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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines mikrophysiologischen In-vitro-Systems zur Untersuchung von Brustkrebs unter Verwendung von primärem menschlichem Brustgewebe mit Handelsmaterialien.

Abstract

Brustkrebs (BC) bleibt eine der häufigsten Todesursachen für Frauen. Trotz jährlich mehr als 700 Millionen US$Dollar, die in die BC-Forschung investiert werden, bestehen 97% der BC-Kandidatenmedikamente klinische Studien. Daher sind neue Modelle erforderlich, um unser Verständnis der Krankheit zu verbessern. Das NIH Microphysiological Systems (MPS) Programm wurde entwickelt, um die klinische Translation von Grundlagenforschungsentdeckungen und vielversprechenden neuen therapeutischen Strategien zu verbessern. Hier stellen wir eine Methode zur Erzeugung von MPS bei Brustkrebs (BC-MPS) vor. Dieses Modell adaptiert einen zuvor beschriebenen Ansatz zur Kultivierung von primärem menschlichem weißem Fettgewebe (WAT), indem WAT zwischen fettbasierten Stammzellblättern (ASC) eingebettet wird. Zu den neuen Aspekten unseres BC-MPS gehören die Aussaat von BC-Zellen in nicht erkranktes menschliches Brustgewebe (HBT), das native extrazelluläre Matrix, reife Adipozyten, ansässige Fibroblasten und Immunzellen enthält; und Sandwiching der BC-HBT-Beimischung zwischen HBT-abgeleiteten ASC-Platten. Das resultierende BC-MPS ist in Kultur ex vivo für mindestens 14 Tage stabil. Dieses Modellsystem enthält mehrere Elemente der Mikroumgebung, die BC beeinflussen, einschließlich Adipozyten, Stromazellen, Immunzellen und der extrazellulären Matrix. So kann BC-MPS verwendet werden, um die Wechselwirkungen zwischen BC und seiner Mikroumgebung zu untersuchen.

Wir demonstrieren die Vorteile unseres BC-MPS, indem wir zwei BC-Verhaltensweisen untersuchen, von denen bekannt ist, dass sie das Fortschreiten und die Metastasierung von Krebs beeinflussen: 1) BC-Motilität und 2) BC-HBT-metabolisches Crosstalk. Während die BC-Motilität bisher mit intravitalen Bildgebung nachgewiesen wurde, ermöglicht BC-MPS eine hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie über mehrere Tage. Während das metabolische Übersprechen zuvor mit BC-Zellen und murinen Präadipozyten demonstriert wurde, die in unreife Adipozyten differenziert wurden, ist unser BC-MPS-Modell das erste System, das dieses Crosstalk zwischen primären menschlichen Brustadipozyten und BC-Zellen in vitro demonstriert.

Introduction

Jedes Jahr sterben mehr als 40.000 US-Frauen an Brustkrebs (BC)1. Trotz jährlich mehr als 700 Millionen US$Dollar, die in die BC-Forschung investiert werden, bestehen 97% der BC-Kandidatenmedikamente klinische Studien2,3. Neue Modelle sind erforderlich, um die Medikamentenentwicklungspipeline und unser Verständnis von BC zu verbessern. Das NIH Microphysiological (MPS) Program berennt die Merkmale, die für bahnbrechende Modelle zur Verbesserung der Umsetzung von Grundlagenforschung in klinischen Erfolg erforderlich sind4. Dazu gehörten die Verwendung von primären menschlichen Zellen oder Geweben, die 4 Wochen lang in Kultur stabil sind, und die Einbeziehung der nativen Gewebearchitektur und der physiologischen Reaktion.

Aktuelle In-vitro-BC-Modelle, wie die zweidimensionale Kultur von BC-Zelllinien, die Membraneinfüge-Co-Kultur und dreidimensionale Sphäroide und Organoide, erfüllen die MPS-Kriterien des NIH nicht, da keines dieser Modelle die native Brustgewebearchitektur rekapituliert. Wenn extrazelluläre Matrix (ECM) zu diesen Systemen hinzugefügt wird, wird Brust-ECM nicht verwendet; Stattdessen werden Kollagengele und Basalmembranmatrizen verwendet.

Aktuelle In-vivo-Systeme, wie patientenabgeleitete Xenografts (PDX), erfüllen ebenfalls nicht die MPS-Kriterien des NIH, da sich das murine Brustgewebe stark von den menschlichen Brüsten unterscheidet. Darüber hinaus werden Interaktionen zwischen Immunsystem und BC zunehmend als Schlüssel zur Tumorentwicklung anerkannt, aber den immungeschwächten murinen Modellen, die zur Erzeugung von PDX-Tumoren verwendet werden, fehlen reife T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen. Während PDX es ermöglicht, primäre Brusttumoren zu erhalten und zu erweitern, werden die resultierenden PDX-Tumoren mit primären murinen Stromazellen und ECM5infiltriert.

Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir ein neuartiges, ex vivo, dreidimensionales menschliches Brust-MPS entwickelt, das die NIH-MPS-Kriterien erfüllt. Die Grundlage unseres Brust-MPS besteht darin, primäres menschliches Brustgewebe (HBT) zwischen zwei Blättern von fettabgeleiteten Stammzellen (ASCs) zu schalten, die ebenfalls aus HBT isoliert wurden (Abbildung 1). Kolben zum Übertragen der Zellplatten auf Sandwich der HBT können 3D-gedruckt oder aus einfachen Acrylkunststoffen hergestellt werden (Abbildung 1H, I). Diese Technik adaptiert unseren zuvor beschriebenen Ansatz zur Kultivierung von primärem menschlichem weißem Adipozytengewebe6,7. Das Brust-MPS kann dann mit einem BC-Modell der Wahl gesät werden, das von Standard-BC-Zelllinien bis hin zu primären menschlichen Brusttumoren reicht. Hier zeigen wir, dass diese BC-MPS in Kultur über mehrere Wochen stabil sind (Abbildung 2); enthalten native Elemente von HBT wie Brustadipozyten, ECM, Endothel, Immunzellen (Abbildung 3); und rekapitulieren die physiologischen Wechselwirkungen zwischen BC und HBT wie metabolisches Übersprechen (Abbildung 4). Schließlich zeigen wir, dass BC-MPS die Untersuchung der Amöbenbewegung von BC-Zellen während hbT ermöglicht (Abbildung 5).

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Protocol

Alle menschlichen Gewebe wurden in Übereinstimmung mit Protokoll #9189 gesammelt, das vom Institutional Review Board Office der LSUHSC genehmigt wurde.

1. Aussaat von adipösen Stammzellen (ASCs) für Zellblätter

  1. Kaufen Sie ASCs aus kommerziellen Quellen oder isolieren Sie aus primärem menschlichem Brustgewebe, indem Sie die festgelegten Protokolle8,9 befolgen. Samen Sie menschliche Brust-ASCs mit einer Dichte von 70% (~ 80.000 Zellen / cm2 Oberfläche) auf 6-Well-Standard-Gewebekulturplatten in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin (BC-MPS Media). Stellen Sie sicher, dass die ASCs, die für die Bildung der Zellblätter verwendet werden sollen, kleiner als Durchgang 10 sein sollten.
    1. Für jede Bohrung des mikrophysiologischen Systems von Brustkrebs (BC-MPS), die erzeugt wird, säen Sie Zellen in 1 Standardgewebekultur und 1 Vertiefung ähnlicher Größe auf poly(N-isopropylacrylamid) (pNIPAAm)-beschichteter Gewebekultur-Kunststoffplatte. Eine 6-Well-Platte von BC-MPS erfordert eine Standard-Gewebekultur-6-Well-Platte (unten) und eine pNIPAAm-beschichtete Platte (oben). Die pNIPAAm-Platten können aus kommerziellen Quellen bezogen oder im Labor beschichtet werden10,11,12.
  2. Kultur-ASCs in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37°C und 5% CO2. Wechseln Sie die Medien alle 2-3 Tage in einer Biosicherheitswerkbank.
  3. Kulturieren Sie die ASCs, bis sie zu 100% konfluent werden und ein streifengestreiftes Muster bilden. Abhängig von der Konfluenz, an der sie gesät wurden, dauert dies 7-10 Tage. Konfluente Zellblätter werden benötigt, um das schwimmfähige Fettbrustgewebe zu verankern.

2. Vorbereitung der für BC-MPS benötigten Vorräte

  1. Zur Herstellung von Gelatine für 6-Well-Platten wird eine 12% ige Gelatinelösung in destilliertemH2O. Mischen Sie 19 g Gelatine Typ B (Gelstärke von ~225 Bloom) und 125 mlH2O in einer 250 mL Glasmedienflasche. Fügen Sie der Lösung 1,6 ml 1 M NaOH hinzu, um den pH-Wert zu neutralisieren.
  2. Autoklavieren Sie die Lösung unter einem Flüssigkeitszyklus für 25 Minuten, um die Lösung zu sterilisieren.
  3. Lassen Sie die Lösung auf 37 °C abkühlen. In einer sterilen Biosicherheitswerkbank werden 16 ml sterile 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in die Lösung geben, um ein Endvolumen von 160 ml zu erhalten.
    HINWEIS: Die Gelatinelösung kann sofort verwendet oder bei Raumtemperatur für die spätere Verwendung gelagert werden. Die vorbereitete Gelatine ist bei Raumtemperatur für 1 Monat stabil. Wenn nur wenige Kolben benötigt werden, kann am selben Tag wie die Herstellung von BC-MPS wie zuvorbeschriebeneine 10-ml-Lösung hergestellt und steril gefiltert werden.
    1. Um Gelatinelösung durch Filtersterilisation herzustellen, verdünnen Sie 1 ml 10x HBSS mit 9 mlH2O,um eine 1x HBSS-Lösung in einem 15 mL konischen Röhrchen herzustellen. 100 μL 1 M NaOH in jedes 10-ml-Röhrchen geben und dann 0,7 g Gelatine in die Lösung geben. Mischen Sie die Lösung kräftig, um die Gelatine aufzulösen.
    2. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem 75 °C Wasserbad für 20 min Schütteln alle 5 min. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen 0,22-μm-Spritzenfilter, um die Gelatinelösung zu filtern. Filtern Sie die Gelatinelösung direkt auf die Kolben in einer Biosicherheitswerkbank.
  4. 3D-Druck oder verwenden Sie einfaches Acryl, um die Kolben herzustellen, die zum Übertragen der Zellblätter verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Kolben locker in die gewünschte Größe passen. Ein standardmäßiger 3D-gedruckter Kolben ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Kolben können mit Standard-Computer-Aided-Design-Software wie TinkerCad entworfen und mit Filament-3D-Druckern gedruckt werden, die mit Polymilchsäure (PLA)13,14kompatibel sind.
  5. Um ein Rack für die Aufbewahrung der Kolben vorzubereiten, legen Sie ein 15-ml-Rohrgestell in eine Biosicherheitswerkbank. Platzieren Sie die Kolben kopfüber im Rack, so dass die Unterseite der Kolben nach oben zeigt. Legen Sie eine Kunststoffbox mit Deckel für den Transport von BC-MPS in die Biosicherheitswerkbank. Es wird empfohlen, dass die Box mindestens 35,5 cm Länge x 28 cm Breite x 8,25 cm Höhe hat, um 4 Platten BC-MPS unterzulegen. Entfernen Sie den Deckel aus der Box und sprühen Sie das Rack, die Kolben und die Box mit 70% EtOH herunter.
  6. Bereiten Sie sterile Rasierklingen und -zinnen durch Autoklavieren oder durch Legen in eine Biosicherheitswerkbank vor und waschen Sie sie mit 70% EtOH.
  7. Besprühen Sie die Kolben und die Box mit 70% EtOH und schalten Sie das UV-Licht in der Biosicherheitswerkbank für mindestens 30 minuten ein, um die Vorräte zu sterilisieren.

3. Gelatinekolben vorbereiten und auf die oberen Zellblätter auftragen

  1. Wenn die Gelatinelösung zuvor hergestellt wurde, erhitzen Sie sie in einem 37 ° C Wasserbad, um sie zu schmelzen.
  2. Pipetten Sie die Gelatinelösung mit einer serologischen Pipette von 5 oder 10 ml auf die Kolben in der Biosicherheitswerkbank. Ein Kolben für 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte benötigt ~ 2,5 ml Gelatine.
  3. Sobald sich die Gelatine auf den Kolben verfestigt hat (~30-45 min), bewegen Sie die pNIPAAm-beschichteten ASC-Platten in die Biosicherheitswerkbank. Legen Sie die Kolben vorsichtig in die Vertiefungen der pNIPAAm-beschichteten ASC-Platten, damit die Gelatine mit den ASCs in Kontakt tritt. Legen Sie eine Metallscheibe (~ 7,5 g) auf den Kolben, um den Kolben zu beschweren, so dass Gelatine in direktem Kontakt mit dem ASC-Zellblatt steht. Lassen Sie die Kolben 30 minuten lang bei Raumtemperatur auf den ASC-Zellplatten.
  4. Bewegen Sie die Platte mit den Kolben vorsichtig in die sterile Box in der Biosicherheitswerkbank und legen Sie den Deckel darauf. Stellen Sie die Box für 30 min in einen 4 °C Kühlschrank. Wenn kein 4 °C Kühlschrank verfügbar ist, legen Sie den Teller für 30 min in einem Eiskübel in der Biosicherheitswerkbank auf Eis.

4. Herstellung von Krebszelllinien

  1. Säen Sie die Krebszelllinien in einer Standard-T75-Gewebekulturschale aus und halten Sie sie in Kultur, so dass sie an dem Tag, an dem BC-MPS verarbeitet wird, zu ~ 80% konfluent sind. (~200.000 Krebszellen werden pro BC-MPS benötigt). Wachsen Sie die Krebszellen in normalen Medien.
    HINWEIS: Um die Krebszellen zu identifizieren und zu isolieren, wird empfohlen, dass die Zellen mit einem fluoreszierenden Protein transfiziert werden, um sie von den ASCs und dem Brustgewebe zu unterscheiden. Die Anzahl der pro BC-MPS benötigten Krebszellen wurde für MCF7- und MDA-MB-231-Zellen optimiert. Andere Zelllinien erfordern möglicherweise eine weitere Optimierung.
  2. An dem Tag, an dem das BC-MPS vorbereitet wird, bringen Sie den Kolben mit den Krebszellen in die Biosicherheitswerkbank. Saugen Sie das Medium aus dem Kolben ab. Waschen Sie den Kolben mit 5 ml PBS.
  3. Fügen Sie 1 ml Zellablösungslösung in den Kolben mit den Krebszellen hinzu und inkubieren Sie den Kolben dann in einem 37 ° C-Inkubator, bis sich die Zellen gelöst haben (~ 2-5 min).
  4. In der Biosicherheitswerkbank 9 mL PBS in den Kolben geben, die Zellen in PBS in ein 15 mL konisches Röhrchen überführen und die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen.
  5. Zentrifugieren Sie die Krebszellen bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  6. Setzen Sie die Zellen in BC-MPS-Medien wieder ein, so dass 2 x 106 Zellen/ml vorhanden sind.
  7. Legen Sie die Krebszellen in ein 37 °C großes Wasserbad, bis sie bereit sind, dem menschlichen Gewebe hinzugefügt zu werden.

5. Verarbeitung von menschlichem Brustgewebe

  1. In einer Biosicherheitswerkbank das menschliche Brustgewebe (HBT) 3x mit 10 ml sterilem PBS waschen.
  2. Verwenden Sie eine sterile Zette und eine Rasierklinge, um das BC-MPS grob zu zerhacken und versuchen Sie, so viel Faszien und Bindegewebe wie möglich zu entfernen. Das Versäumnis, das Bindegewebe zu entfernen, kann dazu führen, dass die obere ASC-Schicht das HBT nicht richtig verankert.
    HINWEIS: Die Faszie und das Bindegewebe können durch ihr weißes oder klares Aussehen im Vergleich zur gelben Farbe des Fettgewebes identifiziert werden.
  3. Sobald das Bindegewebe entfernt wurde, verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um das Gewebe fein zu hacken, bis es eine homogene flüssige Konsistenz hat. Das Gewebe wird fein gehackt, wenn es leicht mit einer 25 ml serologischen Spitze pipetiert werden kann.
  4. Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um die Spitze von einer p1000-Pipettenspitze abzuschneiden, um das Pipettieren des gehackten HBT zu unterstützen.
  5. In einem 1,5-ml-Röhrchen mischen Sie das gehackte HBT, Krebszelllinien und BC-MPS-Medien (für 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte benötigt dies 200 μL gehacktes HBT, 100 μL BC-MPS-Medien und 100 μL Krebszellen).
  6. Bewegen Sie die ASC-Platte, die für die untere Zellplatte verwendet wird, vom Inkubator in die Biosicherheitswerkbank. Saugen Sie das Medium von der unteren ASC-Platte ab. Pipetten Sie die Mischung auf die Mitte des Brunnens der unteren ASC-Platte mit einer p1000-Pipettenspitze, bei der das distale Ende ab Schritt 5.4 abgeschnitten war
  7. Bewegen Sie die Box mit der oberen ASC-Platte mit den Kolben darauf in die Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie vorsichtig die Gelatinekolben von der pNIPAAm-beschichteten Platte und legen Sie sie auf die HBT-Mischung. Fügen Sie BC-MPS-Medien zum Bohrbrunnen hinzu (für 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte fügen Sie 2 ml Medien hinzu). Bewegen Sie die unteren ASC-Platten mit der BC-MPS-Mischung und den Kolben vorsichtig in die sterile Kunststoffbox und legen Sie den Deckel der Box für den Transport auf.
    HINWEIS: Der 6-Well-Plattendeckel passt nicht wieder auf die ASC-Platte, während die Kolben eingeschaltet sind. Es muss darauf geachtet werden, dass die Kultur nicht kontaminiert wird.
  8. Inkubieren Sie die bodenplatte in der Box in einem Inkubator bei 37 ° C, bis die Gelatine geschmolzen ist und die obere ASC-Schicht begonnen hat, an der unteren Schicht zu haften (~ 30 min).
  9. Bringen Sie die Box mit den Platten in die Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie vorsichtig die Kolben von den Bodenplatten. Das Gewebe mit den Krebszellen wird am Boden des Brunnens verankert.
  10. Legen Sie den Deckel der 6-Well-Platte wieder auf die untere Platte und inkubieren Sie bei 37 °C, um die Gelatine vollständig zu schmelzen und die obere Schicht vollständig in der unteren Schicht verankern zu lassen (~ 30-60 min).
  11. Bewegen Sie die Platten vorsichtig in eine Biosicherheitswerkbank und saugen Sie das Medium mit einer 10 mL serologischen Pipette an. Fügen Sie 2 ml frische Medien zu jedem Brunnen hinzu. Saugen Sie vom Rand des Brunnens ab und pipetieren Sie ihn auf den Rand des Brunnens, um zu vermeiden, dass sich das Gewebe löst.
  12. Halten Sie das BC-MPS für die gewünschte Zeit bei 37 °C und 5% CO2 und wechseln Sie alle 2-3 Tage die Medien.

6. Aufschluss von BC-MPS zur Analyse

  1. Wenn das BC-MPS zur Analyse bereit ist, bewegen Sie die Platte in die Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie die Medien mit einer serologischen Pipette, um ein versehentliches Entfernen von Gewebe zu vermeiden.
  2. Fügen Sie jedem Bohrbrunnen 1 PbS-Volumen hinzu.
  3. Entfernen Sie das PBS mit einer serologischen Pipette.
  4. Fügen Sie 1 ml Zelldissoziationslösung zu jeder Vertiefung hinzu. Bewegen Sie die Platte zurück zum Inkubator und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 5 min, damit sich die Zellen lösen können. Verwenden Sie in einer Biosicherheitswerkbank einen Zellschaber, um die Zellen und das Gewebe vollständig von der Kulturplatte zu lösen.
  5. Die Lösung wird mit dem Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit einer serologischen Pipette übertragen. Fügen Sie 2 ml PBS zu jeder Vertiefung hinzu, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln und diese Lösung in das konische Rohr zu übertragen. Wenn die Zellen fluoreszierend sind, wickeln Sie die Tube in Aluminiumfolie, um sie vor Licht zu schützen.
  6. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C unter ständigem Rühren in einem Orbitalschüttler bei 1 x g für 10-20 min, um die Zellen vollständig vom Gewebe zu dissoziieren.
  7. In einer Biosicherheitswerkbank verwenden Sie eine serologische Pipette, um verbleibende Zellklumpen im Röhrchen zu stören und die Probe durch ein 250 μm Gewebesieb in ein neues 15 ml Röhrchen zu filtern. Pipetieren Sie die Lösung langsam durch das Sieb, damit sie nicht überläuft.
  8. Spülen Sie das Sieb mit 1 ml PBS ab, um alle noch im Sieb noch im Sieb zu sammeln.
  9. Zentrifugiert die Proben bei 500 x g bei Raumtemperatur für 5 min. Nach der Zentrifugation schwimmen die Adipozyten auf der obersten Schicht der Lösung, während die Krebszellen und ASCs in einem Pellet am Boden der Röhre vermischt werden.
  10. Um die Adipozyten zu isolieren, gießen Sie die oberste Schicht vorsichtig in ein neues Röhrchen oder schneiden Sie alternativ die Spitze von einer p1000-Pipettenspitze ab und übertragen Sie die oberste Schicht in ein neues Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 x g für 5 min erneut und entfernen Sie die Lösung mit einer Spritze und Nadel unterhalb der Adipozyten, so dass nur noch die Adipozyten übrig bleiben. Die Adipozyten sind nun bereit für die Analyse
  11. Nachdem Sie die Adipozyten aus der Lösung entfernt haben, trennen Sie die ASCs und Krebszellen zur Analyse voneinander, wenn die Krebszellen zuvor mit einem fluoreszierenden Protein transfiziert wurden. Saugen Sie die verbleibende Lösung aus dem Röhrchen, das die ASCs und Krebszellen enthält, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in PBS- oder BC-MPS-Medien und verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Zellen basierend auf der Fluoreszenz zu sortieren.

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Representative Results

Stabilität in der Kultur
BC-MPS ist ein stabiles mikrophysiologisches System, das bis zu 14 Tage in vitro kultiviert werden kann. Ein Hellfeldbild der ASC-Zellblätter wurde mit 100-facher Vergrößerung aufgenommen, um das streifengestreifte Muster des konfluenten Blattes darzustellen (Abbildung 2A). Die ASC-Zellblätter sind in Kultur mindestens 4 Wochen stabil. BC-MPS nach 14 Tagen in Kultur in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte wurde mit einer Farbkamera aufgenommen, die zeigte, dass das auftriebsintensive HBT nach 14 Tagen noch stabil durch die ASC-Zellblätter am Boden des Bohrplatzes verankert ist (Abbildung 2B). Dies zeigt, dass das Zellblatt, mit dem das Fettgewebe eingeklemmt wird, noch intakt ist. Die dreifach negative BC-Zelllinie MDA-MB-231, die RFP exprimiert, wurde 14 Tage lang in HBT kultiviert und dann mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, das die Stabilität des BC-MPS mit Zelllinien von mindestens 14 Tagen demonstrierte (Abbildung 2C). Das Vorhandensein der BC-Zellen im Gewebe zeigt die Fähigkeit von Krebszellen, in die HBT einzudringen. Eine dreifach negative PDX-Explant wurde aus einer Maus herausgeschnitten, mit Cell Tracker CMTPX gefärbt und mit HBT kultiviert. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen wurden an Tag 6 aufgenommen, um die Stabilität von BC-MPS mit Tumorerregungen für mindestens 6 Tage zu zeigen (Abbildung 2D). Dies zeigt, dass BC-MPS zur Kultigung von Tumorentplants mit HBT sowie Zelllinien verwendet werden kann.

Native HBT-Elemente
BC-MPS enthält die nativen Elemente von HBT in der Kultur. BC-MPS mit 100 mg HBT wurden 14 Tage lang in vitro kultiviert. Das Gewebe wurde mittels Hellfeldmikroskopie nach 14 Tagen in Kultur abgebildet (Abbildung 3A). Dieses Bild zeigt die Konservierung von Clustern reifer Adipozyten nach 14 Tagen in Kultur. Das Gewebe wurde dann mit 10% Formalin fixiert, Paraffin eingebettet, bei 5 μm mit einem Mikrotome durchschnitten und dann mit Movats Pentachrom-Färbung unter Verwendung eines Standardprotokolls gefärbt. Die festen Abschnitte wurden mit 100x (Abbildung 3B) oder 20x (Abbildung 3C ) abgebildet. Die Bilder zeigen, dass das BC-MPS das native Kollagen (violett), retikuläre Fasern (blau) enthält und die große unilokuläre Form der Adipozyten zwischen dem Bindegewebe nach 14 Tagen in Kultur erhalten bleibt. Um primäre Makrophagen im System zu identifizieren, wurde HBT für 0, 3 und 7 Tage kultiviert und dann fixiert und mit dem Anti-CD45, Anti-CD68 und Anti-CD206 gefärbt. CD45 wurde als allgemeiner Leukozytenidentifikator verwendet. CD68 wurde als Monozytenfärbung zur Identifizierung von Makrophagen verwendet, während CD206 einen gemeinsamen Rezeptor identifiziert, der auf Makrophagen vorhanden ist. Die Färbung der Makrophagenmarker wurde mit einer Bildgebungssoftware quantifiziert (Abbildung 3D). Dies zeigt die Konservierung primärer Makrophagen nach 3 und 7 Tagen in Kultur. Diese Daten zeigen, dass BC-MPS die nativen Elemente von HBT in Kultur bewahrt. Weitere Experimente können durchgeführt werden, um zu untersuchen, wie die BC-Zellen die nativen Elemente von HBT umgestalten. Dies kann die Bewertung von Veränderungen in Makrophagenmarkern umfassen, um festzustellen, ob sie durch das Vorhandensein von BC-Zellen verändert werden. Veränderungen im ECM können weiter analysiert werden, indem die Movats Pentachrom-Färbung von Proben, die mit oder ohne BC-Zellen kultiviert wurden, verglichen wird, um festzustellen, ob der Kollagengehalt verändert ist und die Größe der Adipozyten mit Bildanalysesoftware wie Image J verglichen werden kann, um festzustellen, ob BC-Zellen die Größe der Adipozyten verändern.

Metabolisches Übersprechen
Das metabolische Übersprechen zwischen Adipozytenkrebs ist ein wichtiger Weg, bei dem die Mikroumgebung des Tumors die BC-Progression beeinflusst. BC-Zellen, die intrazelluläre Lipide akkumulieren, zeigen eine erhöhte Arzneimittelresistenz und einen invasiveren Phänotyp15. Während bc-Zellen gezeigt haben, dass sie die Lipolyse in unreifen, murinen Adipozyten induzieren, ist die physiologische Relevanz dieser Lipolyse induzieren, da das metabolische Crosstalk zwischen BC und primären menschlichen Brustadipozyten nie gezeigt wurde. Um zu zeigen, dass BC-MPS dieses Adipozyten-BC-metabolische Übersprechen modellieren kann, wurden RFP-markierte MDA-MB-231-Zellen allein oder in BC-MPS für 14 Tage kultiviert. Die Zellen wurden enzymatisch zu Einzelzellsuspension verdaut, mit dem neutralen Lipidfarbstoff Bodipy gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert (Abbildung 4A, B)16. Der Anteil lipidpositiver MDA-MB-231-Zellen war in BC-MPS- vs. 2D-Kultur um das 26,2-fache SEM +/- 2,5 höher (Abbildung 4C). Diese Zunahme der Lipidfärbung zeigt, dass die Krebszellen mit den Adipozyten interagieren und Lipide aufnehmen, die aus den reifen Adipozyten freigesetzt werden. Die Zellsortierung wurde durchgeführt, um rfP+ Bodipy+ Zellen auszuwählen. Nach dem Sortieren wurden die Zellen auf Kollagen plattiert, ich beschichtete Glasdeckschichten und ließ sie über Nacht anbringen. Am folgenden Tag wurden die Zellen für 30 min in 4% Paraformaldehyd fixiert und dann auf einem Fluoreszenzmikroskop bei 100-facher Vergrößerung abgebildet. Zellen, die in BC-MP kultiviert wurden (Abbildung 4E) zeigten erhöhte Lipidtröpfchen im Vergleich zu Zellen, die in Standard-2D-Kultur kultiviert wurden (Abbildung 4D). Dies zeigt metabolisches Übersprechen zwischen den BC-Zellen und dem HBT und zeigt auch, wie die Lipidakkumulation durch Durchflusszytometrie oder durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden kann. Eine weitere Analyse der Lipidakkumulation in Krebszellen kann durch Quantifizierung der Größe der Lipidtröpfchen und der Anzahl der Lipidtröpfchen pro Zelle erfolgen.

Amöbenbewegung
Metabolisches Cross-Talk zwischen BC-Zellen und Adipozyten erhöht die invasive Fähigkeit des Krebses. Um die erhöhte invasive Fähigkeit der mit dem HBT kultivierten Krebszellen zu beurteilen, wurde die Migration von BC-Zellen durch HBT mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die metastasierende TNBC-Zelllinie MDA-MB-231, die RPF exprimiert, wurde 4 Tage lang in BC-MPS kultiviert, damit sich das System stabilisieren konnte. Die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie wurde nach 4 Tagen durchgeführt, um die MDA-MB-231-Motilität mit einem Bild abbilden zu können, das alle 20 Minuten für 19 h bei 37 °C und 5% CO2aufgenommen wurde. Das resultierende Video zeigte amöboide Bewegungsmuster und einen überraschend hohen Grad an Motilität für die MDA-MB-231-Zellen (Abbildung 5 und Video 1). Dies zeigt eine Zunahme der invasiven Fähigkeit der BC-Zellen und der Fähigkeit der BC-Zellen, in die HBT einzudringen. Die Migration der BC-Zellen im HBT kann mit zuvor veröffentlichten Methoden zur Quantifizierung der Geschwindigkeit und Richtungsalität von migrierenden Zellen weiter analysiert werden17,18. Es wurde auch beobachtet, dass die MDA-MB-231-Zellen eine Mitose zu durchlaufen scheinen. Diese Verhaltensweisen stimmen mit seinem aggressiven Phänotyp überein, sind wichtige Verhaltensweisen für das Fortschreiten und die Metastasierung von Krebs und heben neue BC-Verhaltensweisen hervor, die für BC-Therapien ins Visier genommen werden können.

Figure 1
Abbildung 1:Allgemeiner Workflow der BC-MPS-Einrichtung. (A) Gelatine wird in einem aufrechten Kolben verfestigt. (B) Der Kolben mit Gelatine wird auf das thermoresponsive obere ASC-Zellblatt gelegt. (C) Ein Gewicht wird verwendet, um die Gelatine zu zwingen, den Kontakt mit dem Zellblatt aufrechtzuerhalten, während die Zellen bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren, gefolgt von einer Inkubation bei 4 °C für 30 min. (D) Der Kolben wird aus der kalten Schüssel entfernt und das intakte Zellblatt mit ihm entfernt. (E) Der Kolben mit dem oberen Zellblatt wird in eine Schüssel mit dem unteren Zellblatt und den gehackten HBT- und BC-Zellen übertragen. (F) Die untere Zellschale mit Medien, Kolben, HBT, BC und beide Zellblätter werden bei 37 °C für 30-60 min inkubiert, damit die Gelatine schmelzen und die Zellblätter von Kontakten abblättern können. (G) Wenn der Kolben entfernt wird, bleiben HBT und BC zwischen zwei ASC-Zellplatten eingeklemmt. Ein 3D-gedruckter Kolben wurde mit der kostenlosen Online-Software TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) entworfen und auf einem 3D-Drucker gedruckt. Der Kolben besteht aus Polymilchsäure. (H) Die Abmessungen eines Kolbens für 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte sind angegeben. Die Aussparung des Kolbens beträgt 2,5 mm. (I) Ein Bild des tatsächlichen 3D-gedruckten Kolbens wird gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Stabilität von BC-MPS in Kultur. (A) Ein Hellfeldbild bei 100-facher Vergrößerung der konfluenten ASCs, das das abgestreifte Muster der konfluenten Zellen zeigt. Scale bar = 100 μm. (B) BC-MPS, das 100 mg HBT enthielt, wurde in einer 6-Well-Platte kultiviert. Nach 14 Tagen wurde ein Farbfoto gemacht, um zu zeigen, dass das HBT am Boden des Brunnens einer 6-Well-Platte verankert ist. (C) Die dreifach negative BC-Zelllinie MDA-MB-231, die RFP exprimiert, wurde 14 Tage lang mit HBT kultiviert und dann mit Fluoreszenzmikroskopie bei 40-facher Vergrößerung abgebildet. Die Bilder zeigen, dass die MDA-MB-231-Zellen noch lebensfähig waren und im HBT wuchsen. Scale bar = 200 μm D) PDX Tumore von dreifach negativem Brustkrebs von Mäusen wurden in 3 cm2 Stück gehackt und mit Cell Tracker Red CMPTX markiert. Die Stücke wurden in HBT kultiviert und das resultierende BC-MPS wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 40-facher Vergrößerung an Tag 6 abgebildet, was seine Stabilität in der Kultur demonstrierte. Maßstabsleiste = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Erhaltung nativer HBT-Elemente in BC-MPS. BC-MPS wurde 14 Tage lang kultiviert und dann entweder mit Hellfeldmikroskopie bei 40x (A) abgebildet und dann mit 10% Formalin fixiert und mit Movats Pentachrom-Fleck gefärbt. Die Bilder wurden mit 100x (B) oder 20x (C) aufgenommen. Die Bildgebung des HBT zeigt die Konservierung großer unilokulärer Adipozyten, die sich zusammenballen, und Gewebescheiben zeigen das Vorhandensein der Konservierung des nativen ECM wie Kollagen (gelb) und retikuläre Fasern zwischen den Adipozyten (blau) an. Um die Konservierung von Makrophagen im Modell zu demonstrieren, wurde HBT für 0, 3 oder 7 Tage kultiviert, auf Makrophagenmarker gefärbt und mit konfokaler Mikroskopie abgebildet (D). Die fluoreszierende Intensität der Färbung der Makrophagenmarker wurde mit kommerziell erhältlicher Software quantifiziert, die zeigte, dass Makrophagen nach 3 und 7 Tagen in Kultur noch im Gewebe vorhanden sind. Maßstabsleiste = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentatives metabolisches Übersprechen zwischen Adipozyten und Krebszellen in BC-MPS. RFP-markierte MDA-MB-231-Zellen wurden 14 Tage lang in BC-MPS vs. 2D kultiviert, dann mit Bodipy (250 nM) gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. (A) Fluss von körpergefärbten MDA-MB-231-Zellen nach 14 Tagen in 2D-Kultur. Zellen in B2 waren Bodipy+RFP+; Zellen in B1 waren Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3,26%, was auf eine minimale Lipidakkumulation hinweist. (B) Durchflusszytometrie-Analyse von Bodipy-gefärbten MDA-MB-231-Zellen nach 14 Tagen in BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85,35%, was auf eine ausgedehnte Lipidakkumulation hinweist. (C) Lipidakkumulation in MDA-MB-231 Zellen nach 14 Tagen in 2D-Kultur vs. BC-MPS. Die fluoreszmikroskopische Analyse der Körperfärbung von MDA-MB-231 kultiviert in 2D (D) vs BC-MPS (E) zeigt eine erhöhte Lipidakkumulation in Zellen, die in BC-MPS gezüchtet wurden. Fehlerbalken zeigten SEM an. ** p < 0,01, n=2 biologische Replikate, Skalenbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Migration von TNBC in BC-MPS. RFP-markierte MDA-MB-231-Zellen wurden 4 Tage lang in BC-MPS kultiviert und dann sequenzielle Zeitrafferbilder von RFP-markierten BC-MPS + MDA-MB-231-Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen (ein Bild pro 60 min, 100-fache Vergrößerung). Gelbe Sternchen = mitotisches Ereignis. Gelbe Box = Zelltrümmer, die als Positionsreferenz verwendet werden. Blaue Pfeile = 231 Zellen, die eine amöboide Bewegung mit Pseudopoden und hoher Motilität zeigen. Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Repräsentative Migration von TNBC in BC-MPS. BC-MPS mit RFP-markierten MDA-MB-231-Zellen wurden 4 Tage lang kultiviert und die Fluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um die Zellen alle 20 Minuten nach 19 Stunden bei 37 ° C und 5% CO2 abbilden. Die Bilder wurden zu einem Video zusammengestellt (Ein Frame pro 60 Minuten, 100-fache Vergrößerung). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

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Discussion

Neue Systeme zur Modellierung von menschlichem Brustkrebs sind erforderlich, um ein besseres Verständnis der Krankheit zu entwickeln. Die Entwicklung menschlicher mikrophysiologischer Systeme zur Modellierung von Krankheitseinstellungen, die native ECM- und Stromazellen umfassen, wird die Vorhersagekraft präklinischer Studien erhöhen. Das hier vorgestellte BC-MPS-Modell ist ein neu entwickeltes System, das die Einschränkungen früherer Modelle überwindet und die Auswertung von BC in seiner nativen HBT-Umgebung ermöglicht. Dieses System kann mit Krebszelllinien oder mit Tumorerregungen verwendet werden und ist mindestens 14 Tage stabil. Die fluoreszierende Markierung der BC-Zellen ermöglicht es, ihre Echtzeit-Visualisierung der Motilität von Krebszellen und der Zell-Zell-Interaktionen, Migration, Lebensfähigkeit oder Proliferation entweder in Echtzeit oder zu bestimmten Zeitpunkten zu überwachen (Abbildung 3 und Abbildung 5). Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um wichtige Aspekte der Krebsbiologie in Bezug auf die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung aufzuklären. Die Befragung dieses Systems kann über die TME-Regulation des Krebsverlaufs, das Ansprechen des Medikaments und die Einleitung von Metastasen informieren.

Um das System erfolgreich einzurichten, müssen einige kritische Schritte befolgt werden. Der erste kritische Schritt ist die Kultivierung und Der Transfer der ASC-Zellblätter. Die pNIPAAm-beschichteten Platten sind temperaturempfindlich. Wenn die Platten über 32 °C liegen, ist die Oberfläche hydrophob und die ASCs haften an der Oberfläche. Die Oberfläche wird unterhalb dieser Temperatur hydrophil und die Zellen beginnen sich zu lösen19. Daher ist es notwendig zu bestimmen, wie schnell sich ein bestimmter Zelltyp von diesen Oberflächen löst. Bei HBT-abgeleiteten ASCs dauert dies > 30 Minuten, wenn die Zellen konfluent sind. Um zu verhindern, dass sich die Zellen während der normalen Wartung lösen, sollten die Medien auf 37 °C vorgewärmt und die Gewebekulturplatten nicht zu lange bei Raumtemperatur gehalten werden, um ein Abkühlen der Platten und ein Ablösen der Zellen zu verhindern. Es ist auch wichtig, den optimalen Zeitpunkt für die Gelatinekolben auf den pNIPAAm-beschichteten Platten zu bestimmen, um das gesamte Zellblatt zu übertragen. Die ASCs müssen konfluent sein und das gesamte Blatt muss übertragen werden. Wenn das obere Zellblatt keine Zeit hat, sich vollständig zu lösen und an die Gelatine zu binden, wird das Zellblatt während des Transfers gebrochen. Wenn das gesamte Zellblatt nicht vollständig übertragen wird, können die ASCs das schwimmende Brustgewebe nicht ein Sandwich bilden.

Die ASCs, die verwendet werden, um das HBT zu sandwichen, sind normale Stromazellen der Brustmikroumgebung, die ECM, Wachstumsfaktoren und Zytokine absondern, die BC20beeinflussen. Um das HBT zwischen zwei Zellblättern zu sandwichen, werden die ASC-Blätter mit thermoresponsiven Gewebekulturplatten übertragen. Dadurch kann das native ECM, das von den ASCs abgesondert wird, intakt sein und dient dazu, die schwimmfähigen Adipozyten im Gewebe zu verankern. Durch die Verwendung von ASCs, die aus menschlichem Brustgewebe gewonnen werden, wird sichergestellt, dass die Wechselwirkungen, die die ASCs mit den Krebszellen haben, nachahmen, was bei Brustkrebs auftritt, da ASCs aus verschiedenen Depots unterschiedliche Genexpression und ECM-Umbau aufweisen21.

Der zweite kritische Schritt ist die Verarbeitung des HBT. Es ist notwendig, frisch isoliertes HBT zu verwenden, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Bei der Verarbeitung des HBT ist es wichtig, das Gewebe fein zu hacken und so viel wie möglich von der Faszie zu entfernen. Wenn große Faszienstücke im HBT verbleiben, verhindert dies, dass die Zellblätter das Schwimmgewebe richtig verankern. Darüber hinaus können sich Faszien, die im Gewebe verbleiben, von der Platte dissoziieren und es werden mehrere Cluster des HBT mit sich gezogen, wodurch der Brunnen für weitere Experimente unbrauchbar wird. Das HBT sollte in der Mitte des Brunnens platziert werden, bevor das obere Zellblatt hinzugefügt wird, da die ASCs sonst nicht in der Lage sind, das HBT angemessen zu sandwichen, und das Gewebe am Rand der Vertiefungen wird nicht verankert. Wenn diese kritischen Schritte befolgt werden, ist der Prozess der Herstellung von BC-MPS einfach einzurichten.

Das hier beschriebene Modell ist ein verbessertes System zur Untersuchung von BC in seiner natürlichen Mikroumgebung von primärem HBT, das die reifen Adipozyten, ECM und ansässigen Immunzellen beibehält (Abbildung 4). Präklinischen Modellen, die die fettfreie Mikroumgebung nachahmen, fehlen mehrere Elemente der Mikroumgebung, wie reife Adipozyten, Immunzellen, Fibroblasten und das ECM. Die Verwendung von voll ausgereifter HBT ermöglicht die gleichzeitige und reziproke Abfrage dieser komplexen Umgebung, die mehrere Elemente umfasst, die die Krebsentwicklung, die Arzneimittelreaktion und die Invasivität durch parakrine und juxtacrine Signalisierung beeinflussen22,23,24,25. Residente Fibroblasten und ASCs beeinflussen die Krebsmetastasierung durch Umbau des ECM im Gewebe und durch parakrine Signalisierung26,27. Das ECM und sein Umbau sind essentiell für die Initiierung von Metastasen. Veränderungen in der ECM der Tumormikroumgebung beeinflussen die Migration und Metastasierung von BC, aber die meisten BC-Studien integrieren native ECM nicht in ihre Studien und verwenden stattdessen vereinfachte Modelle, die aus Kollagen I oder Matrigel bestehen28,29. Das ECM in BC-MPS stammt vom HBT und von den ASCs. So kann untersucht werden, wie das native ECM in der Tumormikroumgebung im Brustgewebe umgestaltet wird und Metastasen beeinflusst. Somit enthält dieses BC-MPS-Modell mehrere Elemente der Tumormikroumgebung, die frühere Modellsysteme nicht hatten.

Dieses Modell kann verwendet werden, um metabolisches Übersprechen zwischen voll ausgereiften Adipozyten und BC-Zellen zu untersuchen. Frühere Modelle, die die Interaktion zwischen Adipozyten und Krebszellen untersuchten, verwenden Präadipozyten, die in vitro differenziert werden. Präadipozyten, die in vitro differenziert werden, reifen nicht vollständig im gleichen Maße wie in vivo differenzierte Adipozyten30,31. Um zu verstehen, wie die Adipozyten das Fortschreiten des Krebses und die Arzneimittelreaktion beeinflussen, ist es wichtig, die komplexe molekulare und chemische Zusammensetzung nativer Adipozyten richtig nachzuahmen. Hier haben wir gezeigt, dass unser System es ermöglicht, das metabolische Übersprechen zwischen Adipozyten und BC-Zellen zu beurteilen (Abbildung 4).

BC-MPS kann auch bei der Durchführung von In-vitro-Studien verwendet werden, wie Erkrankungen wie Fettleibigkeit, die mit Standardzelllinien nicht richtig modelliert werden können, das Fortschreiten von Krebs beeinflussen. Fettleibigkeit ist mit einer Veränderung der Mikroumgebung von HBT und einer Zunahme der Metastasierung in BC verbunden, obwohl die genauen Mechanismen nicht vollständig verstanden werden32,33,34. Fibroblasten, ASCs, Adipozyten und ECM werden während der Fettleibigkeit verändert und fördern das Fortschreiten und die Metastasierung von Krebs weiter25,35,36. Daher ist es wichtig, native Stromazellen und ECM aus fettleibigem Gewebe zu verwenden, um zu verstehen, wie diese Veränderungen in den Stromazellen und ECM BC beeinflussen. Durch die Verwendung von HBT und ASCs von adipösen oder schlanken Patienten im BC-MPS-Modell können die Mechanismen aufgeklärt werden, durch die Fettleibigkeit einen metastasierten Phänotyp fördert.

Die hier vorgestellte Methode dient der Kultivierung von Brustkrebszellen in einer Kultur, die ASCs, reife Adipozyten und native ECM umfasst. Frühere Modelle von Co-Kulturen-Systemen haben untersucht, wie diese einzelnen verschiedenen Elemente der stromalen Umgebung Krebs beeinflussen. Da sowohl die ASCs als auch die Adipozyten die BC-Progression beeinflussen, kann es kompliziert sein zu bestimmen, welcher Zelltyp für die Beeinflussung der BC verantwortlich ist. Dies kann jedoch durch den Vergleich von BC-MPS mit einfacheren Co-Kulturmodellen mit einem Zelltyp bestimmt werden. Einer der Vorteile dieses Systems gegenüber On-a-Chip- oder Bioprinting-Systemen besteht darin, dass keine spezielle Ausrüstung erforderlich ist, um das System über die im Handel erhältlichen pNIPAAm-beschichteten Platten hinaus einzurichten. Modellsysteme von Brustgewebe wurden zuvor mit Bioprinting beschrieben, um ASCs in Gerüste abzuscheiden, die dann in Kultur22differenziert werden. Dies erfordert zusätzliche 2-3 Wochen, bis sich die Zellen differenziert haben, und ascs, die in Kultur differenziert wurden, differenzieren sich nicht vollständig zu reifen Adipozyten. Die reifen Adipozyten aus dem HBT in BC-MPS sind einsatzbereit, sobald sie einem Patienten entnommen werden.

Das hier beschriebene Modellsystem ist ein nützliches System zur Untersuchung des Übersprechens zwischen Krebszellen und der Mikroumgebung, hat jedoch einige Einschränkungen. Eine der größten Einschränkungen ist die Verfügbarkeit von primärem menschlichem Brustgewebe. Menschliches Fettgewebe kann nicht ohne Verlust der Lebensfähigkeit kryokonserviert werden, und daher muss das gewebe, das zur Herstellung von BC-MPS verwendet wird, frisch gewonnen und verwendet werden37. Eine weitere Einschränkung ist, dass das hier vorgestellte Modell ein statisches System ist, das in regulären 6-Well-Platten kultiviert wird. Dem System fehlt der mikrofluidische Fluss, der in Organen auf einem Chip vorhanden ist, was die Sauerstoff- und Nährstoffverfügbarkeit, den schieren Stress und die Medikamentenverteilung beeinflussen kann38,39. Eine dritte Einschränkung ist die Notwendigkeit, die Zellen am Ende des Experiments voneinander zu trennen, wenn die verschiedenen Zelltypen einzeln analysiert werden müssen. Dies erfordert die Notwendigkeit, die Zellen so zu beschriften, dass sie voneinander getrennt werden können.

Die Einbeziehung vieler Elemente der Tumormikroumgebung erzeugt ein physiologisches Modell zur Untersuchung des Fortschreitens von Krebs und der Einleitung von Metastasen. Neben der Möglichkeit, Krebszellen in einem physiologischeren Modell zu untersuchen, kann BC-MPS auch verwendet werden, um die einzelnen Elemente der Mikroumgebung zu untersuchen und wie sie von Krebs beeinflusst werden. Während die hier dargestellten Daten zeigen, wie BC-MPS mit einer Zelllinie verwendet werden kann, kann BC-MPS leicht an den speziellen experimentellen Bedarf eines Forschers angepasst werden. Zum Beispiel kann fettleibiges HBT mit magerem HBT verglichen werden, um festzustellen, wie Fettleibigkeit krebsmetastasen und -progression beeinflusst. Verschiedene Subtypen von BC können in BC-MPS eingesät werden, um zu untersuchen, wie Subtypen von Krebs unterschiedlich mit der Mikroumgebung interagieren. Gen-Editing-Techniken können verwendet werden, um zu bestimmen, wie bestimmte Gene die Interaktion zwischen BC und der Mikroumgebung beeinflussen. Dieses Modell und seine Anwendungen werden ein genaueres Verständnis dafür ermöglichen, wie die stromale Umgebung und Brustkrebs interagieren, um das Fortschreiten und die Metastasierung von Krebs zu fördern.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine interessenkonflikte haben.

Acknowledgments

Wir danken dem Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core sowie dem Tulane Histology Core für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Southeastern Society of Plastic & Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant und der National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

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