Summary
Denne rapporten beskriver en protokoll for samtidig isolering av primære brune og hvite preadipocytter fra nyfødte mus. Isolerte celler kan dyrkes i kultur og induseres for å skille seg ut i fullt modne hvite og brune adipocytter. Metoden muliggjør genetisk, molekylær og funksjonell karakterisering av primære fettceller i kulturen.
Abstract
Forståelsen av mekanismene som ligger til grunn for adipocyttdifferensiering og funksjon har hatt stor nytte av bruk av udødelige hvite preadipocyttcellelinjer. Disse kultiverte cellelinjene har imidlertid begrensninger. De fanger ikke fullt ut det mangfoldige funksjonelle spekteret av de heterogene adipocyttpo-populasjonene som nå er kjent for å eksistere innenfor hvite fettdepoter. For å gi en mer fysiologisk relevant modell for å studere kompleksiteten til hvitt fettvev, har en protokoll blitt utviklet og optimalisert for å muliggjøre samtidig isolasjon av primære hvite og brune adipocyttforfedre fra nyfødte mus, deres raske ekspansjon i kulturen og deres differensiering in vitro til modne, fullt funksjonelle adipocytter. Den primære fordelen med å isolere primærceller fra nyfødte, i stedet for voksne mus, er at fettdepotene utvikler seg aktivt og derfor er en rik kilde til spredning av preadipocytter. Primære preadipocytter isolert ved hjelp av denne protokollen skiller seg raskt ved å nå samløp og blir fullt modne på 4-5 dager, et temporalt vindu som nøyaktig gjenspeiler utseendet på utviklede fettputer hos nyfødte mus. Primærkulturer utarbeidet ved hjelp av denne strategien kan utvides og studeres med høy reproduserbarhet, noe som gjør dem egnet for genetiske og fenotypiske skjermer og muliggjør studiet av de celle-autonome adipocyttfenotypene av genetiske musemodeller. Denne protokollen tilbyr en enkel, rask og billig tilnærming for å studere kompleksiteten til fettvev in vitro.
Introduction
Fedme skyldes en kronisk ubalanse mellom energiinntak og energiforbruk. Etter hvert som fedme utvikler seg, gjennomgår hvite adipocytter en massiv utvidelse i cellestørrelse som resulterer i hypoksi i mikromiljøet, celledød, betennelse og insulinresistens1. Dysfunksjonelle, hypertrofierte adipocytter kan ikke lagre overflødige lipider på riktig måte, som akkumuleres i stedet i andre vev der de demper insulinvirkning2,3. Midler som forbedrer adipocyttfunksjonen og gjenoppretter normal lipidpartisjonering blant vev, forventes å være gunstige for behandling av fedmerelaterte tilstander preget av insulinresistens som type 2 diabetes. Fenotypiske skjermer i adipocytter ved hjelp av udødelige cellelinjer, for eksempel 3T3-L1, F442A og 10T 1/2, har vist seg nyttige for å identifisere genetiske faktorer som regulerer adipogenese og isolere pro-adipogene molekyler med antidiabetiske egenskaper4,5,6,7. Disse cellelinjene gjenspeiler imidlertid ikke fullt ut heterogeniteten til celletyper som finnes i fettdepoter, som inkluderer hvite, brune, beige og andre adipocyttundertyper med unike egenskaper, som alle bidrar til systemisk homeostase8,9,10. Videre viser kultiverte cellelinjer ofte en redusert respons på ytre stimuli.
I motsetning til dette rekapitulerer kulturer av primære adipocytter mer nøyaktig kompleksiteten til in vivo-adipogenese, og primære adipocytter viser robuste funksjonelle responser. Primære preadipocytter er vanligvis isolert fra den stromale vaskulære brøkdelen av fettdepoter av voksne mus11,12,13,14. Men fordi fettdepotene til voksne dyr hovedsakelig består av fullt modne adipocytter som har en veldig langsomomsetningshastighet 15,16,17, gir denne tilnærmingen en begrenset mengde preadipocytter med lav spredningshastighet. Derfor er isolasjon av preadipocytter fra nyfødte mus å foretrekke å oppnå store mengder raskt voksende celler som kan differensieres in vitro. Her er det beskrevet en protokoll, inspirert av det første arbeidet med primærbrune adipocytter av Kahn et al.18 for effektivt å isolere både hvite og brune preadipocytter som kan utvides og differensieres in vitro til fullt funksjonelle primære adipocytter (Figur 1A). Fordelen med å isolere primære celler fra nyfødte, i motsetning til voksne mus, er at fettdepotene vokser raskt og dermed er en rik kilde til aktivt spredning av preadipocytter17. Celler isolert ved hjelp av denne protokollen har høy proliferativ kapasitet, noe som muliggjør rask oppskalering av kulturer. I tillegg viser preadipocytter fra nyfødte valper høyere differensieringspotensial enn voksne forfedre, noe som reduserer trivsel i graden av differensiering og dermed øker reproduserbarheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger alle IACUC-retningslinjer fra Scripps Research Institute og University of Wisconsin – Madison School of Medicine and Public Health.
1. Innsamling og fordøyelse av fettdepoter (dag 1)
- Forbered to 1,5 ml rør for hver valp: en for brunt fettvev (BAT) og en for hvitt fettvev (WAT). Tilsett 250 μL fosfatbufret saltvann (PBS) + 200 μL 2x isolasjonsbuffer (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2, 5 mM glukose, 100 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), penicillin-streptomycin og 4% fettsyrefri bovint serumalbumin) til hvert rør. Hold løsningene sterile og på is.
- Plasser valpene i små kamre (f.eks. en brønn av en 6-brønns tallerken), og sett dem på is til de blir hypotermiske. Pass på at det ikke er direkte kontakt mellom valpene og isen. Stikk en pote med et tips for å sikre tap av bevissthet, og euthanize valpene ved halshugging ved hjelp av skarp saks.
MERK: Hvis du arbeider med forskjellige genotyper, klargjør du et ekstra rør for å samle en halebiopsi (3 mm kutt) for genotyping. Hvis genotyping utføres umiddelbart, hold de euthanized valpene på is til disseksjonen for å samle fettdepoter. - Beregn og vei ut mengden kollagenalisse som trengs for å fordøye alle depotene. Tilsett 50 μL 15 mg/ml kollagenalens type I i 2x isolasjonsbuffer til hvert rør. Ikke resuspender kollagenen i isolasjonsbufferen før alle vevene er samlet inn.
- For å samle subkutan WAT, kutt huden rundt valpens underliv (unngå peritoneal brudd), og trekk huden forsiktig ned under bena. Uten å ta huden, samle forsiktig fettdepotet, som vil vises som et klart (P1 eller yngre) eller hvitt (P2 og eldre), tynt, langstrakt vev festet på innsiden eller på toppen av quadriceps (Figur 1B). Skyll fettdepotet i PBS, og legg det i et av rørene som inneholder 250 μL PBS + 200 μL 2x isolasjonsbuffer. Hold deg på isen.
MERK: P0- og P1-mus gir det beste utbyttet. I P0-1 valper er det subkutane WAT-depotet nesten gjennomsiktig. I P2-mus og eldre er depotet lettere å identifisere fordi det allerede blir hvitt, noe som indikerer tilstedeværelsen av fullt modne, lipidbelastede, hvite adipocytter. - For å samle interscapular BAT, trekk huden fra skulderbladene over hodet. Løft BAT - det dype røde vevet mellom skulderbladene - og gjør forsiktig snitt rundt det for å løsne det fra kroppen (Figur 1B). Se etter konsistens og farge; skyll med PBS; plasser den i det andre røret som inneholder 250 μL PBS + 200 μL 2x isolasjonsbuffer; og hold deg på is.
MERK: Ved høsting av BAT fra P2-mus og eldre, fjern forsiktig det hvite fettvevet rundt BAT. Den består av et tynt, mykt, hvitt ark med adipocytter som ligger mellom huden og BAT, som er dypere mellom skulderbladene. - Når alle depotene er samlet inn, hakker du forsiktig hvert depot (4-6 ganger) ved hjelp av små saks direkte inne i rørene.
- Resuspend kollagenalus type I i riktig volum 2x isolasjonsbuffer for å oppnå en 10x lagerløsning ved 15 mg / ml. Tilsett 50 μL 10x kollagenaliser til hvert rør, og hold rørene på is til kollagenasen er lagt til alle rørene.
- Snu rørene raskt for å blande, og overfør til en temperaturkontrollert mikser. Inkuber prøvene i 30 min ved 37 °C på en shaker (1400 rpm frekvens for effektiv prøveblanding).
2. Plating preadipocytter (dag 1)
- Etter å ha fordøyd vevet, plasser rørene tilbake på is.
MERK: Fra dette trinnet og fremover utføres alt arbeid under sterile forhold i et biosikkerhetsskap. - Sil det fordøyde vevet gjennom en 100 μm cellesil til nye 50 ml rør. Hvis du bare arbeider med WT-mus, eller hvis genotyper er kjent, kan du samle de relevante, dissosierte BATene sammen; gjenta dette for WAT-ene. For å maksimere celleutbyttet, skyll hvert rør med 1 ml isolasjonsmedium (Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) + 20% foster bovint serum (FBS), 10 mM HEPES, 1% penicillin-streptomycin), og filtrer det gjennom cellesilen. Hvis du arbeider med ukjente genotyper, går du til trinn 2.4
MERK: FBS er en viktig determinant for både preadipocyttproliferasjon og differensiering. Test grundig forskjellige masse FBS for å sikre høy ytelse og konsistens mellom mye. - Fortynn BAT- og WAT-suspensjoner til plate 2-3 brønner av en 6-brønns plate for hver BAT-prøve og 4-6 brønner av en 6-brønnsplate for hver WAT-prøve. For eksempel, hvis 6 BATs og 6 WATs ble samlet sammen, fortynn BAT-celleopphenget opp til 24-36 ml og WAT-cellefjæringen opp til 48-72 ml. Plate 2 ml av cellesuspensjonene per brønn.
- For prøver med ukjente genotyper, hold hvert utvalg atskilt. plasser en 100 μm cellesil på toppen av hver brønn på en 6-brønns plate, og filtrer en prøve per brønn. Skyll røret med 1,5 ml isolasjonsmedium, og før det gjennom silen, og utgjør det endelige volumet til 2 ml per brønn. Kast cellesilen, legg lokket på platen og overfør platen til inkubatoren.
MERK: Mediet i brønnene skal se uklart ut på grunn av flytende blodlegemer, cellerester og lipider fra lysede celler. - 1-1,5 timer etter plating, aspirerte medier og vask med 2 ml DMEM uten serum. Rør forsiktig platen for å løsne blodceller fra bunnen av brønnene. Etter 3 vasker, tilsett 2 ml friskt isolasjonsmedium, og overfør cellene til inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
MERK: Kontroller cellene under mikroskopet. Flytende materiale (blodceller, cellulært rusk) bør være minimalt. Brune preadipocytter vises som små ikke-gjennomsiktige celler, mens hvite preadipocytter vil vise en mer langstrakt form. Både brune og hvite preadipocytter skal festes tett til platen.
3. Utvidelse av preadipocyttkulturen (dag 2 til dag 5)
- På neste dag aspirerer du mediet, vasker cellene med 2 ml DMEM uten serum, og legger tilbake 2 ml isolasjonsmedium.
- Gjenta trinn 3.1 en gang hver annen dag til cellene når 80-90% samløp.
MERK: For primære brune preadipocytter kan det ta 4-5 dager å nå 80-90% samløp. For primære hvite preadipocytter tar det vanligvis 2-3 dager. Når preadipocyttene når 60% samløp, kan de effektivt bli smittet med viruspartikler for knockdown eller overekspression eksperimenter. Infiser preadipocytter med en passende virusbelastning i opptil 8 timer. Bruken av kationiske polymerer for å øke infeksjonseffektiviteten frarådes, da det ofte resulterer i toksisitet og i en betydelig reduksjon av det adipogene potensialet til infiserte preadipocytter. - For å dele cellene, belegge nye destinasjonsplater ved hjelp av en steril løsning på 0,1% m / v gelatin (oppløst i destillert vann; ikke bruk varme). Bruk nok volum til å dekke bunnen av brønnen/retten. Inkuber plater ved 37 °C til cellene er klare til å bli sådd (minst 10 min).
MERK: Dette trinnet er valgfritt. Belegg av cellekulturplater påvirker ikke utbyttet eller differensieringspotensialet, men det forenkler vedlikehold og håndtering av differensiering av adipocytter betydelig. - Når cellene når subkonfluenttetthet (85-95%), aspirerer mediet, vask med PBS, og legg til trypsin i 3 minutter for å løsne cellene. Blokker trypsinaktivitet ved å legge til 2,5x trypsinvolum av isolasjonsmedium. Pipette celleopphenget opp og ned for å maksimere cellegjenoppretting, og overfør til et nytt rør. Vask brønnene med 1 ml isolasjonsmedium, og legg det til den første samlingen.
- Sentrifuger cellene i 5 min ved 800-1200 × g, aspirer supernatanten og resuspend cellene i 3-5 ml av isolasjonsmediet. Tell cellene, og fortynn dem til ønsket endelig tetthet.
MERK: For eksempel vil 50.000-80.000 celler/ml (2,5, 1 og 0,5 ml for henholdsvis 6-, 12- og 24-brønnsplater) resultere i fullt sammenfallende brønner innen 72-96 t. - Aspirer beleggløsningen i trinn 3.3, og vask av overflødig gelatin med PBS. Frø cellene, og returner platene til inkubatoren til det er fullt sammenløp.
4. Differensiering av hvite og brune preadipocytter (dag 7 - 12)
- Når preadipocytter blir konfluente, aspirerer du mediet og erstatter det med differensieringsmedium som består av 10% FBS i DMEM som inneholder 170 nM insulin, 1 μM deksametason og 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxantin. Hvis du differensierer BAT preadipocytter, legg også til 1 nM triiodothyronin (T3). Merk dagen da adipogene differensiering induseres som dag 0 av differensiering.
MERK: Både hvite og brune preadipocytter kan spontant differensiere ved å nå samløp. Men for å maksimere adipocyttdifferensiering, bør den tradisjonelle pro-adipogene cocktailen beskrevet ovenfor (pluss T3 for BAT preadipocytter) brukes. - Etter 48 timer (dag 2 av differensiering), oppdater mediet med vedlikeholdsmedium som består av 10% FBS i DMEM og 170 nM insulin (pluss 1 nM T3 for BAT).
MERK: På dag 2 kan små lipiddråper som akkumuleres i cellene under mikroskopet observeres ved hjelp av standard lyse felt. - Gjenta trinn 4.2 én gang annenhver dag til cellene brukes til eksperimenter.
MERK: På dag 4 eller 5 av differensiering vil de fleste cellene vises lastet med lipider. Terminal differensiering av adipocytter kan holdes i kulturen lenger eller brukes på dette stadiet for eksperimenter.
5. Re-plating for bioenergetics eksperimenter
MERK: Hvis intensjonen er å utføre bioenergistudier i modne adipocytter i 96-brønnsformatet, må følgende trinn tas. Ideelt sett bør celler som nettopp har fullstendig differensiert (dag 4 eller 5) brukes. Prosedyren beskrevet nedenfor starter fra 1 brønn av en 6-brønns plate.
- Før trypsin fordøyelsen, forberede belegg for 96-brønns plater. Tilsett 50 μL 0,1% gelatin til hver brønn. La platen stå i en vevskulturinkubator til cellene er klare til å bli sådd.
- På dag 4 eller 5 av differensiering aspirerer du mediet, vasker med 1 ml PBS og tilsetter 300 μL 0,25% trypsin-etylendiamintetraacetisk syre (for 1 brønn av en 6-brønns plate). Vipp platen forsiktig for å sikre at trypsin helt dekker bunnen av brønnen; inkubere i 2 min ved romtemperatur. Blokker virkningen av trypsin med 700 μL vedlikeholdsmedium, pipette opp og ned for å maksimere cellegjenoppretting, og overfør cellefjæringen til et nytt 1,5 ml rør.
- Sentrifuger cellene ved 1200 × g i 5 min. Fjern supernatanten, resuspend pellet i 1 ml vedlikeholdsmedium, og tell cellene.
MERK: En brønn på en 6-brønns plate skal gi ca. 1,5-1,8 millioner celler. - Fortynn cellene slik at de har en endelig konsentrasjon på 60 000 til 80 000 celler/ml for brune adipocytter og 100 000 til 120 000 celler/ml for hvite adipocytter. Plate 100 μL av cellefjæringen per brønn i gelatinbelagte 96-brønnsplater.
MERK: En brønn på en 6-brønns plate gir nok celler til opptil to 96-brønnsplater. For bioenergetiske eksperimenter er det nødvendig med lav tetthet (30-40% samløp) for å muliggjøre nøyaktig måling av oksygenforbruk og unngå oksygennedbrytning i brønnene under analysen. - La cellene holde seg til bunnen av platen i minst 48 timer. Hvis cellene holdes i platen i mer enn 48 timer, oppdater mediet etter 2 dager.
- På analysedagen aspirerer du mediet og erstatter det med analysemedium. Inkuber i 1 time ved 37 °C i en ikke-CO2-kontrollertinkubator, og utfør analysen i henhold til produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Paragraf 1 i protokollen vil gi en heterogen suspensjon av celler som er synlige under et standard lysmikroskop. Filtrering av fordøyd vev med cellesil (avsnitt 2) vil fjerne ufordøyd vev. Noen cellulære rusk, blodceller og modne adipocytter vil imidlertid passere gjennom (Figur 1C). Forsiktig vask 1 t etter plating vil fjerne ikke-relevante celler som preadipocytter festes raskt til bunnen av brønnen (Figur 1C). I § 3 utvides adipocyttforløpere for å oppnå antall celler som kreves for den eksperimentelle planen. Selv om både hvite og brune preadipocytter isolert fra nyfødte valper har høy proliferativ kapasitet, er utbyttet av hvite preadipocytter generelt dobbelt så stort som brune preadipocytter per depotbasis (Figur 2A). Derfor, hvis synkroniserte kulturer er ønsket, må starttettheten til hvite preadipocytter beregnes tilsvarende. § 4 gir retningslinjer for å få fullt modne adipocytter.
På slutten av differensiering vil celler vises lastet med lipiddråper og uttrykke klassiske markører av henholdsvis hvite og brune adipocytter (Figur 2B,C). Både hvite og brune adipocytter kan brukes til bioenergistudier som beskrevet i avsnitt 5. En komparativ analyse av oksygenforbruk i en mitokondriestresstest av primærhvite og brune adipocytter under basale forhold, samt som svar på kjente stimulatorer av mitokondriefunksjon (f.eks. noradrenalin) er vist i figur 2D. Ved isolasjon er det også mulig å skille primærhvite og brune adipocytter på platene som skal brukes direkte til bioenergetiske eksperimenter19. I dette tilfellet er preadipocytter isolert og belagt som beskrevet i avsnitt 1 og 2. Når cellene blir flytende, blir de indusert til å skille seg ut som beskrevet i avsnitt 4 til de når terminal differensiering og er klare for bioenergianalyse. Denne prosedyren er vanlig for et 24-brønns plateformat, men mindre for 96-brønnsplater.
Figur 1: Innsamling og behandling av fettputer. (A) Skjematisk representasjon av primær hvit (topp) og brun (bunn) adipocyttisolasjon. (B) Subkutan hvit (topp) og brun (bunn) fett depoter. I P0-mus er subkutan WAT nesten usynlig, men skiller seg ut på ~ dag 2 etter fødselen. I kontrast har BAT en tydelig mørk farge selv på P0. I eldre valper er BAT omgitt av et tynt overfladisk lag av WAT, som krever fjerning når vevet dissekeres. (C) Representative bilder av primære hvite og brune forløperceller etter filtrering gjennom 100 μm cellesil, etter de første vaskene, og 24 timer etter isolasjon. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: WAT = hvitt fettvev; BAT = brunt fettvev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Differensiering av adipocyttgenitorer. (A) Gjennomsnittlig antall subkutane WAT- og BAT-preadipocytter oppnådd per nyfødt (P0) valp. (B) Representative bilder av terminalt differensierte hvite og brune adipocytter. For fluorescensavbildning ble celler inkubert med henholdsvis Nilen Rød og Hoechst 33342 for å flekke nøytrale lipider og nuklei. Skalastenger = 100 μm.(C) Genuttrykksanalyse av klassiske adipocyttmarkører, hvite beige markører og brunspesifikke markører i primærhvite og brune adipocytter differensiert i 6 dager (n=3). For hvert gen er BAT-uttrykk i forhold til WAT-nivåer (satt til 1). (D) OCR av hvite og brune adipocytter i en mitokondriestresstest og som svar på noradrenalin (n =3). Brune adipocytter viser usammenhengende åndedrett og en robust respons på noradrenalin, mens hvite adipocytter viser liten usammenhengende åndedrett og ingen signifikant respons på adrenerge stimulering. *p<0,05; **p<0.01, bestemt av to-tailed Student's t-test. Forkortelser: WAT = hvitt fettvev; BAT = brunt fettvev; OCR = oksygenforbruk; Oligo = oligomycin; FCCP = karbonylcyanid-4-(trifluorometoksy)fenylhydrazon; RAA = rotenon, antimycin A; PPARγ = peroksisom proliferatoraktivert reseptorgamma; Acrp30 = adipocytt komplementrelatert protein på 30 kDa; Fabp4 = fettsyrebindende protein 4; Glut4 = glukosetransportør 4; Cd36 = differensieringsklynge 36; Retn = resistin; Slc27a1 = solute carrier familie 27 medlem 1; Ear2 = eosinofil-assosiert, ribonuklease En familie 2; Pgc1a = PPARγ koaktivator 1alpha; Prdm16 = positivt regulatorisk domene I-bindende faktor 1 (PRDI-BF1) og retinoblastom protein-interagerende sinkfingergen 1 (RIZ1) homologt domene som inneholder 16; Eva1 = epitelial V-lignende antigen 1; Cidea = celledødsinduserende DNA-fragmenteringsfaktor-alfa-lignende effektor A; Ucp1 = frakobling protein 1; Dio2 = type 2 deiodinase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fettvev er avgjørende for systemisk insulinfølsomhet og glukose homeostase20. Fedme-bundet adipocyt dysfunksjon er tett forbundet med utbruddet av type 2 diabetes. Derfor kan større forståelse av grunnleggende biologi og fysiologi av fettvev muliggjøre design av nye behandlinger for metabolske forstyrrelser. Som et supplement til direkte funksjonell og transkripsjonell analyse av modne adipocytter isolert fra fettdepoter21,22, har kultiverte primære adipocytter vist seg å rekapitulere mange aspekter av fettvev patofysiologi, inkludert sekresjon av adipokiner, motstand mot insulin som svar på proinflammatoriske stimuli, og induksjon av det termogene programmet23,24,25. Selv om tidligere protokoller har beskrevet isolering av adipocyttforløpere fra voksne mus11,12, gir denne protokollen en metode for effektiv isolasjon av celler fra nyfødte valper. Denne strategien gir en betydelig større befolkning av hvite og brune adipocytt forfedre med høyere differensieringspotensial, da postnatale fettdepoter fortsatt er relativt likegyldige sammenlignet med fettdepotene til voksne mus26. Videre er celler isolert ved hjelp av denne metoden allerede forpliktet og gir fullt funksjonelle differensierte adipocytter som uttrykker markører av modne celler og viser sine unike fysiologiske egenskaper, inkludert lipidlagring og termogen kapasitet.
Primærceller kan ikke utvides på ubestemt tid in vitro. I tillegg begynner primære preadipocytter å miste sitt adipogene potensial etter flere passasjer i kulturen. Dette er sannsynligvis fordi kontinuerlig cellekultur resulterer i en iboende berikelse av mindre engasjerte, mer proliferative celler. Dermed er en begrensning av denne protokollen tidsvinduet der preadipocytter kan brukes. Adipogent potensial er fullt bevart hvis celler blir indusert til å skille innen 7-8 dager fra isolasjonstidspunktet. Adipocytt forfedre er spesielt motstandsdyktige mot enzymatisk fordøyelse, men det er likevel viktig å riktig tid kollagen behandling. Over fordøyelsesbesvær av vev kan føre til redusert celleoverlevelse og redusert evne til celler til å holde seg til platen. Gjennom ekspansjonsfasen er både hvite og brune preadipocytter sterkt tilhenger og tåler kraftige vasker og hyppig medieutveksling. Imidlertid anbefales bruk av belagte plater når preadipocytter induseres for å skille. Eldre, lipidladede adipocytter har redusert overflateadhesjon og cellecelleinteraksjoner, noe som resulterer i en tendens til å løsne under differensiering med mindre forsiktig håndteres. Det mest delikate trinnet i protokollen er induksjonen av differensiering. FBS, insulin, T3 og andre legemidler må testes, og deres endelige konsentrasjoner optimalisert, for å oppnå den høyeste graden av differensiering. En PPARγ-agonist (f.eks. rosiglitazon) kan også tilsettes for ytterligere å stimulere adipogenese ytterligere.
Det er viktig å merke seg at differensieringsforholdene kan tilpasses de eksperimentelle behovene. For eksempel, i skjermer med genetiske eller kjemiske biblioteker designet for å identifisere proteiner / forbindelser som forbedrer hvit og / eller brun adipocyttdifferensiering, kan preadipocytter bare induseres for å skille ved hjelp av et minimalt tillatt medium som bare inkluderer 10% FBS i DMEM og 170 nM insulin. Vurdering av hver komponent i differensieringscocktail anbefales for å bestemme ideelle analysevinduer for differensieringsanalyser. T3 og deksametason kan dispenseres for primær hvit og brun adipocytdifferensiering. Disse forholdene vil sikre en lav grad av differensiering i kontrollceller, og dermed øke vinduet til analysen og maksimere evnen til å oppdage pro-adipogene faktorer. Kulturer av primære brune og hvite adipocytter er et kraftig verktøy for å forhøre adipocyttcelle-autonom funksjon som svar på genetisk manipulasjon og metabolske påkjenninger for å utfylle studiet av brunt og hvitt fettvev in vivo. Derfor er protokoller for isolasjon og kultur av primære preadipocytter nødvendig for å muliggjøre reproduserbare, høygjennomstrømningsundersøkelser av adipocyttfunksjon in vitro. Strategien beskrevet her tillater studie av primære hvite og brune preadipocytter som kan differensieres til fullt modne adipocytter og testes under en rekke eksperimentelle manipulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige til Cristina Godio ved Centro Nacional de Biotecnología i Madrid, Spania, Mari Gantner ved Scripps Research Institute, La Jolla og Anastasia Kralli ved Johns Hopkins University, Baltimore, for hjelp til å optimalisere denne protokollen basert på det første arbeidet til Kahn et al.18. Dette arbeidet ble finansiert av NIH-tilskudd DK114785 og DK121196 til E.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H. Deciphering adipose tissue heterogeneity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1411 (1), 5-20 (2018).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
