèles d’empreinte représentatifs pour les rats (A) WT et (B) DKO montrant (panneau supérieur) carte thermique de l’empreinte représentant l’intensité des pixels et ligne horizontale représentant la trajectoire du corps ainsi que (panneau inférieur) pieds individuels étiquetés avec différentes couleurs: avant gauche (LF, jaune), postérieur gauche (LH, bleu), avant droit (RF, orange) et postérieur droit (RH, vert). (C) Vitesse de marche moyenne pour chaque rat WT (n = 7) et DKO (n = 8). Moyenne avec SEM. Non significatif. (D-H) Paramètres d’étape en fonction de la vitesse chez les rats WT (n = 7) et DKO (n = 8). Lignes de régression linéaire et valeurs R carrés incluses. (D) La longueur des pas augmente avec la vitesse chez les rats WT et DKO. (E) La durée de balancement est inversement proportionnelle à la vitesse chez les rats WT, mais pas chez les rats DKO (n’est pas significative). (F) La durée de la position diminue avec la vitesse chez les rats WT et DKO. (G) Le facteur de service est inversement proportionnel à la vitesse chez les rats DKO, mais pas chez les rats WT (n’est pas significatif). (H) La vitesse de rotation augmente linéairement avec la vitesse chez les rats WT, mais pas chez les rats DKO (ne sont pas significatifs). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Traces de position et analyse du positionnement des pattes. (A) Analyse représentative de la piste de marche pour un rat WT (avant et après la correction de l’arrière-plan) visualisée avec le nez (rouge solide), le contour de la tête (en pointillés bleus), le contour de la queue (en pointillés verts), le centre du corps (en pointillés blancs) et les empreintes (cercles: vert, RF et bleu clair, LH). (B) Des tracés représentatifs des traces de position pour les rats WT et DKO qui marchent librement. (C) Le positionnement des pattes chez les rats WT (n = 7) et DKO (n = 8) est indiqué. AEP, position extrême antérieure; PEP, position extrême postérieure; L, à gauche; R, à droite; F, patte antérieure; H, patte arrière. Moyenne avec SEM. Significatif par rapport à WT (p < 0,05*, 0,001***) en utilisant l’ANOVA bidirectionnelle et le test de comparaison multiple de Sidak. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Les paramètres de balancement de la patte postérieure ont été modifiés chez les rats DKO. Mesures de la patte avant et de la patte arrière de la vitesse (A) à laquelle les pattes se déplacent et du temps (B) pendant lequel les pattes sont en suspension dans l’air chez les rats WT (n = 7) et DKO (n = 8). L, à gauche; R, à droite; F, patte antérieure; H, patte arrière. Moyenne avec SEM. Significatif par rapport à WT (p < 0,01**) en utilisant le test t bilatéral non apparié de Student avec la correction de Welch. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Longueur des pas inchangée chez les rats DKO. Mesures de la longueur des pas chez les rats WT (n = 7) et DKO (n = 8). L, à gauche; R, à droite; F, patte antérieure; H, patte arrière. Moyenne avec SEM. Significatif par rapport à WT (non significatif) en utilisant le test t bilatéral non apparié de Student avec la correction de Welch. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Les troubles de la démarche, y compris la diminution du balancement des bras, la vitesse de marche plus lente et les pas plus courts, sont une caractéristique déterminante de la MP et surviennent tôt au cours de l’évolution de la maladie 1,5. Plusieurs méthodes ont été développées au fil des ans pour observer et enregistrer les pas pour l’analyse de la marche dans des modèles de chez les rongeurs, avec des techniques manuelles pour quantifier la position des pas conduisant à des approches automatisées plus sensibles et capables de capturer des paramètres dynamiques. Certaines approches statiques impliquent l’encrage des pattes de rongeurs avec un indicateur à suivre sur des supports placés sur une passerelle24,25,26. Les pas résiduels sont ensuite quantifiés à la main. Ces méthodes sont souvent utilisées en conjonction avec l’enregistrement vidéo pour la notation cinématique manuelle. Des méthodes autonomes de capture et de quantification des schémas de marche ont été introduites plus récemment15,16 et sont disponibles dans le commerce. La quantification autonome de la marche ajoute des attributs temporels à des empreintes autrement statiques, permettant aux enquêteurs de rechercher des anomalies attribuées à la vitesse et au temps en plus de la distance et de l’angle27. La pression est également quantifiable lorsqu’elle est associée à la méthode FTIR.
Des anomalies du profil de la marche ont également été signalées dans des modèles de MP induits par des toxines chez le rat. En particulier, des changements de démarche ont été signalés dans le modèle de lésion 6-OHDA utilisant une plateforme commerciale d’analyse de la marche28,29,30. La modification la plus importante de ce modèle a été la baisse de la vitesse et de la cadence de marche. En outre, la plateforme commerciale d’analyse de la marche a été utilisée pour évaluer un certain nombre de paramètres de démarche dynamiques et statiques des modèles de MP, tels que l’impact des lésions unilatérales induites par le 6-OHDA et la façon dont la transplantation de neurones dopaminergiques sauve les altérations de la démarche31. De plus, une étude a analysé le rapport des paramètres des lésions 6-OHDA dans les côtés blessés et non blessés du cerveau, tout en corrigeant la vitesse dans des paramètres connexes tels que le cycle des pas des membres postérieurs, la zone d’empreinte des membres postérieurs et la séquence des étapes, qui sont tous considérablement modifiés lorsque l’on compare différents types de lésions aux témoins salins32 . Cependant, il est important de noter que le fond pathogénique des modèles induits par les toxines est de nature toxique plutôt qu’un processus neurodégénératif comme dans la6 humaine, et en tant que tel, l’évaluation de la démarche après l’induction de la lésion pourrait imiter la MP avancée lorsque les neurones sont perdus, mais rendre les études sur les changements moteurs précoces plus difficiles.
La géométrie de la démarche a été mesurée chez des rats Pink1 KO, Parkin KO et DJ-1 KO22, des modèles de MP héréditaire, qui présentent une perte progressive des neurones dopaminergiques nigraux avec le vieillissement. La démarche a été mesurée à l’aide de l’appareil commercial NeuroCube, où les rats sont autorisés à marcher en cercle, en regardant la géométrie et les caractéristiques dynamiques. Les rats Pink1 et DJ-1 KO ont montré une durée plus courte dans la foulée, le balancement et la position par rapport au WT à 4 et 8 mois.
Parce que les systèmes commerciaux d’analyse de la marche sont coûteux et viennent avec des pipelines d’analyse propriétaires, nous avons cherché une alternative ouverte pour notre étude des modèles héréditaires de la MP chez le rat. Le système MouseWalker14, qui est livré avec des instructions de montage et un logiciel en libre accès, capture tous les paramètres de l’équipement commercial conçu pour les petits rongeurs. Comme la plate-forme était trop petite pour obtenir systématiquement des résultats passables avec des rats adultes, c’est-à-dire quatre pas ininterrompus pendant la locomotion à la vitesse de marche, nous avons redimensionné le matériel pour accueillir les rats. De plus, nous avons utilisé une caméra d’action domestique au lieu d’une solution vidéo commerciale haute vitesse.
Une densité d’images plus faible était un piège potentiel de l’utilisation d’une caméra d’action à la place d’une caméra à haute vitesse. Cependant, le seuil de qualité dans la vidéographie domestique augmente rapidement et est capable d’enregistrer à 120 ips en haute résolution. De plus, la distorsion de l’objectif peut être corrigée pendant l’enregistrement par un logiciel de caméra produisant un champ de vision linéaire (FOV) constant.
Nous étions initialement préoccupés par la dynamique de pression de l’utilisation d’une épaisseur similaire d’acrylique pour la passerelle avec une base plus large et des animaux plus lourds, et la capacité du logiciel à traiter la vidéo d’animaux plus gros dans un champ de vision plus large. Nous supposons que la plage de masse entre les souris et les rats se situe dans la plage de sensibilité de la plate-forme IRTF acrylique nous permettant de mesurer les rats tout au long de leur cycle de vie. De plus, il est possible que la dilution potentielle des pixels soit compensée par la surface plus élevée des empreintes de pattes des rats par rapport à la zone capturée dans le champ de vision, s’il y a une différence significative. Avec un étalonnage approprié, comme documenté ici, le logiciel14 disponible gratuitement a été en mesure de traiter la vidéo de marche des rats comme décrit.
Avec ce protocole, nous avons pu démontrer que le système de marche de souris FTIR14 modifié ici pour les rats peut détecter des altérations de la démarche avant l’observation visuelle du traînage des membres postérieurs chez les rats DKO mâles. Il convient de noter que la déficience motrice visuelle apparente manifeste (traînée des membres postérieurs) observée chez les rats DKO a déjà été signalée chez des rats mâles Pink1 simples KO22. Alors que les rats DKO mâles présentent un traînement des membres postérieurs visuellement observable à partir de l’âge de 4 à 6 mois, l’analyse de la démarche a révélé des changements de locomotion à l’âge de 2 mois. En particulier, des changements dans les paramètres de la démarche des membres postérieurs ont été constatés. Les rats DKO présentent une vitesse de balancement accrue des membres postérieurs (gauche et droite) et une diminution associée de la durée de balancement des membres postérieurs (gauche et droite). De plus, les rats DKO placent leur patte arrière gauche plus près de leur corps lors du toucher des pattes, tandis que la patte arrière droite est plus éloignée de leur corps pendant le décollage de la patte. Bien que nous n’ayons pas découvert de changements dans la durée de la foulée ou de la position chez les rats DKO à 2 mois, la durée de balancement était plus courte chez les rats DKO, comme cela est également signalé chez les rats Pink1 et DJ-1 KO22. Dans l’ensemble, ces changements suggèrent que les paramètres de la démarche des membres postérieurs sont modifiés avant le développement du traînage des membres postérieurs chez les rats DKO mâles. De futures études longitudinales sur la marche qui suivent le développement des altérations de la locomotion aideront à déterminer l’âge auquel les changements de démarche deviennent significatifs.
Dans cette étude, nous avons montré qu’un système de marche de souris FTIR14 modifié ici pour l’étude des rats peut être utilisé pour distinguer les changements dans les paramètres de marche chez les rats DKO mâles âgés de 2 mois, un modèle pour la MP héréditaire, par rapport aux rats WT appariés selon l’âge. Des études antérieures chez des patients atteints de MP ont révélé une longueur de foulée réduite et un temps de balancement moyen plus faible, ainsi qu’une variabilité accrue du temps de foulée et une variabilité du temps de basculement4. Ainsi, nos résultats de changements dans le temps de balancement chez les rats DKO, et les rapports précédents sur les modifications du temps de balancement chez les rats Pink1 KO et DJ-1 KO22, semblent pertinents pour la progression de la MP.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
KS et HF remercient la Fondation Michael J Fox pour la recherche sur la maladie de Parkinson pour son soutien à son travail sur la maladie de Parkinson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
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| 1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
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