Summary
Une technique originale pour la reconstruction de circuit de sang dans un modèle abdominal heterotopic de transplantation de coeur de souris est démontrée.
Abstract
La technique chirurgicale de transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez la souris est un modèle standard pour la recherche en immunologie de transplantation. Ici, la technique établie pour une reconstruction modifiée de circuit de sang dans un modèle abdominal heterotopic de transplantation de coeur est présentée. Cette méthode utilise la veine cave inférieure intrathoracique (IIVC) au lieu de l’artère pulmonaire du cœur donneur pour l’anastomose à la veine cave inférieure du receveur. Il facilite et améliore les taux de réussite de la transplantation cardiaque abdominale chez la souris.
Introduction
La technique chirurgicale de transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez la souris représente un modèle standard pour la recherche en immunologie de transplantation1,2,3. Cependant, il est très difficile à réaliser et cela implique une restriction à l’utilisation généralisée de ce modèle4,5.
Dans la transplantation cardiaque traditionnelle de souris (THTx), l’aorte donneuse et l’aorte abdominale réceptrée sont anastomosées tandis que l’artère pulmonaire est anastomosée à la veine cave inférieure réceptible6,7,8.
Dans cette technique modifiée de transplantation cardiaque de souris, l’aorte donneuse est anastomosée à l’aorte abdominale récepteur et le donneur IIVC est anastomosé à la veine cave inférieure récepteur(3,4,6) (figure 2 et figure 3).
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Protocol
Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux lignes directrices de la directive 2010/63/UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (approbation du comité éthique, #G1071/09).
NOTE: La préparation préliminaire, l’anesthésie, les soins postopératoires et le travail de surveillance sont les mêmes que ceux effectués dans les méthodes chirurgicales traditionnelles1,2,4. Les souris BALB/c ont servi de donneurs de coeur et C57BL/6J comme destinataires de greffe. Les souris ont été âgées de 8 à 12 semaines, pesaient environ 30 g à la transplantation et étaient logées dans des conditions standard.
1. Étapes préparatoires
- Pour l’anesthésie, donnez à la souris de l’isoflurane inhalatif (2%) jusqu’à ce qu’ils s’endorment, suivis d’injections intrapéritonéales de kétamine (100 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg) + acepromazine (2 mg/kg). Pour l’analgésie postopératoire, appliquer metamizol (200 mg/kg) p.o. et carprofène (5 mg/kg) s.c..
REMARQUE: L’application d’antibiotiques a été abstenue exprès car ces substances peuvent influencer les réponses immunologiques. - Pour la chirurgie, utilisez un ensemble d’instruments microscopiques comprenant un micro-ciseaux, une micro-pince, un porte-aiguille et des pinces micro hémostatiques. Un stylo électrochirurgical est également nécessaire. Effectuez des sutures en utilisant des types de nylon 7/0er, 10/0er et 4/0er.
- Placez la souris dans une boîte pour l’inhalation d’isoflurane (2%) pendant 40-60 secondes. Déterminez la profondeur de l’anesthésie en serrant la patte avec une pince à épiler. S’il y a une absence totale de réponse à ce stimulus, passez à l’étape suivante.
- Une fois que la souris s’est endormie, pesez la souris.
- Appliquer une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg) + acepromazine (2 mg/kg) sur la souris anesthésiée.
- Coupez la fourrure abdominale et placez la souris sur la table d’opération. Effectuez une désinfection à l’aide d’iodure de povidone pendant 3 fois, puis drapez correctement la souris à l’aide d’une serviette chirurgicale fenêtrée.
2. Procédure d’opération du donateur
- Utilisez des ciseaux pour couper la peau du cou au bas-ventre et décollez toute la couche de la peau jusqu’à la ligne médiane des deux aisselles.
- Utilisez des ciseaux pour couper les muscles de la paroi abdominale et déplacez doucement les viscères vers la gauche (du point de vue de l’opérateur). Enveloppez les viscères avec une gaze imbibée saline pour exposer en toute sécurité la veine cave inférieure.
- Utilisez une seringue de 1 mL pour injecter 0,4 mL de la solution d’héparine (contient 500 U d’héparine) lentement dans la veine cave inférieure et attendez 1 minute avant de retirer l’aiguille.
- Retirez l’aiguille et utilisez un micro-ciseaux pour couper à la fois la veine cave inférieure et l’aorte abdominale pour accélérer l’exsanguination.
- Utilisez des ciseaux pour ouvrir la cavité thoracique en effectuant une coupe en forme de U; exposer complètement le cœur, les poumons et tous les vaisseaux sanguins de la poitrine.
- Exposez l’aorte thoracique, coupez 1/2 de la lumière, puis coupez la veine pulmonaire pour faciliter l’irrigation et le drainage.
- Insérez un tube d’irrigation dans l’ouverture de l’aorte thoracique, injectez au moins 2 mL de solution de cardioplégie froide d’histidine-tryptophane-cétoglutarate à 4 °C (solution de Custodiol HTK)9 jusqu’à ce que l’écoulement de la veine pulmonaire soit complètement clair et que le cœur cesse complètement de battre.
- Retirez le tube d’irrigation et détachez le sternum.
- Utilisez des micro-ciseaux pour enlever le thymus et pour enlever légèrement la graisse autour de l’arc aortique.
- Utilisez une pince droite et incurvée pour exposer et ligater le tronc de l’arteria pulmonalis (sur le côté droit de l’arc aortique) avec une suture 10/0.
- Utilisez des micro pinces pour séparer la graisse et le tissu conjonctif attachés à l’IIVC, exposez et ligatez la veine cave supérieure (sur le côté gauche de l’arc aortique) avec une suture 7/0 et utilisez des micro-ciseaux pour la couper derrière la ligature.
- Faites une suture 7/0 autour de la base du cœur sous l’arc aortique, l’IIVC et les deux oreillettes. Ensuite, légiféez les branches de l’artère pulmonaire et les vaisseaux pulmonaires veineux.
- Utilisez des micro-ciseaux pour transecter l’arc aortique aussi distal que possible, les vaisseaux pulmonaires sous la ligature et l’IIVC près du diaphragme. Retirez le cœur de la poitrine.
- Placer le cœur du donneur explanté dans une solution de cardioplégie HTK froide à 4 °C et conserver temporairement.
3. Procédure d’exploitation du bénéficiaire
REMARQUE: Les étapes initiales de l’opération sont similaires à celles précédemment montrées pour la souris donneuse, y compris l’anesthésie et la désinfection.
- Effectuez la coupe de la peau abdominale de manière transversale, couvrez les organes abdominaux avec une gaze humide à l’aide d’une solution saline.
- Utilisez la micro-pince pour exposer la veine cave inférieure et l’aorte abdominale et les libérer du tissu adipeux environnant.
- Utilisez des micro pinces pour ligater ou électrocautériser les vaisseaux de branche latérale (latéraux ou sous la veine/ aorte) sous les vaisseaux rénaux.
- Utilisez une pince applicatrice de clips pour positionner deux pinces micro hémostatiques au niveau de la partie abdominale de la veine / aorte provenant de la droite, laissant une distance de plus de 1 cm pour l’aorte / veine afin d’assurer un espace pour la construction de l’anastomose entre elles.
- Utilisez des micro-ciseaux pour faire une incision dans l’aorte un peu plus près de la pince inférieure que de la pince supérieure. Vous pouvez également utiliser une aiguille de 30 G pour faire un petit trou et l’ouvrir avec des micro-ciseaux.
- Positionnez la souris récepteur de sorte que l’aorte soit face à l’opérateur avec la veine cave de l’autre côté. Ensuite, placez le cœur dans la cavité abdominale et couvrez-le d’un petit tampon de gaze humide.
- Utilisez une suture 10/0 pour adapter et coudre l’aorte donneuse à l’aorte réceptive en commençant caudalement, faites un nœud et procédez à une suture courante au sommet de l’incision (environ 4-5 points). Ensuite, retournez le cœur vers la droite (du point de vue du sujet), couvrez-le à nouveau et continuez la suture sur le côté gauche jusqu’à atteindre l’extrémité caudale et nouez-la.
- Utilisez un tube d’irrigation pour injecter au moins 0,5 mL de solution de cardioplégie HTK à 4 °C pour rincer l’IIVC du donneur.
- Utilisez des micro-ciseaux pour couper un trou rond sur la veine cave inférieure abdominale du receveur, qui devrait avoir la même taille que la lumière IIVC des donneurs. L’incision doit être située au-dessus de l’ouverture anastomotique aortique. Rendre l’incision veineuse plus grande que l’incision aortique.
- Utilisez une suture 10/0 pour coudre le donneur IIVC à la veine cave récepteur commençant caudalement. Attachez un nœud et effectuez une suture courante jusqu’à ce que le sommet de l’incision soit atteint. Utilisez cinq points de suture et continuez la suture sur la gauche. Enfin, attachez un nœud dans le coin de la queue et serrez soigneusement (veillez à ne pas tirer trop serré).
- Placez les petites parties de l’éponge hémostatique autour de la veine et des anastomoses aortiques.
- Utilisez une pince d’applicateur de clip pour enlever d’abord les pinces micro-hémostatiques inférieures, puis supérieures et rincez la cavité abdominale avec du chlorure de sodium à 0,9 % tempéré à 38,0 °C.
- Utilisez une micro pince pour enlever l’éponge hémostatique.
- Observez le rythme cardiaque du cœur transplanté.
- Utilisez une pince pour remettre les intestins dans la cavité abdominale et des sutures à deux couches (muscles abdominaux suivis de peau) pour fermer la plaie abdominale avec une suture 4/0.
- Mettez les souris dans une chambre de poste de travail de contrôle de l’oxygène et de la température (par exemple, INVIVO2-400) pour fournir un environnement chaud et riche en oxygène pour que les souris transplantées récupèrent, attendez que les souris se réveillent.
- Pour l’analgésie postopératoire, donnez directement metamizol 200 mg/kg par os après opération. Quatre et 16 heures après l’opération donner Metamizol 200 mg/kg par os+ Carprofène (5mg/kg) s.c. Dans le suivi ultérieur, donnez du carprofène (5 mg/kg) s.c aux souris transplantées toutes les 24 heures pendant trois jours consécutifs après l’opération.
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Representative Results
Ici, une technique modifiée de transplantation abdominale heterotopic de coeur chez les souris qui a été précédemment développée dans notre laboratoire et s’est avérée utile pour les 16 dernières années est présentée. Précédemment, on l’a rapporté que dans l’ensemble 40 cas de veine cave à veine cave (groupe V-V) comparé à 40 cas de l’artère pulmonaire traditionnelle à la veine cave (groupe P-V) procédure d’anastomose4 (tableau 1)l’anastomose de navire a pris 20.8±1.3 min dans le groupe de V-V, qui était sensiblement plus court que dans le groupe de P-V (27.5±1.3 min, p<0.01). Le temps chaud d’ischémie, le temps total d’opération de destinataire et le temps de répétition postopératoire de coeur, qui étaient 25.5±1.2 minute, 42.0±1.5min, et 1.1±0.2 minute, respectivement, ont été également sensiblement raccourcis qu’observé dans le groupe traditionnel de P-V (tout le p<0,05) (figure 1). Même s’il n’y a pas de différences pour les taux de survie à long terme dans ce modèle10,11, la technique modifiée a facilité la transplantation abdominale de coeur chez la souris ayant pour résultat à la fois une ischémie chaude réduite et le temps de rebeating de coeur greffé.
En ce qui concerne ces données publiées précédemment et notre expérience avec ce modèle au cours des 16 dernières années, nous recommandons que les étapes clés de l’exploitation prennent un temps limité pour assurer un taux de réussite de >90%4. Par conséquent, des résultats optimaux sont obtenus si la récolte du cœur du donneur ne prend pas plus de 60 min, le temps d’ischémie froide doit être limité à 40 min au maximum, et la construction de l’anastomose IIVC ne doit pas prendre plus de 15 min car cela est directement associé à un temps d’ischémie chaude réduit.
Figure 1. Comparaison des temps de procédure entre les deux techniques de fonctionnement (n = 40 chacune, moyenne + SE) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Préparation du cœur du donneur à l’aide du modèle de transplantation cardiaque de souris traditionnel (a, en haut à gauche) et modifié (b, en bas à gauche). Les photographies en panneaux a et b dépeignent l’aorte (A), l’artère pulmonaire (PA), l’oreillette droite (RA), l’oreillette gauche (LA) et la veine cave inférieure intrathoracique (IIVC) du coeur de distributeur. Notez la différence de longueur du navire du PA par rapport à l’IIVC. Le panneau c montre le situs récepteur préparé pour le HTX abdominal heterotopic. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Anastomose vasculaire du modèle modifié: aorte (A), veine cave inférieure intrathoracique (IIVC), veine cave inférieure abdominale (aivc), aorte abdominale (aa). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Démonstration de la longueur de navire pour l’artère pulmonaire (PA) et la veine cave inférieure intrathoracique (IIVC). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Forme physiologique de trompette à l’extrémité de la veine cave inférieure intrathoracique. Aorte (A), veine cave inférieure intrathoracique (IIVC), oreillette droite (RA), oreillette gauche (LA). La double flèche rouge gauche sur la gauche met en évidence le diamètre et le cercle rouge sur la droite la structure de la forme de la trompette. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Veine cave à veine cave (nouvelle méthode) | A pulmonaire à la veine cave (méthode traditionnelle) | |
| Achats des donateurs (min)) | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| Opération du destinataire (min)Recipient operation (min) | 42.0 + 1.5 | 48,6 + 1,4** |
| Anastomose des vaisseaux (min) | 20.8 + 1.3 | 27,5 + 1,3** |
| Ischémie froide (min) | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| Ischémie chaude (min) | 25.5 + 1.2 | 32,6 + 1,3** |
| Postopération de rebeat (min) | 1.1 + 0.2 | 2,1 + 0,4* |
| Taux de réussite | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0,05 | ||
| **P < 0,01. |
Tableau 1. Comparaison des distributions temporelles et des résultats initiaux dans deux opérations (n - 40, moyenne + SE)
Réimprimé de Wu, K., Zhang, J., Fu, J., Wu, S., Philipp, T., Uwe, H., Kribben, A. et Witzke, O. Nouvelle technique pour la reconstruction du circuit sanguin dans le modèle de transplantation cardiaque de souris. microchirurgie. 26, 594-598 (2006).
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Discussion
La technique chirurgicale de la transplantation abdominale hétérotopique de coeur chez la souris est très provocante et ceci implique une restriction à l’utilisation répandue de ce modèle.
L’un des inconvénients de la technique conventionnelle est la longueur limite de l’artère pulmonaire (PA) du donneur. Il est généralement d’environ 2 mm de longueur, alors que la longueur de l’IIVC du cœur donneur utilisé dans notre modèle est généralement d’environ 1 cm(Figure 2). Cela signifie que dans le modèle modifié, l’anastomose IIVC offre une vue plus claire du situs opératoire permettant une meilleure chirurgie des anastomoses et empêchant le développement indésirable de sutures trop strictes ou même de lésions dommageables des vaisseaux (Figure 4). La construction de l’AP ainsi que l’anastomose IIVC sont difficiles, même pour les opérateurs expérimentés. L’AP est très délicat et à parois minces et l’IIVC est encore plus mince et potentiellement plus fragile chez la souris. Par conséquent, les exploitants doivent être conscients de cette restriction et doivent faire preuve de prudence lorsqu’ils entasser le CIVI. Cependant, à ce stade, il est important de souligner que bien que la paroi du vaisseau IIVC soit très mince, elle présente le grand avantage que la longueur du vaisseau n’est pas associée à une tension à la connexion du vaisseau sanguin, rendant ainsi l’application d’une suture précise plus facile et moins sujette à un dommage. Puisque l’application prudente et sûre des sutures de navire sont très critiques pour un résultat réussi d’opération, un grossissement du situs de 10 à 20 fois est recommandé.
De plus, la terminaison du segment thoracique de l’IIVC forme une structure typique en forme de trompette(figure 5). Son plus grand diamètre d’ouverture représente l’une des raisons importantes et bénéfiques pour lesquelles l’IIVC peut être choisi. Son utilisation facilite l’application d’une anastomose suffisante. Cela réduit à la fois la difficulté de l’opération et le temps de fonctionnement.
Un événement possible qui peut compromettre le résultat du procédé de greffe représente une thrombose de l’anastomose de navire, souvent favorisée par une sténose. Bien que dans notre modèle, la longueur du navire augmente exprès, cela n’a pas été associé à la formation de thrombus. L’anastomose en forme de trompette de l’IIVC peut également exercer un effet positif tout en réduisant considérablement l’apparition d’une sténose anastomotique. Par conséquent, pour cette procédure, une héparinisation posttransplant n’est pas nécessaire.
Une analyse précédente de la méthode d’anastomose IVC-aivc a révélé plusieurs avantages et améliorations par rapport à la technique conventionnelle10. En ce qui concerne ces résultats et du point de vue rétrospectif de notre expérience de longue date4,10,12,13,cette technique se traduit à la fois par une ischémie chaude réduite et par un temps de rebeating du cœur greffé. Même s’il n’y a pas de différences pour les taux de survie à long terme pour ce modèle10,la technique modifiée présentée ici facilite la reconstruction des vaisseaux anostomotiques réduisant ainsi la difficulté de la transplantation cardiaque abdominale chez la souris. La formation et l’application de ce modèle peuvent donc améliorer l’accessibilité et l’application généralisée de la transplantation cardiaque abdominale chez la souris à des fins immunologiques et de recherche cardiaque.
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Disclosures
aucun.
Acknowledgments
Nous remercions la Dre Yun Xu pour son aide en tant qu’actrice de doublage, la Dre med Jianhua Peng pour son aide au montage vidéo et la Dre Annika Kuckhahn pour ses commentaires et son soutien. Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) pour promouvoir les collaborations internationales (HO2581/4-1 à AH), et la Fondation nationale de la science de Chine (NSFC; #81760291 à FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
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