Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Modellering av bröstcancer i bröstvävnad hos människa med hjälp av ett mikrofysiskt system

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver byggandet av ett in vitro mikrofysiologiskt system för att studera bröstcancer med hjälp av primära mänskliga bröstvävnad med off the shelf material.

Abstract

Bröstcancer (BC) är fortfarande en ledande dödsorsak för kvinnor. Trots mer än $ 700 miljoner investerade i BC-forskning årligen, misslyckas 97% av kandidat BC-läkemedel kliniska prövningar. Därför behövs nya modeller för att förbättra vår förståelse av sjukdomen. NIH Microphysiological Systems (MPS) programmet utvecklades för att förbättra den kliniska översättningen av grundläggande vetenskapliga upptäckter och lovande nya terapeutiska strategier. Här presenterar vi en metod för att generera MPS för bröstcancer (BC-MPS). Denna modell anpassar en tidigare beskriven metod för odling av primära mänskliga vit fettvävnad (WAT) genom att smöra WAT mellan fett-härledda stamcellsark (ASC) . Nya aspekter av vår BC-MPS inkluderar sådd BC celler i icke-sjuka mänskliga bröstvävnad (HBT) som innehåller inhemska extracellulära matris, mogna adipocyter, bosatta fibroblaster och immunceller; och smörgås av BC-HBT-blandningen mellan ASC-ark som härrör från HBT. Den resulterande BC-MPS är stabil i kultur ex vivo i minst 14 dagar. Detta modellsystem innehåller flera element i mikromiljön som påverkar BC inklusive adipocyter, stromal celler, immunceller och den extracellulära matrisen. Således BC-MPS kan användas för att studera interaktionerna mellan BC och dess mikromiljö.

Vi visar fördelarna med vår BC-MPS genom att studera två BC beteenden kända för att påverka cancer progression och metastasering: 1) BC motility och 2) BC-HBT metabolisk crosstalk. Medan BC motility har tidigare visats med intravital imaging, BC-MPS möjliggör högupplöst tid-förfall avbildning med fluorescensmikroskopi under flera dagar. Dessutom, medan metaboliska crosstalk tidigare visats med BC celler och murin pre-adipocytes differentierade i omogna adipocytes, vår BC-MPS modell är det första systemet att visa denna crosstalk mellan primära mänskliga bröst adipocyter och BC celler in vitro.

Introduction

Varje år dör mer än 40 000 amerikanska kvinnor av bröstcancer (BC)1. Trots mer än $ 700 miljoner investerade i BC-forskning årligen, misslyckas 97% av kandidat BC-läkemedel kliniskaprövningar 2,3. Nya modeller behövs för att förbättra läkemedelsutvecklingspipelinen och vår förståelse av BC. NIH Microphysiological (MPS) Program avgränsade de funktioner som krävs för genombrottsmodeller för att förbättra översättningen av grundläggande vetenskap till klinisk framgång4. Dessa inkluderade användning av primära mänskliga celler eller vävnader, stabil i kultur i 4 veckor, och införande av inhemska vävnad arkitektur och fysiologiska svar.

Nuvarande in vitro BC-modeller, såsom tvådimensionell kultur av BC-cellinjer, membran infoga co-culture och tredimensionella sfäroider och organoider, uppfyller inte NIH: s MPS-kriterier eftersom ingen av dessa rekapitulerar infödd bröstvävnadsarkitektur. När extracellulär matris (ECM) tillsätts i dessa system används inte bröst-ECM. Istället används kollagengeler och källarmembranmatriser.

Nuvarande in vivo-system, såsom patient härledda xenografter (PDX), uppfyller på samma sätt inte NIH: s MPS-kriterier eftersom murin mammary vävnader skiljer sig mycket från mänskliga bröst. Dessutom erkänns immunsystemet-BC interaktioner alltmer som nyckeln i tumör utveckling, men de immunkomprometterade murin modeller som används för att generera PDX tumörer saknar mogna T-celler, B celler och naturliga mördarceller. Dessutom, medan PDX tillåter primära bröst tumörer att upprätthållas och expanderas, infiltreras de resulterande PDX tumörer med primära murin stromal celler och ECM5.

För att övervinna dessa utmaningar har vi utvecklat en ny, ex vivo, tredimensionell mänsklig bröst MPS som uppfyller NIH MPS-kriterierna. Grunden för vårt bröst MPS görs genom att smöra primära mänskliga bröstvävnad (HBT) mellan två ark fett-härledda stamceller (ASCs), också isolerade från HBT (Figur 1). Kolvarna för överföring av celllakan till sandwich HBT kan 3D-printas eller tillverkas av enkel akrylplast (Figur 1H,I). Denna teknik anpassar vår tidigare beskrivna strategi för odling av primära mänskliga vita adipocytvävnad6,7. Bröst MPS kan sedan sås av en BC modell av val, allt från standard BC cellinjer till primära mänskliga bröst tumörer. Här visar vi att dessa BC-MPS är stabila i kulturen i flera veckor (Figur 2); inkludera inhemska element av HBT såsom bröstadipocyter, ECM, endotel, immunceller (figur 3), och rekapitulera de fysiologiska interaktionerna mellan BC och HBT, såsom metabolisk crosstalk (figur 4). Slutligen visar vi att BC-MPS möjliggör studier av amöeboidrörelse av BC-celler i hela HBT (Figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla mänskliga vävnader samlades in i enlighet med #9189 som godkänts av LSUHSC:s institutionella granskningsnämnd.

1. Sådd av fettbaserade stamceller (ASC) för cellplåtar

  1. Köp ASC från kommersiella källor eller isolera från primär mänsklig bröstvävnad genom att följa etablerade protokoll8,9. Frö mänskliga bröst ASCs vid 70% densitet (~ 80,000 celler / cm2 yta) på 6-brunn standard vävnad kulturplattor i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum, och 1% Penicillin/Streptomycin (BC-MPS Media). Se till att de ASC som ska användas för att forma cellbladen bör vara mindre än passage 10.
    1. För varje brunn av bröstcancer mikrofysiologiskt system (BC-MPS) som kommer att genereras, fröceller i 1 standard vävnad kultur väl och 1 brunn av liknande storlek på poly (N-isopropylacrylamid) (pNIPAAm)-belagda vävnad kultur plastplatta. En 6-brunnsplatta av BC-MPS kommer att kräva en standard vävnadskultur 6 brunnsplatta (botten) och en pNIPAAm-belagd platta (topp). PNIPAAm-plattorna kan köpas från kommersiella källor eller kan beläggas i labb10,11,12.
  2. Kultur ASC i en vävnad kultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Byt media var 2-3 dagar i ett biosäkerhetsskåp.
  3. Kultur ASC tills de blir 100% konfluenta och bildar ett strimmigt mönster. Beroende på sammanflödet där de såddes, kommer detta att ta 7-10 dagar. Konfluenta cellark krävs för att förankra den flytande fettbröstvävnaden.

2. Förberedelse av leveranser som behövs för BC-MPS

  1. För att förbereda gelatin för 6-brunnsplattor gör du en 12% gelatinlösning i destillerad H2O. Blanda 19 g gelatin typ B (gelstyrka på ~ 225 Bloom) och 125 ml H2O i en 250 mL glasmedieflaska. Tillsätt 1,6 ml 1 M NaOH till lösningen för att neutralisera pH.Add 1.6 mL of 1 M NaOH to the solution to neutralize the pH.
  2. Autoklavera lösningen under en vätskecykel i 25 minuter för att sterilisera lösningen.
  3. Låt lösningen svalna till 37 °C. Tillsätt 16 ml steril 10x Hanks balanserad saltlösning (HBSS) i ett sterilt biosäkerhetsskåp för att få en slutlig volym på 160 ml.
    OBS: Gelatinlösningen kan användas direkt eller förvaras i rumstemperatur för senare användning. Det beredda gelatinet är stabilt vid rumstemperatur i 1 månad. Om bara några kolv kommer att behövas kan en 10 ml-lösning tillverkas och steril filtreras samma dag som att göra BC-MPS som tidigarebeskrivits 7.
    1. För att förbereda gelatinlösning genom filtersterilisering, späd 1 ml 10x HBSS med 9 ml H2O för att göra en 1x HBSS-lösning i ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt 100 μL 1 M NaOH till varje 10 ml rör och tillsätt sedan 0,7 g gelatin till lösningen. Blanda lösningen kraftigt för att lösa upp gelatinet.
    2. Inkubera röret i ett 75 °C vattenbad i 20 min skakningar var 5:e minut. Använd en 10 ml spruta och ett 0,22 μm sprutfilter för att filtrera gelatinlösningen. Filtrera gelatinlösningen direkt på kolven i ett biosäkerhetsskåp.
  4. 3D-skriva ut eller använd enkel akryl för att göra kolven som används för att överföra cellbladen. Se till att kolven passar löst i önskad storlek på brunnen. En vanlig 3D-utskriven kolv visas i figur 1. Kolven kan utformas med hjälp av standard datorstödd designprogramvara som TinkerCad och tryckt med filament 3D-skrivare som är kompatibla med polylaktisk syra (PLA)13,14.
  5. För att förbereda ett rack för att hålla kolven placera ett 15 ml rörställ i ett biosäkerhetsskåp. Placera kolvarna upp och ner i racket, så att kolvens botten är vänd uppåt. Placera en plastlåda med lock för transport av BC-MPS i biosäkerhetsskåpet. Det rekommenderas att lådan är minst 35,5 cm lång x 28 cm bredd x 8,25 cm höjd för att passa 4 plattor BC-MPS. Ta bort locket från lådan och spraya ner racket, kolven och lådan med 70% EtOH.
  6. Förbered sterila rakblad och tång genom autoklavering eller genom att placera dem i ett biosäkerhetsskåp och tvätta med 70% EtOH.
  7. Spraya kolven och lådan med 70% EtOH och tänd UV-lampan i biosäkerhetsskåpet i minst 30 minuter för att sterilisera tillbehören.

3. Förbered gelatinkolvarna och applicera på de övre cellplattorna

  1. Om gelatinlösningen tidigare har förberetts, värm den i ett 37 ° C vattenbad för att smälta den.
  2. Pipett gelatinlösningen på kolven i biosäkerhetsskåpet med en 5- eller 10-ml serologisk pipett. En kolv för 1 brunn av en 6-brunnsplatta kräver ~ 2,5 ml gelatin.
  3. När gelatinet har stelnat på kolven (~ 30-45 min) flytta pNIPAAm-belagda ASC-plattor till biosäkerhetsskåpet. Placera försiktigt kolven i brunnarna på de pNIPAAm-belagda ASC-plattorna så att gelatinkontakterna kommer i kontakt med ASC: erna. Placera en metallbricka (~7,5 g) på kolven för att tynga ner kolven så att gelatin kommer i direkt kontakt med ASC-cellen. Lämna kolvarna på ASC-cellplattorna i rumstemperatur i 30 minuter.
  4. Flytta försiktigt plattan med kolven i den sterila lådan i biosäkerhetsskåpet och lägg locket på den. Flytta lådan till ett kylskåp på 4 °C i 30 minuter. Om det inte finns ett kylskåp på 4 °C placerar du plattan på is i en ishink i biosäkerhetsskåpet i 30 minuter.

4. Förberedelse av cancercelllinjer

  1. Så cancercellslinjerna i en vanlig T75 vävnadskulturrätt och håll dem i kultur så att de är ~ 80% konfluenta den dag BC-MPS kommer att bearbetas. (~ 200 000 cancerceller kommer att behövas per BC-MPS). Odla cancercellerna i normala medier.
    OBS: För att identifiera och isolera cancercellerna rekommenderas att cellerna transfecteras med ett fluorescerande protein för att skilja dem från ASC och bröstvävnad. Antalet cancerceller som behövs per BC-MPS har optimerats för MCF7- och MDA-MB-231-celler. Andra cellinjer kan kräva ytterligare optimering.
  2. Samma dag som BC-MPS förbereds flyttar kolven som innehåller cancercellerna till biosäkerhetsskåpet. Aspirera mediet från kolven. Tvätta kolven med 5 ml PBS.
  3. Tillsätt 1 ml cellavlossningslösning till kolven som innehåller cancercellerna och inkubera sedan kolven i en inkubator på 37 °C tills cellerna har lossnat (~2-5 min).
  4. I biosäkerhetsskåpet tillsätt 9 ml PBS till kolven, överför cellerna i PBS till ett koniskt rör på 15 ml och räkna cellnumret med hjälp av en hemocytometer.
  5. Centrifugera cancercellerna vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur.
  6. Återanvänd cellerna i BC-MPS-media så att det finns 2 x 106 celler/ml.
  7. Placera cancercellerna i ett 37 °C vattenbad tills de är redo att tillsättas till den mänskliga vävnaden.

5. Bearbetning av bröstvävnad hos människa

  1. Tvätta den mänskliga bröstvävnaden (HBT) 3x med 10 ml steril PBS i ett biosäkerhetsskåp.
  2. Använd sterila tångar och ett rakblad för att grovt hacka BC-MPS och försök att ta bort så mycket fascia och bindväv som möjligt. Underlåtenhet att ta bort bindväven kan leda till att ASC:s övre skikt inte förankrar HBT ordentligt.
    OBS: Fascian och bindväven kan identifieras med sitt vita eller tydliga utseende jämfört med fettvävnadens gula färg.
  3. När bindväven har tagits bort, använd ett sterilt rakblad för att finhacka vävnaden tills den har en homogen vätskekonsistens. Vävnaden finhackas när den lätt kan ledas med en 25 ml serologisk spets.
  4. Använd ett sterilt rakblad för att skära av spetsen från en p1000 pipettspets för att hjälpa till att pipettera den malda HBT.
  5. I en 1,5 ml rörblandning blandar det malet HBT, cancercellslinjer och BC-MPS-media (för 1 brunn av en 6-brunnsplatta kräver detta 200 μL malet HBT, 100 μL BC-MPS-media och 100 μL cancerceller).
  6. Flytta ASC-plattan som ska användas för det nedre cellbladet från inkubatorn till biosäkerhetsskåpet. Aspirera mediet från den nedre ASC-plattan. Pipett blandningen på mitten av brunnen på den nedre ASC-plattan med en p1000 pipettspets som fick den distala änden avskuren från steg 5.4
  7. Flytta lådan som innehåller den övre ASC-plattan med kolven på till biosäkerhetsskåpet. Ta försiktigt bort gelatinkolven från pNIPAAm-belagda plattan och placera ovanpå HBT-blandningen. Lägg till BC-MPS-media till brunnen (för 1 brunn av en 6-brunnsplatta tillsätt 2 ml media). Flytta försiktigt de nedre ASC-plattorna med BC-MPS-blandningen och kolven till den sterila plastlådan och sätt på locket på lådan för transport.
    OBS: 6-brunnsplattans lock passar inte tillbaka på ASC-plattan medan kolven är på. Man måste se till att undvika att förorena kulturen.
  8. Inkubera bottenplattan i lådan i en inkubator vid 37 ° C tills gelatinet har smält, och det övre ASC-skiktet har börjat klibba vid bottenskiktet (~ 30 min).
  9. Flytta lådan med plattorna till biosäkerhetsskåpet. Ta försiktigt bort kolven från bottenplattorna. Vävnaden med cancercellerna kommer att förankras i botten av brunnen.
  10. Placera locket på 6-brunnsplattan tillbaka på bottenplattan och inkubera vid 37 °C för att helt smälta gelatinet och låt det övre skiktet helt förankras i bottenskiktet (~ 30-60 min).
  11. Flytta försiktigt plattorna till ett biosäkerhetsskåp och aspirera på media med en 10 ml serologisk pipett. Tillsätt 2 ml färskt medium till varje brunn. Aspirera från kanten av brunnen och pipetten på brunnens kant för att undvika att lossa vävnaden.
  12. Håll BC-MPS vid 37 °C och 5 % CO2 under önskad tid och byt media var 2-3:e dag.

6. Matsmältning av BC-MPS för analys

  1. När BC-MPS är redo att analyseras, flytta plattan till biosäkerhetsskåpet. Ta bort media med en serologisk pipett för att undvika oavsiktlig borttagning av någon vävnad.
  2. Lägg till 1 volym PBS till varje brunn.
  3. Ta bort PBS med en serologisk pipett.
  4. Tillsätt 1 ml celldeassociationslösning till varje brunn. Flytta tillbaka plattan till inkubatorn och inkubera vid 37 °C i 5 minuter så att cellerna kan lossna. I ett biosäkerhetsskåp, använd en cellskrapa för att helt lossa cellerna och vävnaden från odlingsplattan.
  5. Överför lösningen med vävnaden till ett koniskt rör på 15 ml med en serologisk pipett. Tillsätt 2 ml PBS till varje brunn för att samla upp eventuella återstående celler och överför denna lösning till det koniska röret. Om cellerna är fluorescerande, linda röret i aluminiumfolie för att skydda det från ljus.
  6. Inkubera röret vid 37 °C under konstant omrörning i en orbital shaker vid 1 x g i 10-20 min för att helt skilja celler från vävnaden.
  7. I ett biosäkerhetsskåp använd en serologisk pipett för att störa eventuella återstående klumpar av celler i röret och filtrera provet genom en 250 μm vävnadssil till ett nytt 15 ml-rör. Pipetter lösningen långsamt genom silen så att den inte svämmar över.
  8. Skölj silen med 1 ml PBS för att samla in celler som fortfarande finns kvar i silen.
  9. Centrifugera proverna vid 500 x g vid rumstemperatur i 5 min. Efter centrifugering kommer adipocyterna att flyta på lösningens översta lager medan cancercellerna och ASC:erna blandas ihop i en pellet längst ner i röret.
  10. För att isolera adipocyterna häll försiktigt det övre lagret i ett nytt rör eller alternativt skära av spetsen från en p1000 pipettspets och överför det övre lagret till ett nytt rör. Centrifugera provet vid 500 x g i 5 minuter igen och använd en spruta och nål för att ta bort lösningen under adipocyterna så att endast adipocyterna finns kvar. Adipocyterna är nu redo för analys
  11. Efter att ha tagit bort adipocyterna från lösningen separerar du ASC och cancercellerna från varandra för analys om cancercellerna tidigare transfekterades med ett fluorescerande protein. Aspirera den återstående lösningen från röret som innehåller ASC och cancerceller utan att störa cellpelleten. Återanvänd pelleten i PBS- eller BC-MPS-media och använd flödescytometri för att sortera cellerna baserat på fluorescensen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stabilitet i kulturen
BC-MPS är ett stabilt mikrofysiskt system som kan odlas in vitro i upp till minst 14 dagar. En ljusfältsbild av ASC-cellbladen togs vid 100x förstoring för att visa det strimmiga mönstret på det konfluenta arket (figur 2A). ASC-cellplattorna är stabila i kulturen i minst 4 veckor. BC-MPS vid 14 dagar i kultur i en brunn av en 6 brunnsplatta avbildades med en färgkamera som visar att den flytande HBT fortfarande är stabilt förankrad av ASC-cellbladen till botten av brunnen efter 14 dagar (Figur 2B). Detta visar att cellbladet som används för att smöra fettvävnaden fortfarande är intakt. Den trippelnegativa BC-cellinjen MDA-MB-231 som uttrycker RFP odlades i HBT i 14 dagar och avbildades sedan med ett fluorescerande mikroskop som visar stabiliteten hos BC-MPS med cellinjer ut till minst 14 dagar (Figur 2C). Närvaron av BC-cellerna i vävnaden visar cancercellernas förmåga att invadera HBT. En trippel negativ PDX explant var strukits från en mus, färgas med Cell Tracker CMTPX och odlas med HBT. Fluorescerande mikroskopibilder togs dag 6 för att visa stabiliteten hos BC-MPS med tumörexplanter i minst 6 dagar (Figur 2D). Detta visar att BC-MPS kan användas för att odla tumör explanter med HBT samt cellinjer.

Inbyggda HBT-element
BC-MPS innehåller de ursprungliga elementen i HBT i kulturen. BC-MPS som innehåller 100 mg HBT odlades in vitro i 14 dagar. Vävnaden avbildades med brightfieldmikroskopi efter 14 dagar i kultur (Figur 3A). Denna bild visar bevarandet av kluster av mogna adipocyter vid 14 dagar i kultur. Vävnaden fixerades sedan med 10% formalin, paraffin inbäddat, sektionerat vid 5 μm med hjälp av en mikrotom och sedan färgat med Movats pentachrome fläck med hjälp av ett standardprotokoll. De fasta avsnitten avbildades med 100x (Figur 3B) eller 20x (Figur 3C). Bilderna visar att BC-MPS innehåller det inhemska kollagenet (lila), retikulära fibrer (blå) och adipocyterna stor unilocular form mellan bindväven bevaras vid 14 dagar i kultur. För att identifiera primära makrofager i systemet odlades HBT i 0, 3 och 7 dagar och sedan fixerades och färgades med anti-CD45, anti-CD68 och anti-CD206. CD45 användes som en allmän leukocyt identifierare. CD68 användes som en monocyt fläck för att identifiera makrofager medan CD206 identifierar en gemensam receptor finns på makrofager. Färgningen av makrofagmarkörerna kvantifierades med hjälp av en bildbehandlingsprogramvara (figur 3D). Detta visar bevarandet av primära makrofager efter 3 och 7 dagar i kultur. Dessa data visar att BC-MPS bevarar de ursprungliga elementen i HBT i kulturen. Ytterligare experiment kan utföras för att studera hur BC-cellerna omformar de ursprungliga elementen i HBT. Detta kan inkludera bedömning av förändringar i makrofatmarkörer för att avgöra om de ändras av förekomsten av BC-celler. Förändringar i ECM kan analyseras ytterligare genom att jämföra Movats pentachrome färgning av prover som odlades med eller utan BC celler för att avgöra om kollagen innehåll ändras och storleken på adipocytes kan jämföras med hjälp av bildanalys programvara såsom bild J för att avgöra om BC celler ändra adipocyte storlek.

Metabolisk crosstalk
Adipocyte-cancer metabolisk crosstalk är en viktig väg där tumör microenvironment påverkar BC progression. BC-celler som ackumulerar intracellulära lipider visar ökad läkemedelsresistens och en mer invasiv fenotyp15. Medan BC celler har visat sig inducera lipolys i omogna, murin adipocytes, har den fysiologiska relevansen av detta förblivit oklart eftersom metabolisk crosstalk mellan BC och primära mänskliga bröst adipocyter har aldrig visats. För att visa att BC-MPS kan modellera denna adipocyte-BC metabolic crosstalk RFP-märktA MDA-MB-231 celler odlades ensam eller i BC-MPS i 14 dagar. Cellerna smältes enzymatiskt till encellsupphängning, färgades med det neutrala lipidfärgämnet Bodipy och analyserades av flödescytometri (Figur 4A,B)16. Andelen lipidpositiva MDA-MB-231-celler var 26,2 gånger SEM +/- 2,5 större i BC-MPS jämfört med 2D-kultur (Figur 4C). Denna ökning av lipidfärgning visar att cancercellerna interagerar med adipocyterna och tar upp lipider som frigörs från de mogna adipocyterna. Cellsortering utfördes för att välja för RFP+ Bodipy+-celler. Efter sortering pläterades cellerna på kollagen jag belagda glaslock och fick fästa över natten. Följande dag var cellerna fixerade i 4% paraformaldehyd i 30 min och sedan avbildas på ett fluorescerande mikroskop vid 100x förstoring. Celler odlade i BC-MP (Figur 4E) visade ökade lipiddroppar jämfört med celler odlade i standard 2D-kultur (Figur 4D). Detta visar metabolisk crosstalk mellan BC-cellerna och HBT och visar också hur lipidackumulering kan analyseras genom flödescytometri eller fluorescerande mikroskopi. Ytterligare analys av lipidackumulering i cancerceller kan göras genom att kvantifiera storleken på lipiddroppar och antalet lipiddroppar per cell.

Amoeboid rörelse
Metaboliskt korsprat mellan BC-celler och adipocyter ökar cancerns invasiva förmåga. För att bedöma den ökade invasiva förmågan hos de cancerceller som odlades med HBT bedömdes migrationen av BC-celler i hela HBT med fluorescensmikroskopi. Den metastaserade TNBC-cellinjen MDA-MB-231 som uttrycker RPF odlades i BC-MPS i 4 dagar för att systemet skulle kunna stabiliseras. Time-lapse fluorescensmikroskopi utfördes efter 4 dagar för att avbilda MDA-MB-231 motility med en bild fångad var 20: e minut i 19 h vid 37 °C och 5% CO2. Den resulterande videon visade amöeboid rörelsemönster och en förvånansvärt hög grad av rörlighet för MDA-MB-231-cellerna (figur 5 och video 1). Detta visar en ökning av bc-cellernas invasiva förmåga och BC-cellernas förmåga att invadera HBT. Migreringen av BC-cellerna i HBT kan analyseras ytterligare med hjälp av tidigare publicerade metoder för att kvantifiera hastigheten och riktningen hos migrerande celler17,18. MDA-MB-231 celler observerades också för att verka genomgå mitos. Dessa beteenden överensstämmer med dess aggressiva fenotyp, är viktiga beteenden för cancerprogression och metastasering, och belyser nya BC beteenden som kan vara riktade mot BC terapier.

Figure 1
Bild 1: Allmänt arbetsflöde för BC-MPS-installationen. A)Gelatin stelnas i en upprätt kolv. (B) Kolven med gelatin placeras på det termoresponsiva övre ASC-cellbladet. C)En vikt används för att tvinga gelatinet att hålla kontakten med cellbladet medan cellerna inkuberar vid rumstemperatur i 30 minuter följt av inkubation vid 4 °C i 30 min. (D) Kolven avlägsnas från den kalla skålen och tar bort det intakta cellbladet med det. (E) Kolven med det övre cellbladet överförs till en skål som innehåller det nedre cellbladet och de malda HBT- och BC-cellerna. F)Bottencellsskålen med media, kolv, HBT, BC och båda cellplattorna inkuberas vid 37 °C i 30-60 minuter för att gelatinet ska smälta och cellbladen till från kontakterna. g)Avlägsnandet av kolven lämnar HBT och BC inklämda mellan två ASC-cellark. En 3D-utskriven kolv designades med den kostnadsfria onlineprogramvaran TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) och trycktes på en 3D-skrivare. Kolven består av polylaktisk syra. (H) Måtten på en kolv för 1 brunn av en 6-brunnsplatta anges. Kolvens urtag är 2,5 mm. (I) En bild av den faktiska 3D-utskrivna kolven visas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativ stabilitet hos BC-MPS i kultur. (A) En ljusfältsbild vid 100x förstoring av de sammanflödes-ASC som visar de konfluenta cellernas strimmiga mönster. Skala bar = 100 μm. (B) BC-MPS, innehållande 100mg HBT, odlades i en 6 brunn platta. Efter 14 dagar togs ett färgfoto för att visa att HBT är förankrad i botten av brunnen på en 6 brunnsplatta. (C) Den trippelnegativa BC-cellinjen MDA-MB-231 som uttrycker RFP odlades med HBT i 14 dagar och sedan avbildas med fluorescerande mikroskopi vid 40x förstoring. Bilderna visar att MDA-MB-231-cellerna fortfarande var livskraftiga och växte i HBT. Skala bar = 200 μm D) PDX Tumörer av trippelnegativ bröstcancer från möss maldes i 3 cm2 stycken och märkts med Cell Tracker Red CMPTX. Bitarna odlades i HBT och den resulterande BC-MPS avbildades med hjälp av ett fluorescerande mikroskop vid 40x förstoring på dag 6 visar dess stabilitet i kulturen. Skalbar = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativt bevarande av inhemska element i HBT som förekommer i BC-MPS. BC-MPS odlades i 14 dagar och sedan antingen avbildas med ljus fältmikroskopi vid 40x (A) och sedan fixas med 10% formalin och färgas med Movats pentachrome fläck. Bilderna togs i 100x (B) eller 20x (C). Avbildning av HBT indikerar bevarandet av stora uniloculor adipocytes grupperade tillsammans och vävnad skivor indikerar förekomsten av bevarande av den inhemska ECM såsom kollagen (gul) och reticular fibrer mellan adipocytes (blå). För att påvisa bevarandet av makrofager i modellen odlades HBT i 0, 3 eller 7 dagar, färgas för makrofagmarkörer och avbildas med confocal mikroskopi (D). Fluorescerande intensiteten av färgning av makrofag markörer kvantifierades med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara som visar att makrofager fortfarande finns i vävnaden efter 3 och 7 dagar i kultur. Skalbar = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativ metabolisk crosstalk mellan adipocyter och cancerceller i BC-MPS. RFP-märkta MDA-MB-231 celler odlades i BC-MPS vs. 2D i 14 dagar, sedan färgas med Bodipy (250 nM) och analyseras av flöde cytometri. (A) Flöde av Bodipy-färgade MDA-MB-231 celler efter 14 dagar i 2D kultur. Celler i B2 var Bodipy+RFP+; celler i B1 var Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3,26%, vilket indikerar minimal lipidackumulering. (B) Flöde cytometri analys av Bodipy-färgade MDA-MB-231 celler efter 14 dagar i BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85,35%, vilket indikerar omfattande lipidackumulering. (C) Lipid ackumulering i MDA-MB- 231 celler efter 14 dagar i 2D kultur vs. BC-MPS. Fluorescerande mikroskopi analys av Bodipy färgning av MDA-MB-231 odlas i 2D (D) vs BC-MPS (E) visar ökad lipid ackumulering i celler odlas i BC-MPS. Felstaplar indikerade SEM. ** p < 0,01, n=2 biologiska replikat, Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Representativ migration av TNBC i BC-MPS. RFP-märkta MDA-MB-231 celler odlades i BC-MPS i 4 dagar och sedan sekventiella time-lapse bilder av RFP-märkt BC-MPS + MDA-MB-231 celler fångades med hjälp av ett fluorescensmikroskop (En ram per 60 min, 100x förstoring.) Gula asterisker = mitotisk händelse. Gul låda = cellulärt skräp som används för positionsreferens. Blå pilar = 231 celler som visar amöeboidrörelse med pseudopoder och hög rörlighet. Skalbar = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1: Representativ migrering av TNBC i BC-MPS. BC-MPS innehållande RFP-märkta MDA-MB-231 celler odlades i 4 dagar och fluorescerande mikroskopi användes för att avbilda cellerna var 20: e minut vid 19 timmar vid 37 ° C och 5% CO2. Bilderna kompilerades till en video (En bildruta per 60 minuter, 100x förstoring). Klicka här för att ladda ner den här videon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det behövs nya system för modellering av mänsklig bröstcancer för att utveckla en bättre förståelse för sjukdomen. Utveckling av humana mikrofysiologiska system för att modellera sjukdomsinställningar som inkluderar inhemska ECM- och stromalceller kommer att öka prediktiv kraft i prekliniska studier. BC-MPS-modellen som presenteras här är ett nyutvecklat system som övervinner begränsningarna i tidigare modeller möjliggör utvärdering av BC i sin ursprungliga HBT-miljö. Detta system kan användas med cancer cellinjer eller med tumör explanter och är stabil i minst 14 dagar. Fluorescerande märkning av BC-cellerna gör det möjligt att övervaka deras realtidsvisualisering av cancercellsmotilitet och cellcellsinteraktioner, migration, livskraft eller spridning antingen i realtid eller vid specifika tidpunkter (figur 3 och figur 5). Detta modellsystem kan användas för att belysa viktiga aspekter om cancerbiologi när det gäller interaktionerna mellan cancerceller och deras mikromiljö. Förhör av detta system kan informera om TME reglering av cancer progression, läkemedelssvar och inledandet av metastasering.

För att systemet ska kunna konfigureras finns det några kritiska steg som måste följas. Det första kritiska steget är odling och överföring av ASC-cellernas ark. PNIPAAm-belagda plattor är temperaturkänsliga. När plattorna är över 32 °C är ytan hydrofobisk, och ASC:erna kommer att fästas på ytan. Ytan blir hydrofil under denna temperatur och cellerna börjar lossna19. Således är det nödvändigt att bestämma hur snabbt en viss celltyp börjar lossna från dessa ytor. För HBT-härledda ASCs tar detta > 30 min om cellerna är konfluenta. För att förhindra att cellerna lossnar under normalt underhåll bör mediet förvärmas till 37 °C och vävnadskulturplattorna bör inte hållas vid rumstemperatur för länge för att förhindra att plattorna kyls och cellerna lossnar. Det är också viktigt att bestämma den optimala tiden för gelatinkolven att vara på pNIPAAm-belagda plattor för att överföra hela cellbladet. Asc:erna måste vara sammanflödes- och hela arket måste överföras. Om det övre cellbladet inte har tid att helt lossa och binda till gelatinet bryts cellbladet under överföringen. Om hela cellbladet inte överförs helt, kommer ASC:erna inte att kunna smöra den flytande bröstvävnaden.

De ASC som används för att smöra HBT är normala stromal celler i bröstmikromiljön som utsöndrar ECM, tillväxtfaktorer och cytokiner som påverkar BC20. För att smöra HBT mellan två cellark överförs ASC-arken med hjälp av termoresponsiva vävnadskulturplattor. Detta gör det möjligt för den inhemska ECM som utsöndras av ASC att vara intakt och tjänar till att förankra de flytande adipocyterna i vävnad. Genom att använda ASC som härrör från mänsklig bröstvävnad säkerställer detta att de interaktioner som ASCs har med cancercellerna kommer att efterlikna vad som händer i bröstcancer eftersom ASC från olika depåer visar olika genuttryck och ECM-ombyggnad21.

Det andra kritiska steget är behandlingen av HBT. Det är nödvändigt att använda nyisolerad HBT för att bevara vävnadens livskraft. Vid bearbetning av HBT är det viktigt att finhacka vävnaden och att ta bort så mycket av fascian som möjligt. Om stora bitar av fascia lämnas kvar i HBT, kommer detta att förhindra att celllakanen förankrar den flytande vävnaden ordentligt. Dessutom kan fascia kvar i vävnaden skilja sig från plattan och det kommer att dra flera kluster av HBT med det vilket gör brunnen oanvändbar för ytterligare experiment. HBT bör placeras i mitten av brunnen innan den översta cellen läggs till, annars kommer ASC inte att kunna smöra HBT på ett tillfredsställande sätt och vävnaden på brunnens kant kommer inte att förankras. Om dessa kritiska steg följs är processen att producera BC-MPS direkt inställd.

Den modell som beskrivs här är ett förbättrat system för att studera BC i dess naturliga mikromiljö av primär HBT som behåller de mogna adipocyterna, ECM och bosatta immunceller (Figur 4). Prekliniska modeller som efterliknar fettmikromiljön saknar flera element i mikromiljön, såsom mogna adipocyter, immunceller, fibroblaster och ECM. Att använda fullt mogen HBT möjliggör samtidiga och ömsesidiga förhör av denna komplexa miljö som innehåller flera element som påverkar cancerutveckling, läkemedelsrespons och invasivitet genom parakrina och juxtacrine signalering22,23,24,25. Bosatta fibroblaster och ASCs påverkar cancermetastas genom ombyggnad av ECM i vävnad och genom parakrina signalering26,27. ECM och dess ombyggnad är nödvändiga för att metastasering ska inledas. Förändringar i ECM av tumör mikromiljön påverkar migration och metastasering av BC, men de flesta BC studier införlivar inte inhemska ECM i sina studier och istället använda förenklade modeller bestående av kollagen I eller matrigel28,29. ECM i BC-MPS kommer från HBT och från ASCs. Således kan det sätt på vilket den inhemska ECM ombyggnad i tumörmikromiljön i bröstvävnad och influenser metastasering studeras. Således innehåller denna BC-MPS-modell flera element i tumörmikromiljön som tidigare modellsystem inte hade.

Denna modell kan användas för att studera metabolisk crosstalk mellan fullt mogna adipocyter och BC-celler. Tidigare modeller som studerar interaktionen mellan adipocyter och cancerceller använder pre-adipocyter som är differentierade in vitro. Pre-adipocyter som är differentierade in vitro mognar inte helt i samma utsträckning som adipocyter differentierade in vivo30,31. För att förstå hur adipocyterna påverkar cancerprogression och läkemedelsrespons är det viktigt att korrekt efterlikna den komplexa molekylära och kemiska sammansättningen av inhemska adipocyter. Här har vi visat att vårt system gör det möjligt att bedöma den metaboliska crosstalk som uppstår mellan adipocyter och BC-celler (Figur 4).

BC-MPS kan också användas för att utföra in vitro-studier om hur tillstånd som fetma, som inte kan modelleras korrekt med hjälp av standardcelllinjer, påverkar cancerprogressionen. Fetma är förknippat med förändring av mikromiljön av HBT och en ökning av metastasering i BC även om de exakta mekanismerna inte är helt förstådda32,33,34. Fibroblaster, ASCs, adipocyter och ECM ändras under fetma och främjar ytterligare progression och metastasering av cancer25,35,36. Således är det viktigt att använda inhemska stromal celler och ECM från överviktig vävnad för att förstå hur dessa förändringar i stromal cellerna och ECM påverkar BC. Genom att använda HBT och ASCs från överviktiga eller magra patienter i BC-MPS-modellen kan mekanismerna genom vilka fetma främjar en metastaserad fenotyp klargöras.

Metoden som presenteras här är för odling av bröstcancerceller i en kultur som omfattar ASCs, mogna adipocyter och infödda ECM. Tidigare modeller av samkultursystem har studerat hur dessa enskilda olika delar av stromalmiljön påverkar cancer. Eftersom ASCs och adipocytes båda påverkar BC progression kan det vara komplicerat att avgöra vilken celltyp som är ansvarig för att påverka BC. Detta kan dock bestämmas genom att jämföra BC-MPS med enklare samkulturmodeller med en celltyp. En av fördelarna med detta system jämfört med on-a-chip eller bioprinting system är att ingen speciell utrustning behövs för att ställa in systemet utöver pNIPAAm belagda plattor som är kommersiellt tillgängliga. Modellsystem av bröstvävnad har tidigare beskrivits med hjälp av bioprinting för att deponera ASC i byggnadsställningar som sedan differentieras i kultur22. Detta kräver ytterligare 2-3 veckor för cellerna att skilja och ASCs differentierade i kultur skiljer inte helt till mogna adipocyter. De mogna adipocyterna från HBT i BC-MPS är redo att användas så snart de tas bort från en patient.

Det modellsystem som beskrivs här är användbart system för att studera korsstjälken mellan cancerceller och mikromiljön, men det har vissa begränsningar. En av de största begränsningarna är tillgången på primär mänsklig bröstvävnad. Mänsklig fettvävnad kan inte kryopreserveras utan förlust av livskraft och därför måste den vävnad som används för att göra BC-MPS erhållas nyligen och användas37. En annan begränsning är att modellen som presenteras här är ett statiskt system som odlas i vanliga 6 brunnsplattor. Systemet saknar det mikrofluidiska flödet som finns i organ-på-ett-chip som kan påverka syre- och näringstillgången, ren stress och läkemedelsfördelning38,39. En tredje begränsning är behovet av att cellerna separeras från varandra i slutet av experimentet om de olika celltyperna behöver analyseras individuellt. Detta kräver behovet av att märka cellerna så att de kan separeras från varandra.

Införlivandet av många delar av tumörmikromiljön ger en fysiologisk modell för att studera cancerprogression och inledandet av metastasering. Förutom att kunna studera cancerceller i en mer fysiologisk modell kan BC-MPS också användas för att studera de enskilda elementen i mikromiljön och hur de påverkas av cancer. Medan de data som representeras här visar hur BC-MPS kan användas med en cellinje, kan BC-MPS enkelt anpassas för att passa en forskares specifika experimentella behov. Till exempel kan överviktig HBT jämföras med mager HBT för att avgöra hur fetma påverkar cancermetastas och progression. Olika undertyper av BC kan sås in i BC-MPS för att studera hur subtyper av cancer interagerar annorlunda med mikromiljön. Genredigeringstekniker kan användas för att avgöra hur specifika gener påverkar interaktionen mellan BC och mikromiljön. Denna modell och dess tillämpningar kommer att möjliggöra en mer exakt förståelse för hur stromal miljö och bröstcancer interagerar för att främja cancerprogression och metastasering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Vi vill tacka Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core samt Tulane Histology Core för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av Southeastern Society of Plastic & Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant och National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020).
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

Cancerforskning Utgåva 170 bröstcancer mikrofysiologiskt system bröstvävnad hos människa fettbaserade stamceller primärkultur läkemedelsutveckling metabolisk tvärstjälk
Modellering av bröstcancer i bröstvävnad hos människa med hjälp av ett mikrofysiskt system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. M., Hebert, K. L.,… More

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter