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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

Este protocolo descreve a construção de um sistema microfisiológico in vitro para o estudo do câncer de mama usando tecido mamário humano primário com materiais fora da prateleira.

Abstract

O câncer de mama (BC) continua sendo a principal causa de morte das mulheres. Apesar dos mais de US$ 700 milhões investidos em pesquisas do BC anualmente, 97% dos medicamentos candidatos do BC falham em testes clínicos. Portanto, novos modelos são necessários para melhorar nossa compreensão da doença. O programa NIH Microphysiological Systems (MPS) foi desenvolvido para melhorar a tradução clínica de descobertas científicas básicas e prometendo novas estratégias terapêuticas. Aqui apresentamos um método de geração de MPS para câncer de mama (BC-MPS). Este modelo adapta uma abordagem previamente descrita de tecido adiposo branco humano primário (WAT) por sanduíche wat entre folhas de células-tronco derivadas de adipose (ASC)s. Novos aspectos do nosso BC-MPS incluem a semeadura de células BC em tecido mamário humano não doente (HBT) contendo matriz extracelular nativa, adipócitos maduros, fibroblastos residentes e células imunes; e sanduíches a mistura BC-HBT entre folhas ASC derivadas do HBT. O BC-MPS resultante é estável na cultura ex vivo por pelo menos 14 dias. Este sistema de modelo contém múltiplos elementos do microambiente que influenciam o BC, incluindo adipócitos, células estromais, células imunes e a matriz extracelular. Assim, o BC-MPS pode ser usado para estudar as interações entre o BC e seu microambiente.

Demonstramos as vantagens do nosso BC-MPS ao estudar dois comportamentos bc conhecidos por influenciar a progressão do câncer e a metástase: 1) motilidade bc e 2) conversa cruzada metabólica BC-HBT. Embora a motilidade bc tenha sido anteriormente demonstrada usando imagens intravitais, o BC-MPS permite imagens de lapso de tempo de alta resolução usando microscopia de fluorescência ao longo de vários dias. Além disso, enquanto o crosstalk metabólico foi previamente demonstrado usando células BC e pré-adipócitos murinas diferenciadas em adipócitos imaturos, nosso modelo BC-MPS é o primeiro sistema a demonstrar esse crosstalk entre adipócitos mamários primários e células BC in vitro.

Introduction

Todos os anos, mais de 40.000 mulheres norte-americanas morrem de câncer de mama (BC)1. Apesar de mais de US$ 700 milhões investidos em pesquisa do BC anualmente, 97% dos medicamentos candidatos do BC reprovam os ensaios clínicos2,3. Novos modelos são necessários para melhorar o pipeline de desenvolvimento de medicamentos e nosso entendimento do BC. O Programa De Microfisiológico (MPS) do NIH delineou os recursos necessários para modelos inovadores para melhorar a tradução da ciência básica para o sucesso clínico4. Estes incluíram o uso de células ou tecidos humanos primários, estáveis na cultura por 4 semanas, e inclusão da arquitetura de tecido nativo e resposta fisiológica.

Os modelos atuais in vitro BC, como a cultura bidimensional das linhas celulares BC, a cocultura de inserção de membrana e esferoides tridimensionais e organoides, não atendem aos critérios de MPS do NIH porque nenhum desses recapitulam a arquitetura do tecido mamário nativo. Quando a matriz extracelular (ECM) é adicionada a esses sistemas, o ECM mamário não é utilizado; em vez disso, géis de colágeno e matrizes de membrana de porão são usados.

Os sistemas in vivo atuais, como os xenoenxertos derivados da paciente (PDX), da mesma forma não atendem aos critérios de MPS do NIH, pois os tecidos mamários murinas diferem muito das mamas humanas. Além disso, as interações do sistema imunológico-BC são cada vez mais reconhecidas como chave no desenvolvimento do tumor, mas os modelos de murina imunocomprometidos usados para gerar tumores PDX carecem de células T maduras, células B e células assassinas naturais. Além disso, enquanto o PDX permite que os tumores primários de mama sejam mantidos e expandidos, os tumores PDX resultantes são infiltrados com células estromais murinas primárias e ECM5.

Para superar esses desafios, desenvolvemos um mps de mama humano novo, ex vivo, tridimensional que atende aos critérios do NIH MPS. A base do mps da mama é feita por sanduíche de tecido mamário humano primário (HBT) entre duas folhas de células-tronco derivadas de adipose (ASCs), também isoladas do HBT(Figura 1). Os êmbolos para transferir as folhas de celular para sanduíche o HBT podem ser impressos em 3D ou feitos de simples plásticos acrílicos(Figura 1H,I). Esta técnica adapta nossa abordagem previamente descrita para a cultura do tecido adipócito branco humano primário6,7. A MPS mamária pode então ser semeada por um modelo de escolha BC, que vai desde linhas celulares padrão BC até tumores primários de mama humana. Aqui, mostramos que esses BC-MPS estão estáveis na cultura por várias semanas(Figura 2); incluem elementos nativos do HBT, tais como adipócitos mamários, ECM, endotélio, células imunes(Figura 3); e recapitular as interações fisiológicas entre BC e HBT, como crosstalk metabólico(Figura 4). Por fim, mostramos que o BC-MPS permite o estudo do movimento ameboide das células BC ao longo do HBT (Figura 5).

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Protocol

Todos os tecidos humanos foram coletados de acordo com o protocolo #9189 aprovados pelo Gabinete do Conselho de Revisão Institucional do LSUHSC.

1. Semeadura de Células-Tronco Derivadas de Adipose (ASCs) para folhas de células

  1. Comprar ASCs de fontes comerciais ou isolar do tecido mamário humano primário seguindo os protocolos estabelecidos8,9. ASCs de mama humana com 70% de densidade (~80.000 células/cm2 superfície) em placas de cultura de tecido padrão de 6 poços no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de soro bovino fetal, e 1% Penicillin/Streptomicina (BC-MPS Media). Certifique-se de que os ASCs a serem utilizados para formar as folhas de células devem ser inferiores à passagem 10.
    1. Para cada poço do sistema microfisiológico do câncer de mama (BC-MPS) que será gerado, células de sementes em 1 cultura de tecido padrão bem e 1 poço de tamanho semelhante em poli (N-isopropylacrylamida) (pNIPAAm)-coated tissue culture plastic plate. Uma placa de 6 poços de BC-MPS exigirá uma cultura de tecido padrão 6 placas de poço (inferior) e uma placa revestida pNIPAAm (superior). As placas pNIPAAm podem ser adquiridas de fontes comerciais ou podem ser revestidas em laboratório10,11,12.
  2. AsCs de cultura em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO2. Mude a mídia a cada 2-3 dias em um armário de biossegurança.
  3. Cultuem os ASCs até se tornarem 100% confluentes e formam um padrão estriado. Dependendo da confluência em que foram semeados, isso levará de 7 a 10 dias. As folhas de células confluentes são necessárias para ancorar o tecido mamário adiposo flutuante.

2. Preparação dos suprimentos necessários para o BC-MPS

  1. Para preparar a gelatina para placas de 6 poços faça uma solução de gelatina de 12% em H2O. Misture 19 g de gelatina tipo B (resistência ao gel de ~225 Bloom) e 125 mL de H2O em uma garrafa de mídia de vidro de 250 mL. Adicione 1,6 mL de 1 M NaOH à solução para neutralizar o pH.
  2. Autoclave a solução sob um ciclo líquido por 25 minutos para esterilizar a solução.
  3. Deixe a solução esfriar a 37 °C. Em um gabinete de biossegurança estéril adicione 16 mL de solução de sal balanceada Hanks (HBSS) para a solução para obter um volume final de 160 mL.
    NOTA: A solução de gelatina pode ser usada imediatamente ou armazenada à temperatura ambiente para uso posterior. A gelatina preparada é estável à temperatura ambiente por 1 mês. Se apenas alguns êmbolos forem necessários, então uma solução de 10 mL pode ser feita e filtrada estéril no mesmo dia que a fabricação de BC-MPS como descrito anteriormente7.
    1. Para preparar a solução de gelatina por esterilização de filtro, diluir 1 mL de HBSS 10x com 9 mL de H2O para fazer uma solução 1x HBSS em um tubo cônico de 15 mL. Adicione 100 μL de 1 M NaOH a cada tubo de 10 mL e, em seguida, adicione 0,7 g de gelatina à solução. Misture a solução vigorosamente para dissolver a gelatina.
    2. Incubar o tubo em um banho de água de 75 °C por 20 minutos tremendo a cada 5 minutos. Use uma seringa de 10 mL e um filtro de seringa de 0,22 μm para filtrar a solução de gelatina. Filtre a solução de gelatina diretamente nos êmbolos em um armário de biossegurança.
  4. Impressão 3D ou use acrílico simples para fazer os êmbolos usados para transferir as folhas de celular. Certifique-se de que os êmbolos se encaixam livremente no tamanho desejado do poço. Um êmbolo impresso 3D padrão é mostrado na Figura 1. Os desêntos podem ser projetados usando software de design auxiliado por computador padrão, como o TinkerCad e impressos usando impressoras 3D de filamento compatíveis com ácido polilático (PLA)13,14.
  5. Para preparar um rack para segurar os êmbolos coloque um rack de tubo de 15 mL em um armário de biossegurança. Coloque os êmbolos de cabeça para baixo no rack, de modo que a parte inferior dos êmbolos esteja voltada para cima. Coloque uma caixa de plástico com tampa para transportar BC-MPS no armário de biossegurança. Recomenda-se que a caixa tenha pelo menos 35,5 cm de comprimento x 28 cm de largura x 8,25 cm de altura para caber 4 placas de BC-MPS. Retire a tampa da caixa e pulverize o rack, os êmbolos e a caixa com 70% de EtOH.
  6. Prepare lâminas de barbear estéreis e fórceps autoclavando ou colocando-as em um armário de biossegurança e lavando com 70% de EtOH.
  7. Pulverize os êmbolos e a caixa com 70% de EtOH e ligue a luz UV no armário de biossegurança por pelo menos 30 minutos para esterilizar os suprimentos.

3. Prepare os despensos de gelatina e aplique nas folhas de células superiores

  1. Se a solução de gelatina foi previamente preparada, aqueça-a em um banho de água de 37 ° C para derretê-la.
  2. Pipeta a solução de gelatina sobre os êmbolos no armário de biossegurança usando uma pipeta sorológica de 5 ou 10 mL. Um êmbolo para 1 poço de uma placa de 6 poços exigirá ~2,5 mL de gelatina.
  3. Uma vez que a gelatina tenha solidificado nos êmbolos (~30-45 min) mova as placas ASC revestidas de pNIPAAm para o armário de biossegurança. Coloque suavemente os êmbolos nos poços das placas ASC revestidas de pNIPAAm para que a gelatina entre em contato com os ASCs. Coloque uma arruela metálica (~7,5 g) no êmbolo para pesar o êmbolo para que a gelatina esteja em contato direto com a folha de células ASC. Deixe os êmbolos nas folhas de células ASC em temperatura ambiente por 30 minutos.
  4. Mova suavemente a placa com os êmbolos para dentro da caixa estéril no armário de biossegurança e coloque a tampa sobre ela. Mova a caixa para uma geladeira de 4 °C por 30 minutos. Se não estiver disponível uma geladeira de 4 °C, coloque a placa no gelo em um balde de gelo no armário de biossegurança por 30 minutos.

4. Preparação de linhas celulares cancerosas

  1. Semente as linhas de células cancerígenas em um prato padrão de cultura de tecido T75 e mantê-los na cultura para que eles sejam ~80% confluentes no dia em que BC-MPS será processado. (~200.000 células cancerígenas serão necessárias por BC-MPS). Cresça as células cancerígenas na mídia normal.
    NOTA: Para identificar e isolar as células cancerígenas recomenda-se que as células sejam transfeinadas com uma proteína fluorescente para distingui-las das ASCs e do tecido mamário. O número de células cancerígenas necessárias por BC-MPS foi otimizado para células MCF7 e MDA-MB-231. Outras linhas celulares podem exigir maior otimização.
  2. No dia em que o BC-MPS está sendo preparado mova o frasco contendo as células cancerígenas para o armário de biossegurança. Aspire a mídia do frasco. Lave o frasco com 5 mL de PBS.
  3. Adicione 1 mL de solução de descolamento celular ao frasco contendo as células cancerosas e, em seguida, incubar o frasco em uma incubadora de 37 °C até que as células se despeçam (~2-5 min).
  4. No gabinete de biossegurança adicione 9 mL de PBS ao frasco, transfira as células em PBS para um tubo cônico de 15 mL e conte o número da célula usando um hemótmetro.
  5. Centrifugar as células cancerígenas a 500 x g por 5 min a temperatura ambiente.
  6. Resuspende as células em mídia BC-MPS para que haja 2 x 106 células/mL.
  7. Coloque as células cancerígenas em um banho de água de 37 °C até que estejam prontas para serem adicionadas ao tecido humano.

5. Processamento do tecido mamário humano

  1. Em um armário de biossegurança lave o tecido mamário humano (HBT) 3x com 10 mL de PBS estéril.
  2. Use fórceps estéreis e uma lâmina de barbear para cortar grosseiramente o BC-MPS e tentar remover o máximo de fáscia e tecido conjuntivo possível. A não remoção do tecido conjuntivo pode resultar na camada superior ASC para não ancorar adequadamente o HBT.
    NOTA: A fáscia e o tecido conjuntivo podem ser identificados por sua aparência branca ou clara em comparação com a cor amarela do tecido adiposo.
  3. Uma vez que o tecido conjuntivo tenha sido removido use uma lâmina de barbear estéril para picar finamente o tecido até que tenha uma consistência líquida homogênea. O tecido é finamente picado quando pode ser facilmente pipetado usando uma ponta sorológica de 25 mL.
  4. Use uma lâmina de barbear estéril para cortar a ponta de uma ponta de pipeta p1000 para ajudar na pipetação do HBT picado.
  5. Em um tubo de 1,5 mL misture o HBT picado, as linhas celulares cancerosas e a mídia BC-MPS (para 1 poço de uma placa de 6 poços isso requer 200 μL de HBT picado, 100 μL de mídia BC-MPS e 100 μL de células cancerosas).
  6. Mova a placa ASC que será usada para a folha de célula inferior da incubadora para o armário de biossegurança. Aspire a mídia da placa ASC inferior. Pipeta a mistura no centro do poço da placa ASC inferior usando uma ponta de pipeta p1000 que teve a extremidade distal cortada da etapa 5.4
  7. Mova a caixa contendo a placa ASC superior com os êmbolos sobre ele para o armário de biossegurança. Retire delicadamente os êmbolos de gelatina da placa revestida pNIPAAm e coloque em cima da mistura HBT. Adicione mídia BC-MPS ao poço (para 1 poço de uma placa de 6 poços adicione 2 mL de mídia). Mova cuidadosamente as placas ASC inferiores com a mistura BC-MPS e os desentupidores para a caixa de plástico estéril e coloque a tampa da caixa para transporte.
    NOTA: A tampa da placa de 6 poços não caberá de volta na placa ASC enquanto os êmbolos estiverem ligados. Deve-se tomar cuidado para evitar contaminar a cultura.
  8. Incubar a placa inferior da caixa em uma incubadora a 37 ° C até que a gelatina tenha derretido, e a camada superior asc tenha começado a aderir à camada inferior (~30 min).
  9. Mova a caixa com as placas para o armário de biossegurança. Remova suavemente os êmbolos das placas inferiores. O tecido com as células cancerosas será ancorado no fundo do poço.
  10. Coloque a tampa da placa de 6 poços de volta na placa inferior e incubar a 37 °C para derreter completamente a gelatina e permitir que a camada superior ancorue completamente para a camada inferior (~30-60 min).
  11. Mova suavemente as placas para um armário de biossegurança e aspire a mídia com uma pipeta sorológica de 10 mL. Adicione 2 mL de mídia fresca a cada poço. Aspire da borda do poço e pipeta para a borda do poço para evitar desalojar o tecido.
  12. Mantenha o BC-MPS a 37 °C e 5% de CO2 pelo tempo desejado e mude a mídia a cada 2-3 dias.

6. Digestão do BC-MPS para análise

  1. Quando o BC-MPS estiver pronto para ser analisado, mova a placa para o gabinete de biossegurança. Remova a mídia com uma pipeta sorológica para evitar a desalojadeira acidental de qualquer tecido.
  2. Adicione 1 volume de PBS a cada poço.
  3. Remova o PBS com uma pipeta sorológica.
  4. Adicione 1 mL de solução de dissociação celular a cada poço. Mova a placa de volta para a incubadora e incubar a 37 °C por 5 minutos para permitir que as células se desprendem. Em um armário de biossegurança, use um raspador de células para desprender completamente as células e o tecido da placa de cultura.
  5. Transfira a solução com o tecido para um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta sorológica. Adicione 2 mL de PBS a cada poço para coletar quaisquer células restantes e transfira esta solução para o tubo cônico. Se as células forem fluorescentes, enrole o tubo em papel alumínio para protegê-lo da luz.
  6. Incubar o tubo a 37 °C sob agitação constante em um agitador orbital a 1 x g por 10-20 min para dissociar completamente as células do tecido.
  7. Em um armário de biossegurança use uma pipeta sorológica para interromper quaisquer aglomerados restantes de células no tubo e filtrar a amostra através de um coador de tecido de 250 μm em um novo tubo de 15 mL. Pipeta a solução lentamente através do coador para que não transborde.
  8. Enxágüe o coador com 1 mL PBS para coletar todas as células ainda no coador.
  9. Centrifugar as amostras a 500 x g em temperatura ambiente por 5 minutos. Após a centrifugação, os adipócitos estarão flutuando na camada superior da solução, enquanto as células cancerosas e ASCs serão misturadas em uma pelota na parte inferior do tubo.
  10. Para isolar os adipócitos despeje suavemente a camada superior em um novo tubo ou, alternativamente, corte a ponta de uma ponta de pipeta p1000 e transfira a camada superior para um novo tubo. Centrifugar a amostra a 500 x g por 5 minutos novamente e usar uma seringa e agulha para remover a solução de baixo dos adipócitos para que apenas os adipócitos permaneçam. Os adipócitos estão prontos para análise
  11. Após remover os adipócitos da solução, separe as ASCs e as células cancerosas umas das outras para análise se as células cancerígenas foram previamente transfeinadas com uma proteína fluorescente. Aspire a solução restante do tubo contendo as ASCs e células cancerosas sem interromper a pelota celular. Resuspenque a pelota na mídia PBS ou BC-MPS e use citometria de fluxo para classificar as células com base na fluorescência.

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Representative Results

Estabilidade na cultura
BC-MPS é um sistema microfisiológico estável que pode ser cultivado in vitro por pelo menos 14 dias. Uma imagem de campo brilhante das folhas de células ASC foi tirada em ampliação de 100x para exibir o padrão estriado da folha de confluentes(Figura 2A). As folhas de células ASC estão estáveis na cultura por pelo menos 4 semanas. BC-MPS aos 14 dias de cultura em um poço de uma placa de 6 poços foi imagens com uma câmera colorida demonstrando que o HBT flutuante ainda está firmemente ancorado pelas folhas de células ASC na parte inferior do poço após 14 dias(Figura 2B). Isso demonstra que a folha celular usada para sanduiche o tecido adiposo ainda está intacta. A linha celular BC três negativa MDA-MB-231 expressando RFP foi cultivada em HBT por 14 dias e, em seguida, imagem com um microscópio fluorescente demonstrando a estabilidade do BC-MPS com linhas de celular até pelo menos 14 dias(Figura 2C). A presença das células BC no tecido demonstra a capacidade das células cancerígenas de invadir o HBT. Uma explanta PDX três negativos foi extirpada de um mouse, manchada com cell tracker CMTPX e cultivada com HBT. Imagens de microscopia fluorescente foram tiradas no dia 6 para mostrar a estabilidade do BC-MPS com explantas tumorais por pelo menos 6 dias(Figura 2D). Isso demonstra que o BC-MPS pode ser usado para cultivar explanações tumorais com HBT, bem como linhas celulares.

Elementos HBT nativos
O BC-MPS contém os elementos nativos do HBT na cultura. BC-MPS contendo 100 mg de HBT foram cultivados in vitro por 14 dias. O tecido foi retratado usando microscopia de campo brilhante após 14 dias na cultura(Figura 3A). Esta imagem demonstra a preservação de aglomerados de adipócitos maduros aos 14 dias de cultura. O tecido foi então fixado com 10% de formalina, parafina embarcada, seccionada a 5 μm usando um microtome e depois manchada com mancha de pentatro de Movats usando um protocolo padrão. As seções fixas foram imagedas em 100x (Figura 3B) ou 20x(Figura 3C). As imagens demonstram que o BC-MPS contém o colágeno nativo (roxo), as fibras reticulares (azul) e os adipócitos grande forma unilocular entre o tecido conjuntivo é preservado aos 14 dias de cultura. Para identificar macrófagos primários no sistema, o HBT foi cultivado por 0, 3 e 7 dias e, em seguida, fixado e manchado com o anti-CD45, anti-CD68 e anti-CD206. CD45 foi usado como um identificador de leucócitos geral. O CD68 foi usado como uma mancha de monócito para identificar macrófagos, enquanto o CD206 identifica um receptor comum presente em macrófagos. A coloração dos marcadores de macrófago foi quantificada por meio de um software de imagem(Figura 3D). Isso demonstra a preservação dos macrófagos primários após 3 e 7 dias na cultura. Esses dados demonstram que o BC-MPS preserva os elementos nativos do HBT na cultura. Outros experimentos podem ser realizados para estudar como as células BC remodelam os elementos nativos do HBT. Isso pode incluir a avaliação de alterações nos marcadores de macrófagos para determinar se eles estão sendo alterados pela presença de células BC. As alterações no ECM podem ser posteriormente analisadas comparando-se a coloração pentatroe de Movats de amostras que foram cultivadas com ou sem células BC para determinar se o conteúdo de colágeno é alterado e o tamanho dos adipócitos pode ser comparado usando softwares de análise de imagem como a Imagem J para determinar se as células BC alteram o tamanho do adipócito.

Crosstalk metabólico
O crosstalk metabólico do câncer de adipócito é um caminho importante pelo qual o microambiente tumoral influencia a progressão do BC. Células bc que acumulam lipídios intracelulares demonstram aumento da resistência à droga e um fenótipo mais invasivo15. Embora as células bc tenham sido demonstradas para induzir lipólise em adipócitos imaturos e murinas, a relevância fisiológica disso permaneceu incerta porque o crosstalk metabólico entre BC e adipócitos mamários primários nunca foi mostrado. Para demonstrar que o BC-MPS pode modelar esta célula mda-MB-231 metabólica de adocicado-BC foi cultivada sozinha ou em BC-MPS por 14 dias. As células foram digeridas enzimáticamente em suspensão de célula única, manchadas com o corante lipídedo neutro Bodipy, e analisadas por citometria de fluxo (Figura 4A, B)16. A proporção de células MDA-MB-231 lipídicas positivas foi 26,2 vezes maior em BC-MPS vs. cultura2D (Figura 4C). Esse aumento na coloração lipídica demonstra que as células cancerígenas estão interagindo com os adipócitos e tomando lipídios liberados dos adipócitos maduros. A triagem celular foi realizada para selecionar células RFP+ Bodipy+. Após a triagem, as células foram banhadas em colágeno eu reveste tampas de vidro e permissão para anexar durante a noite. No dia seguinte, as células foram fixadas em 4% de paraformaldeído por 30 minutos e, em seguida, imagens em um microscópio fluorescente a 100x de ampliação. As células cultivadas em BC-MP(Figura 4E) apresentaram aumento das gotículas lipídicas em comparação com as células cultivadas na cultura 2D padrão(Figura 4D). Isso demonstra o crosstalk metabólico entre as células BC e o HBT e, também, mostra como o acúmulo lipíduo pode ser analisado por citometria de fluxo ou por microscopia fluorescente. Uma análise mais aprofundada do acúmulo de lipídios em células cancerosas pode ser feita através da quantificação do tamanho das gotículas lipídicas e do número de gotículas lipídicas por célula.

Movimento amebaide
A conversa cruzada metabólica entre células BC e adipócitos aumenta a capacidade invasiva do câncer. Para avaliar o aumento da capacidade invasiva das células cancerígenas cultivadas com o HBT, a migração de células BC em todo o HBT foi avaliada por microscopia de fluorescência. A linha de células TNBC metastática MDA-MB-231 expressando RPF foi cultivada em BC-MPS por 4 dias para permitir que o sistema se estabilizasse. A microscopia de fluorescência de lapso de tempo foi realizada após 4 dias para imagem da motilidade MDA-MB-231 com uma imagem capturada a cada 20 minutos por 19 h a 37 °C e 5% de CO2. O vídeo resultante demonstrou padrões de movimento amoeboid e um grau surpreendentemente alto de motilidade para as células MDA-MB-231(Figura 5 e Vídeo 1). Isso demonstra um aumento na capacidade invasiva das células BC e a capacidade das células BC de invadir o HBT. A migração das células BC no HBT pode ser ainda mais analisada utilizando métodos publicados anteriormente para quantificar a velocidade e a direcionalidade das células migratórias17,18. As células MDA-MB-231 também parecem sofrer mitose. Esses comportamentos são consistentes com seu fenótipo agressivo, são comportamentos importantes para a progressão do câncer e metástase, e destacam novos comportamentos do BC que podem ser direcionados para terapias bc.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho geral da configuração BC-MPS. (A) A gelatina é solidificada em um êmbolo vertical. (B) O êmbolo com gelatina é colocado na folha de células asc superiores termoresponsiva. (C) Um peso é usado para forçar a gelatina a manter contato com a folha de células enquanto as células incubam à temperatura ambiente por 30 minutos seguidos de incubação a 4 °C por 30 min. (D) O êmbolo é removido da folha fria removendo a folha celular intacta com ele. (E) O êmbolo com a folha de célula superior é transferido para um prato contendo a folha de célula inferior e as células HBT e BC picadas. (F) A antena da célula inferior com mídia, êmbolo, HBT, BC e ambas as folhas de células são incubadas a 37 °C por 30-60 min para permitir que a gelatina derreta e as folhas celulares a partir de contatos. (G) A remoção do êmbolo deixa o HBT e o BC entre duas folhas de células ASC. Um êmbolo impresso em 3D foi projetado usando o software online gratuito TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) e impresso em uma impressora 3D. O êmbolo é composto de ácido polilático. (H) As dimensões de um êmbolo para 1 poço de uma placa de 6 poços são indicadas. O recesso do êmbolo é de 2,5 mm. (I) Uma imagem do êmbolo impresso em 3D real é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Estabilidade representativa do BC-MPS na cultura. (A) Uma imagem de campo brilhante na ampliação de 100x das ASCs confluentes que demonstram o padrão estriado das células confluentes. Barra de escala = 100 μm. (B) BC-MPS, contendo 100mg de HBT, foi cultivada em uma placa de 6 poços. Após 14 dias, uma foto colorida foi tirada para demonstrar que o HBT está ancorado na parte inferior do poço de uma placa de 6 poços. (C) A linha de células BC três 3 negativos MDA-MB-231 expressando RFP foi cultivada com HBT por 14 dias e, em seguida, imagem usando microscopia fluorescente a 40x de ampliação. As imagens demonstram que as células MDA-MB-231 ainda eram viáveis e crescendo no HBT. Barra de escala = 200 μm D) PDX Tumores de câncer de mama triplo negativo de camundongos foram picados em 3 cm2 peças e rotulados com Cell Tracker Red CMPTX. As peças foram cultivadas em HBT e o BC-MPS resultante foi retratado usando um microscópio fluorescente a 40x de ampliação no dia 6 demonstrando sua estabilidade na cultura. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Preservação representativa de elementos nativos do HBT presentes no BC-MPS. O BC-MPS foi cultivado por 14 dias e, em seguida, ou foi imageado com microscopia de campo brilhante a 40x (A) e depois fixado com 10% de formalina e manchado com mancha de pentatro movats. As imagens foram tiradas a 100x(B)ou 20x(C). A imagem do HBT indica a preservação de adipócitos uniloculor agrupados e fatias de tecido indica a presença de preservação do ECM nativo, como colágeno (amarelo) e fibras reticulares entre os adipócitos (azul). Para demonstrar a preservação dos macrófagos no modelo HBT foi cultivada por 0, 3 ou 7 dias, manchada para marcadores macrófagos, e imageda utilizando microscopia confocal(D). A intensidade fluorescente da coloração dos marcadores macrófagos foi quantificada por meio de software comercialmente disponível demonstrando que os macrófagos ainda estão presentes no tecido após 3 e 7 dias na cultura. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Conversa metabólica representativa entre adipócitos e células cancerosas em BC-MPS. As células MDA-MB-231 rotuladas por RFP foram cultivadas em BC-MPS vs. 2D por 14 dias, depois manchadas com Bodipy (250 nM) e analisadas por citometria de fluxo. (A) Fluxo de células MDA-MB-231 manchadas de Bodipy após 14 dias na cultura 2D. As células em B2 eram Bodipy+RFP+; as células em B1 eram Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3,26%, indicando acúmulo mínimo de lipídios. (B) Análise da citometria de fluxo das células MDA-MB-231 manchadas de Bodipy após 14 dias em BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85,35%, indicando acúmulo labíduo extenso. (C) Acúmulo de lipídios em células MDA-MB-231 após 14 dias na cultura 2D vs. BC-MPS. A análise de microscopia fluorescente da coloração bodipy de MDA-MB-231 cultivada em 2D (D) vs BC-MPS(E) demonstra aumento do acúmulo de lipídios em células cultivadas em BC-MPS. As barras de erro indicadas SEM. ** p < 0,01, n=2 réplicas biológicas, Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Migração representativa da TNBC no BC-MPS. As células MDA-MB-231 rotuladas por RFP foram cultivadas em BC-MPS por 4 dias e, em seguida, imagens sequenciais de lapso de tempo da célula BC-MPS + MDA-MB-231 foram capturadas usando um microscópio de fluorescência (Um quadro por 60 min, 100x de ampliação.) Asteriscos amarelos = evento mitotístico. Caixa amarela = detritos celulares utilizados para referência posicional. Setas azuis = 231 células mostrando movimento amoeboide com pseudopods e alta motilidade. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Migração representativa da TNBC no BC-MPS. BC-MPS contendo células MDA-MB-231 rotuladas por RFP foram cultivadas por 4 dias e a microscopia fluorescente foi usada para imaginar as células a cada 20 minutos a 19 horas a 37 ° C e 5% de CO2. As imagens foram compiladas em um vídeo (Um quadro por 60 minutos, 100x de ampliação). Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

Novos sistemas de modelagem do câncer de mama humano são necessários para desenvolver uma melhor compreensão da doença. O desenvolvimento de sistemas microfisiológicos humanos para modelar ambientes de doenças que incluem ECM nativo e células estromais aumentará o poder preditivo dos estudos pré-clínicos. O modelo BC-MPS aqui apresentado é um sistema recém-desenvolvido que supera as limitações dos modelos anteriores permite a avaliação do BC em seu ambiente HBT nativo. Este sistema pode ser usado com linhas de células cancerosas ou com explants tumorais e é stabile por pelo menos 14 dias. A rotulagem fluorescente das células BC permite que sua visualização em tempo real da motilidade celular e interações células, migração, viabilidade ou proliferação sejam monitoradas em tempo real ou em pontos de tempo específicos(Figura 3 e Figura 5). Este sistema modelo pode ser usado para elucidar aspectos importantes sobre a biologia do câncer no que se refere às interações entre as células cancerígenas e seu microambiente. O interrogatório deste sistema pode informar sobre a regulação do TME sobre a progressão do câncer, a resposta medicamentosa e o início da metástase.

Para configurar o sistema com sucesso, existem algumas etapas críticas que precisam ser seguidas. O primeiro passo crítico é a colheita e transferência das folhas de células ASC. As placas revestidas de pNIPAAm são sensíveis à temperatura. Quando as placas estiverem acima de 32 °C, a superfície é hidrofóbica, e as ASCs aderirão à superfície. A superfície se tornará hidrofílica abaixo desta temperatura e as células começarão a se desprender19. Assim, é necessário determinar a rapidez com que um determinado tipo de célula começará a se desprender dessas superfícies. Para ASCs derivados do HBT, isso levará > 30 min se as células forem confluentes. Para evitar que as células se desprendem durante a manutenção normal, a mídia deve ser pré-aquecida a 37 °C e as placas de cultura tecidual não devem ser mantidas à temperatura ambiente por muito tempo para evitar que as placas esfriem e as células se desprendem. Também é importante determinar o momento ideal para que os êmbolos de gelatina estejam nas placas revestidas de pNIPAAm para transferir toda a folha celular. As ASCs precisam ser confluentes e toda a folha precisa ser transferida. Se a folha de célula superior não tiver tempo para se desprender completamente e ligar à gelatina, a folha de células será quebrada durante a transferência. Se toda a folha celular não for completamente transferida, então os ASCs não serão capazes de sanduichar o tecido mamário flutuante.

Os ASCs usados para sanduichar o HBT são células estromicanas normais do microambiente mamário que secretam eCM, fatores de crescimento e citocinas que influenciam BC20. Para sanduichar o HBT entre duas folhas de células, as folhas ASC são transferidas usando placas de cultura de tecido termoresponsiva. Isso permite que o ECM nativo secretado pelos ASCs esteja intacto e serve para ancorar os adipócitos flutuantes no tecido. Ao usar ASCs derivados do tecido mamário humano, isso garante que as interações que as ASCs têm com as células cancerosas irão imitar o que ocorre no câncer de mama como ASCs de diferentes depósitos exibem expressão genética diferente e remodelação do ECM21.

O segundo passo crítico é o processamento do HBT. É necessário usar HBT recém-isolado para preservar a viabilidade do tecido. Ao processar o HBT é fundamental picar finamente o tecido e remover o máximo possível da fáscia. Se grandes pedaços de fáscia forem deixados no HBT, isso evitará que as folhas celulares anleiem corretamente o tecido flutuante. Além disso, a fáscia deixada no tecido pode dissociar-se da placa e puxará vários aglomerados do HBT com ele tornando o poço inutilizável para novas experimentações. O HBT deve ser colocado no meio do poço antes de adicionar a folha de célula superior, caso contrário, os ASCs não serão capazes de sanduíche adequado do HBT e o tecido na borda dos poços não será ancorado. Se essas etapas críticas forem seguidas, o processo de produção do BC-MPS será direto para a configuração.

O modelo detalhado aqui é um sistema aprimorado para estudar o BC em seu microambiente natural do HBT primário que retém os adipócitos maduros, ECM e células imunes residentes(Figura 4). Modelos pré-clínicos que imitam o microambiente adiposo carecem de múltiplos elementos do microambiente, como adipócitos maduros, células imunes, fibroblastos e eCM. O uso de HBT totalmente maduro permite o interrogatório simultâneo e recíproco deste ambiente complexo que inclui múltiplos elementos que influenciam o desenvolvimento do câncer, a resposta medicamentosa e a invasividade através da sinalização paracrina e justacririna22,23,24,25. Fibroblastos residentes e ASCs influenciam a metástase do câncer através da remodelação do ECM no tecido e através da sinalização paracrina26,27. O ECM e sua remodelagem são essenciais para o início da metástase. Alterações no ECM do microambiente tumoral influenciam a migração e a metástase do BC, mas a maioria dos estudos do BC não incorporam OCM nativo em seus estudos e, em vez disso, utilizam modelos simplificados compostos de colágeno I ou matrigel28,29. O ECM em BC-MPS é do HBT e dos ASCs. Assim, a forma como o ECM nativo é remodelado no microambiente tumoral no tecido mamário e influencia a metástase pode ser estudada. Assim, este modelo BC-MPS incorpora múltiplos elementos do microambiente tumoral que os sistemas de modelos anteriores não possuíam.

Este modelo pode ser usado para estudar o crosstalk metabólico entre adipócitos totalmente maduros e células BC. Modelos anteriores que estudam a interação entre adipócitos e células cancerosas usam pré-adipócitos que são diferenciados in vitro. Os pré-adipócitos diferenciados in vitro não amadurecem totalmente na mesma medida que os adipócitos diferenciados in vivo30,31. Para entender como os adipócitos influenciam a progressão do câncer e a resposta medicamentosa é vital imitar adequadamente a complexa composição molecular e química dos adipócitos nativos. Aqui demonstramos que nosso sistema permite avaliar o crosstalk metabólico que ocorre entre adipócitos e células BC(Figura 4).

O BC-MPS também pode ser usado na realização de estudos in vitro sobre como condições como a obesidade, que não podem ser modeladas adequadamente usando linhas celulares padrão, influenciam a progressão do câncer. A obesidade está associada à alteração do microambiente do HBT e ao aumento da metástase no BC, embora os mecanismos exatos não sejam plenamente compreendidos32,33,34. Fibroblastos, ASCs, adipócitos e ECM são alterados durante a obesidade e promovem ainda mais a progressão e metástase do câncer25,35,36. Assim, é importante utilizar células estromicas nativas e ECM do tecido obeso para entender como essas alterações nas células estromicas e ECM influenciam a ACM. Utilizando HBT e ASCs de pacientes obesos ou magros no modelo BC-MPS, os mecanismos pelos quais a obesidade promove um fenótipo metastático podem ser elucidados.

O método aqui apresentado é para a cultivo de células cancerígenas de mama em uma cultura que engloba ASCs, adipócitos maduros e ECM nativo. Modelos anteriores de sistemas de co-culturas estudaram como esses diferentes elementos individuais do ambiente estromal influenciam o câncer. Como as ASCs e os adipócitos influenciam a progressão do BC, pode-se complicar determinar qual tipo de célula é responsável por influenciar o BC. No entanto, isso pode ser determinado comparando BC-MPS com modelos de co-cultura mais simples com um tipo de célula. Uma das vantagens deste sistema em comparação com sistemas on-a-chip ou bioimpressora é que nenhum equipamento especial é necessário para configurar o sistema além das placas revestidas pNIPAAm que estão disponíveis comercialmente. Os sistemas modelo de tecido mamário foram descritos anteriormente usando bioimpressão para depositar ASCs em andaimes que são então diferenciados na cultura22. Isso requer 2-3 semanas adicionais para que as células se diferenciem e as ASCs diferenciadas na cultura não se diferenciem totalmente aos adipócitos maduros. Os adipócitos maduros do HBT em BC-MPS estão prontos para serem usados no momento em que são removidos de um paciente.

O sistema modelo descrito aqui é um sistema útil para estudar o crosstalk entre as células cancerosas e o microambiente, no entanto, ele tem algumas limitações. Uma das principais limitações é a disponibilidade do tecido mamário humano primário. O tecido adiposo humano não pode ser criopreservado sem perda de viabilidade e, portanto, o tecido utilizado para a fabricação de BC-MPS precisa ser recém-obtido e utilizado37. Outra limitação é que o modelo apresentado aqui é um sistema estático que é cultivado em placas regulares de 6 poços. O sistema carece do fluxo microfluido presente em órgãos-em-um-chip que podem influenciar a disponibilidade de oxigênio e nutrientes, o estresse e a distribuição de medicamentos38,39. Uma terceira limitação é a necessidade de as células serem separadas umas das outras no final do experimento se os diferentes tipos de células precisarem ser analisados individualmente. Isso requer a necessidade de rotular as células para que elas possam ser separadas umas das outras.

A incorporação de muitos elementos do microambiente tumoral produz um modelo fisiológico para estudar a progressão do câncer e o início da metástase. Além de poder estudar células cancerígenas em um modelo mais fisiológico, o BC-MPS também pode ser usado para estudar os elementos individuais do microambiente e como elas são influenciadas pelo câncer. Embora os dados aqui representados demonstrem como o BC-MPS pode ser usado com uma linha celular, o BC-MPS pode ser prontamente adaptado para atender à necessidade experimental particular de um pesquisador. Por exemplo, o HBT obeso pode ser comparado ao HBT magro para determinar como a obesidade afeta a metástase e a progressão do câncer. Diferentes subtipos de BC podem ser semeados no BC-MPS para estudar como subtipos de câncer interagem de forma diferente com o microambiente. Técnicas de edição de genes podem ser empregadas para determinar como genes específicos afetam a interação entre BC e o microambiente. Este modelo e suas aplicações permitirão uma compreensão mais precisa de como o ambiente estromático e o câncer de mama interagem para promover a progressão do câncer e a metástase.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer ao Núcleo de Citometria de Fluxo de Tulane e ao Núcleo de Triagem celular, bem como ao Núcleo de Histologia de Tulane pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Sudeste de Cirurgiões Plásticos & Reconstrutivos 2019 Research Grant e pela National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

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Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico
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