Summary
このプロトコルは、貯蔵材料を使った原発性ヒト乳房組織を用いて乳癌を研究するためのインビトロ微小生理学的システムの構築を記述する。
Abstract
乳癌(BC)は依然として女性の主要な死因である。BCの研究に年間7億ドル以上が投資されているにもかかわらず、BC候補薬の97%が臨床試験に失敗しています。したがって、病気の理解を深めるために新しいモデルが必要です。NIHの微生理学的システム(MPS)プログラムは、基礎科学の発見の臨床翻訳を改善し、新しい治療戦略を有望にするために開発されました。ここでは、乳癌(BC-MPS)のMPSを生成する方法を提示する。このモデルは、脂肪由来幹細胞シート(ASC)sの間にWATを挟み込み、ヒト一次脂肪組織(WAT)を培養するという先に説明したアプローチを適応させる。BC-MPSの新しい側面には、BC細胞を非疾患ヒト乳房組織(HBT)に播種し、天然の細胞外マトリックス、成熟した腺細胞、常駐線維芽細胞、免疫細胞を含む。HBT由来ASCシート間でBC-HBT混和剤を挟み込む。得られたBC-MPSは、少なくとも14日間の培養ex vivoにおいて安定である。このモデルシステムは、アディポサイト、間質細胞、免疫細胞、および細胞外マトリックスを含むBCに影響を与える微小環境の複数の要素を含む。したがって、BC-MPSは、BCとその微小環境との相互作用を研究するために使用することができる。
我々は、癌の進行と転移に影響を及ぼすと知られている2つのBC行動を研究することによって、BC-MPSの利点を実証する:1)BC運動性および2)BC-HBT代謝クロストーク。BC運動は以前、生体内イメージングを用いて実証されていましたが、BC-MPSでは数日間にわたって蛍光顕微鏡を用いた高分解能のタイムラプスイメージングが可能です。さらに、代謝クロストークは、BC細胞と未熟なアディポサイトに分化したマウス前アディポサイトを使用して以前に実証されましたが、BC-MPSモデルは、初代ヒト乳腺細胞とBC細胞の間でこのクロストークを実証した最初のシステムです。
Introduction
毎年、40,000人以上の米国の女性が乳癌(BC)1で死亡しています。BCの研究に年間7億ドル以上が投資されているにもかかわらず、BC候補薬の97%が臨床試験2,3に失敗しています。医薬品開発パイプラインとBCの理解を深めるためには、新しいモデルが必要です。NIHマイクロ生理学(MPS)プログラムは、基礎科学を臨床成功に翻訳するための画期的なモデルに必要な機能を説明しました 4.これらには、ヒトの原発性細胞または組織の使用、4週間の培養における安定、およびネイティブ組織アーキテクチャおよび生理学的応答の包含が含まれていた。
BC細胞株の2次元培養、膜挿入共培養、三次元スフェロイドおよびオルガノイドなどの現在のインビトロBCモデルは、いずれも在来乳房組織アーキテクチャを再現しないため、NIHのMPS基準を満たしていない。細胞外マトリックス(ECM)がこれらのシステムに添加されると、乳房ECMは使用されません。代わりに、コラーゲンゲルと原膜マトリックスが使用されます。
患者由来異種移植片(PDX)などの生体外システムの電流は、同様に、マウス乳腺組織がヒトの乳房と大きく異なるため、NIHのMPS基準を満たしていない。さらに、免疫系とBCの相互作用は腫瘍の発症の鍵としてますます認識されているが、PDX腫瘍を発生させる免疫不全マウスモデルは成熟したT細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞を欠いている。さらに、PDXは原発性乳房腫瘍を維持および拡張することを可能にするが、得られたPDX腫瘍は原発性マウス間質細胞およびECM5とに浸潤される。
これらの課題を克服するために、我々はNIH MPS基準を満たす新しい、ex vivo、3次元の人間の乳房MPSを開発しました。私たちの乳房MPSの基礎は、脂肪由来幹細胞(ASC)の2枚のシートの間に原発性ヒト乳房組織(HBT)を挟み込み、HBTからも分離することによって作られる(図1)。HBTを挟むためにセルシートを移すプランジャーは、3Dプリントまたはシンプルなアクリルプラスチックから作ることができます(図1H、I)。この技術は、原発性ヒト白色椎細胞組織6,7を培養するための先に述べたアプローチを適応させる。乳房MPSは、標準的なBC細胞株から原発性ヒト乳房腫瘍に至るまで、選択したBCモデルによって播種することができる。ここでは、これらのBC-MPSが数週間培養中安定していることを示します(図2)。乳腺腺細胞、ECM、内皮、免疫細胞などのHBTのネイティブ要素が含まれます (図 3);代謝クロストークなどのBCとHBTの生理学的相互作用を再現する(図4)。最後に、BC-MPSがHBT全体のBC細胞のアメーバ運動の研究を可能にすることを示す(図5)。
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Protocol
すべてのヒト組織は、LSUHSCの機関審査委員会事務所によって承認されたプロトコル#9189に従って収集された。
1. 脂肪由来幹細胞(ASC)の細胞シートの播種
- 商業ソースからASCを購入するか、確立されたプロトコル8、9に従うことによって、原発性ヒト乳房組織から分離する。人間の乳房ASCを70%密度(約80,000細胞/cm2表面積)で、10%のウシ胎児血清を添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の6ウェル標準組織培養プレートに、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(BC-MPSメディア)を添加します。セルシートの形成に使用するASCが、通過10より小さくなるようにしてください。
- 発生する乳がん微小生理学的システム(BC-MPS)の各ウェルについて、1つの標準的な組織培養井戸の種子細胞と同様の大きさの1つのポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(pNIPAAm)コーティングされた組織培養プラスチックプレート。BC-MPSの1つの6ウェルプレートは、1つの標準的な組織培養6ウェルプレート(底)と1つのpNIPAAmコーティングプレート(上)を必要とする。pNIPAAmプレートは、市販のソースから購入することも、ラボ内10、11、12をコーティングすることもできます。
- 培養ASCは、37°Cおよび5%CO2で組織培養インキュベーター中に含まれる。バイオセーフティキャビネットで2~3日ごとにメディアを交換してください。
- ASCが100%コンフルエントになるまで培養し、線状のパターンを形成します。彼らが播種された合流点に応じて、これは7-10日かかります。コンフルエント細胞シートは浮力脂肪乳房組織を固定するために必要とされる。
2. BC-MPSに必要な補給品の準備
- 6ウェルプレート用のゼラチンを調製するには、蒸留したH2Oで12%ゼラチン溶液を作り、ゼラチンタイプB(ゲル強度は〜225ブルーム)と125mLのH2Oを250mLガラス培地ボトルに混ぜます。1 M NaOH の 1.6 mL を溶液に加えるし、pH を中和します。
- 25分間液体サイクル下で溶液をオートクレーブし、溶液を殺菌します。
- 溶液を37°Cに冷却します。 滅菌バイオセーフティキャビネットでは、溶液に16mLの無菌10xハンクスバランス塩溶液(HBSS)を加え、160mLの最終容積を得る。
注:ゼラチン溶液はすぐに使用するか、または後で使用するために室温で保存することができます。調製したゼラチンは室温で1ヶ月間安定である。ほんの数個のプランジャーが必要な場合、10 mL溶液を作り、前述の7のようにBC-MPSを作るのと同じ日に無菌でフィルタリングすることができます。- フィルター滅菌法でゼラチン溶液を調製するには、10x HBSSの1mLを9 mLのH2Oで希釈し、15 mLの円錐管に1x HBSS溶液を作製した。10 mL チューブに 1 M NaOH の 100 μL を加え、0.7 g のゼラチンを溶液に加えます。ゼラチンを溶解するために溶液を激しく混ぜる。
- 75°Cの水浴でチューブを5分ごとに20分間振ってインキュベートします。ゼラチン溶液をフィルター処理するには、10 mLシリンジと0.22 μmのシリンジフィルターを使用します。バイオセーフティキャビネットのプランジャーにゼラチン溶液を直接フィルターします。
- 3Dプリントまたは簡単なアクリルを使用して、セルシートを転送するために使用されるプランジャーを作ります。プランジャーが望ましいサイズの井戸にゆるやかに収まることを確認してください。標準の 3D 印刷プランジャを図 1に示します。プランジャーはTinkerCadのような標準的なコンピュータ支援設計ソフトウェアを使用して設計することができ、ポリ乳酸(PLA)13、14と互換性のあるフィラメント3Dプリンタを使用して印刷される。
- プランジャーを保持するためのラックを準備するには、バイオセーフティキャビネットに15 mLチューブラックを置きます。プランジャーの底面が上向きになるように、プランジャーをラックに逆さまに置きます。BC-MPSを輸送するための蓋付きのプラスチック製の箱をバイオセーフティキャビネットに入れます。箱はBC-MPSの4つの版に合うために少なくとも35.5 cmの長さx 28 cmの幅x8.25 cmの高さであることを推薦する。箱から蓋を外し、ラック、プランジャー、および70%のEtOHでボックスを吹き付けます。
- 無菌カミソリの刃と鉗子をオートクレーブするか、バイオセーフティキャビネットに入れて70%のEtOHで洗浄して準備します。
- 70%のEtOHでプランジャーとボックスをスプレーし、少なくとも30分間バイオセーフティキャビネットのUVライトをオンにして消耗品を殺菌します。
3. ゼラチンプランジャーを準備し、上のセルシートに適用
- ゼラチン溶液をあらかじめ調製した場合は、それを37°Cの水浴で加熱して溶融させる。
- 5 mL または 10 mL 血清ピペットを使用して、バイオセーフティ キャビネット内のプランジャーにゼラチン溶液をピペットします。6ウェルプレートの1ウェル用プランジャーは、ゼラチンの〜2.5 mLを必要とします。
- ゼラチンがプランジャー(〜30〜45分)で固まったら、pNIPAAmコーティングされたASCプレートをバイオセーフティキャビネットに移動させます。ゼラチンがASCに接触するように、pNIPAAmコーティングされたASCプレートの井戸にプランジャーをそっと置きます。プランジャーに金属ワッシャー(約7.5g)を置き、ゼラチンがASC細胞シートに直接接触するようにプランジャーを計量します。ASCセルシートのプランジャーを室温で30分間放置します。
- プランジャー付きプレートをバイオセーフティキャビネットの滅菌箱にそっと動かし、蓋をします。箱を4°Cの冷蔵庫に30分間移動します。4°Cの冷蔵庫が利用できない場合は、30分間のバイオセーフティキャビネットのアイスバケツに氷の上にプレートを置きます。
4. がん細胞株の調製
- 標準的なT75組織培養皿に癌細胞株を播種し、BC-MPSが処理される日に約80%コンフルエントになるように培養しておきます。(BC-MPS当たり20万個のがん細胞が必要になります)。正常な培地で癌細胞を成長させます。
注:がん細胞を同定して単離するには、細胞を蛍光タンパク質でトランスフェクトしてASCや乳房組織と区別することをお勧めします。BC-MPS当たりに必要ながん細胞の数は、MCF7およびMDA-MB-231細胞に対して最適化されています。他の細胞株は、さらなる最適化を必要とするかもしれない。 - BC-MPSが準備されている日に、癌細胞を含むフラスコをバイオセーフティキャビネットに移動させる。フラスコからメディアを吸引する。5 mLのPBSでフラスコを洗います。
- 癌細胞を含むフラスコに1mLの細胞剥離液を加え、細胞が剥離するまでフラスコを37°Cインキュベーターでインキュベートする(〜2〜5分)。
- バイオセーフティキャビネットでは、9 mLのPBSをフラスコに加え、PBS内の細胞を15 mL円錐管に移し、ヘモサイトメーターを使用して細胞数を数えます。
- 癌細胞を室温で5分間500xgで遠心分離する。
- 2 x 106 個のセル/mL が存在するように、BC-MPS メディアのセルを再中断します。
- 癌細胞を37°Cの水浴に入れ、ヒト組織に加える準備が整うまで入れます。
5. ヒト乳房組織の加工
- バイオセーフティキャビネットでは、ヒト乳房組織(HBT)3xを10 mLの無菌PBSで洗浄します。
- 無菌鉗子とカミソリの刃を使用してBC-MPSを粗くミンチし、できるだけ多くの筋膜および結合組織を除去してみてください。結合組織を除去しないと、HBTを適切に固定しないASC上層が生じる可能性があります。
注:鼻隠しおよび結合組織は脂肪組織の黄色と比較して白または明確な外観によって識別することができる。 - 結合組織が除去されたら、滅菌カミソリの刃を使用して、均質な液体の一貫性がなくなるまで組織を細かくミンチします。組織は、25 mLの血清学的先端を使用して容易にピペット加工できる場合に細かく細かく刻む。
- 滅菌カミソリの刃を使用して、p1000ピペットチップの先端を切り落とし、ひき肉HBTをピペット化するのを助けます。
- 1.5 mLチューブでは、細かく入ったHBT、がん細胞株、およびBC-MPS培地(6ウェルプレートの1ウェルに対して、200μLの細切りHBT、100μLのBC-MPS培地、100μLの癌細胞)を混合します。
- 下部セルシートに使用する ASC プレートをインキュベーターからバイオセーフティ キャビネットに移動します。下部ASCプレートからメディアを吸引します。ステップ5.4から遠位端を切り取ったp1000ピペットチップを使用して、底ASCプレートのウェルの中央に混合物をピペット
- 上部のASCプレートを含むボックスを、プランジャーを置いてバイオセーフティキャビネットに移動します。pNIPAAmコーティングプレートからゼラチンプランジャーを静かに取り出し、HBT混合物の上に置きます。ウェルにBC-MPSメディアを追加します(6ウェルプレートの1ウェルに2mLのメディアを追加します)。BC-MPS混合物とプランジャーを含む底のASCプレートを滅菌プラスチックボックスに慎重に移動させ、箱の蓋を入れ、輸送します。
注:6ウェルプレートの蓋は、プランジャーがオンになっている間はASCプレートに戻りません。文化を汚染しないように注意する必要があります。 - ゼラチンが溶けるまで37°Cで箱の中の底板をインキュベーターにインキュベートし、最上のASC層が底層に付着し始めた(〜30分)。
- プレート付きのボックスをバイオセーフティキャビネットに移動します。下のプレートからプランジャーをそっと取り出します。癌細胞を有する組織は、井戸の底に固定されます。
- 6ウェルプレートの蓋を底板に戻し、37°Cでインキュベートしてゼラチンを完全に溶融させ、最上層を底層に完全に固定させます(〜30〜60分)。
- プレートをバイオセーフティキャビネットにそっと移動し、10 mL血清ピペットでメディアを吸引します。各井戸に新鮮なメディアの2 mLを追加します。組織を取り除かないように、井戸とピペットの端から井戸の端に吸引する。
- BC-MPSを37°C、5%CO2で所望の時間を維持し、2〜3日ごとにメディアを交換してください。
6. 分析のためのBC-MPSの消化
- BC-MPSを分析する準備ができたら、プレートをバイオセーフティキャビネットに移動します。セロロジカルピペットでメディアを除去し、偶発的な組織の脱外を避けます。
- 各井戸にPBSの1ボリュームを追加します。
- 血清ピペットでPBSを取り出します。
- 各ウェルに細胞の解離液の1 mLを追加します。プレートをインキュベーターに戻し、37°Cで5分間インキュベートし、細胞を取り外します。バイオセーフティキャビネットでは、細胞スクレーパーを使用して、細胞と組織を培養プレートから完全に取り外します。
- 血清ピペットを使用して、組織と溶液を15 mLの円錐管に移します。各ウェルに2 mLのPBSを加えて、残りの細胞を収集し、この溶液を円錐管に移します。細胞が蛍光である場合は、チューブをアルミニウム箔で包み、光から保護します。
- 1 x g の軌道シェーカーで一定の撹拌の下で 37 °C でチューブをインキュベートし、細胞を組織から完全に解離します。
- バイオセーフティキャビネットでは、血清学的ピペットを使用してチューブ内の残りの細胞塊を破壊し、250 μmの組織ストレーナーを通してサンプルを新しい15 mLチューブにフィルターします。それがオーバーフローしないように、ストレーナーを通してゆっくりと溶液をピペット。
- ストレーナーを1 mL PBSでリンスし、ストレーナーに残っている細胞を採取します。
- 室温で500 x g でサンプルを5分間遠心する。遠心分離後、アディポサイトは溶液の最上層に浮遊し、癌細胞とASCはチューブの下部のペレットに一緒に混合されます。
- アディポサイトを分離するには、新しいチューブに最上層を静かに注ぐか、代わりにp1000ピペットチップから先端を切断し、上層を新しいチューブに移します。500 x g でサンプルを 5 分間遠心分離し、シリンジと針を使用して、アディポサイトの下から溶液を除去し、アディポサイトのみが残るようにします。アディポサイトは分析の準備が整いました
- 溶液からアディポサイトを除去した後、癌細胞が以前に蛍光タンパク質でトランスフェクションされた場合、ASCと癌細胞を互いに分離して分析する。細胞ペレットを破壊することなく、ASCおよび癌細胞を含むチューブから残りの溶液を吸引する。PBSまたはBC-MPS培地中のペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーを使用して蛍光に基づいて細胞を選別します。
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Representative Results
培養の安定性
BC-MPSは、少なくとも14日間インビトロで培養することができる安定した微生理学的システムである。ASC細胞シートの明視野画像を100倍倍で撮影し、コンフルエントシートの線状パターンを表示した(図2A)。ASC細胞シートは、少なくとも4週間培養において安定である。6ウェルプレートの1ウェルで培養した14日でのBC-MPSは、浮力HBTが14日後にASC細胞シートによって引き続きウェルの底部に安定して固定されていることを示すカラーカメラで画像化した(図2B)。これは、脂肪組織を挟むために使用される細胞シートがまだそのままであることを示しています。RFPを発現するトリプルネガティブBC細胞株MDA-MB-231をHBTで14日間培養し、その後、細胞株を出したBC-MPSの安定性を少なくとも14日間に示す蛍光顕微鏡でイメージングした(図2C)。組織中のBC細胞の存在は、HBTに侵入する癌細胞の能力を示す。トリプルネガティブPDX外植をマウスから切除し、細胞トラッカーCMTPXで染色し、HBTで培養した。蛍光顕微鏡画像は、腫瘍外植を有するBC-MPSの安定性を少なくとも6日間示すために6日目に撮影した(図2D)。これは、BC-MPSが細胞株だけでなくHBTを有する腫瘍外植物を培養するために使用できることを示している。
ネイティブ HBT 要素
BC-MPS には、文化における HBT のネイティブ要素が含まれています。100mgのHBTを含むBC-MPSを14日間インビトロで培養した。培養で14日後に明視野顕微鏡を用いて組織を画像化した(図3A)。この画像は、培養中の14日間で成熟したアディポサイトのクラスターを保存する例である。その後、組織を10%ホルマリン、パラフィン埋め込み、ミクロトームを用いて5μmで切片し、標準プロトコルを使用してMovatsペンタクロム染色で染色した。固定セクションは、100x (図3B)または 20x (図 3C)でイメージ化されました。この画像は、BC-MPSに天然コラーゲン(紫色)、網状繊維(青)が含まれていることを示し、結合組織の間に大きな単球形状が培養中の14日で保存されることを示している。システム内の主要なマクロファージを同定するために、HBTを0、3および7日間培養し、次いで、抗CD45、抗CD68、および抗CD206で固定および染色した。CD45は、一般的な白血球識別子として使用された。CD68はマクロファージを同定するために単球染色体として使用され、CD206はマクロファージ上に存在する共通の受容体を同定する。マクロファージマーカーの染色を撮像ソフトウェアを用いて定量した(図3D)。これは、培養3日および7日後の主要なマクロファージの保存を示す。これらのデータは、BC-MPS が文化における HBT のネイティブ要素を保持することを示しています。さらに実験を行い、BC細胞がHBTの天然元素をどのように改造するかを研究することができる。これには、マクロファージマーカーの変化を評価して、BC細胞の存在によって変化しているかどうかを判断することが含まれます。ECMの変化は、BC細胞の有無にかかわらず培養したサンプルのMovatsペンタクロム染色を比較して、コラーゲン含有量が変化したかどうかを判断し、画像Jなどの画像分析ソフトウェアを使用してBC細胞がアディポサイトサイズを変化させるかどうかを判断することによってさらに分析することができる。
代謝クロストーク
アディポサイト癌代謝クロストークは、腫瘍微小環境がBCの進行に影響を与える重要な経路である。細胞内脂質を蓄積するBC細胞は、薬剤耐性の増加と、より侵襲的な表現型15を示す。BC細胞は未熟なマウス脂肪細胞で脂肪分解を誘導することが示されているが、BCと原発性ヒト乳腺脂肪細胞との間の代謝クロストークは一度も示されていないため、この生理学的関連性は不明のままである。BC-MPSがこのアディポサイト-BC代謝クロストークRFP標識MDA-MB-231細胞を14日間単独またはBC-MPSで培養できることを実証した。細胞を単一細胞懸濁液に酵素的に消化し、中性脂質染料をボディーピーで染色し、フローサイトメトリー(図4A、B)16で分析した。脂質陽性MDA-MB-231細胞の割合は、BC-MPS対2D培養において26.2倍SEM+/- 2.5大きかった(図4C)。この脂質染色の増加は、癌細胞が脂肪細胞と相互作用し、成熟脂肪細胞から放出される脂質を取り上げることを示している。RFP+ Bodipy+ 細胞を選択するために細胞の並べ替えを行った。選別後、細胞をコラーゲンにメッキし、ガラスカバーリップをコーティングし、一晩取り付けた。翌日、細胞を4%パラホルムアルデヒドで30分間固定し、100倍の倍率で蛍光顕微鏡で画像化した。BC-MPで培養した細胞(図4E)は、標準2D培養で培養した細胞と比較して増加した脂質滴を示した(図4D)。これは、BC細胞とHBTの間の代謝クロストークを示し、また、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法によって脂質蓄積を分析する方法を示しています。癌細胞における脂質蓄積のさらなる分析は、細胞当たりの脂質滴の大きさおよび脂質滴の数を定量することによって行うことができる。
アメーバ運動
BC細胞とアディポサイトとの代謝クロストークは、癌の侵襲的能力を増加させる。HBTを用いて培養した癌細胞の浸潤能の増加を評価するために、HBT全体を通してBC細胞の移行を蛍光顕微鏡で評価した。RPFを発現する転移性TNBC細胞株MDA-MB-231を、システムが安定化できるようにBC-MPSで4日間培養した。タイムラプス蛍光顕微鏡は、37°Cおよび5%CO2で19時間毎に20分間撮影された1つの画像でMDA-MB-231運動性を画像化するために4日後に行った。得られたビデオは、MDA-MB-231細胞のアメーバ運動パターンと驚くほど高い運動性を示した(図5およびビデオ1)。これは、BC細胞の侵襲的能力の増加とBC細胞がHBTに侵入する能力を示す。HBTにおけるBC細胞の移動は、移動セル17,18の速度と方向性を定量化するために、以前に公開された方法を用いてさらに分析することができる。MDA-MB-231細胞は、有糸分裂を起するように見えることも観察された。これらの行動は、その積極的な表現型と一致し、癌の進行および転移に対する重要な行動であり、BC療法の標的となり得る新しいBC行動を強調する。
図1: BC-MPS セットアップの一般的なワークフロー(A)ゼラチンは直立プランジャーで固化する。(B)ゼラチンを入れたプランジャーを、熱応答性の上部 ASC 細胞シートに置く。(C)細胞が室温で30分間インキュベートし、その後4°Cでインキュベートを30分間培養しながら、細胞シートとの接触を維持するために重みが使用されます。(E)上段セルシート付きプランジャーを、下部セルシートとひきHBTおよびBC細胞を含む皿に移す。(F)培地、プランジャー、HBT、BCおよび両方のセルシートを含む底セル皿を37°Cで30〜60分間インキュベートし、ゼラチンを溶融させ、細胞シートを接触から接触まで引き出す。(G)プランジャーの除去は、HBTとBCを2つのASC細胞シートの間に挟まれたままにする。3Dプリントプランジャーは、無料のオンラインソフトウェアTinkerCad(https://www.tinkercad.com/)を使用して設計され、3Dプリンタで印刷されました。プランジャーはポリ乳酸で構成されています。(H)6ウェルプレートの1ウェルのプランジャーの寸法が示されている。プランジャの凹部は2.5mm(I)実際の3Dプリントプランジャーの画像が示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:培養におけるBC-MPSの代表的な安定性(A)コンフルエント細胞の線条体パターンを示すコンフルエントASCの100倍倍の明視野画像。スケールバー=100μm(B)BC-MPSは、100mgのHBTを含み、6ウェルプレートで培養した。14日後に、HBTが6ウェルプレートの底に固定されていることを実証するためにカラー写真が撮影されました。(C)RFPを発現するトリプルネガティブBC細胞株MDA-MB-231をHBTで14日間培養し、40倍倍で蛍光顕微鏡を用いて画像化した。この画像は、MDA-MB-231細胞がまだHBTで生存可能であり、増殖していることを示しています。スケールバー=200μm D)マウス由来のトリプルネガティブ乳癌のPDX腫瘍を3cm2個に細かく刻み、細胞トラッカーRed CMPTXで標識した。この断片をHBTで培養し、得られたBC-MPSを、培養におけるその安定性を示す6日目に40倍の倍率で蛍光顕微鏡を用いて画像化した。スケールバー= 200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:BC-MPSに存在するHBTのネイティブ要素の代表的な保存BC-MPSは14日間培養され、40倍(A)で明視野顕微鏡で画像化し、10%ホルマリンで固定し、モバツペンタクロム染色で染色した。画像は100x(B)または20x(C)で撮影された。HBTのイメージングは、一緒に集積した大きな単葉積分植物の保存を示し、組織スライスは、葉類細胞(青色)の間のコラーゲン(黄色)および網状繊維などの天然ECMの保存の存在を示す。モデルHBTにおけるマクロファージの保存を実証するために、0、3、または7日間培養し、マクロファージマーカーに染色し、共焦点顕微鏡(D)を用いて画像化した。マクロファージマーカーの染色の蛍光強度を、培養中の3日および7日後に組織にマクロファージが依然として存在することを示す市販のソフトウェアを用いて定量した。スケールバー= 200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:BC-MPSにおけるアディポサイトと癌細胞の間の代表的な代謝クロストークRFP標識MDA-MB-231細胞をBC-MPS対2Dで14日間培養し、次いでBodipy(250 nM)で染色し、フローサイトメトリーで分析した。(A)2D培養で14日後にボディ染色MDA-MB-231細胞の流動。B2の細胞はボディーピー+RFP+であった。B1の細胞はボディピーだった-RFP+.B2/(B1+B2)=3.26%、最小脂質蓄積を示す。(B) BC-MPSで14日後にボディピ染色MDA-MB-231細胞のフローサイトメトリー分析を行う。B2/(B1+B2)=85.35%、広範な脂質蓄積を示す。(C) 2D培養で14日後のMDA-MB-231細胞における脂質蓄積とBC-MPSの間での蓄積2D(D)対BC-MPS(E)で培養したMDA-MB-231のボディピシー染色の蛍光顕微鏡分析は、BC-MPSで増殖した細胞における脂質蓄積の増加を示す。誤差範囲が示された SEM. ** p < 0.01, n=2 生物学的複製, スケールバー = 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:BC-MPSにおけるTNBCの代表的な移行 RFP標識MDA-MB-231細胞をBC-MPSで4日間培養し、次いでRFP標識BC-MPS+ MDA-MB-231細胞の逐次タイムラプス画像を蛍光顕微鏡を用いて捕捉した(60分あたり1フレーム、100倍倍)。黄色のアスタリスク = 有糸分裂性イベント。黄色のボックス = 位置参照に使用される細胞の破片。青い矢印=231細胞は、擬似ポッドと高い運動性を有するアメーバ運動を示す。スケールバー= 100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ 1: BC-MPS における TNBC の代表的な移行。 RFP標識MDA-MB-231細胞を含むBC-MPSを4日間培養し、蛍光顕微鏡を用いて、37°Cおよび5%CO2で19時間毎に20分毎に細胞を画像化した。 画像はビデオにまとめられました(60分に1フレーム、100倍の倍率)。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
ヒト乳癌をモデル化するための新しいシステムは、この疾患のより良い理解を開発するために必要とされる。ネイティブECMおよび間質細胞を含む疾患設定をモデル化するヒト微小生理学的システムの開発は、前臨床試験の予測力を高める。ここで示すBC-MPSモデルは、以前のモデルの限界を克服し、ネイティブHBT環境でのBCの評価を可能にする新開発のシステムです。このシステムは癌細胞株または腫瘍の外植物と共に使用することができ、少なくとも14日間は、細胞の細胞を刺傷する。BC細胞に蛍光標識することで、リアルタイムで、リアルタイムまたは特定の時点で、癌細胞運動性および細胞間相互作用、移動、生存率、または増殖をリアルタイムで可視化することが可能になる(図3 および 図5)。このモデルシステムは、がん細胞とそれらの微小環境との相互作用に関連するがん生物学に関する重要な側面を解明するために使用することができる。このシステムの尋問は、TMEの癌進行、薬物反応、および転移の開始をTMEに通知することができる。
システムを正常にセットアップするには、いくつかの重要な手順に従う必要があります。最初の重要なステップは、ASC細胞シートの培養と移送です。pNIPAAmコーティングされた版は温度感受性である。プレートが32°Cを超えると表面は疎水性であり、ASCは表面に付着します。表面はこの温度より下の親水性になり、細胞は19を取り外し始める。したがって、特定のセルタイプがこれらのサーフェスからどれだけ早くデタッチを開始するかを決定する必要があります。HBT由来のASCの場合、細胞がコンフルエントである場合、これは>30分かかります。通常のメンテナンス中に細胞が剥離するのを防ぐために、培地は37°Cに予温し、組織培養プレートはプレートが冷却され、細胞が剥離するのを防ぐために、あまりにも長い間室温で保たれるべきではありません。また、ゼラチンプランジャーがpNIPAAmコーティングプレート上に配置して細胞シート全体を移送するのに最適な時間を決定することも重要です。ASC はコンフルエントである必要があり、シート全体を転送する必要があります。トップセルシートが完全に剥離し、ゼラチンに結合する時間がない場合、セルシートは、転送中に破損します。細胞シート全体が完全に転がっていない場合、ASCは浮力のある乳房組織を挟むことができなくなる。
HBTを挟み込むために使用されるASCは、ECM、成長因子、およびBC20に影響を与えるサイトカインを分泌する乳房微小環境の正常な間質細胞である。2つの細胞シート間にHBTを挟むために、ASCシートは、熱応答性組織培養プレートを使用して移管される。これにより、ASCによって分泌されるネイティブECMがそのままであることが可能になり、浮力状のアディポサイトを組織に固定するのに役立ちます。ヒト乳房組織由来のASCを用いることで、異なる拠点からのASCが異なる遺伝子発現およびECMリモデリング21を表示するので、ASCが癌細胞との相互作用を乳癌で起こることを模倣することを保証する。
2 番目の重要なステップは HBT の処理です。組織の生存率を維持するために、新たに単離されたHBTを使用する必要があります。HBTを処理する際には、組織を細かくミンチし、できるだけ多くの筋膜を取り除く必要があります。大きな筋膜がHBTに残っている場合、細胞シートが浮力組織を適切に固定するのを防ぎます。さらに、組織に残された筋膜はプレートから解離することができ、HBTの複数のクラスターを引っ張り、さらなる実験のために十分に使用できなくなる。HBTは、トップセルシートを追加する前にウェルの真ん中に配置する必要があり、そうでなければASCはHBTを十分に挟むことができず、ウェルの端にある組織は固定されません。これらの重要な手順に従えば、BC-MPSを生産するプロセスは、セットアップに簡単に進みます。
ここで詳述するモデルは、成熟したアディポ細胞、ECM、および常駐免疫細胞を保持する一次HBTの自然微小環境におけるBCを研究するための改良されたシステムである(図4)。脂肪微小環境を模倣する前臨床モデルは、成熟脂肪細胞、免疫細胞、線維芽細胞、およびECMのような微小環境の複数の要素を欠いている。完全成熟したHBTを使用すると、パラクリンおよびジュスタクリンシグナリング22、23、24、25を介して癌の発達、薬物応答、および侵襲性に影響を与える複数の要素を含むこの複雑な環境の同時および相互的な尋問を可能にする。生体線維芽細胞およびASCは、組織におけるECMのリモデリングおよびパラクリンシグナル伝達26,27を通じて癌転移に影響を及ぼす。ECMとその改造は転移の開始に不可欠である。腫瘍微小環境のECMにおける変化はBCの移行および転移に影響を及ぼすが、ほとんどのBC研究はネイティブECMを研究に組み込まず、代わりにコラーゲンIまたはマトリゲル28,29からなる簡素モデルを使用する。BC-MPS の ECM は、HBT から、および ASC から取得されます。従って、ネイティブECMが乳房組織における腫瘍微小環境で再モデル化され、転移に影響を及ぼす方法を検討することができる。従って、このBC-MPSモデルは、以前のモデルシステムになかった腫瘍微小環境の複数の要素を組み込む。
このモデルは、完全に成熟したアディポサイトとBC細胞の間の代謝クロストークを研究するために使用することができます。アディポサイトと癌細胞の相互作用を研究する以前のモデルは、インビトロで分化された前のアディポサイトを使用しています。インビトロで分化された前のアディポサイトは、生体内30,31で分化したアディポサイトと同程度に完全に成熟しない。アディポサイトが癌の進行と薬物反応にどのように影響するかを理解するには、天然のアディポサイトの複雑な分子および化学組成を適切に模倣することが重要です。ここでは、我々のシステムが、アディポサイトとBC細胞の間で起こる代謝クロストークを評価することを可能にすることを実証した(図4)。
BC-MPSはまた、標準的な細胞株を使用して適切にモデル化することができない肥満などの状態が癌の進行にどのような影響を与えるかについて、インビトロ研究を行う際にも使用できます。肥満は、HBTの微小環境の変化とBCにおける転移の増加に関連しているが、正確なメカニズムは完全には理解されていないが、32、33、34。線維芽細胞、ASC、アディポサイトおよびECMは肥満の間に変化し、癌25、35、36の進行および転移をさらに促進する。したがって、肥満組織の天然の間質細胞およびECMを使用して、これらの変質がBCに及ぼす影響を理解することが重要である。BC-MPSモデルの肥満または傾いた患者からのHBTおよびASCを利用することにより、肥満が転移性表現型を促進するメカニズムを解明することができる。
ここで提示される方法は、ASC、成熟したアディポサイト、およびネイティブECMを含む培養で乳癌細胞を培養するためのものである。共培養系の以前のモデルは、これらの個々の異なる成分が間質環境にどのように影響するかを研究してきた。ASCとアディポサイトの両方がBCの進行に影響を与えるため、どの細胞タイプがBCに影響を与えるのかを判断するのは複雑になる可能性があります。しかし、これは、BC-MPSを1つの細胞タイプを持つより単純な共培養モデルと比較することによって決定することができる。このシステムの利点の1つは、オンチップまたはバイオプリンティングシステムと比較して、市販されているpNIPAAmコーティングされたプレートを超えてシステムをセットアップするために特別な機器が必要な点です。乳房組織のモデルシステムは、培養22で分化された足場にASCを沈着させるためにバイオプリンティングを使用して以前に記述されている。これは、細胞が分化するためにさらに2〜3週間を必要とし、培養中に分化されたASCが成熟したアディポ細胞に完全に分化しない。BC-MPSのHBTからの成熟したアディポサイトは、患者から取り除かれた瞬間に使用する準備ができています。
ここで説明するモデルシステムは、がん細胞と微小環境とのクロストークを研究するのに有用なシステムであるが、いくつかの制限がある。主な制限の1つは、原発性ヒト乳房組織の利用可能性である。ヒト脂肪組織は生存率を失うことなく凍結保存できないため、BC-MPSを作るために使用される組織は、新たに得られ、37を使用する必要がある。ここで示すモデルは、通常の6ウェルプレートで培養される静的システムである別の制限があります。このシステムは、酸素と栄養素の可用性、完全なストレス、および薬物分布38、39に影響を与えることができる臓器オンチップに存在するマイクロ流体の流れを欠いている。3 つ目の制限は、異なる細胞タイプを個別に分析する必要がある場合に、実験の最後に細胞を分離する必要があることです。このためには、セルを互いに分離できるようにラベルを付ける必要があります。
腫瘍微小環境の多くの要素の組み込みは、癌の進行と転移の開始を研究する生理学的モデルを生成します。BC-MPSは、より生理学的なモデルでがん細胞を研究できることに加えて、微小環境の個々の要素とそれらが癌の影響を受ける方法を研究するためにも使用できます。ここに示すデータは、BC-MPSを1つの細胞株でどのように使用できるかを示していますが、BC-MPSは研究者の特定の実験的ニーズに合わせて容易に適応することができます。例えば、肥満HBTは、肥満が癌の転移および進行にどのように影響するかを決定するために、無駄のないHBTと比較することができる。BCの異なるサブタイプをBC-MPSに播種して、がんのサブタイプが微小環境とどのように相互作用するかを研究することができます。遺伝子編集技術を用いて、特定の遺伝子がBCと微小環境との相互作用に与える影響を判断することができます。このモデルとその応用は、間質環境と乳癌がどのように相互作用して癌の進行と転移を促進するかをより正確に理解することを可能にする。
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Disclosures
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
Acknowledgments
私たちは、トゥレーンフローサイトメトリーとセルソートコアだけでなく、彼らの技術サポートのためのトゥレーン神学コアに感謝したいと思います。この研究は、南東部プラスチック再建外科医協会2019研究助成金と国立科学財団(EPSCoRトラック2 RII、OIA 1632854)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
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