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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Modélisation du cancer du sein dans le tissu mammaire humain à l’aide d’un système microphysiologique

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

Ce protocole décrit la construction d’un système microphysiologique in vitro pour étudier le cancer du sein utilisant le tissu humain primaire de sein avec les matériaux de commerce.

Abstract

Le cancer du sein (C.-B.) demeure l’une des principales causes de décès chez les femmes. Malgré plus de 700 millions de dollars investis dans la recherche en Colombie-Britannique chaque année, 97 % des médicaments candidats de la Colombie-Britannique échouent aux essais cliniques. Par conséquent, de nouveaux modèles sont nécessaires pour améliorer notre compréhension de la maladie. Le programme de systèmes microphysiologiques (MPS) des NIH a été développé pour améliorer l’application clinique des découvertes scientifiques fondamentales et des nouvelles stratégies thérapeutiques prometteuses. Nous présentons ici une méthode de génération de MPS pour les cancers du sein (BC-MPS). Ce modèle adapte une approche précédemment décrite de culture du tissu adipeux blanc humain primaire (WAT) en prenant en sandwich WAT entre les feuilles de cellules souches adipeuses-dérivées (ASC) s. Les nouveaux aspects de notre BC-MPS comprennent l’ensemencement de cellules BC dans le tissu mammaire humain non malade (HBT) contenant la matrice extracellulaire native, les adipocytes matures, les fibroblastes résidents et les cellules immunitaires; et la prise en sandwich du mélange BC-HBT entre les feuilles ASC dérivées de HBT. Le BC-MPS résultant est stable en culture ex vivo pendant au moins 14 jours. Ce système modèle contient plusieurs éléments du microenvironnement qui influencent la Colombie-Britannique, y compris les adipocytes, les cellules stromales, les cellules immunitaires et la matrice extracellulaire. Ainsi, BC-MPS peut être utilisé pour étudier les interactions entre BC et son microenvironnement.

Nous démontrons les avantages de notre BC-MPS en étudiant deux comportements de BC connus pour influencer la progression et la métastase de cancer : 1) motilité de BC et 2) diaphonie métabolique de BC-HBT. Tandis que la motilité de BC a été précédemment démontrée utilisant l’imagerie intravital, BC-MPS tient compte de l’imagerie time-lapse à haute résolution utilisant la microscopie de fluorescence pendant plusieurs jours. En outre, tandis que la diaphonie métabolique a été précédemment démontrée utilisant des cellules de BC et des pre-adipocytes murins différenciés en adipocytes non mûrs, notre modèle de BC-MPS est le premier système à démontrer cette diaphonie entre les adipocytes mammaires humains primaires et les cellules de BC in vitro.

Introduction

Chaque année, plus de 40 000 femmes américaines meurent d’un cancer du sein (BC)1. Malgré plus de 700 millions de dollars investis dans la recherche en Colombie-Britannique chaque année, 97 % des médicaments candidats de la Colombie-Britannique échouent aux essais cliniques2,3. De nouveaux modèles sont nécessaires pour améliorer le pipeline de développement de médicaments et notre compréhension de la Colombie-Britannique. Le programme microphysiologique (MPS) des NIH a délimité les caractéristiques requises pour des modèles révolutionnaires visant à améliorer la traduction de la science fondamentale en succès clinique4. Ceux-ci comprenaient l’utilisation de cellules ou de tissus humains primaires, stables en culture pendant 4 semaines, et l’inclusion de l’architecture tissulaire native et de la réponse physiologique.

Les modèles actuels in vitro de BC, tels que la culture bidimensionnelle des variétés de cellule de BC, la co-culture d’insertion de membrane, et les sphéroïdes et organoïdes tridimensionnels, ne répondent pas aux critères de MPS des NIH parce qu’aucun de ces derniers récapitule l’architecture native de tissu de sein. Lorsque la matrice extracellulaire (ECM) est ajoutée à ces systèmes, l’ECM du sein n’est pas utilisée; au lieu de cela, des gels de collagène et des matrices de membrane basale sont utilisés.

Les systèmes in vivo actuels, tels que les xénogreffes dérivées de patients (PDX), ne répondent pas de même aux critères de MPS des NIH parce que les tissus mammaires murins diffèrent considérablement des seins humains. D’ailleurs, les interactions système immunitaire-BC sont de plus en plus reconnues comme clés dans le développement de tumeur, mais les modèles murins immunocompromised utilisés pour générer des tumeurs pdx manquent des cellules T mûres, des cellules de B, et des cellules tueuses naturelles. En outre, tandis que PDX permet aux tumeurs primaires de sein d’être maintenues et développées, les tumeurs de PDX résultantes sont infiltrées avec les cellules stromal murines primaires et l’ECM5.

Pour surmonter ces défis, nous avons développé un nouveau, ex vivo, mps humain tridimensionnel de sein qui répond aux critères de MPS nih. La base de notre MPS mammaire est faite en sandwichant le tissu mammaire humain primaire (HBT) entre deux feuilles de cellules souches dérivées de l’adipose (ASC), également isolées de HBT (Figure 1). Les pistons pour le transfert des feuilles de cellules en sandwich le HBT peuvent être imprimés en 3D ou fabriqués à partir de plastiques acryliques simples(Figure 1H,I). Cette technique adapte notre approche précédemment décrite pour la culture du tissu adipocytaire blanc humain primaire6,7. Le mps de sein peut alors être ensemencé par un modèle de BC de choix, s’étendant des variétés de cellule standard de BC aux tumeurs humaines primaires de sein. Ici, nous montrons que ces BC-MPS sont stables en culture pendant plusieurs semaines (Figure 2) ; inclure des éléments natifs de l’HBT tels que les adipocytes mammaires, l’ECM, l’endothélium, les cellules immunitaires (Figure 3); et récapituler les interactions physiologiques entre BC et HBT telles que la diaphonie métabolique (Figure 4). Enfin, nous montrons que BC-MPS permet l’étude du mouvement amiboïde des cellules BC dans tout HBT (Figure 5).

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Protocol

Tous les tissus humains ont été prélevés conformément au protocole #9189 tel qu’approuvé par le Bureau du Conseil d’examen institutionnel du LSUHSC.

1. Ensemencement de cellules souches dérivées d’adipeux (ASC) pour les feuilles cellulaires

  1. Acheter des CSA de sources commerciales ou isoler du tissu mammaire humain primaire en suivant les protocoles établis8,9. Ensemencer des ASC du sein humain à une densité de 70 % (~ 80 000 cellules/cm2 de surface) sur des plaques de culture tissulaire standard à 6 puits dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complétées par 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine (milieu BC-MPS). S’assurer que les CSA à utiliser pour former les feuilles cellulaires doivent être inférieurs au passage 10.
    1. Pour chaque puits du système microphysiologique du cancer du sein (BC-MPS) qui sera généré, des cellules de semence dans 1 puits de culture tissulaire standard et 1 puits de taille similaire sur une plaque en plastique de culture tissulaire revêtue de poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm). Une plaque de 6 puits de BC-MPS nécessitera une culture tissulaire standard 6 plaque de puits (en bas) et une plaque revêtue de pNIPAAm (en haut). Les plaques pNIPAAm peuvent être achetées auprès de sources commerciales ou peuvent être revêtues en laboratoire10,11,12.
  2. Culture asc dans un incubateur de culture tissulaire à 37°C et 5% deCO2. Changez les médias tous les 2-3 jours dans une armoire de biosécurité.
  3. Culturez les ASC jusqu’à ce qu’ils deviennent 100% confluents et forment un motif strié. Selon la confluence à laquelle ils ont été ensemencés, cela prendra 7 à 10 jours. Des feuilles de cellules confluentes sont exigées pour ancrer le tissu adipeux flottaillant de sein.

2. Préparation des fournitures nécessaires pour BC-MPS

  1. Pour préparer la gélatine pour les plaques à 6 puits, faites une solution de gélatine à 12% dans H2O. Distillé Mélangez 19 g de gélatine de type B (force de gel de ~ 225 Bloom) et 125 mL deH2O dans une bouteille de support en verre de 250 mL. Ajouter 1,6 mL de NaOH 1 M à la solution pour neutraliser le pH.
  2. Autoclaver la solution sous un cycle liquide pendant 25 min pour stériliser la solution.
  3. Laisser refroidir la solution à 37 °C. Dans une armoire de biosécurité stérile, ajouter 16 mL de solution saline équilibrée (HBSS) hanks stérile 10x à la solution pour obtenir un volume final de 160 mL.
    REMARQUE: La solution de gélatine peut être utilisée immédiatement ou stockée à température ambiante pour une utilisation ultérieure. La gélatine préparée est stable à température ambiante pendant 1 mois. Si seulement quelques pistons sont nécessaires, une solution de 10 mL peut être fabriquée et filtrée stérile le même jour que la fabrication de BC-MPS comme décrit précédemment7.
    1. Pour préparer la solution de gélatine par stérilisation par filtre, diluer 1 mL de 10x HBSS avec 9 mL deH2Opour faire une solution 1x HBSS dans un tube conique de 15 mL. Ajouter 100 μL de NaOH 1 M à chaque tube de 10 mL, puis ajouter 0,7 g de gélatine à la solution. Mélanger vigoureusement la solution pour dissoudre la gélatine.
    2. Incuber le tube dans un bain-marie à 75 °C pendant 20 minutes en secouant toutes les 5 minutes. Utilisez une seringue de 10 mL et un filtre à seringue de 0,22 μm pour filtrer la solution de gélatine. Filtrer la solution de gélatine directement sur les pistons dans une armoire de biosécurité.
  4. Imprimez en 3D ou utilisez de l’acrylique simple pour fabriquer les pistons utilisés pour transférer les feuilles de cellule. Assurez-vous que les pistons s’adaptent lâchement à la taille souhaitée de puits. Un piston imprimé en 3D standard est illustré à la figure 1. Les pistons peuvent être conçus à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur standard tel que TinkerCad et imprimés à l’aide d’imprimantes 3D à filament compatibles avec l’acide polylactique (PLA)13,14.
  5. Pour préparer un rack pour tenir les pistons, placez un rack à tubes de 15 mL dans une armoire de biosécurité. Placez les pistons à l’envers dans le rack, de sorte que le bas des pistons soit orienté vers le haut. Placez une boîte en plastique avec un couvercle pour le transport de BC-MPS dans l’armoire de biosécurité. Il est recommandé que la boîte ait une longueur d’au moins 35,5 cm x 28 cm de largeur x 8,25 cm de hauteur pour s’adapter à 4 plaques de BC-MPS. Retirez le couvercle de la boîte et vaporisez le rack, les pistons et la boîte avec 70% d’EtOH.
  6. Préparez des lames et des pinces de rasoir stériles en les autoclavant ou en les plaçant dans une armoire de biosécurité et en les lavant avec 70% d’EtOH.
  7. Vaporisez les pistons et la boîte avec 70% d’EtOH et allumez la lumière UV dans l’armoire de biosécurité pendant au moins 30 minutes pour stériliser les fournitures.

3. Préparez les pistons de gélatine et appliquez-les sur les feuilles cellulaires supérieures

  1. Si la solution de gélatine a été préalablement préparée, chauffer dans un bain-marie à 37°C pour la faire fondre.
  2. Pipeter la solution de gélatine sur les pistons de l’armoire de biosécurité à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ou 10 mL. Un piston pour 1 puits d’une plaque de 6 puits nécessitera environ 2,5 mL de gélatine.
  3. Une fois que la gélatine s’est solidifiée sur les pistons (~ 30-45 min), déplacez les plaques ASC revêtues de pNIPAAm vers l’armoire de biosécurité. Placez délicatement les pistons dans les puits des plaques ASC revêtues de pNIPAAm afin que la gélatine entre en contact avec les ASC. Placez une rondelle métallique (~ 7,5 g) sur le piston pour alourdir le piston afin que la gélatine soit en contact direct avec la feuille de cellule ASC. Laissez les pistons sur les feuilles cellulaires ASC à température ambiante pendant 30 min.
  4. Déplacez doucement la plaque avec les pistons dans la boîte stérile de l’armoire de biosécurité et placez le couvercle dessus. Déplacez la boîte dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 30 min. Si un réfrigérateur à 4 °C n’est pas disponible, placez l’assiette sur de la glace dans un seau à glace dans l’armoire de biosécurité pendant 30 min.

4. Préparation des lignées cellulaires cancéreuses

  1. Ensemencez les lignées cellulaires cancéreuses dans un plat de culture tissulaire T75 standard et conservez-les en culture afin qu’elles soient confluentes à environ 80 % le jour où BC-MPS sera traité. (~ 200 000 cellules cancéreuses seront nécessaires par BC-MPS). Cultiver les cellules cancéreuses dans des milieux normaux.
    REMARQUE: Pour identifier et isoler les cellules cancéreuses, il est recommandé que les cellules soient transfectées avec une protéine fluorescente pour les distinguer des ASC et du tissu mammaire. Le nombre de cellules cancéreuses nécessaires par BC-MPS a été optimisé pour les cellules MCF7 et MDA-MB-231. D’autres lignées cellulaires peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire.
  2. Le jour de la préparation du BC-MPS, déplacez le ballon contenant les cellules cancéreuses vers l’armoire de biosécurité. Aspirer le support du ballon. Laver le ballon avec 5 mL de PBS.
  3. Ajouter 1 mL de solution de décollement cellulaire dans le ballon contenant les cellules cancéreuses, puis incuber le ballon dans un incubateur à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se sont détachées (~2-5 min).
  4. Dans l’armoire de biosécurité, ajouter 9 mL de PBS au ballon, transférer les cellules du PBS dans un tube conique de 15 mL et compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  5. Centrifuger les cellules cancéreuses à 500 x g pendant 5 min à température ambiante.
  6. Ressuscitez les cellules dans les médias BC-MPS de sorte qu’il y ait 2 x 106 cellules/mL.
  7. Placer les cellules cancéreuses dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être ajoutées au tissu humain.

5. Traitement du tissu mammaire humain

  1. Dans une armoire de biosécurité, lavez le tissu mammaire humain (HBT) 3x avec 10 mL de PBS stérile.
  2. Utilisez une pince stérile et une lame de rasoir pour hacher grossièrement le BC-MPS et essayez d’enlever autant de fascia et de tissu conjonctif que possible. Le défaut d’enlever le tissu conjonctif peut avoir comme conséquence la couche supérieure de l’ASC pour ne pas ancrer correctement le HBT.
    REMARQUE: Le fascia et le tissu conjonctif peuvent être identifiés par son aspect blanc ou clair par rapport à la couleur jaune du tissu adipeux.
  3. Une fois que le tissu conjonctif a été enlevé, utilisez une lame de rasoir stérile pour hacher finement le tissu jusqu’à ce qu’il ait une consistance liquide homogène. Le tissu est finement haché quand il peut facilement être pipeté utilisant une pointe sérologique de 25 mL.
  4. Utilisez une lame de rasoir stérile pour couper la pointe d’une pointe de pipette p1000 pour aider à pipetter le HBT haché.
  5. Dans un tube de 1,5 mL, mélanger le HBT haché, les lignées cellulaires cancéreuses et les milieux BC-MPS (pour 1 puits d’une plaque de 6 puits, cela nécessite 200 μL de HBT haché, 100 μL de milieu BC-MPS et 100 μL de cellules cancéreuses).
  6. Déplacez la plaque ASC qui sera utilisée pour la feuille de cellule inférieure de l’incubateur à l’armoire de biosécurité. Aspirez le support à partir de la plaque ASC inférieure. Pipetter le mélange sur le centre du puits de la plaque ASC inférieure à l’aide d’une pointe de pipette p1000 dont l’extrémité distale était coupée de l’étape 5.4
  7. Déplacez la boîte contenant la plaque ASC supérieure avec les pistons dessus vers l’armoire de biosécurité. Retirez délicatement les pistons de gélatine de la plaque recouverte de pNIPAAm et placez-les sur le mélange hbt. Ajouter un support BC-MPS au puits (pour 1 puits d’une plaque de 6 puits, ajoutez 2 mL de support). Déplacez soigneusement les plaques ASC inférieures avec le mélange BC-MPS et les pistons vers la boîte en plastique stérile et placez le couvercle de la boîte pour le transport.
    REMARQUE: Le couvercle de la plaque de 6 puits ne rentrera pas sur la plaque ASC pendant que les pistons sont allumés. Il faut prendre soin d’éviter de contaminer la culture.
  8. Incuber la plaque inférieure dans la boîte dans un incubateur à 37 ° C jusqu’à ce que la gélatine ait fondu et que la couche ASC supérieure ait commencé à adhérer à la couche inférieure (~ 30 min).
  9. Déplacez la boîte avec les plaques vers l’armoire de biosécurité. Retirez délicatement les pistons des plaques inférieures. Le tissu avec les cellules cancéreuses sera ancré au fond du puits.
  10. Replacez le couvercle de la plaque de 6 puits sur la plaque inférieure et incuber à 37 ° C pour faire fondre complètement la gélatine et permettre à la couche supérieure de s’ancrer complètement à la couche inférieure (~ 30-60 min).
  11. Déplacez délicatement les plaques dans une armoire de biosécurité et aspirez le support avec une pipette sérologique de 10 mL. Ajouter 2 mL de supports frais à chaque puits. Aspirer du bord du puits et pipetter sur le bord du puits pour éviter de délaliser le tissu.
  12. Maintenir le BC-MPS à 37 °C et 5 % deCO2 pendant la durée souhaitée et changer de milieu tous les 2-3 jours.

6. Digestion du BC-MPS pour analyse

  1. Lorsque le BC-MPS est prêt à être analysé, déplacez la plaque vers l’armoire de biosécurité. Retirez les supports à l’munis d’une pipette sérologique pour éviter le délogement accidentel de tout tissu.
  2. Ajoutez 1 volume de PBS à chaque puits.
  3. Retirez le PBS à l’muni d’une pipette sérologique.
  4. Ajouter 1 mL de solution de dissociation cellulaire à chaque puits. Ramenez la plaque à l’incubateur et incuber à 37 °C pendant 5 min pour permettre aux cellules de se détacher. Dans une armoire de biosécurité, utilisez un grattoir à cellules pour détacher complètement les cellules et le tissu de la plaque de culture.
  5. Transférer la solution avec le tissu dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique. Ajouter 2 mL de PBS à chaque puits pour recueillir les cellules restantes et transférer cette solution dans le tube conique. Si les cellules sont fluorescentes, enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière.
  6. Incuber le tube à 37 °C sous agitation constante dans un agitateur orbital à 1 x g pendant 10-20 min pour dissocier complètement les cellules du tissu.
  7. Dans une armoire de biosécurité, utilisez une pipette sérologique pour perturber les touffes de cellules restantes dans le tube et filtrez l’échantillon à travers une passoire tissulaire de 250 μm dans un nouveau tube de 15 mL. Pipeter la solution lentement à travers la passoire afin qu’elle ne déborde pas.
  8. Rincez la crépine avec 1 mL de PBS pour recueillir toutes les cellules encore dans la passoire.
  9. Centrifuger les échantillons à 500 x g à température ambiante pendant 5 min. Après centrifugation, les adipocytes flotteront sur la couche supérieure de la solution tandis que les cellules cancéreuses et les ASC seront mélangés ensemble dans une pastille au fond du tube.
  10. Pour isoler les adipocytes, versez doucement la couche supérieure dans un nouveau tube ou coupez alternativement la pointe d’une pointe de pipette p1000 et transférez la couche supérieure dans un nouveau tube. Centrifuger à nouveau l’échantillon à 500 x g pendant 5 min et utiliser une seringue et une aiguille pour retirer la solution sous les adipocytes afin qu’il ne reste que les adipocytes. Les adipocytes sont maintenant prêts pour l’analyse
  11. Après avoir retiré les adipocytes de la solution, séparez les ASC et les cellules cancéreuses les unes des autres pour l’analyse si les cellules cancéreuses ont déjà été transfectées avec une protéine fluorescente. Aspirer la solution restante du tube contenant les ASC et les cellules cancéreuses sans perturber la pastille cellulaire. Ressusciter la pastille dans des milieux PBS ou BC-MPS et utiliser la cytométrie en flux pour trier les cellules en fonction de la fluorescence.

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Representative Results

Stabilité dans la culture
BC-MPS est un système microphysiologique stable qui peut être cultivé in vitro pendant au moins 14 jours. Une image en champ clair des feuilles de cellules ASC a été prise à un grossissement de 100x pour afficher le motif strié de la feuille confluente(Figure 2A). Les feuilles cellulaires ASC sont stables en culture pendant au moins 4 semaines. BC-MPS à 14 jours en culture dans un puits d’une plaque de 6 puits a été essoufflé avec une caméra couleur démontrant que le HBT flottant est toujours solidement ancré par les feuilles cellulaires ASC au fond du puits après 14 jours(Figure 2B). Cela démontre que la feuille cellulaire utilisée pour sandwicher le tissu adipeux est toujours intacte. La lignée cellulaire triple négative MDA-MB-231 exprimant la demande de propositions a été cultivée dans du HBT pendant 14 jours, puis essoit à l’appel d’un microscope fluorescent démontrant la stabilité du BC-MPS avec des lignées cellulaires jusqu’à au moins 14 jours(figure 2C). La présence des cellules BC dans le tissu démontre la capacité des cellules cancéreuses à envahir le HBT. Un explant négatif triple de PDX a été excisé d’une souris, souillé avec l’appareil de suivi de cellules CMTPX et cultivé avec HBT. Des images de microscopie fluorescente ont été prises au jour 6 pour montrer la stabilité de BC-MPS avec des explants tumoraux pendant au moins 6 jours(figure 2D). Ceci démontre que BC-MPS peut être employé pour culturer des explants de tumeur avec HBT aussi bien que des variétés de cellule.

Éléments HBT natifs
BC-MPS contient les éléments natifs de HBT dans la culture. BC-MPS contenant mg 100 de HBT ont été cultivés in vitro pendant 14 jours. Le tissu a été imbridé à l’aide d’une microscopie à champ brillant après 14 jours en culture(figure 3A). Cette image démontre la préservation des grappes d’adipocytes matures à 14 jours en culture. Le tissu a ensuite été fixé avec du forilite à 10%, de la paraffine incorporée, sectionné à 5 μm à l’aide d’un microtome, puis coloré avec une coloration pentachrome Movats à l’aide d’un protocole standard. Les sections fixes ont été ibrées à 100x(Figure 3B)ou 20x(Figure 3C). Les images démontrent que le BC-MPS contient le collagène indigène (violet), les fibres réticulaires (bleu), et les adipocytes grande forme uniloculaire entre le tissu conjonctif est préservée à 14 jours dans la culture. Pour identifier les macrophages primaires dans le système, HBT a été cultivé pendant 0, 3 et 7 jours et puis fixé et souillé avec l’anti-CD45, l’anti-CD68, et l’anti-CD206. CD45 a été employé comme identificateur général de leucocyte. CD68 a été employé comme tache de monocyte pour identifier des macrophages tandis que CD206 identifie un récepteur commun présent sur des macrophages. La coloration des marqueurs macrophages a été quantifiée à l’aide d’un logiciel d’imagerie(figure 3D). Ceci démontre la conservation des macrophages primaires après 3 et 7 jours dans la culture. Ces données démontrent que BC-MPS préserve les éléments indigènes de HBT dans la culture. D’autres expériences peuvent être menées pour étudier comment les cellules BC remodelent les éléments natifs de HBT. Cela peut inclure l’évaluation des changements dans les marqueurs des macrophages pour déterminer s’ils sont altérés par la présence de cellules BC. Les changements dans l’ECM peuvent être analysés plus avant en comparant la coloration pentachrome movats des échantillons qui ont été cultivés avec ou sans cellules BC pour déterminer si la teneur en collagène est modifiée et la taille des adipocytes peut être comparée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image tel que l’image J pour déterminer si les cellules BC modifient la taille des adipocytes.

Diaphonie métabolique
La diaphonie métabolique d’Adipocyte-cancer est une voie importante par laquelle le microenvironnement de tumeur influence la progression de BC. Les cellules BC qui accumulent des lipides intracellulaires démontrent une résistance accrue aux médicaments et un phénotype15plus invasif. Tandis que des cellules de BC ont été montrées pour induire la lipolyse dans les adipocytes immatures et murins, la pertinence physiologique de ceci est demeurée peu claire parce que la diaphonie métabolique entre bc et adipocytes mammaires humains primaires n’a été jamais montrée. Pour démontrer que BC-MPS peut modéliser cette diaphonie métabolique adipocyte-BC les cellules MDA-MB-231 RFP-étiquetées ont été cultivées seules ou dans BC-MPS pendant 14 jours. Les cellules ont été digérées enzymatiquement en suspension unicellulaire, colorées avec le colorant lipidique neutre Bodipy, et analysées par cytométrie de flux (figure 4A,B)16. La proportion de cellules MDA-MB-231 lipide-positives était 26,2 fois SEM +/- 2,5 plus grande dans BC-MPS contre la culture 2D(figure 4C). Cette augmentation de la coloration lipidique démontre que les cellules cancéreuses interagissent avec les adipocytes et prennent les lipides libérés par les adipocytes matures. Le tri de cellules a été exécuté pour sélectionner pour RFP + Bodipy + cellules. Après le tri, les cellules ont été plaquées sur des lamaux de verre enduits de collagène I et laissées se fixer pendant la nuit. Le lendemain les cellules ont été fixées dans le paraformaldéhyde de 4% pendant 30 minutes et puis essoit sur un microscope fluorescent au grossissement de 100x. Les cellules cultivées en BC-MP(figure 4E)présentaient une augmentation des gouttelettes lipidiques par rapport aux cellules cultivées en culture 2D standard(figure 4D). Ceci démontre la diaphonie métabolique entre les cellules de BC et le HBT et, également, montre comment l’accumulation de lipides peut être analysée par cytométrie de flux ou par microscopie fluorescente. Une analyse plus approfondie de l’accumulation de lipides dans les cellules cancéreuses peut être faite en quantifiant la taille des gouttelettes lipidiques et le nombre de gouttelettes lipidiques par cellule.

Mouvement amiboïde
Le diaphonie métabolique entre les cellules BC et les adipocytes augmente la capacité invasive du cancer. Pour évaluer la capacité invahissante accrue des cellules cancéreuses cultivées avec le HBT la migration des cellules de BC dans tout HBT a été évaluée par microscopie de fluorescence. La variété de cellule métastatique MDA-MB-231 de TNBC exprimant RPF a été cultivée dans BC-MPS pendant 4 jours pour permettre au système de se stabiliser. La microscopie à fluorescence time-lapse a été réalisée après 4 jours pour imager la motilité MDA-MB-231 avec une image capturée toutes les 20 minutes pendant 19 h à 37 °C et 5% deCO2. La vidéo qui en a résulté a démontré des modèles de mouvement amiboïde et un degré étonnamment élevé de motilité pour les cellules MDA-MB-231(Figure 5 et Vidéo 1). Ceci démontre une augmentation de la capacité invahissante des cellules de BC et de la capacité des cellules de BC d’envahir le HBT. La migration des cellules BC dans le HBT peut être analysée plus avant en utilisant des méthodes précédemment publiées pour quantifier la vitesse et la directionnalité des cellules migratrices17,18. On a également observé les cellules MDA-MB-231 pour sembler subir la mitose. Ces comportements sont compatibles à son phénotype agressif, sont des comportements importants pour la progression et la métastase de cancer, et mettent en évidence de nouveaux comportements de BC qui peuvent être ciblés pour des thérapies de BC.

Figure 1
Figure 1: Flux de travail général de la configuration BC-MPS. (A) La gélatine est solidifiée dans un piston vertical. (B) Le piston avec de la gélatine est placé sur la feuille de cellule ASC supérieure thermorésensible. (C) Un poids est utilisé pour forcer la gélatine à maintenir le contact avec la feuille cellulaire pendant que les cellules couvent à température ambiante pendant 30 min, suivie d’une incubation à 4 °C pendant 30 min. (D) Le piston est retiré de la parabole froide en enlevant la feuille cellulaire intacte avec elle. (E) Le piston avec la feuille de cellule supérieure est transféré dans une parabole contenant la feuille de cellule inférieure et les cellules HBT et BC hachées. (F) La parabole de la cellule inférieure avec support, piston, HBT, BC et les deux feuilles cellulaires sont incubées à 37 °C pendant 30-60 min pour permettre à la gélatine de fondre et aux feuilles cellulaires aux contacts. (G) L’enlèvement du piston laisse le HBT et le BC pris en sandwich entre deux feuilles cellulaires ASC. Un piston imprimé en 3D a été conçu à l’aide du logiciel en ligne gratuit TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) et imprimé sur une imprimante 3D. Le piston est composé d’acide polylactique. (H) Les dimensions d’un piston pour 1 puits d’une plaque de 6 puits sont indiquées. L’évidement du piston est de 2,5 mm.(I)Une image du piston imprimé en 3D réel est montrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Stabilité représentative du BC-MPS en culture. (A) Image en champ lumineux à grossissement 100x des ASC confluents démontrant le motif strié des cellules confluentes. Barre d’écaille = 100 μm.(B)BC-MPS, contenant 100 mg de HBT, a été cultivée dans une plaque de 6 puits. Après 14 jours, une photographie couleur a été prise pour démontrer que le HBT est ancré au fond du puits d’une plaque de 6 puits. (C) La lignée cellulaire triple négative de BC MDA-MB-231 exprimant la RFP a été cultivée avec HBT pendant 14 jours et puis essomé utilisant la microscopie fluorescente au grossissement de 40x. Les images démontrent que les cellules MDA-MB-231 étaient toujours viables et en croissance dans le HBT. Barre d’échelle = 200 μm D) PDX Les tumeurs du cancer du sein triple négatif de souris ont été hachées en morceaux de 3 cm2 et étiquetées avec Cell Tracker Red CMPTX. Les morceaux ont été cultivés dans HBT et le BC-MPS résultant a été céféré à l’aide d’un microscope fluorescent à un grossissement 40x le jour 6 démontrant sa stabilité en culture. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Préservation représentative des éléments natifs du HBT présents dans le BC-MPS. BC-MPS a été cultivé pendant 14 jours et puis l’un ou l’autre ime avec la microscopie de champ lumineux à 40x(A)et puis fixé avec du forcine de 10% et souillé avec la tache pentachrome de Movats. Les images ont été prises à 100x(B)ou 20x(C). L’imagerie du HBT indique la préservation de grands adipocytes uniloculteurs regroupés et des tranches de tissu indique la présence de la préservation de l’ECM natif tel que le collagène (jaune) et les fibres réticulaires entre les adipocytes (bleu). Pour démontrer la préservation des macrophages dans le modèle HBT a été cultivé pendant 0, 3, ou 7 jours, souillé pour des marqueurs de macrophage, et ireté utilisant la microscopie confocale(D). L’intensité fluorescente de la souillure des marqueurs de macrophage a été quantifiée utilisant le logiciel disponible dans le commerce démontrant que les macrophages sont encore présents dans le tissu après 3 et 7 jours dans la culture. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Diaphonie métabolique représentative entre les adipocytes et les cellules cancéreuses dans bc-mps. des cellules MDA-MB-231 RFP-étiquetées ont été cultivées dans BC-MPS contre 2D pendant 14 jours, puis souillées avec Bodipy (250 nM) et analysées par cytometry d’écoulement. (A) Écoulement des cellules MDA-MB-231 Bodipy-souillées après 14 jours dans la culture 2D. Les cellules dans B2 étaient Bodipy+RFP+; les cellules dans B1 étaient Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3,26%, indiquant une accumulation minimale de lipides. (B) Analyse cytometry de flux des cellules MDA-MB-231 Bodipy-souillées après 14 jours dans BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85,35%, indiquant une accumulation étendue de lipides. (C) Accumulation de lipides dans les cellules MDA-MB- 231 après 14 jours dans la culture 2D contre BC-MPS. L’analyse fluorescente de microscopie de la souillure de Bodipy de MDA-MB-231 cultivée en 2D(D)contre BC-MPS(E)démontre l’accumulation accrue de lipide dans les cellules cultivées dans BC-MPS. Les barres d’erreur indiquaient SEM. ** p < 0,01, n=2 répétitions biologiques, Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Migration représentative du TNBC dans bc-mps. des cellules MDA-MB-231 RFP-étiquetées ont été cultivées dans BC-MPS pendant 4 jours et puis des images séquentielles de BC-MPS + MDA-MB-231 RFP-marqués ont été capturées utilisant un microscope de fluorescence (une trame par 60 min, grossissement 100x.) Astérisques jaunes = événement mitotique. Boîte jaune = débris cellulaires utilisés pour la référence de position. Flèches bleues = 231 cellules montrant un mouvement amiboïde avec des pseudopodes et une motilité élevée. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1: Migration représentative de TNBC dans BC-MPS. Bc-MPS contenant des cellules MDA-MB-231 marqués RFP ont été cultivées pendant 4 jours et la microscopie fluorescente a été utilisée pour imager les cellules toutes les 20 min à 19 heures à 37° C et 5% deCO2. Les images ont été compilées en vidéo (une image toutes les 60 minutes, grossissement 100x). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

De nouveaux systèmes de modélisation du cancer du sein humain sont nécessaires pour mieux comprendre la maladie. Le développement de systèmes microphysiologiques humains pour modéliser les contextes de la maladie qui incluent des cellules PHY et stromales natives augmentera le pouvoir prédictif des études précliniques. Le modèle BC-MPS présenté ici est un système nouvellement développé qui surmonte les limites des modèles précédents permet l’évaluation de BC dans son environnement HBT natif. Ce système peut être utilisé avec des lignées cellulaires cancéreuses ou avec des explants tumoraux et est stabile pendant au moins 14 jours. Le étiquetage fluorescent des cellules BC permet de surveiller leur visualisation en temps réel de la motilité des cellules cancéreuses et des interactions cellule-cellule, de la migration, de la viabilité ou de la prolifération en temps réel ou à des moments précis(figure 3 et figure 5). Ce système modèle peut être utilisé pour élucider des aspects importants de la biologie du cancer en ce qui concerne les interactions entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement. L’interrogation de ce système peut informer sur la régulation de TME de la progression de cancer, de la réponse de drogue, et de l’initiation de la métastase.

Pour configurer correctement le système, il y a quelques étapes critiques qui doivent être suivies. La première étape critique est la culture et le transfert des feuilles de cellules ASC. Les plaques revêtues de pNIPAAm sont sensibles à la température. Lorsque les plaques sont au-dessus de 32 °C, la surface est hydrophobe et les ASC adhèrent à la surface. La surface deviendra hydrophile en dessous de cette température et les cellules commenceront à sedétacher 19. Ainsi, il est nécessaire de déterminer à quelle vitesse un type de cellule donné commencera à se détacher de ces surfaces. Pour les ASC dérivés du HBT, cela prendra > 30 min si les cellules sont confluentes. Pour éviter que les cellules ne se détachent pendant l’entretien normal, le milieu doit être préchauffé à 37 °C et les plaques de culture tissulaire ne doivent pas être maintenues à température ambiante trop longtemps pour empêcher les plaques de se refroidir et les cellules de se détacher. Il est également important de déterminer le moment optimal pour que les pistons de gélatine soient sur les plaques revêtues de pNIPAAm pour transférer toute la feuille cellulaire. Les ASC doivent être confluents et la feuille entière doit être transférée. Si la feuille cellulaire supérieure n’a pas le temps de se détacher complètement et de se lier à la gélatine, la feuille cellulaire sera cassée pendant le transfert. Si la feuille cellulaire entière n’est pas complètement transférée, alors les ASC ne seront pas en mesure de sandwich le tissu mammaire flottant.

Les ASC utilisés pour sandwicher le HBT sont les cellules stromal normales du microenvironnement de sein qui sécrètent l’ECM, les facteurs de croissance, et les cytokines qui influencent BC20. Pour sandwicher le HBT entre deux feuilles cellulaires, les feuilles ASC sont transférées à l’aide de plaques de culture tissulaire thermorésensibles. Ceci permet à l’ECM indigène sécrété par les ASC d’être intact et sert à ancrer les adipocytes flottants dans le tissu. En utilisant des ASC dérivés du tissu mammaire humain, cela garantit que les interactions que les ASC ont avec les cellules cancéreuses imiteront ce qui se produit dans le cancer du sein car les ASC de différents dépôts affichent une expression génique différente et un remodelage ECM21.

La deuxième étape critique est le traitement du HBT. Il est nécessaire d’utiliser hbt fraîchement isolé pour préserver la viabilité du tissu. Lors du traitement du HBT, il est essentiel de hacher finement le tissu et d’enlever autant de fascia que possible. Si de gros morceaux de fascia sont laissés dans le HBT, cela empêchera les feuilles cellulaires d’ancrer correctement le tissu flottant. En outre, le fascia laissé dans le tissu peut se dissocier de la plaque et il tirera plusieurs grappes du HBT avec elle rendant le puits inutilisable pour d’autres expériences. Le HBT doit être placé au milieu du puits avant d’ajouter la feuille de cellule supérieure, sinon les ASC ne seront pas en mesure de prendre en sandwich adéquatement le HBT et le tissu sur le bord des puits ne sera pas ancré. Si ces étapes critiques sont suivies, le processus de production de BC-MPS est simple à mettre en place.

Le modèle détaillé ici est un système amélioré pour l’étude de la Colombie-Britannique dans son microenvironnement naturel de HBT primaire qui retient les adipocytes matures, l’ECM et les cellules immunitaires résidentes (Figure 4). Les modèles précliniques qui imitent le microenvironnement adipeux manquent de multiples éléments du microenvironnement, tels que les adipocytes matures, les cellules immunitaires, les fibroblastes et l’ECM. L’utilisation de HBT pleinement mature permet l’interrogation simultanée et réciproque de cet environnement complexe qui comprend de multiples éléments qui influencent le développement du cancer, la réponse aux médicaments et le caractère invasif grâce à la signalisation paracrine et juxtaclrine22,23,24,25. Les fibroblastes résidents et les ASC influencent la métastase du cancer par le remodelage de l’ECM dans les tissus et par la signalisation paracrine26,27. L’ECM et son remodelage sont essentiels pour l’initiation de la métastase. Les altérations de l’ECM du microenvironnement tumoral influencent la migration et les métastases de BC, mais la plupart des études bc n’incorporent pas l’ECM indigène dans leurs études et utilisent à la place des modèles simplifiés composés de collagène I ou de matrigel28,29. L’ECM dans BC-MPS est du HBT et de l’ASC. Ainsi, la façon dont l’ECM indigène est remodelé dans le microenvironnement tumoral dans le tissu mammaire et influence la métastase peut être étudiée. Ainsi, ce modèle BC-MPS incorpore de multiples éléments du microenvironnement tumoral que les systèmes modèles précédents n’avaient pas.

Ce modèle peut être utilisé pour étudier la diaphonie métabolique entre les adipocytes pleinement matures et les cellules BC. Les modèles précédents qui étudient l’interaction entre les adipocytes et les cellules cancéreuses utilisent des pré-adipocytes différenciés in vitro. Les pré-adipocytes différenciés in vitro ne mûrissent pas complètement dans la même mesure que les adipocytes différenciés in vivo30,31. Pour comprendre comment les adipocytes influencent la progression du cancer et la réponse aux médicaments, il est essentiel d’imiter correctement la composition moléculaire et chimique complexe des adipocytes natifs. Ici, nous avons démontré que notre système permet d’évaluer la diaphonie métabolique qui se produit entre les adipocytes et les cellules BC (Figure 4).

Bc-MPS peut également être utilisé dans la réalisation d’études in vitro sur la façon dont des conditions telles que l’obésité, qui ne peuvent pas être correctement modélisées à l’aide de lignées cellulaires standard, influencent la progression du cancer. L’obésité est associée à une altération du microenvironnement de HBT et à une augmentation des métastases en Colombie-Britannique bien que les mécanismes exacts ne soient pas entièrement compris32,33,34. Les fibroblastes, les ASC, les adipocytes et les ECM sont altérés pendant l’obésité et favorisent davantage la progression et les métastases du cancer25,35,36. Ainsi, il est important d’employer les cellules stromal indigènes et l’ECM du tissu obèse pour comprendre comment ces changements dans les cellules stromal et l’ECM influencent BC. En utilisant HBT et ASCs des patients obèses ou maigres dans le modèle BC-MPS les mécanismes par lesquels l’obésité favorise un phénotype métastatique peuvent être élucisés.

La méthode présentée ici est pour la culture des cellules de cancer du sein dans une culture qui englobe ASCs, adipocytes mûrs, et ECM indigène. Des modèles antérieurs de systèmes de co-cultures ont étudié comment ces différents éléments individuels de l’environnement stromal influencent le cancer. Comme les ASC et les adipocytes influencent tous deux la progression de bc il peut être compliqué de déterminer quel type de cellule est responsable d’influencer le BC. Cependant, cela peut être déterminé en comparant BC-MPS à des modèles de co-culture plus simples avec un type de cellule. L’un des avantages de ce système par rapport aux systèmes sur puce ou de bioimpression est qu’aucun équipement spécial n’est nécessaire pour mettre en place le système au-delà des plaques revêtues de pNIPAAm qui sont disponibles dans le commerce. Des systèmes modèles de tissu mammaire ont été précédemment décrits en utilisant la bioimpression pour déposer des ASC dans des échafaudages qui sont ensuite différenciés en culture22. Cela nécessite 2-3 semaines supplémentaires pour que les cellules se différencient et les ASC différenciés en culture ne se différencient pas complètement des adipocytes matures. Les adipocytes matures de l’HBT dans BC-MPS sont prêts à être utilisés au moment où ils sont retirés d’un patient.

Le système modèle décrit ici est un système utile pour étudier la diaphonie entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement, cependant, il a quelques limites. L’une des principales limites est la disponibilité du tissu mammaire humain primaire. Le tissu adipeux humain ne peut pas être cryoconservé sans perte de viabilité et donc le tissu utilisé pour la fabrication de BC-MPS doit être fraîchement obtenu et utilisé37. Une autre limitation est que le modèle tel que présenté ici est un système statique qui est cultivé dans 6 plaques de puits régulières. Le système n’a pas le flux microfluidique qui est présent dans les organes sur puce qui peut influencer la disponibilité de l’oxygène et des nutriments, le stress pur et la distribution des médicaments38,39. Une troisième limitation est la nécessité de séparer les cellules les unes des autres à la fin de l’expérience si les différents types de cellules doivent être analysés individuellement. Cela nécessite la nécessité d’étiqueter les cellules afin qu’elles puissent être séparées les unes des autres.

L’incorporation de nombreux éléments du microenvironnement tumoral produit un modèle physiologique pour étudier la progression du cancer et l’initiation de métastases. En plus de pouvoir étudier les cellules cancéreuses dans un modèle plus physiologique, BC-MPS peut également être utilisé pour étudier les éléments individuels du microenvironnement et comment ils sont influencés par le cancer. Bien que les données présentées ici démontrent comment bc-MPS peut être utilisé avec une lignée cellulaire, BC-MPS peut être facilement adapté pour répondre aux besoins expérimentaux particuliers d’un chercheur. Par exemple, l’HBT obèse peut être comparée à l’HBT maigre pour déterminer comment l’obésité affecte les métastases et la progression du cancer. Différents sous-types de BC peuvent être ensemencés dans BC-MPS pour étudier comment les sous-types de cancer interagissent différemment avec le microenvironnement. Des techniques d’édition de gènes peuvent être utilisées pour déterminer comment des gènes spécifiques affectent l’interaction entre la Colombie-Britannique et le microenvironnement. Ce modèle et ses applications permettront de mieux comprendre comment l’environnement stromal et le cancer du sein interagissent pour favoriser la progression du cancer et les métastases.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le tulane flow cytometry et le cell sorting core ainsi que le Tulane Histology Core pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par la southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant et la National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

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