Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

نمذجة سرطان الثدي في أنسجة الثدي البشرية باستخدام نظام الفيزيولوجيا الدقيقة

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

يصف هذا البروتوكول بناء نظام في المختبر للفيزياء الدقيقة لدراسة سرطان الثدي باستخدام أنسجة الثدي البشرية الأولية مع مواد خارج الجرف.

Abstract

لا يزال سرطان الثدي (BC) سببا رئيسيا لوفاة النساء. على الرغم من استثمار أكثر من 700 مليون دولار في أبحاث BC سنويا ، فإن 97٪ من أدوية BC المرشحة تفشل في التجارب السريرية. لذلك ، هناك حاجة إلى نماذج جديدة لتحسين فهمنا للمرض. تم تطوير برنامج النظم الفيزيائية الدقيقة (MPS) التابع للمعهد القومي للصحة لتحسين الترجمة السريرية لاكتشافات العلوم الأساسية والاستراتيجيات العلاجية الجديدة الواعدة. هنا نقدم طريقة لتوليد MPS لسرطان الثدي (BC-MPS). هذا النموذج يتكيف مع نهج وصفها سابقا من زراعة الأنسجة الدهنية البيضاء البشرية الأولية (WAT) عن طريق شطيرة وات بين أوراق الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC)ق. وتشمل الجوانب الجديدة من قبل الميلاد لدينا MPS بذر خلايا BC في أنسجة الثدي البشرية غير المريضة (HBT) التي تحتوي على مصفوفة خارج الخلية الأصلية، الخلايا الدهنية ناضجة، الخلايا الليفية المقيمة، والخلايا المناعية؛ وسند المزيج BC-HBT بين أوراق ASC المشتقة من HBT. الناتجة قبل الميلاد MPS مستقرة في الثقافة ex vivo لمدة 14 يوما على الأقل. يحتوي هذا النظام النموذجي على عناصر متعددة من البيئة الدقيقة التي تؤثر على BC بما في ذلك الخلايا الدهنية والخلايا النجمية والخلايا المناعية والمصفوفة خارج الخلية. وبالتالي يمكن استخدام BC-MPS لدراسة التفاعلات بين قبل الميلاد وضواحيها الدقيقة.

نحن نظهر مزايا BC-MPS لدينا من خلال دراسة اثنين من السلوكيات قبل الميلاد المعروفة للتأثير على تطور السرطان والانبثاث: 1) قبل الميلاد الحركة و 2) قبل الميلاد-HBT الأيضية الحديث. في حين سبق أن ثبت حركة BC باستخدام التصوير داخل الحتمية ، BC-MPS يسمح للتصوير الفاصل الزمني عالية الدقة باستخدام المجهر الفلوري على مدى عدة أيام. وعلاوة على ذلك، في حين تم عرض الحديث الأيضي سابقا باستخدام خلايا BC وخلايا مورين قبل الدهون المتمايزة إلى خلايا شحمية غير ناضجة، فإن نموذج BC-MPS لدينا هو أول نظام لإثبات هذا الكلام المتقاطع بين الخلايا الدهنية الثديية البشرية الأولية وخلايا BC في المختبر.

Introduction

كل عام، أكثر من 40،000 امرأة أمريكية تموت من سرطان الثدي (قبل الميلاد)1. على الرغم من أكثر من 700 مليون دولار استثمرت في البحوث قبل الميلاد سنويا، 97٪ من الأدوية قبل الميلاد مرشح تفشل التجارب السريرية2،3. هناك حاجة إلى نماذج جديدة لتحسين خط أنابيب تطوير الأدوية وفهمنا لإدراك BC. حدد برنامج المعاهد القومية للصحة الفيزيائية الدقيقة (MPS) الميزات المطلوبة لنماذج اختراق لتحسين ترجمة العلوم الأساسية إلى نجاح سريري4. وشملت هذه استخدام الخلايا البشرية الأولية أو الأنسجة، ومستقرة في الثقافة لمدة 4 أسابيع، وإدراج بنية الأنسجة الأصلية والاستجابة الفسيولوجية.

نماذج المختبر BC الحالية، مثل الثقافة ثنائية الأبعاد لخطوط خلايا BC، وإدراج الغشاء الثقافة المشتركة، والشفرات ثلاثية الأبعاد والأعضاء، لا تفي بمعايير MPS في المعاهد القومية للصحة لأن أيا من هذه إعادة رسملة العمارة أنسجة الثدي الأصلية. عندما تضاف مصفوفة خارج الخلية (ECM) إلى هذه الأنظمة، لا يتم استخدام ECM الثدي. بدلا من ذلك، يتم استخدام المواد الهلامية الكولاجين ومصفوفات غشاء الطابق السفلي.

الحالية في النظم الحية، مثل xenografts المريض المستمدة (PDX)، وبالمثل لا تفي بمعايير MPS المعاهد القومية للصحة لأن الأنسجة الثديية مورين تختلف اختلافا كبيرا عن الثديين البشري. وعلاوة على ذلك، يتم الاعتراف بشكل متزايد التفاعلات بين الجهاز المناعي قبل الميلاد كمفتاح في تطور الورم، ولكن نماذج المورين المناقصة المناعية المستخدمة لتوليد أورام PDX تفتقر إلى الخلايا التائية الناضجة، والخلايا B، والخلايا القاتلة الطبيعية. وعلاوة على ذلك، في حين يسمح PDX لأورام الثدي الأولية للحفاظ على وتوسيعها، يتم اختراق الأورام PDX الناتجة مع الخلايا سترومال مورين الأولية وECM5.

للتغلب على هذه التحديات، قمنا بتطوير رواية، فيفو، MPS الثدي البشري ثلاثي الأبعاد التي تلبي معايير MPS المعاهد القومية للصحة. يتم إنشاء أساس MPS الثدي لدينا عن طريق شطيرة أنسجة الثدي البشرية الأولية (HBT) بين ورقتين من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASCs)، معزولة أيضا عن HBT (الشكل 1). المكبس لنقل أوراق الخلية إلى شطيرة HBT يمكن أن تكون مطبوعة 3D أو مصنوعة من البلاستيك الاكريليك بسيطة (الشكل 1H، I). هذه التقنية تتكيف مع نهجنا الموصوف سابقا لزراعة الأنسجة الدهنية البيضاء البشرية الأولية6،7. ويمكن بعد ذلك أن تكون المصنف MPS الثدي من قبل نموذج قبل الميلاد من الاختيار، بدءا من خطوط الخلية قبل الميلاد القياسية لأورام الثدي البشرية الأولية. هنا، نظهر أن هذه BC-MPS مستقرة في الثقافة لعدة أسابيع(الشكل 2)؛ وتشمل العناصر الأصلية من HBT مثل الخلايا الدهنية الثديية, ECM, بطانة الرحم, الخلايا المناعية (الشكل 3); وتلخيص التفاعلات الفسيولوجية بين قبل الميلاد وHBT مثل التحدث الأيضي(الشكل 4). وأخيرا، فإننا نظهر أن BC-MPS يسمح لدراسة حركة الأميبويد من خلايا BC في جميع أنحاء HBT (الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم جمع جميع الأنسجة البشرية وفقا للبروتوكول #9189 كما وافق عليه مكتب مجلس المراجعة المؤسسية في LSUHSC.

1. بذر الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASCs) لأوراق الخلية

  1. شراء ASCs من مصادر تجارية أو عزل من أنسجة الثدي البشرية الأولية باتباع البروتوكولات المعمول بها8،9. بذور الثدي البشري ASCs في كثافة 70٪ (~ 80،000 الخلايا / سم2 مساحة السطح) على لوحات زراعة الأنسجة القياسية 6-جيدا في دولبيكو متوسط النسر المعدلة (DMEM) تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنين، و 1٪ البنسلين / ستريبتومايسين (BC-MPS وسائل الإعلام). تأكد من أن ASCs التي ستستخدم لتشكيل أوراق الخلية يجب أن تكون أقل من الممر 10.
    1. لكل بئر من سرطان الثدي نظام الفيزيولوجيا الدقيقة (BC-MPS) التي سيتم إنشاؤها، خلايا البذور في 1 مستوى زراعة الأنسجة بشكل جيد و 1 بئر من حجم مماثل على بولي (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm) المغلفة الأنسجة ثقافة لوحة بلاستيكية. لوحة واحدة من 6-جيدا من BC-MPS سوف تتطلب واحدة ثقافة الأنسجة القياسية 6 لوحة بئر (أسفل) ولوحة واحدة pNIPAAm المغلفة (أعلى). يمكن شراء لوحات pNIPAAm من مصادر تجارية أو يمكن أن تكون مغلفة في المختبر10،11،12.
  2. زراعة ASCs في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام في خزانة السلامة البيولوجية.
  3. ثقافة ASCs حتى تصبح التقاء 100٪ وتشكيل نمط المخطط. اعتمادا على التقاء التي كانت المصنفين، وهذا سيستغرق 7-10 أيام. مطلوب أوراق الخلايا التقاء لترسيخ أنسجة الثدي الدهنية المزدهرة.

2. إعداد الإمدادات اللازمة ل MPS BC

  1. لإعداد الجيلاتين ل6-جيدا لوحات جعل محلول الجيلاتين 12٪ في المقطر H2O. ميكس 19 غرام من الجيلاتين نوع B (قوة هلام من ~ 225 بلوم) و 125 مل من H2O في زجاجة وسائل الإعلام الزجاج 250 مل. أضف 1.6 مل من 1 M NaOH إلى الحل لتحييد الحموضة.
  2. أوتوكلاف الحل تحت دورة السائل لمدة 25 دقيقة لتعقيم الحل.
  3. السماح للحل لتبرد إلى 37 درجة مئوية. في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة إضافة 16 مل من المحلول المعقم الملح 10x هانكس متوازنة (HBSS) إلى الحل للحصول على حجم نهائي من 160 مل.
    ملاحظة: يمكن استخدام محلول الجيلاتين على الفور أو تخزينه في درجة حرارة الغرفة لاستخدامه لاحقا. الجيلاتين المعد مستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة شهر واحد. إذا كان هناك حاجة فقط عدد قليل من المكبس ثم يمكن إجراء حل 10 مل وتصفية عقيمة في نفس اليوم الذي جعل BC-MPS كما هو موضح سابقا7.
    1. لإعداد محلول الجيلاتين عن طريق تعقيم الفلتر، قم بتخفيف 1 مل من 10x HBSS مع 9 مل من H2O لصنع محلول HBSS 1x في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف 100 ميكرولتر من 1 M NaOH إلى كل أنبوب 10 مل ثم أضف 0.7 غرام من الجيلاتين إلى الحل. خلط الحل بقوة لإذابة الجيلاتين.
    2. احتضان الأنبوب في حمام مائي 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تهتز كل 5 دقائق. استخدم حقنة 10 مل ومرشح حقنة 0.22 ميكرومتر لتصفية محلول الجيلاتين. تصفية محلول الجيلاتين مباشرة على المكبس في خزانة السلامة البيولوجية.
  4. طباعة ثلاثية الأبعاد أو استخدام الاكريليك بسيطة لجعل المكبس المستخدمة لنقل أوراق الخلية. تأكد من أن المكبس تناسب فضفاضة في الحجم المطلوب من جيدا. يظهر المكبس المطبوع ثلاثي الأبعاد القياسي في الشكل 1. يمكن تصميم المكبس باستخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر القياسية مثل TinkerCad وطباعتها باستخدام الطابعات ثلاثية الأبعاد الخيطية المتوافقة مع حمض البوليلاكتيك (PLA)13،14.
  5. لإعداد رف لعقد المكبس وضع رف أنبوب 15 مل في خزانة السلامة البيولوجية. ضع المكبس رأسا على عقب في الرف ، بحيث يواجه الجزء السفلي من المكبس. ضع صندوق بلاستيكي مع غطاء لنقل BC-MPS في خزانة السلامة الحيوية. من المستحسن أن يكون طول الصندوق 35.5 سم على الأقل × 28 سم × 8.25 سم لاحتواء 4 لوحات من BC-MPS. إزالة الغطاء من مربع ورذاذ أسفل الرف، المكبس، ومربع مع 70٪ EtOH.
  6. إعداد شفرات الحلاقة العقيمة والملقط عن طريق الالاستعباد التلقائي أو عن طريق وضعها في خزانة السلامة البيولوجية والغسيل مع 70٪ EtOH.
  7. رش المكبس ومربع مع 70٪ EtOH وبدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة على الأقل لتعقيم الإمدادات.

3. إعداد المكبس الجيلاتين وتطبيقها على أوراق الخلية العليا

  1. إذا كان الحل الجيلاتين أعدت سابقا، تسخينه في حمام الماء 37 درجة مئوية لإذابته.
  2. ماصة الحل الجيلاتين على المكبس في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية باستخدام ماصة المصلية 5-أو 10 مل. المكبس ل 1 بئر من لوحة 6-جيدا سوف تتطلب ~ 2.5 مل من الجيلاتين.
  3. مرة واحدة وقد وطدت الجيلاتين على المكبس (~ 30-45 دقيقة) نقل لوحات ASC المغلفة pNIPAAm إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. ضع المكبس برفق في آبار لوحات ASC المغلفة pNIPAAm بحيث يتصل الجيلاتين بأجهزة ASCs. ضع غسالة معدنية (~ 7.5 غرام) على المكبس لوزن المكبس بحيث الجيلاتين على اتصال مباشر مع ورقة الخلية ASC. اترك المكبس على صفائح خلية ASC في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. تحريك بلطف لوحة مع المكبس في مربع العقيمة في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ووضع الغطاء على ذلك. نقل مربع إلى ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إذا لم تتوفر ثلاجة 4 درجات مئوية ضع الطبق على الثلج في دلو ثلج في خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة.

4. إعداد خطوط الخلايا السرطانية

  1. البذور خطوط الخلايا السرطانية في طبق T75 زراعة الأنسجة القياسية والاحتفاظ بها في الثقافة بحيث تكون ~ 80٪ التقاء في اليوم قبل الميلاد-MPS سيتم معالجتها. (~ 200،000 الخلايا السرطانية ستكون هناك حاجة لكل قبل الميلاد MPS). تنمو الخلايا السرطانية في وسائل الإعلام العادية.
    ملاحظة: لتحديد وعزل الخلايا السرطانية فمن المستحسن أن يتم تحويل الخلايا مع بروتين الفلورسنت لتمييزها عن ASCs وأنسجة الثدي. تم تحسين عدد الخلايا السرطانية اللازمة لكل BC-MPS لخلايا MCF7 و MDA-MB-231. خطوط الخلايا الأخرى قد تتطلب المزيد من التحسين.
  2. في اليوم الذي يتم فيه إعداد BC-MPS نقل القارورة التي تحتوي على الخلايا السرطانية إلى خزانة السلامة البيولوجية. يستنشق وسائل الإعلام من القارورة. غسل القارورة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. إضافة 1 مل من محلول مفرزة الخلية إلى القارورة التي تحتوي على الخلايا السرطانية ومن ثم احتضان القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تكون الخلايا قد انفصلت (~ 2-5 دقيقة).
  4. في خزانة السلامة الحيوية إضافة 9 مل من برنامج تلفزيوني إلى القارورة، ونقل الخلايا في برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي 15 مل والعد رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
  5. الطرد المركزي الخلايا السرطانية في 500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. إعادة إنفاق الخلايا في وسائط BC-MPS بحيث يكون هناك 2 × 106 خلايا /مل.
  7. ضع الخلايا السرطانية في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لإضافتها إلى الأنسجة البشرية.

5. معالجة أنسجة الثدي البشري

  1. في خزانة السلامة الحيوية غسل أنسجة الثدي البشري (HBT) 3x مع 10 مل من برنامج تلفزيوني معقم.
  2. استخدام ملقط معقمة وشفرة حلاقة لفرم بخشونة قبل الميلاد-MPS ومحاولة لإزالة أكبر قدر ممكن من اللفافة والأنسجة الضامة. قد يؤدي الفشل في إزالة النسيج الضام إلى عدم تثبيت الطبقة العليا من ASC بشكل صحيح على HBT.
    ملاحظة: يمكن التعرف على اللفافة والنسيج الضام من خلال مظهره الأبيض أو الواضح مقارنة بالألوان الصفراء للأنسجة الدهنية.
  3. بمجرد إزالة النسيج الضام استخدم شفرة حلاقة معقمة لفرم الأنسجة ناعما حتى يكون لها اتساق سائل متجانس. يتم فرم الأنسجة ناعما عندما يمكن بسهولة أن تكون pipetted باستخدام طرف المصلية 25 مل.
  4. استخدام شفرة حلاقة معقمة لقطع طرف قبالة تلميح ماصة p1000 للمساعدة في pipetting HBT المفروم.
  5. في أنبوب 1.5 مل مزيج HBT المفروم، وخطوط الخلايا السرطانية، والوسائط BC-MPS (ل1 بئر من لوحة بئر 6 وهذا يتطلب 200 ميكروغرام من HBT المفروم، 100 ميكروغرام من وسائل الإعلام قبل الميلاد-MPS، و 100 ميكروغرام من الخلايا السرطانية).
  6. نقل لوحة ASC التي سيتم استخدامها للوحة الخلية السفلية من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية. يستنشق الوسائط من لوحة ASC السفلية. ماصة الخليط على وسط بئر لوحة ASC السفلي باستخدام طرف ماصة p1000 التي كانت نهاية البعيدة قطع من الخطوة 5.4
  7. نقل مربع يحتوي على لوحة ASC العلوي مع المكبس على ذلك إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إزالة بلطف المكبس الجيلاتين من لوحة المغلفة pNIPAAm ومكان على رأس خليط HBT. إضافة وسائل الإعلام قبل الميلاد MPS إلى البئر (ل 1 بئر من لوحة 6-جيدا إضافة 2 مل من وسائل الإعلام). تحرك بعناية لوحات ASC السفلي مع خليط BC-MPS والغطاسات إلى مربع البلاستيك العقيم ووضع غطاء الصندوق على للنقل.
    ملاحظة: غطاء لوحة 6-جيدا لن يصلح مرة أخرى على لوحة ASC بينما المكبس على. يجب توخي الحذر لتجنب تلويث الثقافة.
  8. احتضان لوحة أسفل في المربع في حاضنة في 37 درجة مئوية حتى الجيلاتين قد ذابت، وطبقة ASC الأعلى قد بدأت في الالتزام الطبقة السفلية (~ 30 دقيقة).
  9. نقل مربع مع لوحات لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إزالة بلطف المكبس من لوحات أسفل. الأنسجة مع الخلايا السرطانية سوف تكون راسية في الجزء السفلي من البئر.
  10. ضع غطاء اللوحة ذات 6 آبار مرة أخرى على اللوحة السفلية واحتضنها عند 37 درجة مئوية لإذابة الجيلاتين تماما والسماح للطبقة العليا بالإرساء تماما في الطبقة السفلية (~ 30-60 دقيقة).
  11. نقل لوحات بلطف إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية و يستنشق وسائل الإعلام مع ماصة المصلية 10 مل. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الطازجة إلى كل بئر. يستنشق من حافة البئر وماصة على حافة البئر لتجنب إزاحة الأنسجة.
  12. حافظ على BC-MPS عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للطول المطلوب من الوقت وغير الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام.

6. الهضم من قبل الميلاد - MPS للتحليل

  1. عندما تكون BC-MPS جاهزة للتحليل، حرك اللوحة إلى خزانة السلامة الحيوية. إزالة الوسائط مع ماصة المصلية لتجنب إزاحة عرضي من أي أنسجة.
  2. إضافة 1 حجم برنامج تلفزيوني لكل بئر.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة المصلية.
  4. إضافة 1 مل من حل فصل الخلية لكل بئر. حرك اللوحة مرة أخرى إلى الحاضنة واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا بالفصل. في خزانة السلامة البيولوجية، استخدم مكشطة الخلايا لفصل الخلايا والأنسجة تماما عن لوحة الثقافة.
  5. نقل الحل مع الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام ماصة المصلية. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر لجمع أي خلايا المتبقية ونقل هذا الحل إلى أنبوب مخروطي. إذا كانت الخلايا الفلورية، التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء.
  6. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية تحت التحريض المستمر في شاكر المدارية في 1 × ز لمدة 10-20 دقيقة لنأي الخلايا تماما عن الأنسجة.
  7. في خزانة السلامة الحيوية استخدام ماصة المصلية لتعطيل أي كتل المتبقية من الخلايا في الأنبوب وتصفية العينة من خلال مصفاة الأنسجة 250 ميكرومتر في أنبوب جديد 15 مل. Pipette الحل ببطء من خلال مصفاة بحيث لا تجاوز.
  8. شطف مصفاة مع برنامج تلفزيوني 1 مل لجمع أي خلايا لا تزال في مصفاة.
  9. طرد مركزي العينات في 500 × ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، سوف تطفو الخلايا الدهنية على الطبقة العليا من المحلول في حين سيتم خلط الخلايا السرطانية و ASCs معا في بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
  10. لعزل الخلايا الدهنية صب بلطف الطبقة العليا في أنبوب جديد أو بدلا من ذلك قطع طرف قبالة تلميح ماصة p1000 ونقل الطبقة العليا إلى أنبوب جديد. الطرد المركزي عينة في 500 × ز لمدة 5 دقائق مرة أخرى واستخدام حقنة وإبرة لإزالة الحل من تحت adipocytes بحيث تبقى فقط الخلايا الدهنية. الخلايا الدهنية جاهزة الآن للتحليل
  11. بعد إزالة الخلايا الدهنية من المحلول ، افصل ASCs والخلايا السرطانية عن بعضها البعض للتحليل إذا كانت الخلايا السرطانية مصابة سابقا ببروتين فلوري. يستنشق المحلول المتبقي من الأنبوب الذي يحتوي على ASCs والخلايا السرطانية دون تعطيل بيليه الخلية. Resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني أو قبل الميلاد - MPS وسائل الإعلام واستخدام تدفق قياس الخلايا لفرز الخلايا على أساس الفلورسينس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الاستقرار في الثقافة
BC-MPS هو نظام فيزيائي دقيق مستقر يمكن استزراعه في المختبر لمدة تصل إلى 14 يوما على الأقل. تم التقاط صورة brightfield من أوراق الخلية ASC في التكبير 100x لعرض نمط المخططات من ورقة التقاء (الشكل 2A). أوراق الخلية ASC مستقرة في الثقافة لمدة 4 أسابيع على الأقل. BC-MPS في 14 يوما في الثقافة في بئر واحد من لوحة بئر 6 تم تصويرها مع كاميرا ملونة مما يدل على أن HBT المزدهرة لا تزال راسية بشكل ثابت من قبل أوراق الخلية ASC إلى أسفل البئر بعد 14 يوما(الشكل 2B). وهذا يدل على أن ورقة الخلية المستخدمة لساندويتش الأنسجة الدهنية لا تزال سليمة. تم استزراع خط الخلية الثلاثي السلبي BC MDA-MB-231 الذي يعبر عن RFP في HBT لمدة 14 يوما ثم تم تصويره بمجهر فلوري يوضح استقرار BC-MPS مع خطوط الخلية إلى 14 يوما على الأقل(الشكل 2C). وجود خلايا BC في الأنسجة يدل على قدرة الخلايا السرطانية لغزو HBT. تم استئصال ثلاثية سلبية PDX explant من الماوس، ملطخة CMTPX تعقب الخلية ومثقف مع HBT. تم التقاط صور المجهر الفلوري في اليوم 6 لإظهار استقرار BC-MPS مع explants الورم لمدة 6 أيام على الأقل(الشكل 2D). وهذا يدل على أن BC-MPS يمكن استخدامها لثقافة الأورام explants مع HBT وكذلك خطوط الخلية.

عناصر HBT الأصلية
BC-MPS يحتوي على العناصر الأصلية من HBT في الثقافة. BC-MPS تحتوي على 100 ملغ من HBT كانت مثقفة في المختبر لمدة 14 يوما. تم تصوير الأنسجة باستخدام المجهر برايتفيلد بعد 14 يوما في الثقافة (الشكل 3A). توضح هذه الصورة الحفاظ على مجموعات من الخلايا الدهنية الناضجة في 14 يوما في الثقافة. ثم تم إصلاح الأنسجة مع 10٪ الفورماتين، البارافين جزءا لا يتجزأ، مقطعة في 5 ميكرومتر باستخدام microtome ومن ثم ملطخة بقعة بنتاشروم Movats باستخدام بروتوكول قياسي. تم تصوير المقاطع الثابتة في 100x (الشكل 3B) أو 20x (الشكل 3C). تظهر الصور أن BC-MPS يحتوي على الكولاجين الأصلي (الأرجواني) والألياف الشبكية (الأزرق) ، ويتم الحفاظ على الشكل الأحادي اللون الكبير بين النسيج الضام في 14 يوما في الثقافة. لتحديد الضامة الأساسية في النظام، تم استزراع HBT لمدة 0 و 3 و 7 أيام ثم تم إصلاحه وتلطيخه بمضادات CD45 ومكافحة CD68 ومكافحة CD206. تم استخدام CD45 كمعرف الكريات البيض العام. تم استخدام CD68 كما وصمة عار monocyte لتحديد الضامة في حين CD206 يحدد مستقبلات مشتركة موجودة على الضامة. تم تحديد تلطيخ علامات الضامة كميا باستخدام برنامج تصوير(الشكل 3D). وهذا يدل على الحفاظ على الضامة الأولية بعد 3 و 7 أيام في الثقافة. توضح هذه البيانات أن BC-MPS يحتفظ العناصر الأصلية من HBT في الثقافة. ويمكن إجراء المزيد من التجارب لدراسة كيفية إعادة تشكيل خلايا BC العناصر الأصلية من HBT. يمكن أن يتضمن ذلك تقييم التغييرات في علامات الضامة لتحديد ما إذا كان يتم تغييرها من خلال وجود خلايا BC. يمكن مواصلة تحليل التغيرات في ECM من خلال مقارنة تلطيخ Movats pentachrome للعينات التي تم استزراعها مع خلايا BC أو بدونها لتحديد ما إذا كان محتوى الكولاجين قد تغير ويمكن مقارنة حجم الخلايا الدهنية باستخدام برامج تحليل الصور مثل Image J لتحديد ما إذا كانت خلايا BC تغير حجم الخلايا الدهنية.

التحدث المتبادل الأيضي
Adipocyte سرطان الأيضية الحديث هو مسار مهم حيث تؤثر البيئة الدقيقة الورم تقدم قبل الميلاد. خلايا BC التي تتراكم الدهون داخل الخلايا تثبت زيادة مقاومة الأدوية والنمط الظاهري أكثر الغازية15. في حين ثبت أن خلايا BC تحفز على انحلال الدهون في الخلايا الدهنية غير الناضجة ، مورين ، ظلت الأهمية الفسيولوجية لهذا غير واضحة لأن الحديث الأيضي المتبادل بين BC والخلايا الدهنية الثديية البشرية الأولية لم يظهر أبدا. لإثبات أن BC-MPS يمكن نموذج هذا adipocyte-BC الأيضية عبر الحديث RFP المسمى MDA-MB-231 تم استزراع الخلايا وحدها أو في BC-MPS لمدة 14 يوما. تم هضم الخلايا أنزيميا في تعليق خلية واحدة، ملطخة بصبغة الدهون المحايدة Bodipy، وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي(الشكل 4A،B)16. وكانت نسبة الخلايا MDA-MB-231 إيجابية الدهون 26.2 أضعاف SEM +/- 2.5 أكبر في BC-MPS مقابل الثقافة 2D (الشكل 4C). هذه الزيادة في تلطيخ الدهون يدل على أن الخلايا السرطانية تتفاعل مع الخلايا الدهنية وت تناول الدهون الصادرة من الخلايا الدهنية ناضجة. تم إجراء فرز الخلايا لتحديد الخلايا RFP+ Bodipy+. بعد الفرز ، كانت الخلايا مطلية على الكولاجين الذي قمت بتغطيته بالأغطية الزجاجية وسمح لي بإرفاقه بين عشية وضحاها. في اليوم التالي تم إصلاح الخلايا في 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 30 دقيقة ثم صورت على المجهر الفلوري في التكبير 100x. الخلايا المستزرعة في BC-MP (الشكل 4E) عرض قطرات الدهون زيادة مقارنة مع الخلايا المستزرعة في الثقافة 2D القياسية (الشكل 4D). وهذا يدل على الحديث الأيضي المتبادل بين خلايا BC وHBT، وأيضا، يبين كيف يمكن تحليل تراكم الدهون عن طريق قياس التدفق الخلوي أو عن طريق المجهر الفلوري. يمكن إجراء مزيد من التحليل لتراكم الدهون في الخلايا السرطانية من خلال تحديد حجم قطرات الدهون وعدد قطرات الدهون لكل خلية.

حركة الأميبويد
الأيض عبر الحديث بين خلايا BC و adipocytes يزيد من القدرة الغازية للسرطان. لتقييم القدرة الغازية المتزايدة للخلايا السرطانية المستزرعة مع HBT تم تقييم هجرة خلايا BC في جميع أنحاء HBT عن طريق المجهر الفلوري. تم استزراع خط الخلية TNBC النقيلي MDA-MB-231 الذي يعبر عن RPF في BC-MPS لمدة 4 أيام للسماح للنظام بالاستقرار. تم إجراء المجهر الفلوري الفاصل زمنيا بعد 4 أيام لتصوير حركة MDA-MB-231 مع صورة واحدة يتم التقاطها كل 20 دقيقة لمدة 19 ساعة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2. أظهر الفيديو الناتج أنماط حركة الأميبويد ودرجة عالية من الحركة بشكل مدهش لخلايا MDA-MB-231(الشكل 5 والفيديو 1). وهذا يدل على زيادة في القدرة الغازية للخلايا قبل الميلاد وقدرة خلايا BC لغزو HBT. يمكن تحليل هجرة خلايا BC في HBT باستخدام أساليب نشرت سابقا لتحديد سرعة واتجاه الخلايا المهاجرة17،18. كما لوحظ أن خلايا MDA-MB-231 تبدو كذلك خضعت للإصابة بالخلايا الميتوزية. هذه السلوكيات تتفق مع النمط الظاهري العدوانية، هي السلوكيات الهامة لتطور السرطان والانبثاث، وتسليط الضوء على السلوكيات الجديدة قبل الميلاد التي قد تكون موجهة لعلاجات BC.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل العام لإعداد BC-MPS. (أ) يتم ترسيخ الجيلاتين في المكبس تستقيم. (ب) يتم وضع المكبس مع الجيلاتين على ورقة الخلية ASC العليا الحرارية. (ج)يستخدم الوزن لإجبار الجيلاتين على الحفاظ على ملامسة ورقة الخلية بينما تحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة يليها الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة (D)تتم إزالة المكبس من الطبق البارد الذي يزيل ورقة الخلية السليمة معه. (ه)يتم نقل المكبس مع ورقة الخلية العليا إلى طبق يحتوي على ورقة الخلية السفلية وخلايا HBT وBC المفروم. (F) يتم احتضان طبق الخلية السفلي مع وسائل الإعلام، المكبس، HBT، قبل الميلاد وكلا أوراق الخلية في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة للسماح للجيلاتين لتذوب وصحائف الخلية من جهات الاتصال. (G) إزالة المكبس يترك HBT و BC تقع بين اثنين من أوراق الخلية ASC. تم تصميم المكبس المطبوع ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج TinkerCad المجاني عبر الإنترنت (https://www.tinkercad.com/) وطبع على طابعة ثلاثية الأبعاد. يتكون المكبس من حمض البوليلاكتيك. (H)يشار إلى أبعاد المكبس 1 بئر من لوحة 6-جيدا. راحة المكبس هو 2.5 ملم . (I) تظهر صورة المكبس المطبوعة 3D الفعلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الاستقرار التمثيلي BC-MPS في الثقافة. (A)صورة brightfield في تكبير 100x من ASCs التقاء مما يدل على نمط المخطط للخلايا التقاء. شريط مقياس = 100 ميكرومتر (ب) قبل الميلاد - MPS، التي تحتوي على 100mg من HBT، كان مثقفا في لوحة بئر 6. بعد 14 يوما تم التقاط صورة ملونة لإثبات أن يتم إرساء HBT إلى الجزء السفلي من بئر لوحة بئر 6. (ج)تم استزراع خط الخلية الثلاثي السلبي BC MDA-MB-231 الذي يعبر عن RFP مع HBT لمدة 14 يوما ثم تم تصويره باستخدام المجهر الفلوري عند تكبير 40x. وتبين الصور أن خلايا MDA-MB-231 كانت لا تزال قابلة للحياة وتنمو في HBT. شريط مقياس = 200 μm D) تم مفروم أورام PDX من سرطان الثدي السلبي الثلاثي من الفئران إلى 3 سم2 قطعة ووصفت مع تعقب الخلية CMPTX الأحمر. تم استزراع القطع في HBT وتم تصوير BC-MPS الناتجة باستخدام مجهر فلوري عند التكبير 40x في اليوم 6 مما يدل على استقرارها في الثقافة. مقياس الشريط = 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: المحافظة التمثيلية على العناصر الأصلية من HBT الموجودة في BC-MPS. تم استزراع BC-MPS لمدة 14 يوما ثم إما تم تصويرها بالمنظار المجهري الميداني الساطع عند 40x(A)ثم تم إصلاحها ب 10٪ من الفورماتين وملطخة ببقعة Movats pentachrome. تم التقاط الصور في 100x (ب) أو 20x (C). يشير تصوير HBT إلى الحفاظ على الخلايا الدهنية أحادية الالوان الكبيرة المتجمعة معا وتشير شرائح الأنسجة إلى وجود الحفاظ على ECM الأصلي مثل الكولاجين (الأصفر) والألياف الشبكية بين الخلايا الدهنية (الأزرق). لإثبات الحفاظ على الضامة في نموذج HBT كان مثقفا لمدة 0، 3، أو 7 أيام، ملطخة لعلامات الضامة، وصورت باستخدام المجهر confocal (D). تم قياس كثافة الفلورسنت لتلطيخ علامات الضامة كميا باستخدام البرامج المتاحة تجاريا مما يدل على أن الضامة لا تزال موجودة في الأنسجة بعد 3 و 7 أيام في الثقافة. مقياس الشريط = 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ممثل التمثيل الأيضي بين الخلايا الدهنية والخلايا السرطانية في BC-MPS. تم استزراع خلايا MDA-MB-231 المسماة ب RFP في BC-MPS مقابل 2D لمدة 14 يوما ، ثم لطخت ب Bodipy (250 nM) وتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي. (أ) تدفق Bodipy ملطخة MDA - MB - 231 الخلايا بعد 14 يوما في الثقافة 2D. وكانت الخلايا في B2 Bodipy+RFP+; وكانت الخلايا في B1 Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3.26٪، مما يشير إلى الحد الأدنى من تراكم الدهون. (ب) تحليل تدفق قياس الخلايا من Bodipy ملطخة MDA- MB-231 الخلايا بعد 14 يوما في BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85.35٪، مما يشير إلى تراكم الدهون على نطاق واسع. (ج) تراكم الدهون في MDA-MB- 231 خلايا بعد 14 يوما في الثقافة 2D مقابل قبل الميلاد-MPS. تحليل المجهر الفلورسنت من تلطيخ بوديبي من MDA-MB-231 المستزرعة في 2D (D) مقابل BC-MPS(ه) يوضح تراكم الدهون المتزايدة في الخلايا التي تزرع في BC-MPS. وأشار أشرطة الخطأ SEM. ** ع < 0.01، ن = 2 يكرر البيولوجية، شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الهجرة التمثيلية ل TNBC في BC-MPS. تم استزراع خلايا MDA-MB-231 المسماة ب RFP في BC-MPS لمدة 4 أيام ثم تم التقاط صور متسلسلة فاصل زمني لخلايا BC-MPS + MDA-MB-231 التي تحمل علامة RFP باستخدام مجهر مضان (إطار واحد لكل 60 دقيقة، تكبير 100x).) النجمة الصفراء = حدث ميتوتيك. المربع الأصفر = الحطام الخلوي المستخدم للرجوع إليه الموضعي. الأسهم الزرقاء = 231 خلية تظهر حركة الأميبويد مع pseudopods وحركية عالية. مقياس الشريط = 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: الهجرة التمثيلية ل TNBC في BC-MPS. تم استزراع BC-MPS التي تحتوي على خلايا MDA-MB-231 المسماة ب RFP لمدة 4 أيام وتم استخدام المجهر الفلوري لتصوير الخلايا كل 20 دقيقة في 19 ساعة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2. تم تجميع الصور في شريط فيديو (إطار واحد لكل 60 دقيقة ، 100x التكبير). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك حاجة إلى أنظمة جديدة لنمذجة سرطان الثدي البشري لتطوير فهم أفضل للمرض. تطوير النظم الفيزيائية الدقيقة البشرية لنمذجة إعدادات المرض التي تشمل ECM الأصلي والخلايا السترومية سيزيد من القوة التنبؤية للدراسات ما قبل السريرية. نموذج BC-MPS المعروض هنا هو نظام تم تطويره حديثا يتغلب على قيود النماذج السابقة يسمح بتقييم BC في بيئته الأصلية HBT. يمكن استخدام هذا النظام مع خطوط الخلايا السرطانية أو مع النباتات السرطانية وهو ثابت لمدة 14 يوما على الأقل. Fluorescently تسمية خلايا BC يسمح التصور في الوقت الحقيقي من حركة الخلايا السرطانية والتفاعلات الخلية الخلية، والهجرة، والبقاء، أو الانتشار ليتم رصدها إما في الوقت الحقيقي أو في نقاط زمنية محددة (الشكل 3 والشكل 5). يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لتوضيح الجوانب الهامة حول بيولوجيا السرطان من حيث صلته بالتفاعلات بين الخلايا السرطانية وضواحيها الدقيقة. يمكن أن يبلغ الاستجواب من هذا النظام على تنظيم TME تطور السرطان، والاستجابة للأدوية، وبدء الانبثاث.

لإعداد النظام بنجاح، هناك بعض الخطوات الهامة التي يجب اتباعها. الخطوة الحرجة الأولى هي زراعة ونقل أوراق خلايا ASC. لوحات pNIPAAm المغلفة حساسة لدرجة الحرارة. عندما تكون اللوحات فوق 32 درجة مئوية يكون السطح مسعورا ، وستلتزم ASCs بالسطح. السطح سوف تصبح هيدروفيلية تحت درجة الحرارة هذه والخلايا سوف تبدأ في فصل19. وبالتالي، فمن الضروري تحديد مدى سرعة نوع الخلية معينة سوف تبدأ في الانفصال عن هذه الأسطح. بالنسبة لمركبات الكربون الهيدروفلورية المشتقة من HBT ، سيستغرق ذلك > 30 دقيقة إذا كانت الخلايا التقاء. لمنع الخلايا من فصل أثناء الصيانة العادية يجب أن تكون وسائل الإعلام قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية وينبغي عدم الاحتفاظ لوحات زراعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة جدا لمنع لوحات من التبريد والخلايا فصل. من المهم أيضا تحديد الوقت الأمثل لغازات الجيلاتين لتكون على لوحات المغلفة pNIPAAm لنقل ورقة الخلية بأكملها. يجب أن تكون الشركات غير المتجانسة التقاء ويجب نقل الورقة بأكملها. إذا لم يكن ورقة الخلية العلوي الوقت لفصل تماما وربط الجيلاتين ثم سيتم كسر ورقة الخلية أثناء النقل. إذا لم يتم نقل ورقة الخلية بالكامل، ثم ASCs لن تكون قادرة على شطيرة أنسجة الثدي المزدهرة.

ASCs تستخدم لسندويتش HBT هي الخلايا اللحمية الطبيعية من البيئة الدقيقة الثدي التي تفرز ECM, عوامل النمو, والسيتوكينات التي تؤثر على BC20. لسندويتش HBT بين ورقتين الخلية، يتم نقل أوراق ASC باستخدام لوحات زراعة الأنسجة الحرارية. وهذا يسمح ECM الأصلية التي تفرزها ASCs لتكون سليمة ويعمل على ترسيخ الخلايا الدهنية المزدهرة في الأنسجة. باستخدام ASCs المستمدة من أنسجة الثدي البشرية وهذا يضمن أن التفاعلات التي لديها ASCs مع الخلايا السرطانية سوف تحاكي ما يحدث في سرطان الثدي كما ASCs من مستودعات مختلفة عرض التعبير الجيني مختلفة وإعادة عرض ECM21.

الخطوة الحاسمة الثانية هي معالجة HBT. من الضروري استخدام HBT المعزول حديثا للحفاظ على صلاحية الأنسجة. عند معالجة HBT من المهم أن فرم ناعما الأنسجة وإزالة أكبر قدر ممكن من اللفافة. إذا تركت قطع كبيرة من اللفافة في HBT ، فإن هذا سيمنع أوراق الخلايا من تثبيت الأنسجة المزدهرة بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تنأى اللفافة المتروكة في الأنسجة عن اللوحة وستسحب مجموعات متعددة من HBT معها مما يجعل البئر غير صالح للاستخدام لمزيد من التجارب. وينبغي أن توضع HBT في منتصف البئر قبل إضافة ورقة الخلية العلوي وإلا فإن ASCs لن تكون قادرة على شطيرة كافية HBT والأنسجة على حافة الآبار لن تكون راسية. إذا تم اتباع هذه الخطوات الهامة، ثم عملية إنتاج BC-MPS مباشرة إلى الأمام لإعداد.

النموذج المفصل هنا هو نظام محسن لدراسة BC في بيئته الدقيقة الطبيعية من HBT الأولية التي تحتفظ بالخلايا الدهنية الناضجة ، ECM ، والخلايا المناعية المقيمة(الشكل 4). تفتقر النماذج ما قبل السريرية التي تحاكي البيئة الدقيقة الدهنية إلى عناصر متعددة من البيئة الدقيقة ، مثل الخلايا الدهنية الناضجة والخلايا المناعية والخلايا الليفية و ECM. باستخدام HBT ناضجة تماما يسمح للتحقيق في وقت واحد ومتبادلة من هذه البيئة المعقدة التي تشمل عناصر متعددة تؤثر على تطور السرطان, استجابة المخدرات, والتوغل من خلال الباراترين وjuxtacrine إشارة22,23,24,25. تؤثر الخلايا الليفية المقيمة و ASCs على انبثاث السرطان من خلال إعادة عرض ECM في الأنسجة ومن خلال إشارات الباراكورين26و27. إن تخطيط القلب وإعادة تشكيله ضروريان لبدء الانبثاث. التعديلات في ECM من البيئة الدقيقة الورم تؤثر على الهجرة والانبثاث من قبل الميلاد، ولكن معظم الدراسات قبل الميلاد لا تدرج ECM الأصلي في دراساتهم وبدلا من ذلك استخدام نماذج مبسطة تتألف من الكولاجين أنا أو matrigel28،29. ECM في BC-MPS هو من HBT ومن ASCs. وهكذا ، يمكن دراسة الطريقة التي يتم بها إعادة تشكيل ECM الأصلي في البيئة الدقيقة للورم في أنسجة الثدي والتأثيرات على الانبثاث. وهكذا، يتضمن هذا النموذج BC-MPS عناصر متعددة من البيئة الدقيقة الورم أن أنظمة النموذج السابق لم يكن لديك.

ويمكن استخدام هذا النموذج لدراسة المحادثات الأيضية المتبادلة بين الخلايا الدهنية ناضجة تماما وخلايا BC. تستخدم النماذج السابقة التي تدرس التفاعل بين الخلايا الدهنية والخلايا السرطانية خلايا ما قبل الشحمية التي يتم تمييزها في المختبر. ما قبل adipocytes التي يتم تمييزها في المختبر لا تنضج تماما بنفس القدر كما adipocytes متباينة في الجسم الحي30،31. لفهم كيفية تأثير الخلايا الدهنية على تطور السرطان والاستجابة للأدوية ، من الضروري تقليد التركيب الجزيئي والكيميائي المعقد للخلايا الدهنية الأصلية بشكل صحيح. هنا أثبتنا أن نظامنا يسمح بتقييم الحديث الأيضي المتبادل الذي يحدث بين الخلايا الدهنية وخلايا BC(الشكل 4).

يمكن أيضا استخدام BC-MPS في إجراء دراسة في المختبر حول كيفية تأثير حالات مثل السمنة ، والتي لا يمكن تصميمها بشكل صحيح باستخدام خطوط الخلايا القياسية ، على تطور السرطان. ويرتبط السمنة مع تغيير البيئة الدقيقة من HBT وزيادة في الانبثاث في قبل الميلاد على الرغم من أن الآليات الدقيقة ليست مفهومة تماما32،33،34. يتم تغيير الخلايا الليفية، ASCs، الخلايا الدهنية و ECM أثناء السمنة وزيادة تعزيز التقدم والانبثاث من السرطان25،35،36. وبالتالي، من المهم استخدام الخلايا اللحمية الأصلية و ECM من الأنسجة البدينة لفهم كيفية تأثير هذه التعديلات في الخلايا النجمية و ECM قبل الميلاد. من خلال استخدام HBT و ASCs من المرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة أو العجاف في نموذج BC-MPS يمكن توضيح الآليات التي تعزز السمنة النمط الظاهري النقيلي.

الطريقة المعروضة هنا هي لزراعة خلايا سرطان الثدي في ثقافة تشمل ASCs ، الخلايا الدهنية الناضجة ، و ECM الأصلية. وقد درست النماذج السابقة لأنظمة الثقافات المشتركة كيف تؤثر هذه العناصر المختلفة الفردية للبيئة السترومية على السرطان. كما ASCs و adipocytes على حد سواء تؤثر على التقدم قبل الميلاد يمكن أن يكون معقدا لتحديد نوع الخلية التي هي المسؤولة عن التأثير على قبل الميلاد. ومع ذلك، يمكن تحديد ذلك عن طريق مقارنة BC-MPS بنماذج الثقافة المشتركة الأبسط مع نوع خلية واحدة. واحدة من مزايا هذا النظام مقارنة على رقاقة أو أنظمة الطباعة الحيوية هو أنه لا توجد حاجة إلى معدات خاصة لإعداد النظام وراء لوحات المغلفة pNIPAAm التي تتوفر تجاريا. وقد وصفت النظم النموذجية لأنسجة الثدي سابقا باستخدام الطباعة الحيوية لإيداع ASCs في السقالات التي يتم تمييزها بعد ذلك في الثقافة22. وهذا يتطلب 2-3 أسابيع إضافية للخلايا للتمييز و ASCs المتمايزة في الثقافة لا تفرق تماما إلى الخلايا الدهنية الناضجة. الخلايا الدهنية الناضجة من HBT في BC-MPS جاهزة لاستخدامها لحظة إزالتها من المريض.

النظام النموذجي الموصوف هنا هو نظام مفيد لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية والبيئة الدقيقة ، ومع ذلك ، فإنه لديه بعض القيود. أحد القيود الرئيسية هو توافر أنسجة الثدي البشرية الأولية. لا يمكن الحصول على الأنسجة الدهنية البشرية cryopreserved دون فقدان مقومات البقاء وبالتالي فإن الأنسجة المستخدمة لصنع BC-MPS يحتاج إلى الحصول عليها حديثا واستخدامها37. وهناك قيد آخر هو أن النموذج كما هو معروض هنا هو نظام ثابت يتم استزراعه في 6 لوحات آبار منتظمة. يفتقر النظام إلى التدفق الدقيق الذي يوجد في الأعضاء على رقاقة والتي يمكن أن تؤثر على توافر الأكسجين والمغذيات ، والإجهاد المطلق ، وتوزيع الأدوية38،39. القيد الثالث هو الحاجة إلى فصل الخلايا عن بعضها البعض في نهاية التجربة إذا كانت أنواع الخلايا المختلفة تحتاج إلى تحليل فردي. وهذا يتطلب الحاجة إلى تسمية الخلايا بحيث يمكن فصلها عن بعضها البعض.

دمج العديد من عناصر البيئة الدقيقة الورم تنتج نموذجا الفسيولوجية لدراسة تطور السرطان وبدء الانبثاث. بالإضافة إلى القدرة على دراسة الخلايا السرطانية في نموذج أكثر فسيولوجية ، يمكن أيضا استخدام BC-MPS لدراسة العناصر الفردية للبيئة الدقيقة وكيف تتأثر بالسرطان. في حين أن البيانات الممثلة هنا توضح كيف يمكن استخدام BC-MPS مع خط خلية واحد ، يمكن تكييف BC-MPS بسهولة لتناسب الحاجة التجريبية الخاصة للباحث. على سبيل المثال، يمكن مقارنة HBT السمنة إلى HBT العجاف لتحديد كيفية تأثير السمنة على الانبثاث السرطان والتقدم. يمكن زرع أنواع فرعية مختلفة من BC في BC-MPS لدراسة كيفية تفاعل الأنواع الفرعية للسرطان بشكل مختلف مع البيئة الدقيقة. يمكن استخدام تقنيات تحرير الجينات لتحديد كيفية تأثير جينات محددة على التفاعل بين BC والبيئة الدقيقة. هذا النموذج وتطبيقاته سوف تسمح لفهم أكثر دقة لكيفية بيئة سترومال وسرطان الثدي التفاعل لتعزيز تطور السرطان والانبثاث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgments

نود أن نشكر تولين تدفق قياس الخلايا وخلية الفرز الأساسية وكذلك تولين الأنسجة الأساسية لدعمهم التقني. تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الجنوبية الشرقية للجراحين التجميليين والترميميين 2019 منحة بحثية والمؤسسة الوطنية للعلوم (EPSCoR Track 2 RII، OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020).
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 170، سرطان الثدي، النظام الفيزيائي الدقيق، أنسجة الثدي البشرية، الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية، الثقافة الأولية، تطوير الأدوية، الحديث الأيضي
نمذجة سرطان الثدي في أنسجة الثدي البشرية باستخدام نظام الفيزيولوجيا الدقيقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. M., Hebert, K. L.,… More

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter