パーキンソン病の遺伝的ラットモデルにおける歩行解析のためのラットウォーカーシステムの適用
Summary
ここでは、ラットのサイズと重量の増加に対応するためにマウスウォーカー装置を再設計することによって構築されたラットウォーカーシステムについて説明します。このシステムは、フラストレーション全反射(FTIR)、高速ビデオキャプチャ、およびオープンアクセス分析ソフトウェアを使用して、歩行パラメータを追跡および定量化します。
Abstract
パーキンソン病(PD)は、黒質緻密症におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの喪失によって引き起こされる進行性の神経変性疾患です。腕の振りの減少、歩行速度の低下、歩数の短縮などの歩行異常は、PD患者によく見られ、病気の経過の初期に現れます。したがって、PDの動物モデルにおける運動パターンの定量化は、疾患経過中および治療中の表現型の特徴付けにとって重要になります。PDのほとんどの症例は特発性です。しかし、PDの遺伝型を同定したところ、ミトコンドリアの品質管理に関与する2つのタンパク質であるPink1とParkinの機能喪失変異などの遺伝子変異と変異体が明らかになり、動物モデルの作成に利用できるようになりました。マウスはPink1およびParkinの喪失(単一および複合欠失)による神経変性に耐性があるが、ラットでは、Pink1はパーキン欠損ではないが、黒質DAニューロン喪失および運動障害を引き起こす。ここでは、Pink1ノックアウト(KO)ラットで以前に報告された後肢の引きずりを特徴とする、Pink1とParkinの複合喪失を伴う自由に歩く若い(生後2か月)オスラットの歩行変化を明らかにするためのFTIRイメージングの有用性を報告します。
Introduction
最も一般的な加齢性神経変性運動障害であるPDは、黒質緻密症におけるDAニューロンの喪失によって引き起こされます。この黒質DAニューロンの喪失と線条体へのDA入力は、PD 1,2の患者に見られる観察された運動機能障害につながります。パーキンソニズムと総称されるPD患者の定義運動特性には、硬直、安静時振戦、運動緩慢、姿勢不安定性、および顕微鏡写真が含まれます3。さらに、PD患者によく見られる歩行障害は、疾患の経過の初期に現れます1,4,5。健康的な食事や定期的な運動など、PDの進行を遅らせるのに役立つ特定のライフスタイルが提案されていますが、現在、PDの治療法はなく、症状を管理するための薬しかありません。これは、治療法の改善を期待して、さらなる調査の必要性の余地を残しています。したがって、PD動物モデルにおける歩行パターンの特性評価は、モデルの関連性と、PDを制御することを目的とした治療的治療が運動障害をどのように予防または改善しているかを特徴付けるための重要なツールです。
治療法の試験に使用されているさまざまなPD動物モデルがありますが、それぞれに限界があります。たとえば、神経毒1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)で治療された動物モデルは、黒質DAニューロンの喪失とその後の線条体適応に重要なプロセスに関する豊富な情報をもたらし、PD病因におけるミトコンドリアの役割を指摘しました。しかしながら、MPTPモデルの病因的背景は、ヒトPD6のような神経変性過程ではなく毒性の性質のものである。追加の化学的に誘導可能なモデルには、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)およびロテノンが含まれる。6-OHDAは、DAニューロンに薬物を選択的に蓄積することによってPDを誘導するために使用された最初の薬剤であり、最終的にはニューロンを殺し、PDのような症状を引き起こします。このモデルは、アンフェタミンとアポモルヒネ7に応答した挙動を調べることにより、DA枯渇の追跡に最初に使用されました。このPD誘導法は、DAおよびその受容体に影響を与える薬理学的物質のスクリーニングに有用であることが証明されています8。6-OHDAモデルは、定量化可能な運動障害を追跡するための優れたモデルですが、このモデルは、ニューロンの段階的な喪失とレビー小体の形成が動物にどのように影響するかを示していません。他の誘導方法であるロテノンは、チロシンヒドロキシラーゼとDAトランスポーターの喪失を伴う黒質線条体ニューロンの進行性変性を有することが示されており、ニューロンの喪失を経時的に追跡するためのより良いモデルを可能にする9。ロテノン処理ラットは、運動緩慢、姿勢不安定、および不安定な歩行を示しました10。しかし、この方法はラットの異なる系統間で大きく変動することが見出されており、ロテノンが信頼できるPDモデルであるかどうか疑問を投げかけている11、12、13。歩行解析はラットにおけるPDの誘導によって影響を受けることが示されているが、これまで、遺伝的に誘導されたPDラットモデルは、滑走路を自由に歩くことによる歩行解析に容易に使用されていない。
自由に歩くげっ歯類の運動障害を分析する1つの方法は、FTIRイメージングを利用して実行できる運動学的歩行分析です。この確立された方法は、FTIRに基づく光学式タッチセンサを使用し、滑走路14,15,16を下る齧歯類の足跡を記録および追跡する。他の方法と比較して、FTIRは足跡を妨げる可能性のある動物の体のマーカーに依存しません。ビデオデータの生成により、4つの手足すべてのデジタル足跡が生成され、それを組み合わせて、さまざまなげっ歯類モデルの動的で再現可能な歩行パターンを作成できます。画像ベースの歩行分析の原理は、個々の足を取り、げっ歯類が滑走路を歩くときの経時的な接触面積を測定することです。各スタンスは、足面積の増加(制動段階)と足面積の減少(推進段階)で表されます。これは、足の信号が検出されないスイングフェーズによって進行します。ビデオの評価後、野生型(WT)モデルとPDモデルを比較するために使用できるいくつかのパラメータが生成されます。パラメータの例としては、ステップ長(足が1ステップでカバーする距離)、スイング持続時間(足が滑走路に接触していない時間)、スイング速度(スイング時間の関数としてのステップ長)、およびステップパターン(斜めのステップ、横方向のステップ、またはガードルステップ)があります。
ラットの初期の歩行パターンの変化を明らかにするためのFTIRの有用性を実証するために、PDの遺伝子ラットモデルを使用しました。PDのほとんどの症例は特発性ですが。PDの遺伝型を同定すると、ミトコンドリアの品質管理に関与する2つのタンパク質であるPink1とParkinの機能喪失変異などの遺伝子変異と変異が明らかになり17、動物モデルの作成に利用できる可能性があります18。残念ながら、マウスはこれらのタンパク質(単一および複合)が失われると神経変性に耐性があります19,20,21。ラットでは、パーキン欠損ではなくPink1は、黒質DAニューロン喪失および運動障害22をもたらすが、完全な浸透性はない。したがって、Pink1 / Parkinダブルノックアウト(DKO)ラットを組み合わせたモデルを生成し、オスのPink1 KOラット22で報告された明白な視覚的に明らかな後肢ドラッグ表現型を表示しますが、現在はより高い率で示されています:100%対4〜6か月のオスの30〜50%。
この方法はマウス14の運動障害を分析するのにうまく機能しますが、ラットのサイズと体重に対応するためのFTIRイメージング歩行システム仕様は、以前は非商業的に利用できませんでした。ここでは、ラットのサイズと体重に適合した場合を除き、マウスウォーカー14をモデルにした修正されたFTIR歩行イメージングシステムであるRatWalkerの構築方法について説明します。このシステムは、光学効果であるFTIRを利用して、動物の足跡を視覚化し、その後分析のために記録する方法を提供します。動物の足が光導波路(プラットフォーム)に接触すると、光路が乱れ、目に見える散乱効果が生じ、国産グレードの高速ビデオ撮影とオープンソースソフトウェアを使用した処理を使用してキャプチャされます。この研究は、PDの遺伝子ラットモデルにおける歩行変化の研究におけるFTIRイメージングの力を実証しています。例えば、早くても4ヶ月の雄DKOラットでは、視覚的に明らかな運動変化(後肢の引きずり)が明白に観察されますが、FTIRを使用すると、生後2か月の雄DKOラットのゲート異常を明らかにすることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
腕の振りの減少、歩行速度の低下、歩数の短縮などの歩行障害は、PDの決定的な特徴であり、疾患経過の早い段階で発生します1,5。PDのげっ歯類モデルにおける歩行分析のために足跡を観察および記録するためのいくつかの方法が長年にわたって開発されており、足場の位置を定量化するための手動技術は、より感度が高く、動的パラメータを捕捉?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KSとHFは、パーキンソン病に関する研究を支援してくれたパーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団に感謝します。
Materials
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
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| 1” Aluminum Square Tube (1/16” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
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| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
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| 1” Aluminum Tube (1/8” – 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
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| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
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| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
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| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
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| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
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| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
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| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
- Behari, M., et al. Parkinson’s disease. Annals of Indian Academy of Neurology. 14, 2-6 (2011).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- Fahn, S. Description of Parkinson’s disease as a clinical syndrome. Annals of the New York Academy of Sciences. 991, 1-14 (2003).
- Frenkel-Toledo, S., et al. Effect of gait speed on gait rhythmicity in Parkinson’s disease: variability of stride time and swing time respond differently. Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation. 2, 23 (2005).
- Shulman, J. M., De Jager, P. L., Feany, M. B. Parkinson’s disease: genetics and pathogenesis. Annual Review of Pathology. 6, 193-222 (2011).
- Klemann, C., Martens, G. J. M., Poelmans, G., Visser, J. E. Validity of the MPTP-Treated Mouse as a Model for Parkinson’s Disease. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1625-1636 (2016).
- Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve degeneration revealed by rotational behaviour. Acta Physiologica Scandinavian Supplementum. 367, 49-68 (1971).
- Beal, M. F. Experimental models of Parkinson’s disease. Nature Reviews Neuroscience. 2 (5), 325-334 (2001).
- Betarbet, R., et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson’s disease. Nature Neuroscience. 3 (12), 1301-1306 (2000).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 34 (2), 279-290 (2009).
- Quary, S., et al. Major strain differences in response to chronic systemic administration of the mitochondrial toxin 3-nitropropionic acid in rats: implications for neuroprotection studies. Neuroscience. 97 (3), 521-530 (2000).
- Cicchetti, F., Drouin-Ouellet, J., Gross, R. E. Environmental toxins and Parkinson’s disease: what have we learned from pesticide-induced animal models. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (9), 475-483 (2009).
- Greenamyre, J. T., Cannon, J. R., Drolet, R., Mastroberardino, P. G. Lessons from the rotenone model of Parkinson’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 31 (4), 142-143 (2010).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50 (2015).
- Hamers, F. P., Lankhorst, A. J., van Laar, T. J., Veldhuis, W. B., Gispen, W. H. Automated quantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: its application to spinal cord contusion and transection injuries. Journal of Neurotrauma. 18 (2), 187-201 (2001).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of PINK1, parkin, and mitochondrial fidelity in Parkinson’s disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
- Dawson, T. M., Ko, H. S., Dawson, V. L. Genetic animal models of Parkinson’s disease. Neuron. 66 (5), 646-661 (2010).
- Gispert, S., et al. Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration. PLoS One. 4 (6), 5777 (2009).
- Goldberg, M. S., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (2003).
- Kitada, T., Tong, Y., Gautier, C. A., Shen, J. Absence of nigral degeneration in aged parkin/DJ-1/PINK1 triple knockout mice. Journal of Neurochemistry. 111 (3), 696-702 (2009).
- Dave, K. D., et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson’s disease. Neurobiology of Disease. 70, 190-203 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hruska, R. E., Kennedy, S., Silbergeld, E. K. Quantitative aspects of normal locomotion in rats. Life Sciences. 25 (2), 171-179 (1979).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Methods to assess the development and recovery of locomotor function after spinal cord injury in rats. Experimental Neurology. 119 (2), 153-164 (1993).
- Jacobs, B. Y., Kloefkorn, H. E., Allen, K. D. Gait Analysis Methods for Rodent Models of Osteoarthritis. Current Pain and Headache Reports. 18 (10), 456 (2014).
- Boix, J., von Hieber, D., Connor, B. Gait Analysis for Early Detection of Motor Symptoms in the 6-OHDA Rat Model of Parkinson’s Disease. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 39 (2018).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson’s disease. Neuroscience Letters. 584, 184-189 (2015).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Chuang, C. S., et al. Quantitative evaluation of motor function before and after engraftment of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson’s disease. Journal of Biomedical Science. 17, 9 (2010).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C., Whitaker, K. W., Harvey, B. K. Step Sequence Is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson’s Rat Models. Cell Transplantation. 26 (4), 659-667 (2017).
