Summary
이성애 복부 마우스 심장 이식 모델에서 혈액 회로 재건을 위한 새로운 기술이 입증된다.
Abstract
마우스에서 이성애 복부 심장 이식의 외과 기술은 이식 면역학에 있는 연구를 위한 표준 모형입니다. 여기서, 이종성 복부 심장 이식 모델에서 수정된 혈액 회로 재건을 위한 확립된 기술이 제시된다. 이 방법은 기증자 심장의 폐 동맥 대신 열등한 정맥 카바(IIVC)를 사용하여 수혜자의 열등한 정맥 카바에 대한 해부학을 사용한다. 그것은 촉진 하 고 쥐에 복 심 혼 이식에 대 한 성공률을 개선.
Introduction
마우스에서 이성토피복부 심혼 이식의 외과기술은 이식면성1,2,3에대한 연구를 위한 표준 모델을 나타낸다. 그러나, 그것은 수행하는 것은 매우 도전적이며,이 모델4의광범위한 사용에 대한 제한을 연루4,5.
전통적인 마우스 심장 이식 (THTx)에서, 기증자 대동맥및 수령인 복부 대동맥은 폐 동맥이 수신자 열등한 베나 카바6,7,8에마취되는 동안 마취된다.
이러한 수정된 마우스 심장 이식 기법에서, 기증자 대자는 수혜자 복부 대어타에 대해 마취하고 기증자 IIVC는 수신자 열등한 정맥카바(3,4,6)(도 2 및 도 3)에대해 마취된다.
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Protocol
모든 동물 실험은 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 대한 유럽 의회의 지침 2010/63/EU의 지침에 따라 수행되었습니다 (윤리위원회 승인, #G1071/09).
참고: 예비 제제, 마취, 수술 후 치료 및 모니터링 작업은 전통적인 수술 방법1,2,4에서수행되는 것과 동일합니다. BALB/c 마우스는 심장 기증자와 C57BL/6J를 이식 수혜자로 사용했습니다. 마우스는 8-12 주, 이식에 무게 ~30 g 세하 고 표준 조건 하에서 보관 되었다.
1. 준비 단계
- 마취의 경우, 쥐흡입제 이소플루란을 준다(2%) 잠들 때까지 케타민(100 mg/kg) + 자일라진(10 mg/kg) + 아세프로마진(2 mg/kg)의 복막 주사가 뒤따릅니다. 수술 후 진통의 경우 메타미졸 (200 mg /kg) p.o 및 Carprofen (5 mg / kg) s.c.를 적용하십시오.
참고: 이러한 물질이 면역 반응에 영향을 미칠 수 있기 때문에 항생제의 적용은 의도적으로 기권되었다. - 수술을 위해 마이크로 가위, 마이크로 집게, 바늘 홀더 및 미세 이혈성 클램프를 포함한 미세 한 계측기 세트를 사용하십시오. 전기 수술 펜도 필요합니다. 7/0er, 10/0er 및 4/0er 나일론 유형을 사용하여 봉합사를 수행합니다.
- 이소플루란 흡입을 위해 상자에 마우스를 놓습니다 (2%) 40-60초 동안. 핀셋으로 발을 압박하여 마취의 깊이를 결정합니다. 이 자극에 대한 응답의 완전한 부족이있는 경우, 다음 단계로 이동합니다.
- 마우스가 잠든 후 마우스의 무게를 측정합니다.
- 케타민(100 mg/kg) + 자일라진(10 mg/kg) + 아세프로마진(2 mg/kg)을 마취마우스에 적용한다.
- 복부 털을 잘라 수술 테이블에 마우스를 놓습니다. 포비도오드요드를 사용하여 3회 소독을 수행한 다음, 회향수술 수건을 사용하여 마우스를 제대로 휘저으세요.
2. 기증자 운영 절차
- 가위를 사용하여 목에서 하복부로 피부를 자르고 피부의 전체 층을 양쪽 축실라에 껍질로 벗깁니다.
- 가위를 사용하여 복벽의 근육을 자르고 내장을 왼쪽으로 부드럽게 이동합니다(작업자의 시야에서). 바삭한 임비브 거즈로 내장을 감싸서 열등한 베나 카바를 안전하게 노출시하십시오.
- 1 mL 주사기를 사용하여 헤파린 용액의 0.4 mL (500 U 헤파린 포함)을 천천히 하부 베나 카바에 주입하고 바늘을 꺼내기 전에 1 분 동안 기다립니다.
- 바늘을 꺼내 마이크로 가위를 사용하여 열등한 베나 카바와 복부 대어타를 모두 잘라 내어 흥분을 가속화합니다.
- U자형 컷을 수행하여 가슴 구멍을 여는 가위를 사용; 심장, 폐 및 모든 흉부 혈관을 완전히 노출시합니다.
- 흉부 대동맥을 노출하고 루멘의 1/2를 자른 다음 폐 정맥을 잘라 관개와 배수를 용이하게합니다.
- 흉부 대동맥의 개구부에 관개 튜브를 삽입하고, 폐 정맥 유출이 완전히 맑고 심장박동이 완전히 멈출 때까지 4 °C 의 적어도 2 mL의 4 °C 감기 히스티딘 - 트립토판 케토글루타레이트 심플기아 용액 (Custodiol HTK 솔루션)9을 주입하십시오.
- 관개 튜브를 꺼내 흉골을 분리합니다.
- 마이크로 가위를 사용하여 흉구를 제거하고 대동맥 아치 주변의 지방을 약간 제거합니다.
- 직선및 곡선 포셉을 사용하여 10/0 봉합사로 아르테리아 폐모날리스(대동맥 아치 오른쪽)의 트렁크를 노출하고 리게이트합니다.
- 마이크로 집게를 사용하여 IIVC에 부착 된 지방 및 결합 조직을 분리하고, 7/0 봉합사와 우수한 베나 카바 (대동맥 아치의 왼쪽)를 노출하고 리게이트하고 마이크로 가위를 사용하여 결찰 뒤에 잘라냅니다.
- 대동맥 아치 아래 심장 의 밑에 7/0 봉합사를, IIVC, 그리고 두 auricles. 그런 다음 폐 동맥 가지와 정맥 폐 혈관을 리게이트합니다.
- 마이크로 가위를 사용하여 대동맥 아치를 가능한 한 해동으로, 합자 아래의 폐 혈관및 다이어프램 근처의 IIVC를 분리합니다. 가슴에서 심장을 제거합니다.
- 이식된 기증자의 심장을 4°C 의 차가운 HTK 심폐액에 넣고 일시적으로 보존하십시오.
3. 받는 사람 운영 절차
참고: 초기 수술 단계는 마취 및 소독을 포함하여 기증자 마우스에 대해 이전에 표시된 것과 유사합니다.
- 복부 피부를 횡방향 방식으로 수행하고, 식염수 용액을 사용하여 젖은 거즈로 복부 장기를 덮습니다.
- 마이크로 집게를 사용하여 열등한 베나 카바와 복부 대어타를 노출하고 주변 지방 조직에서 해방하십시오.
- 마이크로 집게를 사용하여 신장 혈관 아래 측 분기 혈관(측면 또는 정맥/대어아래)을 ligate 또는 전기카운테화하십시오.
- 클립 어플리케이터 집게를 사용하여 오른쪽에서 나오는 정맥/대어타의 복부 부분에 두 개의 미세 혈전 클램프를 배치하여 대오르타/정맥 에 대해 1cm 이상의 거리를 남기고 그 사이에 해부학을 시공할 공간을 확보한다.
- 마이크로 가위를 사용하여 대오르타에 절개를 하면 상부 클램프보다 하부 클램프에 조금 더 가깝습니다. 또는 30 G 바늘을 사용하여 작은 구멍을 만들고 마이크로 가위로 엽니다.
- 대자가 다른 쪽에 있는 베나 카바를 가진 연산자를 향할 수 있도록 받는 마우스를 배치합니다. 그런 다음 심장을 복강에 넣고 작은 젖은 거즈 패드로 덮습니다.
- 10/0 봉합사를 사용하여 기증자 대어를 캐들로 시작하는 받는 사람 대어에 적응하고 스티치하고 매듭을 만들고 절개 (약 4-5 바늘)의 상단에 실행 봉합사를 진행합니다. 다음으로, (피사체의 관점에서) 오른쪽으로 하트를 뒤집어, 다시 덮고 카우달 끝에 도달하고 매듭 때까지 왼쪽에 봉합사를 계속.
- 관개 튜브를 사용하여 4°C HTK 심폐항액의 0.5mL 이상을 주입하여 기증자의 IIVC를 플러시합니다.
- 마이크로 가위를 사용하여 기증자 IIVC 루멘의 동일한 크기를 가져야하는 받는 사람의 복부 열등한 베나 카바에 둥근 구멍을 잘라냅니다. 절개는 대동맥 마취 개구부 위에 위치해야 합니다. 대동맥 절개보다 정맥 절개를 크게 만듭니다.
- 10/0 봉합사를 사용하여 기증자 IIVC를 캐들로 시작하는 받는 사람 vena cava에 바느질하십시오. 매듭을 묶고 절개 상단에 도달할 때까지 실행 봉합사를 수행합니다. 다섯 바늘을 사용하고 왼쪽에 봉합사를 계속합니다. 마지막으로, 꼬리 모서리에 매듭을 묶고 조심스럽게 조입니다 (너무 꽉 당기지 않도록주의하십시오).
- 정맥과 대동맥 술 주위에 혈전 스폰지의 작은 부분을 놓습니다.
- 클립 어플리케이터 집게를 사용하여 먼저 하부를 제거하고 상부 미세 혈전성 클램프를 제거하고 38.0°C로 복강을 헹구면 염화 나트륨 0.9%를 강화합니다.
- 마이크로 집게를 사용하여 혈전 스폰지를 빼앗습니다.
- 이식된 심장박동을 관찰한다.
- 집게를 사용하여 내장을 복강과 2 층 봉합사 (복부 근육 다음 피부)에 다시 넣어 4/0 봉합사로 복부 상처를 닫습니다.
- 이식된 마우스가 회복될 때까지 따뜻하고 산소가 풍부한 환경을 제공하기 위해 마우스를 산소 및 온도 조절 워크스테이션 챔버(예를 들어 INVIVO2-400)에 마우스를 넣고 마우스가 깨어날 때까지 기다립니다.
- 수술 후 진통의 경우 수술 후 Os당 Metamizol 200 mg/kg을 직접 제공합니다. 4 시간 및 16 작업 후 메타미졸 200 os + Carprofen (5 mg / kg) s.c 당 mg / kg을 제공합니다. 추가 후속 조치에서, 수술 후 3일 연속으로 24시간마다 이식된 마우스에 카프로펜(5 mg/kg).c 준다.
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Representative Results
여기서, 이전에 우리의 실험실에서 개발되고 지난 16 년 동안 유용하다는 것을 입증한 마우스에 있는 이성애 복부 심혼 이식의 수정된 기술이 제시됩니다. 이전에는 베나카바(V-V 군)에 대한 전체 40건의 경우, 기존 폐동맥40례와 비교하여 정맥카바(P-V 군) 마취시4(표1)혈관 아나스토모시스가 V-V그룹에서 20.8±1.3분이 걸린 것으로 보고되었다. P-V 그룹(27.5±1.3분, p<0.01)보다 현저히 짧아졌다. 따뜻한 허혈 시간, 총 수용자 수술 시간 및 수술 후 심장 반복 시간, 각각 25.5±1.2 분, 42.0±1.5 분, 1.1±0.2 분, 또한 기존의 P-V 그룹에서 관찰 된 것보다 현저히 단축되었다 (모든 p<0.05)(그림 1). 본 모델10,11에서장기간 생존율에 대한 차이가 없더라도, 수정된 기술은 생쥐의 복부 심장 이식을 용이하게 하여 따뜻한 허혈과 접목된 심장 박동 시간을 모두 초래한다.
지난 16년 동안 이전에 게시된 데이터와 이 모델에 대한 당사의 경험과 관련하여 주요 작업 단계는 >90%4의성공률을 보장하기 위해 제한된 시간이 소요되는 것이 좋습니다. 따라서, 기증자 심장의 수확이 60분 이상 걸리지 않으면 최적의 결과를 얻을 수 있으며, 감기 허혈 시간은 최대 40분으로 제한되어야 하며, IIVC 마취의 시공은 따뜻한 허혈 시간 감소와 직접적으로 연관되기 때문에 15분 이상 걸리지 않아야 한다.
그림 1. 두 동작 기술(각각 n =40, 평균 + SE)간의 프로시저 시간을 비교하려면 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2. 전통적인 (a, 왼쪽 위)과 수정 된 (b, 왼쪽 아래) 마우스 심장 이식 모델을 사용하여 기증자 심장 준비. 패널 a와 b의 사진은 대동맥(A), 폐동맥(PA), 오른쪽 아트리움(RA), 왼쪽 아트리움(LA), 기증자 심장의 열등한 베나 카바(IIVC)를 묘사한다. IIVC에 비해 PA의 선박 길이의 차이를 확인합니다. 패널 c는 이성애 복부 HTX에 대해 준비된 받는 사람의 시동을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 수정된 모형의 혈관 편도모: 대동맥 (A), 내구 내 열등한 베나 카바 (IIVC), 복부 열등한 베나 카바 (aivc), 복부 대동맥 (aa). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 폐 동맥 (PA) 및 내열성 베나 카바 (IIVC)에 대한 혈관 길이의 데모. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 생리적 트럼펫 모양은 내트라토라시성 열등한 베나 카바의 끝에 있습니다. 아오르타 (A), 내트라토라시비시 열등한 베나 카바 (IIVC), 오른쪽 아트리움 (RA), 왼쪽 아트리움 (LA). 왼쪽의 왼쪽 빨간색 이중 화살표는 오른쪽의 직경과 빨간색 원을 강조 하여 트럼펫 모양의 구조를 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 베나 카바 → 베나 카바 (새로운 방법) | 폐 A ~ 베나 카바 (전통적인 방법) | |
| 기부자 조달 (분) | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| 받는 사람 작업(최소) | 42.0 + 1.5 | 48.6 + 1.4** |
| 혈관 해부학 (분) | 20.8 + 1.3 | 27.5 + 1.3** |
| 감기 허혈 (분) | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| 따뜻한 허혈 (분) | 25.5 + 1.2 | 32.6 + 1.3** |
| 리비트 포스트 작업 (최소) | 1.1 + 0.2 | 2.1 + 0.4* |
| 성공률 | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0.05 | ||
| **P < 0.01. |
표 1. 두 작업의 시간 분포 및 초기 결과 비교(n - 40, 평균 + SE)
우, K., 장, J., 푸, J., 우, S., 필립, T., Uwe, H., Kribben, A. 및 Witzke, 마우스 심장 이식 모델에서 혈액 회로 재건을위한 O. 새로운 기술에서 전재. 미세 수술. 26, 594-598 (2006).
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Discussion
마우스에 있는 이종성 복부 심혼 이식의 외과 기술은 아주 도전적이고 이것은 이 모형의 광범위한 사용에 제한을 연루합니다.
종래기술의 단점 중 하나는 기증자의 폐동맥(PA)의 제한 길이이다. 그것은 일반적으로 약 2 mm 길이의 길이, 반면 우리의 모델에 사용 되는 기증자 심장의 IIVC의 길이는 일반적으로 약 1 cm(도 2). 즉, 변형된 모델에서 IIVC 해부학은 해부학의 향상된 수술을 가능하게 하고 혈관의 너무 엄격한 봉합사 또는 손상병변의 원치 않는 발달을 방지하는 수술 시상주의 명확한 시력을 제공한다는 것을의미한다(도 4). PA의 건설과 IIVC 해부학은 숙련 된 운영자에게도 도전적입니다. PA는 매우 섬세하고 얇은 벽이며 IIVC는 마우스에서 더 얇고 잠재적으로 더 취약합니다. 따라서 운영자는 이러한 제한을 알고 있어야 하며 IIVC를 이의를 제기하고 필요할 때주의해야 합니다. 그러나, 이 시점에서 IIVC 혈관 벽은 매우 얇지만 혈관 길이가 혈관 연결에 장력과 연관되지 않는다는 큰 장점이 있어 정확한 봉합사를 보다 쉽고 손상시키기 쉽다는 점을 강조하는 것이 중요하다. 선박 봉합사의 신중하고 안전한 적용은 성공적인 작동 결과에 매우 중요하기 때문에 10 ~20 배의 처의 배율이 좋습니다.
또한, IIVC의 흉부 세그먼트의 종결은 전형적인 트럼펫 형상구조(도 5)를형성한다. 더 큰 개구지름은 IIVC를 선택할 수 있는 중요하고 유익한 이유 중 하나입니다. 그것의 사용은 충분한 해부학의 적용을 용이하게. 이렇게 하면 작업의 어려움과 작동 시간이 모두 줄어듭니다.
이식 절차의 결과를 손상시킬 수 있는 가능한 사건은 종종 협착증에 의해 육성되는 혈관 해부학의 혈전증을 나타낸다. 우리의 모형에서 혈관의 길이가 의도적으로 증가하더라도, 이것은 혈전의 형성과 연관되지 않았습니다. IIVC의 나펫 모양의 해부학은 또한 해부학 협착증의 발생을 크게 감소시키면서 긍정적 인 효과를 발휘할 수 있습니다. 따라서 이 절차에 대해 이식 후 분리가 필요하지 않습니다.
IVC-aivc 해부학 방법의 이전 분석은 종래의기술(10)에비해 몇 가지 장점과 개선을 드러냈다. 이러한 결과와 우리의 오랜 경험4,10,12,13의회고적 관점에서 이 기술은 접목된 심장의 저하된 따뜻한 허혈과 재발시간 모두에서 발생합니다. 본모델(10)에대한 장기간 생존율에 대한 차이가 없더라도, 여기에 제시된 수정된 기술은 소강혈관 재건을 용이하게 하여 마우스에서 복부 심장 이식의 어려움을 감소시킨다. 따라서 이 모델의 훈련 및 적용은 면역학적뿐만 아니라 심장 연구 목적으로 마우스에서 복부 심장 이식의 접근성과 광범위한 적용을 향상시킬 수 있습니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
윤수 박사가 성우, 닥터 젠화 펑(Jianhua Peng) 박사의 도움에 감사를 표하고, 애니카 쿠칸 박사의 의견과 지원에 감사드립니다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG)이 국제 협력을 촉진하기 위해 부분적으로 지원되었다 (HO2581/4-1 AH에), 중국의 국립 과학 재단 (NSFC; FJ에 #81760291).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
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