Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

Dit protocol beschrijft de constructie van een in vitro microfysiologisch systeem voor het bestuderen van borstkanker met behulp van primair menselijk borstweefsel met kant-en-klare materialen.

Abstract

Borstkanker (BC) blijft een belangrijke doodsoorzaak voor vrouwen. Ondanks meer dan $ 700 miljoen geïnvesteerd in BC onderzoek jaarlijks, 97% van de kandidaat BC drugs falen klinische proeven. Daarom zijn nieuwe modellen nodig om ons begrip van de ziekte te verbeteren. Het NIH Microphysiological Systems (MPS) programma is ontwikkeld om de klinische vertaling van fundamentele wetenschappelijke ontdekkingen en veelbelovende nieuwe therapeutische strategieën te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor het genereren van MPS voor borstkanker (BC-MPS). Dit model past een eerder beschreven benadering van het cultiveren van primair menselijk wit vetweefsel (WAT) aan door WAT tussen vet-afgeleide stamcelbladen (ASC)s te sandwichen. Nieuwe aspecten van onze BC-MPS zijn het zaaien van BC-cellen in niet-ziek menselijk borstweefsel (HBT) met inheemse extracellulaire matrix, volwassen adipocyten, ingezeten fibroblasten en immuuncellen; en het inklemmen van het BC-HBT-mengsel tussen HBT-afgeleide ASC-vellen. De resulterende BC-MPS is stabiel in cultuur ex vivo gedurende ten minste 14 dagen. Dit modelsysteem bevat meerdere elementen van het micromilieu die BC beïnvloeden, waaronder adipocyten, stromale cellen, immuuncellen en de extracellulaire matrix. Zo kan BC-MPS worden gebruikt om de interacties tussen BC en zijn micromilieu te bestuderen.

We tonen de voordelen van onze BC-MPS door twee BC-gedragingen te bestuderen waarvan bekend is dat ze de progressie en metastase van kanker beïnvloeden: 1) BC-beweeglijkheid en 2) BC-HBT metabolische overspraak. Hoewel bc-motiliteit eerder is aangetoond met behulp van intravitale beeldvorming, maakt BC-MPS time-lapse-beeldvorming met hoge resolutie mogelijk met behulp van fluorescentiemicroscopie gedurende meerdere dagen. Bovendien, terwijl metabole overspraak eerder werd aangetoond met behulp van BC-cellen en muriene pre-adipocyten gedifferentieerd in onrijpe adipocyten, is ons BC-MPS-model het eerste systeem dat deze overspraak tussen primaire menselijke melkklieradipocyten en BC-cellen in vitro demonstreert.

Introduction

Elk jaar sterven meer dan 40.000 Amerikaanse vrouwen aan borstkanker (BC)1. Ondanks meer dan $ 700 miljoen geïnvesteerd in BC onderzoek jaarlijks, 97% van de kandidaat BC drugs falen klinische proeven2,3. Nieuwe modellen zijn nodig om de pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en ons begrip van BC te verbeteren. Het NIH Microphysiological (MPS) Programma beschrijft de functies die nodig zijn voor baanbrekende modellen voor het verbeteren van de vertaling van basiswetenschap naar klinisch succes4. Deze omvatten het gebruik van primaire menselijke cellen of weefsels, stabiel in cultuur gedurende 4 weken, en opname van inheemse weefselarchitectuur en fysiologische respons.

Huidige in vitro BC-modellen, zoals tweedimensionale cultuur van BC-cellijnen, membraaninzetcocultuur en driedimensionale sferoïden en organoïden, voldoen niet aan de MPS-criteria van de NIH omdat geen van deze de inheemse borstweefselarchitectuur samenvatten. Wanneer extracellulaire matrix (ECM) aan deze systemen wordt toegevoegd, wordt borst-ECM niet gebruikt; in plaats daarvan worden collageengels en keldermembraanmatrices gebruikt.

Huidige in vivo systemen, zoals patiënt afgeleide xenografts (PDX), voldoen ook niet aan de MPS-criteria van de NIH omdat muriene borstweefsels enorm verschillen van menselijke borsten. Bovendien worden interacties tussen het immuunsysteem en BC steeds meer erkend als de sleutel in de ontwikkeling van tumoren, maar de immunocompromitteerde muriene modellen die worden gebruikt voor het genereren van PDX-tumoren missen volwassen T-cellen, B-cellen en natuurlijke killercellen. Bovendien, terwijl PDX het mogelijk maakt om primaire borsttumoren te behouden en uit te breiden, worden de resulterende PDX-tumoren geïnfiltreerd met primaire muriene stromale cellen en ECM5.

Om deze uitdagingen te overwinnen, hebben we een nieuwe, ex vivo, driedimensionale menselijke borst MPS ontwikkeld die voldoet aan de NIH MPS-criteria. De basis van onze borst MPS wordt gemaakt door sandwiching primaire menselijke borstweefsel (HBT) tussen twee vellen vet-afgeleide stamcellen (ASC's), ook geïsoleerd van HBT (Figuur 1). Plunjers voor het overbrengen van de celbladen naar sandwich de HBT kan 3D-geprint of gemaakt van eenvoudige acryl kunststoffen(figuur 1H,I). Deze techniek past onze eerder beschreven aanpak aan voor het cultiveren van primair menselijk wit adipocytweefsel6,7. De borst MPS kan vervolgens worden gezaaid door een BC-model naar keuze, variërend van standaard BC-cellijnen tot primaire menselijke borsttumoren. Hier laten we zien dat deze BC-MPS meerdere weken stabiel in cultuur zijn (Figuur 2); omvatten inheemse elementen van HBT zoals melkklieradipocyten, ECM, endotheel, immuuncellen (figuur 3); en vat de fysiologische interacties tussen BC en HBT zoals metabole overspraak (figuur 4) samen. Ten slotte laten we zien dat BC-MPS de studie van amoebe beweging van BC-cellen in HBT mogelijk maakt (Figuur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle menselijke weefsels werden verzameld in overeenstemming met protocol #9189 zoals goedgekeurd door het Institutional Review Board Office van LSUHSC.

1. Zaaien van adipose-afgeleide stamcellen (ASC's) voor celbladen

  1. Asc 's kopen uit commerciële bronnen of isoleren van primair menselijk borstweefsel door de vastgestelde protocollen8,9 te volgen. Zaad menselijke borst ASC's bij 70% dichtheid (~80.000 cellen/cm2 oppervlakte) op 6-goed standaard weefselkweekplaten in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum en 1% Penicilline/Streptomycine (BC-MPS Media). Zorg ervoor dat de ASC's die voor de vorming van de celbladen moeten worden gebruikt, kleiner moeten zijn dan passage 10.
    1. Voor elke put van borstkanker microfysiologisch systeem (BC-MPS) dat zal worden gegenereerd, zaadcellen in 1 standaard weefselkweek goed en 1 put van vergelijkbare grootte op poly (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm) gecoate weefselkweek plastic plaat. Een 6-put plaat van BC-MPS vereist een standaard weefselkweek 6 put plaat (bodem) en een pNIPAAm-gecoate plaat (boven). De pNIPAAm platen kunnen worden gekocht bij commerciële bronnen of kunnen worden gecoat in-lab10,11,12.
  2. Kweek ASC's in een weefselkweekincubator bij 37 ° C en 5% CO2. Verander de media elke 2-3 dagen in een bioveiligheidskast.
  3. Kweek de ASC's totdat ze 100% samenvloeien en een dwars doorspannen patroon vormen. Afhankelijk van de samenvloeiing waarbij ze werden gezaaid, duurt dit 7-10 dagen. Confluente celbladen zijn nodig om het drijvende vetborstweefsel te verankeren.

2. Voorbereiding van de voor BC-MPS benodigde voorraden

  1. Om gelatine te bereiden voor 6-put platen maak een 12% gelatineoplossing in gedestilleerde H2O. Meng 19 g gelatine type B (gelsterkte van ~225 Bloom) en 125 ml H2O in een glazen mediafles van 250 ml. Voeg 1,6 ml 1 M NaOH toe aan de oplossing om de pH te neutraliseren.
  2. Autoclaaf de oplossing gedurende 25 minuten onder een vloeistofcyclus om de oplossing te steriliseren.
  3. Laat de oplossing afkoelen tot 37 °C. Voeg in een steriele bioveiligheidskast 16 ml steriele 10x Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) toe aan de oplossing om een eindvolume van 160 ml te verkrijgen.
    OPMERKING: De gelatineoplossing kan direct worden gebruikt of op kamertemperatuur worden bewaard voor later gebruik. De bereide gelatine is 1 maand stabiel bij kamertemperatuur. Als er slechts enkele plunjers nodig zijn, kan een oplossing van 10 ml worden gemaakt en steriel worden gefilterd op dezelfde dag als het maken van BC-MPS zoals eerder beschreven7.
    1. Om gelatineoplossing te bereiden door filtersterilisatie, verdun 1 ml 10x HBSS met 9 ml H2O om een 1x HBSS-oplossing te maken in een conische buis van 15 ml. Voeg 100 μL 1 M NaOH toe aan elke buis van 10 ml en voeg vervolgens 0,7 g gelatine toe aan de oplossing. Meng de oplossing krachtig om de gelatine op te lossen.
    2. Incubeer de buis in een waterbad van 75 °C gedurende 20 minuten schudden om de 5 minuten. Gebruik een spuit van 10 ml en een spuitfilter van 0,22 μm om de gelatineoplossing te filteren. Filtreer de gelatineoplossing rechtstreeks op de plunjers in een bioveiligheidskast.
  4. 3D-printen of gebruik eenvoudig acryl om de plunjers te maken die worden gebruikt voor het overbrengen van de celbladen. Zorg ervoor dat de plunjers losjes in de gewenste maat goed passen. Een standaard 3D-geprinte plunjer is weergegeven in figuur 1. De plunjers kunnen worden ontworpen met behulp van standaard computerondersteunde ontwerpsoftware zoals TinkerCad en worden afgedrukt met filament 3D-printers die compatibel zijn met polylactic acid (PLA)13,14.
  5. Om een rek voor te bereiden voor het vasthouden van de plunjers plaatst u een buizenrek van 15 ml in een bioveiligheidskast. Plaats plunjers ondersteboven in het rek, zodat de onderkant van de plunjers naar boven is gericht. Plaats een plastic doos met deksel voor het transport van BC-MPS in de bioveiligheidskast. Het wordt aanbevolen om de doos minstens 35,5 cm lengte x 28 cm breedte x 8,25 cm hoogte te hebben voor 4 platen BC-MPS. Haal het deksel uit de doos en spuit het rek, de plunjers en de doos met 70% EtOH.
  6. Bereid steriele scheermesjes en tangen door ze te autoclaafen of door ze in een bioveiligheidskast te plaatsen en te wassen met 70% EtOH.
  7. Besproei de plunjers en doos met 70% EtOH en zet het UV-licht in de bioveiligheidskast minstens 30 minuten aan om de benodigdheden te steriliseren.

3. Bereid gelatine plunjers en breng aan op de bovenste celbladen

  1. Als de gelatineoplossing eerder is bereid, verwarmt u deze in een waterbad van 37 ° C om het te smelten.
  2. Pipet de gelatineoplossing op de plunjers in de bioveiligheidskast met behulp van een serologische pipet van 5 of 10 ml. Een plunjer voor 1 put van een 6-put plaat vereist ~ 2,5 ml gelatine.
  3. Zodra de gelatine op de plunjers is gestold (~ 30-45 min) verplaatst u de pNIPAAm-gecoate ASC-platen naar de bioveiligheidskast. Plaats de plunjers voorzichtig in de putten van de met pNIPAAm gecoate ASC-platen, zodat de gelatine in contact komt met de ASC's. Plaats een metalen ring (~7,5 g) op de zuiger om de zuiger te verzwawegen, zodat gelatine in direct contact komt met de ASC-celplaat. Laat de zuigers 30 minuten op kamertemperatuur op de ASC-celbladen staan.
  4. Verplaats de plaat voorzichtig met de plunjers in de steriele doos in de bioveiligheidskast en plaats het deksel erop. Zet de doos 30 minuten in een koelkast van 4 °C. Als er geen koelkast van 4 °C beschikbaar is, plaatst u de plaat op ijs in een ijsemmer in de bioveiligheidskast gedurende 30 minuten.

4. Voorbereiding van kankercellijnen

  1. Zaai de kankercellijnen in een standaard T75 weefselkweekschaal en bewaar ze in cultuur zodat ze ~80% samenvloeien op de dag dat BC-MPS wordt verwerkt. (~200.000 kankercellen zijn nodig per BC-MPS). Laat de kankercellen groeien in normale media.
    OPMERKING: Om de kankercellen te identificeren en te isoleren, wordt aanbevolen dat de cellen worden getransfecteerd met een fluorescerend eiwit om ze te onderscheiden van de ASC's en borstweefsel. Het aantal kankercellen dat nodig is per BC-MPS is geoptimaliseerd voor MCF7- en MDA-MB-231-cellen. Andere cellijnen moeten mogelijk verder worden geoptimaliseerd.
  2. Op de dag dat de BC-MPS wordt voorbereid, verplaatst u de kolf met de kankercellen naar de bioveiligheidskast. Aspireer de media uit de kolf. Was de kolf met 5 ml PBS.
  3. Voeg 1 ml celloslatingsoplossing toe aan de kolf met de kankercellen en incubeer de kolf vervolgens in een incubator van 37 °C totdat de cellen zijn losgeraakt (~2-5 min).
  4. Voeg in de bioveiligheidskast 9 ml PBS toe aan de kolf, breng de cellen in PBS over in een conische buis van 15 ml en tel het celnummer met behulp van een hemocytometer.
  5. Centrifugeer de kankercellen 5 min op kamertemperatuur op 500 x g.
  6. Resuspendeer de cellen in BC-MPS media zodat er 2 x 106 cellen/ml zijn.
  7. Plaats de kankercellen in een waterbad van 37 °C totdat ze klaar zijn om aan het menselijk weefsel te worden toegevoegd.

5. Verwerking van menselijk borstweefsel

  1. Was in een bioveiligheidskast het menselijk borstweefsel (HBT) 3x met 10 ml steriel PBS.
  2. Gebruik steriele tang en een scheermesje om de BC-MPS grof te gehakt en probeer zoveel mogelijk fascia en bindweefsel te verwijderen. Het niet verwijderen van het bindweefsel kan ertoe leiden dat de ASC-bovenlaag de HBT niet goed verankert.
    OPMERKING: De fascia en het bindweefsel zijn te herkennen aan het witte of heldere uiterlijk in vergelijking met de gele kleur van het vetweefsel.
  3. Zodra het bindweefsel is verwijderd, gebruikt u een steriel scheermesje om het weefsel fijn te gehakt totdat het een homogene vloeistofconsistentie heeft. Het weefsel wordt fijngehakt wanneer het gemakkelijk kan worden gepijpt met behulp van een serologische tip van 25 ml.
  4. Gebruik een steriel scheermesje om de punt van een p1000 pipetpunt af te snijden om te helpen bij het pipetten van de gehakte HBT.
  5. Meng in een buis van 1,5 ml het gehakte HBT, de kankercellijnen en de BC-MPS-media (voor 1 put van een plaat met 6 putjes is 200 μL gehakte HBT, 100 μL BC-MPS-media en 100 μL kankercellen nodig).
  6. Verplaats de ASC-plaat die voor het onderste celblad wordt gebruikt van de incubator naar de bioveiligheidskast. Aspireer de media van de onderste ASC-plaat. Pipetteer het mengsel op het midden van de put van de onderste ASC-plaat met behulp van een p1000 pipetpunt met het distale uiteinde afgesneden van stap 5.4
  7. Verplaats de doos met de bovenste ASC-plaat met de plunjers erop naar de bioveiligheidskast. Verwijder voorzichtig de gelatine plunjers van de met pNIPAAm beklede plaat en leg deze bovenop het HBT-mengsel. Voeg BC-MPS-media toe aan de put (voeg voor 1 put van een 6-putplaat 2 ml media toe). Verplaats de onderste ASC-platen met het BC-MPS-mengsel en de plunjers voorzichtig naar de steriele plastic doos en plaats het deksel van de doos erop voor transport.
    OPMERKING: Het 6-put plaatdeksel past niet terug op de ASC-plaat terwijl de plunjers aan staan. Er moet voor worden gezorgd dat de cultuur niet wordt besmet.
  8. Incubeer de onderste plaat in de doos in een incubator op 37 ° C totdat de gelatine is gesmolten en de bovenste ASC-laag zich begint te hechten aan de onderste laag (~ 30 min).
  9. Verplaats de doos met de platen naar de bioveiligheidskast. Verwijder de plunjers voorzichtig van de onderste platen. Het weefsel met de kankercellen wordt verankerd aan de bodem van de put.
  10. Plaats het deksel van de 6-put plaat terug op de bodemplaat en incubeer op 37 °C om de gelatine volledig te smelten en laat de bovenste laag volledig verankeren aan de onderste laag (~ 30-60 min).
  11. Verplaats de platen voorzichtig naar een bioveiligheidskast en aspireer de media met een serologische pipet van 10 ml. Voeg 2 ml verse media toe aan elke put. Aspireer vanaf de rand van de put en pipet op de rand van de put om te voorkomen dat het weefsel loskomt.
  12. Houd de BC-MPS op 37 °C en 5% CO2 gedurende de gewenste tijdsduur en verander elke 2-3 dagen van medium.

6. Vertering van BC-MPS voor analyse

  1. Wanneer de BC-MPS klaar is om te worden geanalyseerd, verplaatst u de plaat naar de bioveiligheidskast. Verwijder media met een serologische pipet om te voorkomen dat weefsel per ongeluk loskomt.
  2. Voeg 1 volume PBS toe aan elke put.
  3. Verwijder de PBS met een serologische pipet.
  4. Voeg 1 ml celdisassociatieoplossing toe aan elke put. Verplaats de plaat terug naar de incubator en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C om de cellen los te laten. Gebruik in een bioveiligheidskast een celschraper om de cellen en het weefsel volledig los te maken van de kweekplaat.
  5. Breng de oplossing met het weefsel over naar een conische buis van 15 ml met behulp van een serologische pipet. Voeg 2 ml PBS toe aan elke put om de resterende cellen te verzamelen en breng deze oplossing over naar de conische buis. Als de cellen fluorescerend zijn, wikkelt u de buis in aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen.
  6. Incubeer de buis bij 37 °C onder constante agitatie in een orbitale shaker op 1 x g gedurende 10-20 minuten om cellen volledig van het weefsel te scheiden.
  7. Gebruik in een bioveiligheidskast een serologische pipet om eventuele resterende klonten cellen in de buis te verstoren en filter het monster door een weefselzeef van 250 μm in een nieuwe buis van 15 ml. Pipetteer de oplossing langzaam door de zeef zodat deze niet overloopt.
  8. Spoel de zeef af met 1 ml PBS om eventuele cellen die nog in de zeef zitten te verzamelen.
  9. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten op 500 x g bij kamertemperatuur. Na centrifugeren drijven de adipocyten op de bovenste laag van de oplossing, terwijl de kankercellen en ASC's worden gemengd in een pellet aan de onderkant van de buis.
  10. Om de adipocyten te isoleren giet je de toplaag voorzichtig in een nieuwe buis of snijd je de punt van een p1000 pipetpunt af en breng je de toplaag over naar een nieuwe buis. Centrifugeer het monster opnieuw op 500 x g gedurende 5 minuten en gebruik een spuit en naald om de oplossing onder de adipocyten vandaan te verwijderen, zodat alleen de adipocyten overblijven. De adipocyten zijn nu klaar voor analyse
  11. Nadat de adipocyten uit de oplossing zijn verwijderd, scheidt u de ASC's en kankercellen van elkaar voor analyse als de kankercellen eerder zijn getransfecteerd met een fluorescerend eiwit. Aspireer de resterende oplossing uit de buis met de ASC's en kankercellen zonder de celkorrel te verstoren. Resuspend de pellet in PBS of BC-MPS media en gebruik flow cytometrie om de cellen te sorteren op basis van de fluorescentie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stabiliteit in cultuur
BC-MPS is een stabiel microfysiologisch systeem dat tot ten minste 14 dagen in vitro kan worden gekweekt. Een brightfield-afbeelding van de ASC-celbladen werd genomen bij 100x vergroting om het dwarsgestreepte patroon van het samenvloeiingsblad weer te geven (figuur 2A). De ASC-celbladen zijn minstens 4 weken stabiel in cultuur. BC-MPS op 14 dagen cultuur in een put van een 6 put plaat werd afgebeeld met een kleurencamera die aantoont dat de drijvende HBT nog steeds stabiel verankerd is door de ASC celbladen aan de onderkant van de put na 14 dagen (Figuur 2B). Dit toont aan dat het celblad dat wordt gebruikt om het vetweefsel te sandwichen nog steeds intact is. De drievoudige negatieve BC-cellijn MDA-MB-231 die RFP uitdrukt, werd gedurende 14 dagen in HBT gekweekt en vervolgens afgebeeld met een fluorescerende microscoop die de stabiliteit van de BC-MPS aantoonde met cellijnen tot ten minste 14 dagen (figuur 2C). De aanwezigheid van de BC-cellen in het weefsel toont het vermogen van kankercellen om de HBT binnen te dringen. Een drievoudige negatieve PDX-explant werd uit een muis verwijderd, bevlekt met Cell Tracker CMTPX en gekweekt met HBT. Fluorescerende microscopiebeelden werden genomen op dag 6 om de stabiliteit van BC-MPS met tumor explants gedurende ten minste 6 dagen aan te tonen (Figuur 2D). Dit toont aan dat BC-MPS kan worden gebruikt om tumor explants met HBT en cellijnen te culteren.

Native HBT-elementen
BC-MPS bevat de inheemse elementen van HBT in cultuur. BC-MPS met 100 mg HBT werd gedurende 14 dagen in vitro gekweekt. Het weefsel werd afgebeeld met behulp van brightfield microscopie na 14 dagen in cultuur (Figuur 3A). Dit beeld toont het behoud van clusters van rijpe adipocyten bij 14 dagen in cultuur. Het weefsel werd vervolgens gefixeerd met 10% formaline, paraffine ingebed, gesectied op 5 μm met behulp van een microtome en vervolgens gekleurd met Movats pentachrome vlek met behulp van een standaard protocol. De vaste secties werden afgebeeld op 100x (Figuur 3B) of 20x (Figuur 3C). De afbeeldingen tonen aan dat de BC-MPS het inheemse collageen (paars), reticulaire vezels (blauw) bevat en dat de adipocyten grote niet-oculaire vorm tussen het bindweefsel wordt bewaard na 14 dagen in cultuur. Om primaire macrofagen in het systeem te identificeren, werd HBT gedurende 0, 3 en 7 dagen gekweekt en vervolgens gefixeerd en gekleurd met de anti-CD45, anti-CD68 en anti-CD206. CD45 werd gebruikt als een algemene leukocytenidentificatie. CD68 werd gebruikt als een monocytvlek om macrofagen te identificeren, terwijl CD206 een gemeenschappelijke receptor identificeert die aanwezig is op macrofagen. De kleuring van de macrofaagmarkers werd gekwantificeerd met behulp van een beeldvormingssoftware (figuur 3D). Dit toont het behoud van primaire macrofagen na 3 en 7 dagen in cultuur. Deze gegevens tonen aan dat BC-MPS de inheemse elementen van HBT in cultuur bewaart. Verdere experimenten kunnen worden uitgevoerd om te bestuderen hoe de BC-cellen de inheemse elementen van HBT remodelleren. Dit kan het beoordelen van wijzigingen in macrofaagmarkers omvatten om te bepalen of ze worden gewijzigd door de aanwezigheid van BC-cellen. Veranderingen in de ECM kunnen verder worden geanalyseerd door de Movats pentachrome kleuring van monsters die met of zonder BC-cellen zijn gekweekt te vergelijken om te bepalen of het collageengehalte wordt gewijzigd en de grootte van de adipocyten kan worden vergeleken met behulp van beeldanalysesoftware zoals Image J om te bepalen of BC-cellen de adipocytgrootte veranderen.

Metabolische overspraak
Adipocyt-kanker metabole overspraak is een belangrijke route waarbij de tumor micro-omgeving bc progressie beïnvloedt. BC-cellen die intracellulaire lipiden accumuleren, vertonen een verhoogde resistentie tegen geneesmiddelen en een meer invasief fenotype15. Hoewel is aangetoond dat BC-cellen lipolyse induceren in onrijpe, muriene adipocyten, is de fysiologische relevantie hiervan onduidelijk gebleven omdat metabole overspraak tussen BC en primaire menselijke melkklieradipocyten nooit is aangetoond. Om aan te tonen dat BC-MPS deze adipocyt-BC metabolische overspraak kan modelleren, werden RFP-gelabelde MDA-MB-231 cellen alleen of gedurende 14 dagen gekweekt in BC-MPS. De cellen werden enzymatisch verteerd in eencellige suspensie, gekleurd met de neutrale lipidekleurstof Bodipy, en geanalyseerd door flowcytometrie (figuur 4A, B)16. Het aandeel lipidenpositieve MDA-MB-231 cellen was 26,2-voudig SEM +/- 2,5 groter in BC-MPS vs. 2D-cultuur (Figuur 4C). Deze toename van lipidekleuring toont aan dat de kankercellen interageren met de adipocyten en lipiden opnemen die vrijkomen uit de volwassen adipocyten. Celsortering werd uitgevoerd om te selecteren voor RFP+ Bodipy+ cellen. Na het sorteren werden de cellen geplateerd op collageen I gecoate glazen coverslips en 's nachts toegestaan om te bevestigen. De volgende dag werden de cellen gedurende 30 minuten gefixeerd in 4% paraformaldehyde en vervolgens op een fluorescerende microscoop met 100x vergroting afgebeeld. Cellen gekweekt in BC-MP (Figuur 4E) vertoonden verhoogde lipidedruppels in vergelijking met cellen gekweekt in standaard 2D-cultuur (Figuur 4D). Dit toont metabolische overspraak tussen de BC-cellen en de HBT en laat ook zien hoe lipideaccumulatie kan worden geanalyseerd door flowcytometrie of door fluorescerende microscopie. Verdere analyse van lipideaccumulatie in kankercellen kan worden gedaan door de grootte van lipidedruppels en het aantal lipidedruppels per cel te kwantificeren.

Amoebeïdenbeweging
Metabole kruisbesprekname tussen BC-cellen en adipocyten verhoogt het invasieve vermogen van de kanker. Om het verhoogde invasieve vermogen van de kankercellen gekweekt met de HBT te beoordelen, werd de migratie van BC-cellen in hbt beoordeeld door fluorescentiemicroscopie. De gemetastaseerde TNBC-cellijn MDA-MB-231 die RPF uitdrukt, werd gedurende 4 dagen gekweekt in BC-MPS om het systeem te stabiliseren. Time-lapse fluorescentiemicroscopie werd uitgevoerd na 4 dagen om de MDA-MB-231 motiliteit in beeld te brengen met één beeld dat elke 20 minuten werd vastgelegd gedurende 19 uur bij 37 °C en 5% CO2. De resulterende video toonde amoebe bewegingspatronen en een verrassend hoge mate van beweeglijkheid voor de MDA-MB-231 cellen (Figuur 5 en Video 1). Dit toont een toename aan van het invasieve vermogen van de BC-cellen en het vermogen van de BC-cellen om de HBT binnen te dringen. De migratie van de BC-cellen in de HBT kan verder worden geanalyseerd met behulp van eerder gepubliceerde methoden voor het kwantificeren van de snelheid en richting van migrerende cellen17,18. De MDA-MB-231 cellen werden ook waargenomen te ondergaan mitose. Dit gedrag is consistent met het agressieve fenotype, zijn belangrijk gedrag voor kankerprogressie en metastase en benadrukken nieuw BC-gedrag dat kan worden gericht op BC-therapieën.

Figure 1
Figuur 1: Algemene workflow van BC-MPS setup. (A) Gelatine wordt gestold in een rechtopstaande zuiger. (B) De zuiger met gelatine wordt op het thermoresponsieve bovenste ASC-celblad geplaatst. (C) Een gewicht wordt gebruikt om de gelatine te dwingen contact te houden met het celblad, terwijl de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen, gevolgd door incubatie bij 4 °C gedurende 30 minuten. (D) De zuiger wordt uit de koude schaal verwijderd en verwijdert daarmee het intacte celblad. (E) De zuiger met het bovenste celblad wordt overgebracht naar een schaal met het onderste celblad en de gehakte HBT- en BC-cellen. (F) De onderste celschaal met media, plunjer, HBT, BC en beide celbladen worden gedurende 30-60 minuten bij 37 °C geïncubeerd om de gelatine te laten smelten en de celbladen van contacten te laten komen. (G) Bij het verwijderen van de zuiger blijven de HBT en BC ingeklemd tussen twee ASC-celbladen. Een 3D-geprinte plunjer is ontworpen met behulp van de gratis online software TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) en afgedrukt op een 3D-printer. De zuiger bestaat uit polymelkzuur. (H) De afmetingen van een zuiger voor 1 put van een 6-put plaat zijn aangegeven. De uitsparing van de plunjer is 2,5 mm. (I) Er wordt een afbeelding van de eigenlijke 3D-geprinte plunjer getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Representatieve stabiliteit van BC-MPS in cultuur. (A) Een helderveldbeeld bij 100x vergroting van de samenvloeiende ASC's die het dwarsgestreepte patroon van de samenvloeiende cellen aantonen. Schaalbalk = 100 μm. (B) BC-MPS, met 100 mg HBT, werd gekweekt in een 6-putplaat. Na 14 dagen werd een kleurenfoto gemaakt om aan te tonen dat de HBT is verankerd aan de bodem van de put van een 6 putplaat. (C) De drievoudige negatieve BC-cellijn MDA-MB-231 die RFP uitdrukt, werd gedurende 14 dagen gekweekt met HBT en vervolgens afgebeeld met behulp van fluorescerende microscopie bij 40x vergroting. De beelden laten zien dat de MDA-MB-231 cellen nog levensvatbaar waren en groeiden in de HBT. Schaalbalk = 200 μm D) PDX Tumoren van drievoudige negatieve borstkanker van muizen werden in 3 cm 2 stukkengehakt en gelabeld met Cell Tracker Red CMPTX. De stukken werden gekweekt in HBT en de resulterende BC-MPS werd afgebeeld met behulp van een fluorescerende microscoop met 40x vergroting op dag 6 die de stabiliteit in cultuur aantoonde. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatief behoud van inheemse elementen van HBT aanwezig in BC-MPS. BC-MPS werd gedurende 14 dagen gekweekt en vervolgens afgebeeld met heldere veldmicroscopie op 40x (A) en vervolgens bevestigd met 10% formaline en gekleurd met Movats pentachrome vlek. De foto's zijn gemaakt op 100x (B) of 20x (C). Beeldvorming van de HBT duidt op het behoud van grote uniloculor-adipocyten die aan elkaar zijn geclusterd en weefselsegmenten wijzen op de aanwezigheid van behoud van de inheemse ECM zoals collageen (geel) en reticulaire vezels tussen de adipocyten (blauw). Om aan te tonen dat macrofagen in het model HBT behouden blijven, werd gedurende 0, 3 of 7 dagen gebeeldleerd, gekleurd voor macrofaagmarkers en afgebeeld met confocale microscopie (D). De fluorescerende intensiteit van de kleuring van de macrofaagmarkers werd gekwantificeerd met behulp van commercieel beschikbare software die aantoonde dat macrofagen na 3 en 7 dagen in cultuur nog steeds in het weefsel aanwezig zijn. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve metabolische overspraak tussen adipocyten en kankercellen in BC-MPS. RFP-gelabelde MDA-MB-231 cellen werden gedurende 14 dagen gekweekt in BC-MPS vs. 2D, vervolgens gekleurd met Bodipy (250 nM) en geanalyseerd door flowcytometrie. (A) Stroom van met bodipy bevlekte MDA-MB-231 cellen na 14 dagen in 2D-cultuur. Cellen in B2 waren Bodipy+RFP+; cellen in B1 waren Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3,26%, wat wijst op minimale lipidenaccumulatie. (B) Flow cytometrie analyse van Bodipy-stained MDA-MB-231 cellen na 14 dagen in BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85,35%, wat wijst op uitgebreide lipidenaccumulatie. (C) Lipide accumulatie in MDA-MB-231 cellen na 14 dagen in 2D-cultuur vs. BC-MPS. Fluorescerende microscopie analyse van Bodipy kleuring van MDA-MB-231 gekweekt in 2D (D) vs BC-MPS (E) toont verhoogde lipide accumulatie in cellen gekweekt in BC-MPS. Foutbalken aangegeven SEM. ** p < 0,01, n=2 biologische replica's, Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve migratie van TNBC in BC-MPS. RFP-gelabelde MDA-MB-231 cellen werden gedurende 4 dagen gekweekt in BC-MPS en vervolgens werden opeenvolgende time-lapse beelden van RFP-gelabelde BC-MPS + MDA-MB-231 cellen vastgelegd met behulp van een fluorescentiemicroscoop (één frame per 60 min, 100x vergroting.) Gele sterretjes = mitotische gebeurtenis. Geel vak = cellulair puin dat wordt gebruikt voor positionele referentie. Blauwe pijlen = 231 cellen die amoebe beweging met pseudopoden en hoge beweeglijkheid tonen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Representatieve migratie van TNBC in BC-MPS. BC-MPS met RFP-gelabelde MDA-MB-231 cellen werden gedurende 4 dagen gekweekt en de fluorescerende microscopie werd gebruikt om de cellen elke 20 minuten bij 19 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 in beeld tebrengen. De beelden werden gecompileerd in een video (Één frame per 60 minuten, 100x vergroting). Klik hier om deze video te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nieuwe systemen voor het modelleren van menselijke borstkanker zijn nodig om een beter begrip van de ziekte te ontwikkelen. De ontwikkeling van menselijke microfysiologische systemen om ziekte-instellingen te modelleren die inheemse ECM- en stromale cellen omvatten, zal de voorspellende kracht van preklinische studies vergroten. Het HIER gepresenteerde BC-MPS-model is een nieuw ontwikkeld systeem dat de beperkingen van eerdere modellen overwint, waardoor BC in zijn oorspronkelijke HBT-omgeving kan worden geëvalueerd. Dit systeem kan worden gebruikt met kankercellijnen of met tumor explants en is stabiel gedurende ten minste 14 dagen. Fluorescerend labelen van de BC-cellen maakt het mogelijk om hun real-time visualisatie van de beweeglijkheid van kankercellen en celcelinteracties, migratie, levensvatbaarheid of proliferatie in realtime of op specifieke tijdstippen te controleren (figuur 3 en figuur 5). Dit modelsysteem kan worden gebruikt om belangrijke aspecten van kankerbiologie op te helderen als het gaat om de interacties tussen kankercellen en hun micromilieu. Ondervraging van dit systeem kan informeren over TME-regulatie van kankerprogressie, geneesmiddelrespons en het starten van metastase.

Om het systeem succesvol in te stellen, zijn er een paar kritieke stappen die moeten worden gevolgd. De eerste kritische stap is het cultiveren en overdragen van de ASC-cellenbladen. De pNIPAAm gecoate platen zijn temperatuurgevoelig. Wanneer de platen boven 32 °C zijn, is het oppervlak hydrofoob en hechten de ASC's zich aan het oppervlak. Het oppervlak zal hydrofiele onder deze temperatuur worden en de cellen zullen beginnen los temaken 19. Het is dus noodzakelijk om te bepalen hoe snel een bepaald celtype van deze oppervlakken begint los te komen. Voor HBT-afgeleide ASC's duurt dit > 30 minuten als de cellen samenvloeien. Om te voorkomen dat de cellen tijdens normaal onderhoud losraken, moeten de media worden voorverwarmd tot 37 °C en mogen de weefselkweekplaten niet te lang op kamertemperatuur worden gehouden om te voorkomen dat de platen afkoelen en de cellen losraken. Het is ook belangrijk om de optimale tijd te bepalen voor de gelatine plunjers om op de pNIPAAm-gecoate platen te zitten om het hele celblad over te brengen. De ASC's moeten samenvloeien en het hele blad moet worden overgedragen. Als het bovenste celblad geen tijd heeft om volledig los te maken en zich aan de gelatine te binden, wordt het celblad tijdens de overdracht verbroken. Als het hele celblad niet volledig wordt overgedragen, kunnen de ASC's het drijvende borstweefsel niet sandwichen.

De ASC's die worden gebruikt om de HBT te sandwichen zijn normale stromale cellen van het micromilieu van de borst die ECM, groeifactoren en cytokinen afscheiden die BC20beïnvloeden . Om de HBT tussen twee celbladen te sandwichen, worden de ASC-platen overgebracht met behulp van thermoresponsieve weefselkweekplaten. Dit zorgt ervoor dat de inheemse ECM die door de ASC's wordt afgescheiden intact is en dient om de drijvende adipocyten in weefsel te verankeren. Door asc's afgeleid van menselijk borstweefsel te gebruiken, zorgt dit ervoor dat de interacties die de ASC's hebben met de kankercellen nabootsen wat er bij borstkanker voorkomt, aangezien ASC's uit verschillende depots verschillende genexpressie en ECM-remodellering21vertonen.

De tweede kritische stap is de verwerking van de HBT. Het is noodzakelijk om vers geïsoleerde HBT te gebruiken om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. Bij het verwerken van de HBT is het van cruciaal belang om het weefsel fijn te gehakt en zoveel mogelijk van de fascia te verwijderen. Als er grote stukken fascia in de HBT achterblijven, voorkomt dit dat de celbladen het drijfweefsel goed verankeren. Bovendien kan fascia in het weefsel zich van de plaat scheiden en zal het meerdere clusters van de HBT trekken, waardoor de put onbruikbaar wordt voor verdere experimenten. De HBT moet in het midden van de put worden geplaatst voordat het bovenste celblad wordt toegevoegd, anders kunnen de ASC's de HBT niet voldoende sandwichen en wordt het weefsel aan de rand van de putten niet verankerd. Als deze kritieke stappen worden gevolgd, is het proces van het produceren van BC-MPS eenvoudig in te stellen.

Het hier beschreven model is een verbeterd systeem voor het bestuderen van BC in zijn natuurlijke micromilieu van primaire HBT dat de volwassen adipocyten, ECM en ingezeten immuuncellen behoudt (Figuur 4). Preklinische modellen die het vetmicromilieu nabootsen, missen meerdere elementen van het micromilieu, zoals volwassen adipocyten, immuuncellen, fibroblasten en het ECM. Het gebruik van volgroeide HBT maakt het mogelijk om deze complexe omgeving gelijktijdig en wederkerig te ondervragen, die meerdere elementen bevat die de ontwikkeling van kanker, de respons op geneesmiddelen en de invasiviteit beïnvloeden door paracrine en juxtacrine signalering22,23,24,25. Ingezeten fibroblasten en ASC's beïnvloeden kankermetastasen door remodellering van het ECM in weefsel en door paracrinesignalering26,27. Het ECM en de verbouwing ervan zijn essentieel voor het ontstaan van uitzaaiingen. Veranderingen in het ECM van het micromilieu van de tumor beïnvloeden de migratie en metastase van BC, maar de meeste BC-studies nemen geen native ECM op in hun studies en gebruiken in plaats daarvan vereenvoudigde modellen bestaande uit collageen I of matrigel28,29. De ECM in BC-MPS is van de HBT en van de ASC's. Zo kan de manier waarop de inheemse ECM wordt geremodelleerd in de tumormicro-omgeving in borstweefsel en metastase beïnvloedt, worden bestudeerd. Dit BC-MPS-model bevat dus meerdere elementen van de tumormicromilieu die eerdere modelsystemen niet hadden.

Dit model kan worden gebruikt om metabolische overspraak tussen volgroeide adipocyten en BC-cellen te bestuderen. Eerdere modellen die de interactie tussen adipocyten en kankercellen bestuderen, gebruiken pre-adipocyten die in vitro worden gedifferentieerd. Pre-adipocyten die in vitro gedifferentieerd zijn , rijpen niet volledig in dezelfde mate als in vivo 30,31gedifferentieerde adipocyten . Om te begrijpen hoe de adipocyten de progressie van kanker en de reactie van geneesmiddelen beïnvloeden, is het van vitaal belang om de complexe moleculaire en chemische samenstelling van inheemse adipocyten goed na te bootsen. Hier hebben we aangetoond dat ons systeem het mogelijk maakt om de metabolische overspraak te beoordelen die optreedt tussen adipocyten en BC-cellen (Figuur 4).

BC-MPS kan ook worden gebruikt bij het uitvoeren van in vitro onderzoek naar hoe aandoeningen zoals obesitas, die niet goed kunnen worden gemodelleerd met behulp van standaard cellijnen, de progressie van kanker beïnvloeden. Obesitas wordt geassocieerd met verandering van het micromilieu van HBT en een toename van metastase in BC , hoewel de exacte mechanismen niet volledig worden begrepen32,33,34. Fibroblasten, ASC's, adipocyten en ECM worden gewijzigd tijdens obesitas en bevorderen de progressie en metastase van kankerverder 25,35,36. Het is dus belangrijk om inheemse stromale cellen en ECM uit zwaarlijvig weefsel te gebruiken om te begrijpen hoe deze veranderingen in de stromale cellen en ECM BC beïnvloeden. Door hbt en ASC's van zwaarlijvige of magere patiënten in het BC-MPS-model te gebruiken, kunnen de mechanismen waarmee obesitas een gemetastaseerd fenotype bevordert, worden opgehelderd.

De hier gepresenteerde methode is voor het cultiveren van borstkankercellen in een cultuur die ASC's, volwassen adipocyten en inheemse ECM omvat. Eerdere modellen van coculturensystemen hebben onderzocht hoe deze individuele verschillende elementen van de stromale omgeving kanker beïnvloeden. Aangezien de ASC's en de adipocyten beide de BC-progressie beïnvloeden, kan het ingewikkeld zijn om te bepalen welk celtype verantwoordelijk is voor het beïnvloeden van de BC. Dit kan echter worden bepaald door BC-MPS te vergelijken met eenvoudigere co-cultuurmodellen met één celtype. Een van de voordelen van dit systeem ten opzichte van on-a-chip- of bioprintingsystemen is dat er geen speciale apparatuur nodig is om het systeem op te zetten buiten de pNIPAAm gecoate platen die in de handel verkrijgbaar zijn. Modelsystemen van borstweefsel zijn eerder beschreven met behulp van bioprinting om ASC's af te zetten in steigers die vervolgens worden onderscheiden in cultuur22. Dit vereist een extra 2-3 weken voor de cellen om te differentiëren en ASC's gedifferentieerd in cultuur niet volledig differentiëren naar volwassen adipocyten. De rijpe adipocyten van de HBT in BC-MPS zijn klaar om te worden gebruikt op het moment dat ze bij een patiënt worden verwijderd.

Het hier beschreven modelsysteem is een nuttig systeem voor het bestuderen van de overspraak tussen kankercellen en het micromilieu, maar het heeft wel enkele beperkingen. Een van de belangrijkste beperkingen is de beschikbaarheid van primair menselijk borstweefsel. Menselijk vetweefsel kan niet cryopreserved zonder verlies van levensvatbaarheid worden gediend en daarom moet het weefsel dat voor het maken van BC-MPS wordt gebruikt vers worden verkregen en gebruikt37. Een andere beperking is dat het model zoals hier gepresenteerd een statisch systeem is dat is gekweekt in regelmatige 6 putplaten. Het systeem mist de microfluïdische stroom die aanwezig is in organen-op-een-chip die de beschikbaarheid van zuurstof en voedingsstoffen, pure stress en medicijndistributie kan beïnvloeden38,39. Een derde beperking is de noodzaak om de cellen aan het einde van het experiment van elkaar te scheiden als de verschillende celtypen afzonderlijk moeten worden geanalyseerd. Dit vereist de noodzaak om de cellen te labelen, zodat ze van elkaar kunnen worden gescheiden.

De integratie van veel elementen van de tumormicromilieu produceert een fysiologisch model om de progressie van kanker en het begin van uitzaaiingen te bestuderen. Naast het kunnen bestuderen van kankercellen in een meer fysiologisch model, kan BC-MPS ook worden gebruikt om de individuele elementen van het micromilieu te bestuderen en hoe ze worden beïnvloed door kanker. Hoewel de hier weergegeven gegevens aantonen hoe BC-MPS met één cellijn kan worden gebruikt, kan BC-MPS gemakkelijk worden aangepast aan de specifieke experimentele behoefte van een onderzoeker. Obesitas HBT kan bijvoorbeeld worden vergeleken met mager HBT om te bepalen hoe obesitas kankermetastasen en progressie beïnvloedt. Verschillende subtypes van BC kunnen in BC-MPS worden gezaaid om te bestuderen hoe subtypes van kanker anders interageren met het micromilieu. Genbewerkingstechnieken kunnen worden gebruikt om te bepalen hoe specifieke genen de interactie tussen BC en het micromilieu beïnvloeden. Dit model en de toepassingen ervan zullen een nauwkeuriger begrip mogelijk maken van hoe de stromale omgeving en borstkanker op elkaar inwerken om de progressie en uitzaaiingen van kanker te bevorderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Acknowledgments

We willen de Tulane Flow Cytometrie en Cell Sorting Core en de Tulane Histology Core bedanken voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant en de National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020).
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

Kankeronderzoek borstkanker microfysiologisch systeem menselijk borstweefsel vet-afgeleide stamcellen primaire cultuur medicijnontwikkeling metabole overspraak
Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. M., Hebert, K. L.,… More

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter