Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

דוגמנות סרטן השד ברקמת השד האנושית באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר את בנייתה של מערכת מיקרופיזיולוגית במבחנה לחקר סרטן השד באמצעות רקמת שד אנושית ראשונית עם חומרי מדף.

Abstract

סרטן השד (BC) נשאר הגורם המוביל למוות עבור נשים. למרות יותר מ -700 מיליון דולר שהושקעו במחקר BC מדי שנה, 97% מהתרופות המועמדות BC נכשלות בניסויים קליניים. לכן, מודלים חדשים נדרשים כדי לשפר את ההבנה שלנו של המחלה. תוכנית NIH Microphysiological Systems (MPS) פותחה כדי לשפר את התרגום הקליני של תגליות מדעיות בסיסיות ואסטרטגיות טיפוליות חדשות ומבטיחות. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת MPS עבור סרטן השד (BC-MPS). מודל זה מתאים גישה שתוארה בעבר של culturing רקמת שומן לבן אנושי ראשוני (WAT) על ידי דחיקת WAT בין יריעות תאי גזע נגזר שומן (ASC)s. היבטים חדשניים של BC-MPS שלנו כוללים זריעת תאי BC לתוך רקמת שד אנושית לא חולה (HBT) המכיל מטריצה חוץ תאית מקורית, adipocytes בוגרת, פיברובלסטים תושב, ותאי חיסון; וכריך תערובת BC-HBT בין גיליונות ASC נגזר HBT. BC-MPS וכתוצאה מכך יציב בתרבות ex vivo לפחות 14 ימים. מערכת מודל זו מכילה אלמנטים מרובים של microenvironment המשפיעים על BC כולל adipocytes, תאים סטרומה, תאים חיסוניים, ואת המטריצה חוץ תאית. לכן BC-MPS יכול לשמש כדי ללמוד את האינטראקציות בין BC ו microenvironment שלה.

אנו מדגימים את היתרונות של BC-MPS שלנו על ידי חקירת שתי התנהגויות BC הידועות כמשפיעות על התקדמות סרטן ועגורות: 1) תנועתיות BC ו -2) CROSSTALK מטבולי BC-HBT. בעוד תנועתיות BC הוכח בעבר באמצעות הדמיה תוך-וvital, BC-MPS מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית על פני מספר ימים. יתר על כן, בעוד crosstalk מטבולית הודגם בעבר באמצעות תאי BC ו מורין טרום adipocytes מובחן לתוך adipocytes בשלים, מודל BC-MPS שלנו היא המערכת הראשונה להדגים crosstalk זה בין אדיפוציטים mammary האדם העיקרי ותאי BC במבחנה.

Introduction

בכל שנה, יותר מ 40,000 נשים בארה"ב למות מסרטן השד (BC)1. למרות יותר מ 700 מיליון דולר שהושקעו במחקר BC מדי שנה, 97% של תרופות BC מועמד להיכשל בניסויים קליניים2,3. מודלים חדשים נדרשים כדי לשפר את צינור פיתוח התרופה ואת ההבנה שלנו של BC. התוכנית המיקרופיזיולוגית של NIH (MPS) סימנה את התכונות הנדרשות למודלים פורצי דרך לשיפור תרגום המדע הבסיסי להצלחה קלינית4. אלה כללו את השימוש בתאים אנושיים ראשוניים או ברקמות, יציב בתרבות במשך 4 שבועות, והכללה של ארכיטקטורת רקמות ילידיות ותגובה פיזיולוגית.

מודלים נוכחיים במבחנה BC, כגון תרבות דו מימדית של קווי תאים BC, ממברנה להוסיף תרבות משותפת, וספרואידים תלת מימדיים אורגנואידים, אינם עומדים בקריטריונים MPS של NIH כי אף אחד מאלה recapitulate ארכיטקטורת רקמת השד המקומי. כאשר מטריצה חוץ-תאית (ECM) מתווספת למערכות אלה, לא נעשה שימוש ב- ECM של השד; במקום זאת, ג'לים קולגן מטריצות קרום מרתף משמשים.

מערכות in vivo הנוכחי, כגון קסנוגרפטים נגזר המטופל (PDX), באופן דומה אינם עומדים בקריטריונים MPS של NIH כי רקמות חלב מורין שונים בהרבה משדיים אנושיים. יתר על כן, אינטראקציות מערכת החיסון-BC מוכרים יותר ויותר כמפתח בהתפתחות הגידול, אבל מודלים מורין immunocompromised המשמש ליצירת גידולים PDX חסרים תאי T בוגרים, תאי B, ותאים רוצח טבעי. יתר על כן, בעוד PDX מאפשר גידולים השד העיקרי להישמר ולהרחיב, הגידולים PDX וכתוצאה מכך הם הסתננו עם תאים סטרומה מורין ראשוני ECM5.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, פיתחנו רומן, ex vivo, תלת מימדי השד האנושי MPS העונה על הקריטריונים MPS NIH. הבסיס של MPS השד שלנו נעשה על ידי דחיקה רקמת השד האנושית העיקרית (HBT) בין שני גיליונות של תאי גזע נגזר שומן (ASCs), גם מבודד HBT (איור 1). בוכנות להעברת יריעות התא לכריך HBT יכול להיות 3D מודפס או עשוי פלסטיק אקרילי פשוט(איור 1H,I). טכניקה זו מתאימה את הגישה שתוארה לעיל שלנו עבור culturing רקמת אדיפוציטים לבנים אנושיים ראשוניים6,7. השד MPS לאחר מכן יכול להיות זרע על ידי מודל BC של בחירה, החל קווי תאים סטנדרטיים BC לגידולים השד האנושי העיקרי. כאן, אנו מראים כי BC-MPS אלה יציבים בתרבות במשך שבועות מרובים (איור 2); כוללים אלמנטים מקוריים של HBT כגון אדיפוציטים ממותה, ECM, אנדותל, תאים חיסוניים (איור 3); ולסיכום מחדש של האינטראקציות הפיזיולוגיות בין BC ל-HBT, כגון crosstalk מטבולי(איור 4). לבסוף, אנו מראים כי BC-MPS מאפשר לחקור תנועה אמובואידית של תאי BC ברחבי HBT (איור 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הרקמות האנושיות נאספו בהתאם לפרוטוקול #9189 כפי שאושר על ידי משרד ועדת הביקורת המוסדית של LSUHSC.

1. זריעה של תאי גזע (ASCs) שמקורם בשומן עבור יריעות תאים

  1. לרכוש ASCs ממקורות מסחריים או לבודד מרקמת השד האנושית העיקרית על ידי ביצוע פרוטוקולים הוקמה8,9. זרע ASCs השד האנושי ב 70% צפיפות (~ 80,000 תאים / ס"מ2 שטח פנים) על 6-טוב צלחות תרבית רקמות סטנדרטיות בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברי, ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין (BC-MPS מדיה). ודא ש- ASCs שישמשו ליצירת גליונות התאים צריכים להיות פחותים ממעבר 10.
    1. עבור כל באר של מערכת מיקרופיזיולוגית של סרטן השד (BC-MPS) שייווצרו, תאי זרע ב 1 תרבות רקמה סטנדרטית היטב 1 גם בגודל דומה על פולי (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm)מצופה רקמה תרבות צלחת פלסטיק. צלחת אחת של 6 בארות של BC-MPS תדרוש תרבית רקמה סטנדרטית אחת 6 צלחת באר (למטה) וצלחת מצופה pNIPAAm אחת (למעלה). את לוחות ה-pNIPAAm ניתן לרכוש ממקורות מסחריים, או לציפוי במעבדה10,11,12.
  2. תרבות ASCs באינקובטור תרבית רקמות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. לשנות את התקשורת כל 2-3 ימים בארון biosafety.
  3. תרבות ASCs עד שהם הופכים 100% confluent וליצור דפוס מפוספס. בהתאם למפגשו שבו הם זרעו, זה ייקח 7-10 ימים. גיליונות תאים קונפלונטיים נדרשים לעגן את רקמת השד השומן המצוף.

2. הכנת אספקה הדרושה ל- BC-MPS

  1. כדי להכין ג'לטין עבור 6-באר צלחות לעשות 12% פתרון ג'לטין Hמזוקק 2O. לערבב 19 גרם של סוג ג'לטין B (חוזק ג'ל של ~ 225 בלום) ו 125 מ"ל של H2O בבקבוק 250 מ"ל זכוכית מדיה. הוסף 1.6 מ"ל של 1 M NaOH לפתרון כדי לנטרל את ה- pH.
  2. Autoclave את הפתרון תחת מחזור נוזלי במשך 25 דקות כדי לעקר את הפתרון.
  3. אפשר לפתרון להתקרר עד 37 °C (60 °F). בארון biosafety סטרילי להוסיף 16 מ"ל של סטרילי 10x הנקס פתרון מלח מאוזן (HBSS) לפתרון כדי להשיג נפח סופי של 160 מ"ל.
    הערה: ניתן להשתמש בתמיסת הג'לטין באופן מיד או לאחסן בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר. הג'לטין המוכן יציב בטמפרטורת החדר למשך חודש. אם רק כמה בוכנות יהיה צורך אז פתרון 10 מ"ל יכול להיעשות סטרילי מסונן באותו יום כמו ביצוע BC-MPS כפי שתואר קודםלכן 7.
    1. כדי להכין פתרון ג'לטין על ידי עיקור מסנן, לדלל 1 מ"ל של 10x HBSS עם 9 מ"ל של H2O כדי להפוך פתרון 1x HBSS בצינור חרוט 15 מ"ל. הוסף 100 μL של 1 M NaOH לכל צינור 10 מ"ל ולאחר מכן להוסיף 0.7 גרם של ג'לטין לפתרון. מערבבים את הפתרון במרץ כדי להמיס את הג'לטין.
    2. דגירה הצינור באמבט מים 75 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות רועד כל 5 דקות. השתמש מזרק 10 מ"ל ומסנן מזרק 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את הפתרון ג'לטין. מסננים את תמיסת הג'לטין ישירות על הוכנות בארון בטיחות ביולוגית.
  4. 3D להדפיס או להשתמש אקריליק פשוט כדי להפוך את הוכנות המשמשות להעברת גיליונות התא. ודא כי הבוכנות להתאים באופן רופף בגודל הרצוי של היטב. בוכנה רגילה המודפסת בתלת-ממד מוצגת באיור 1. ניתן לתכנן את הכוענים באמצעות תוכנת תכנון סטנדרטית בסיוע מחשב כגון TinkerCad ומודפסת באמצעות מדפסות תלת-ממד חוטיות התואמות לחומצה פולילקטית (PLA)13,14.
  5. כדי להכין מתלה להחזקת הבוכנות מניחים מתלה צינור 15 מ"ל בארון biosafety. מניחים בוכנות הפוכות במתלה, כך שתחתית הבוכנות פונה כלפי מעלה. מניחים קופסת פלסטיק עם מכסה להובלת BC-MPS בארון biosafety. מומלץ שהתיבה תהיה באורך של לפחות 35.5 ס"מ x רוחב 28 ס"מ x גובה 8.25 ס"מ כדי להתאים ל-4 לוחות BC-MPS. הסר את המכסה מהתיבה וריסוס במורד ארון התקשורת, הבוכנות והתיבה עם 70% EtOH.
  6. הכינו סכיני גילוח ומלקחיים סטריליים על ידי תיל אוטומטי או על ידי הנחתם בארון biosafety וכביסה עם 70% EtOH.
  7. לרסס את הבוכנות ואת התיבה עם 70% EtOH ולהדליק את אור UV בארון biosafety לפחות 30 דקות כדי לעקר את האספקה.

3. להכין בוכנות ג'לטין ולהחיל על יריעות התא העליון

  1. אם פתרון הג'לטין הוכן בעבר, מחממים אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי להמיס אותו.
  2. פיפטה פתרון ג'לטין על הבולענים בארון biosafety באמצעות פיפטה סרולוגית 5 או 10 מ"ל. בוכנה עבור 1 באר של צלחת 6-באר ידרוש ~ 2.5 מ"ל של ג'לטין.
  3. לאחר הג'לטין התגבש על הכובעים (~ 30-45 דקות) להעביר את לוחות ASC מצופה pNIPAAm לארון biosafety. מניחים בעדינות את הבוכנות בבארות של צלחות ASC מצופות pNIPAAm כך הג'לטין יוצר קשר עם ASCs. מניחים מכונת כביסה מתכת (~ 7.5 גרם) על הבוכנה כדי להכביד על הבוכנה, כך ג'לטין נמצא במגע ישיר עם גיליון התא ASC. השאירו את הכוענים על גיליונות התא ASC בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
  4. בעדינות להזיז את הצלחת עם הבוכנות לתוך התיבה סטרילית בארון biosafety ומניחים את המכסה על זה. מעבירים את התיבה למקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אם מקרר 4 מעלות צלזיוס אינו זמין מניחים את הצלחת על קרח בדלי קרח בארון biosafety במשך 30 דקות.

4. הכנת קווי תאים סרטניים

  1. זרע את קווי התאים הסרטניים בצלחת תרבית רקמת T75 סטנדרטית ולשמור אותם בתרבות, כך שהם ~ 80% confluent ביום BC-MPS יעובד. (~ 200,000 תאים סרטניים יהיה צורך לכל BC-MPS). לגדל את התאים הסרטניים בתקשורת נורמלית.
    הערה: כדי לזהות ולבודד את התאים הסרטניים מומלץ כי התאים הם transfected עם חלבון פלואורסצנטי כדי להבדיל אותם מן ASCs ורקמת השד. מספר התאים הסרטניים הדרושים לכל BC-MPS עבר אופטימיזציה לתאי MCF7 ומד"א-MB-231. קווי תא אחרים עשויים לדרוש מיטוב נוסף.
  2. ביום שבו BC-MPS הוא להיות מוכן להעביר את הבקבוק המכיל את התאים הסרטניים לארון biosafety. שאף את התקשורת מהבקבוקון. לשטוף את הבקבוק עם 5 מ"ל של PBS.
  3. הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק תאים לבקבוק המכיל את התאים הסרטניים ולאחר מכן לדגר את הבקבוק באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים נותקו (~ 2-5 דקות).
  4. בארון biosafety להוסיף 9 מ"ל של PBS לבקבוק, להעביר את התאים PBS לתוך צינור חרוט 15 מ"ל ולספור את מספר התא באמצעות המוציטרומטר.
  5. צנטריפוגה התאים הסרטניים ב 500 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. השהה מחדש את התאים במדיית BC-MPS כך שיהיו 2 x 106 תאים/מ"ל.
  7. מניחים את התאים הסרטניים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים להתווסף לרקמה האנושית.

5. עיבוד של רקמת השד האנושית

  1. בארון biosafety לשטוף את רקמת השד האנושית (HBT) 3x עם 10 מ"ל של PBS סטרילי.
  2. השתמש מלקחיים סטריליים סכין גילוח כדי לטחון גס את BC-MPS ולנסות להסיר כמה שיותר fascia ורקמת חיבור ככל האפשר. כשל בהסרת רקמת החיבור עלול לגרום לשכבה העליונה של ASC לא לעגן כראוי את HBT.
    הערה: ניתן לזהות את הפאשיה ורקמת החיבור על ידי המראה הלבן או הברור שלה בהשוואה לצבע הצהוב של רקמת השומן.
  3. לאחר רקמת החיבור הוסר להשתמש סכין גילוח סטרילי כדי לטחון דק את הרקמה עד שיש לו עקביות נוזלי הומוגנית. הרקמה טחונה דק כאשר זה יכול בקלות להיות pipetted באמצעות קצה סרולוגי 25 מ"ל.
  4. השתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לחתוך את הקצה מקצה פיפטה p1000 כדי לסייע בצנרת HBT טחון.
  5. בצינור 1.5 מ"ל לערבב HBT טחון, קווי תאים סרטניים, ומדיה BC-MPS (עבור 1 גם של צלחת 6 גם זה דורש 200 μL של HBT טחון, 100 μL של מדיה BC-MPS, ו 100 μL של תאים סרטניים).
  6. להעביר את צלחת ASC שישמש עבור גיליון התא התחתון מן החממה לארון biosafety. שאף את המדיה מלוח ASC התחתון. פיפטה התערובת למרכז הבאר של צלחת ASC התחתון באמצעות קצה פיפטה p1000 כי היה סוף דיסטלי מנותק משלב 5.4
  7. הזז את התיבה המכילה את צלחת ASC העליונה עם הבוכנות עליה לארון biosafety. מוציאים בעדינות את הבוכנות לג'לטין מהצלחת מצופה pNIPAAm ומניחים על גבי תערובת HBT. הוסף מדיה BC-MPS לבאר (עבור 1 גם של צלחת 6-באר להוסיף 2 מ"ל של מדיה). בזהירות להעביר את לוחות ASC התחתון עם תערובת BC-MPS ובוכנות לתיבת פלסטיק סטרילי ומניחים את המכסה של התיבה על להובלה.
    הערה: מכסה צלחת 6 באר לא יתאים בחזרה על צלחת ASC בזמן הבוכנות הם על. יש להקפיד להימנע מזיהום התרבות.
  8. דגירה את הצלחת התחתונה בתיבה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עד הג'לטין נמס, ואת שכבת ASC העליון החלה לדבוק בשכבה התחתונה (~ 30 דקות).
  9. להעביר את התיבה עם הצלחות לארון biosafety. מוציאים בעדינות את הוכנות מהצלחות התחתונות. הרקמה עם התאים הסרטניים תעוגן לתחתית הבאר.
  10. מניחים את המכסה של צלחת 6 באר בחזרה על הצלחת התחתונה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס כדי להמיס לחלוטין את הג'לטין ולאפשר את השכבה העליונה לעגן לחלוטין לשכבה התחתונה (~ 30-60 דקות).
  11. בעדינות להעביר את הצלחות לארון biosafety ולשאוף את התקשורת עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של מדיה טרייה לכל באר. לשאוף מקצה הבאר פיפטה על קצה הבאר, כדי למנוע עקירת הרקמה.
  12. שמור על BC-MPS ב 37 °C (70 °F) ו 5% CO 2 עבורמשך הזמן הרצוי ולשנות את המדיה כל 2-3 ימים.

6. עיכול של BC-MPS לניתוח

  1. כאשר BC-MPS מוכן לניתוח, להעביר את הצלחת לארון biosafety. הסר מדיה עם פיפטה סרולוגית כדי למנוע עקירה מקרית של כל רקמה.
  2. הוסף נפח אחד של PBS לכל באר.
  3. הסר את PBS עם פיפטה סרולוגית.
  4. הוסף 1 מ"ל של פתרון ניתוק תאים לכל באר. מעבירים את הצלחת חזרה לאינקובטור ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק. בארון biosafety, להשתמש מגרד תאים לנתק לחלוטין את התאים ואת הרקמה מצלחת התרבות.
  5. להעביר את הפתרון עם הרקמה לצינור חרוט 15 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית. הוסף 2 מ"ל של PBS לכל באר כדי לאסוף את כל התאים הנותרים ולהעביר פתרון זה לצינור חרוט. אם התאים הם פלואורסצנטיים, לעטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור.
  6. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמדת שייקר מסלולית ב 1 x g במשך 10-20 דקות כדי לנתק לחלוטין תאים מהרקמה.
  7. בארון biosafety להשתמש פיפטה סרולוגית לשבש את כל גושים שנותרו של תאים בצינור ולסנן את המדגם דרך מסננת רקמת μm 250 לתוך צינור חדש 15 מ"ל. פיפטה הפתרון לאט דרך מסננת, כך שהוא לא עולה על גדותיו.
  8. לשטוף את מסננת עם 1 מ"ל PBS כדי לאסוף את כל התאים עדיין מסננת.
  9. צנטריפוגה הדגימות ב 500 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, adipocytes יהיה צף על השכבה העליונה של הפתרון בעוד תאים סרטניים ASCs יהיה מעורבב יחד גלולה בתחתית הצינור.
  10. כדי לבודד את adipocytes בעדינות לשפוך את השכבה העליונה לתוך צינור חדש או לחילופין לחתוך את הקצה את קצה פיפטה p1000 ולהעביר את השכבה העליונה לצינור חדש. צנטריפוגה המדגם ב 500 x g במשך 5 דקות שוב ולהשתמש מזרק ומחט כדי להסיר את הפתרון מתחת adipocytes כך רק adipocytes נשארים. האדיפוציטים מוכנים כעת לניתוח
  11. לאחר הסרת adipocytes מן הפתרון, להפריד את ASCs ותאים סרטניים אחד מהשני לניתוח אם התאים הסרטניים היו חרוטים בעבר עם חלבון פלואורסצנטי. לשאוף את הפתרון הנותר מן הצינור המכיל את ASCs ותאים סרטניים מבלי לשבש את גלולת התא. השתמש שוב בכדור במדיית PBS או BC-MPS והשתמש בציטומטריית זרימה כדי למיין את התאים בהתבסס על הפלואורסצנטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יציבות בתרבות
BC-MPS היא מערכת מיקרופיזיולוגית יציבה שיכולה להיות תרבותית במבחנה עד 14 ימים לפחות. תמונת שדה בהיר של גליונות התאים של ASC צולמה בהגדלה של פי 100 כדי להציג את התבנית המנוסה של גיליון המפגש (איור 2A). גיליונות התא ASC יציבים בתרבות לפחות 4 שבועות. BC-MPS ב 14 ימים בתרבות בבאר אחת של צלחת 6 באר היה בתמונה עם מצלמה צבעונית המוכיחה כי HBT ציפה עדיין מעוגן ביציבות על ידי גיליונות תא ASC לתחתית הבאר לאחר 14 ימים(איור 2B). זה מדגים כי גיליון התא המשמש כריך רקמת השומן הוא עדיין שלם. קו התאים השלילי המשולש של BC MDA-MB-231 המבטא RFP היה בתרבית ב- HBT במשך 14 יום ולאחר מכן צולם עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הממחיש את יציבות ה- BC-MPS עם קווי תאים החוצה לפחות 14 ימים (איור 2C). נוכחותם של תאי BC ברקמה מדגימה את היכולת של תאים סרטניים לפלוש HBT. הסבר PDX שלילי משולש הוצא מעכבר, מוכתם ב- CMTPX של גשש תאים ותרבית עם HBT. תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות צולמו ביום 6 כדי להראות את היציבות של BC-MPS עם explants הגידול לפחות 6 ימים (איור 2D). זה מדגים כי BC-MPS יכול לשמש לתרבות גידול explants עם HBT, כמו גם קווי תאים.

רכיבי HBT מקוריים
BC-MPS מכיל את האלמנטים המקוריים של HBT בתרבות. BC-MPS המכיל 100 מ"ג של HBT היו תרבותיים במבחנה במשך 14 ימים. הרקמה תועדה באמצעות מיקרוסקופיה של ברייפילד לאחר 14 יום בתרבות (איור 3A). תמונה זו מדגימה את שימורם של אשכולות של אדיפוציטים בוגרים ב 14 ימים בתרבות. הרקמה תוקנה אז עם 10% פורמלין, פרפין מוטבע, חתך ב 5 מיקרומטר באמצעות microtome ולאחר מכן מוכתם בכתם pentachrome Movats באמצעות פרוטוקול סטנדרטי. החלקים הקבועים צולמו ב- 100x (איור 3B) או 20x (איור 3C). התמונות מראות כי BC-MPS מכיל את הקולגן המקורי (סגול), סיבים reticular (כחול), ואת adipocytes צורה חד-תאית גדולה בין רקמת החיבור נשמרת ב 14 ימים בתרבות. כדי לזהות מקרופאגים ראשיים במערכת, HBT היה בתרבית במשך 0, 3 ו- 7 ימים ולאחר מכן תוקן ומוכתם באנטי-CD45, אנטי-CD68 ואנטי-CD206. CD45 שימש כמזהה לויקוציטים כללי. CD68 שימש כתם מונוציט לזיהוי מקרופאגים בעוד CD206 מזהה קולטן נפוץ הקיים על מקרופאגים. הכתם של סמני המקרופאג' כומת באמצעות תוכנת דימות (איור 3D). זה מדגים את השימור של מקרופאגים ראשוניים לאחר 3 ו -7 ימים בתרבות. נתונים אלה מראים כי BC-MPS משמר את האלמנטים המקוריים של HBT בתרבות. ניסויים נוספים יכולים להתבצע כדי לחקור כיצד תאי BC לשפץ את האלמנטים המקוריים של HBT. הדבר יכול לכלול הערכת שינויים בסמני מקרופאגים כדי לקבוע אם הם משתנים על-ידי נוכחותם של תאי BC. שינויים ב- ECM ניתן לנתח עוד יותר על ידי השוואת מכתים pentachrome Movats של דגימות שהיו בתרבית עם או בלי תאי BC כדי לקבוע אם תוכן הקולגן משתנה ואת גודל adipocytes ניתן להשוות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כגון תמונה J כדי לקבוע אם תאי BC לשנות גודל adipocyte.

גבעול מטבולי
סרטן Adipocyte crosstalk מטבולית הוא מסלול חשוב לפיו microenvironment הגידול משפיע על התקדמות BC. BC תאים המצטברים שומנים תאיים להפגין עמידות מוגברת לסמים פנוטיפ פולשני יותר15. בעוד תאי BC הוכחו לגרום lipolysis ב ילדותי, מורין adipocytes, הרלוונטיות הפיזיולוגית של זה נשאר לא ברור כי crosstalk מטבולית בין BC לבין adipocytes אמאמי אנושי ראשי מעולם לא הוכח. כדי להדגים כי BC-MPS יכול מודל זה adipocyte-BC מטבולית crosstalk RFP שכותרתו MDA-MB-231 תאים היו מתורבתים לבד או BC-MPS במשך 14 ימים. התאים התעכלו אנזימטית להשעיית תא יחיד, הוכתמו בצבע השומנים הניטרלי בודיפי, ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה(איור 4A, B)16. שיעור תאי MDA-MB-231 החיוביים לשומנים היה 26.2 פי 2 SEM +/- 2.5 יותר בתרבות BC-MPS לעומת 2D (איור 4C). עלייה זו בכתם השומנים מדגימה כי התאים הסרטניים מקיימים אינטראקציה עם adipocytes ולוקח שומנים ששוחררו מן adipocytes בוגרת. מיון תאים בוצע כדי לבחור עבור תאי RFP+ Bodipy+ . לאחר המיון, התאים היו מצופים בקולגן שציפויתי כיסויי זכוכית והותר לי לחבר בן לילה. למחרת התאים תוקנו ב 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות ולאחר מכן תמונה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה 100x. תאים בתרבית BC-MP (איור 4E) הציגו טיפות שומנים מוגברות בהשוואה לתאים בתרבית דו-מימדית סטנדרטית (איור 4D). זה מדגים crosstalk מטבולית בין תאי BC ו HBT וגם, מראה כיצד הצטברות השומנים ניתן לנתח על ידי cytometry זרימה או על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. ניתוח נוסף של הצטברות שומנים בתאים סרטניים יכול להיעשות באמצעות כימות הגודל של טיפות השומנים ומספר טיפות השומנים לכל תא.

תנועת אמובויד
דיבורים צולבים מטבוליים בין תאי BC ו adipocytes מגביר את היכולת הפולשנית של הסרטן. כדי להעריך את היכולת הפולשנית המוגברת של התאים הסרטניים בתרבית עם HBT ההגירה של תאי BC ברחבי HBT הוערכה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. קו התא גרורתי TNBC MDA-MB-231 המבטא RPF היה תרבותי BC-MPS במשך 4 ימים כדי לאפשר למערכת להתייצב. מיקרוסקופ פלואורסצנטי לשגות זמן בוצע לאחר 4 ימים כדי לדמיין את תנועתיות MDA-MB-231 עם תמונה אחת שנתפסו כל 20 דקות במשך 19 שעות ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2. הסרטון שנוצר הדגים דפוסי תנועה אמובואידיים ודרגה גבוהה באופן מפתיע של תנועתיות לתאי מד"א-MB-231 (איור 5 ווידאו 1). זה מדגים עלייה ביכולת פולשנית של תאי BC ואת היכולת של תאי BC לפלוש HBT. ניתן לנתח עוד יותר את ההעברה של תאי ה- BC ב- HBT באמצעות שיטות שפורסמו בעבר לכימות המהירות והכיוון של תאים נודדים17,18. כמו כן נצפו תאי מד"א-MB-231 שעברו מיטוזה. התנהגויות אלה עולות בקנה אחד עם פנוטיפ אגרסיבי שלה, הם התנהגויות חשובות עבור התקדמות סרטן גרורות, ולהדגיש התנהגויות BC חדשות שעשויות להיות ממוקדות לטיפולים BC.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה כללית של הגדרת BC-MPS. (A)ג'לטין מתגבש בוכנה זקופה. (B) הבוכנה עם ג'לטין ממוקמת על גיליון התא ASC העליון thermoresponsive. (ג)משקל משמש כדי לאלץ את הג'לטין לשמור על קשר עם גיליון התא בעוד התאים דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ואחריו דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. (ד) הבוכנה מוסרת מן המנה הקרה הסרת גיליון התא שלם עם זה. (ה)הבוכנה עם גיליון התא העליון מועברת למנה המכילה את גיליון התא התחתון ואת תאי HBT ו- BC הטחונים. (ו)צלחת התא התחתון עם מדיה, בוכנה, HBT, BC ושני גיליונות התא הם דגירה ב 37 °C (60 °F) במשך 30-60 דקות כדי לאפשר את הג'לטין להמיס את גיליונות התא מן המגעים. (G)הסרת הבוכנה משאירה את HBT ו- BC דחוקים בין שני גיליונות תא ASC. בוכנה מודפסת בתלת-ממד תוכננה באמצעות התוכנה המקוונת החינמית TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) והודפסה במדפסת תלת-ממד. הכוען מורכב מחומצה פולילקטית. (H)הממדים של בוכנה עבור 1 באר של צלחת 6-באר מסומנים. ההפסקה של הכוכנה היא 2.5 מ"מ.(I)מוצגת תמונה של הכוכנה המודפסת בתלת-ממד בפועל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: יציבות מייצגת של BC-MPS בתרבות. (A) תמונת brightfield בהגדלה של 100x של ASCs confluent המדגים את התבנית מפוסגת של התאים confluent. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) BC-MPS, המכיל 100 מ"ג של HBT, היה תרבותי בצלחת 6 באר. לאחר 14 ימים צולמה תמונה צבעונית כדי להדגים כי HBT מעוגן לתחתית הבאר של צלחת 6 באר. (C)קו תאי BC השלילי המשולש MDA-MB-231 המבטא RFP היה תרבית עם HBT במשך 14 ימים ולאחר מכן צולם באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהגדלה 40x. התמונות מראות כי תאי מד"א-MB-231 עדיין היו בני קיימא וגדלו ב- HBT. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר D) גידולי PDX של סרטן שד שלילי משולש מעכברים היו טחונים לתוך 3 ס"מ2 חתיכות ומסומן עם גשש התא האדום CMPTX. היצירות היו תרבותיות ב- HBT וה- BC-MPS שנוצר צולם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 40 ביום 6 הממחיש את יציבותו בתרבות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר.

Figure 3
איור 3: שימור מייצג של אלמנטים מקוריים של HBT הקיימים ב- BC-MPS. BC-MPS היה תרבותי במשך 14 ימים ולאחר מכן גם בתמונה עם מיקרוסקופ שדה בהיר ב 40x (A) ולאחר מכן קבוע עם 10% פורמלין מוכתם עם כתם פנטכרום Movats. התמונות צולמו ב 100x(B)או 20x(C). הדמיה של HBT מצביעה על שימור של אדיפוציטים חד-גוניים גדולים המקובצים יחד ופרוסות רקמות מצביעות על נוכחות של שימור ה- ECM המקורי כגון קולגן (צהוב) וסיבים רשתיים בין האדיפוציטים (כחול). כדי להדגים את השימור של מקרופאגים במודל HBT היה תרבותי במשך 0, 3, או 7 ימים, מוכתם עבור סמני מקרופאגים, ותמונה באמצעות מיקרוסקופיה confocal (D). עוצמת הפלואורסצנט של הכתם של סמני המקרופאג' כמתה באמצעות תוכנה מסחרית זמינה המוכיחה כי מקרופאגים עדיין נמצאים ברקמה לאחר 3 ו -7 ימים בתרבות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר.

Figure 4
איור 4: הצלבה מטבולית מייצגת בין אדיפוציטים לתאי סרטן ב- BC-MPS. תאי MDA-MB-231 בעלי תווית RFP היו מתורבתים ב- BC-MPS לעומת דו-ממדי במשך 14 יום, ולאחר מכן הוכתמו ב Bodipy (250 nM) ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה. (A) זרימהשל תאי מד"א-MB-231 מוכתמים בודיפי לאחר 14 ימים בתרבות דו-ממדית. התאים ב- B2 היו בודיפי+RFP+; התאים ב- B1 היו בודיפי-RFP+. B2/(B1+B2) = 3.26%, המציין הצטברות שומנים שומנים מינימלית. (B)ניתוח ציטומטריה זרימה של תאי MDA-MB-231 מוכתמים בודיפי לאחר 14 ימים ב- BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85.35%, המציין הצטברות שומנים נרחבת. (ג)הצטברות שומנים במד"א-MB- 231 תאים לאחר 14 ימים בתרבות דו-ממדית לעומת BC-MPS. ניתוח מיקרוסקופי פלואורסצנטי של כתמי בודיפי של MDA-MB-231 בתרבית דו-ממדית (D) לעומת BC-MPS (E) מדגים הצטברות שומנים מוגברת בתאים הגדלים ב- BC-MPS. קווי שגיאה הצביעו על SEM. ** p < 0.01, n = 2 משכפלים ביולוגיים, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.

Figure 5
איור 5: הגירה מייצגת של TNBC ב- BC-MPS. תאי MDA-MB-231 בעלי תווית RFP היו מתורבתים ב- BC-MPS במשך 4 ימים ולאחר מכן תמונות רציפות של BC-MPS עם תווית RFP + תאי MDA-MB-231 נלכדו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (מסגרת אחת לכל 60 דקות, הגדלה של 100x).) כוכביות צהובות = אירוע מיטוטי. תיבה צהובה = פסולת סלולרית המשמשת לעיון מיקום. חצים כחולים = 231 תאים המציגים תנועה אמובואידית עם פסאודופודים ותנועתיות גבוהה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.

וידאו 1: הגירה מייצגת של TNBC ב- BC-MPS. BC-MPS המכיל תאי MDA-MB-231 עם תווית RFP היו מתורבתים במשך 4 ימים והמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית שימשה לדימוי התאים כל 20 דקות ב-19 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. התמונות נאספו לתוך וידאו (מסגרת אחת לכל 60 דקות, הגדלה 100x). אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכות חדשות למידול סרטן השד האנושי נדרשות כדי לפתח הבנה טובה יותר של המחלה. פיתוח מערכות מיקרופיזיולוגיות אנושיות למידול הגדרות מחלות הכוללות ECM מקורי ותאי סטרומה יגדיל את כוח החיזוי של מחקרים פרה-קליניים. מודל BC-MPS המוצג כאן הוא מערכת שפותחה לאחרונה המתגברת על המגבלות של מודלים קודמים מאפשרת הערכה של BC בסביבת HBT המקורית שלה. מערכת זו יכולה לשמש עם קווי תאים סרטניים או עם explants הגידול והוא יציב לפחות 14 ימים. תיוג פלואורסצנטי של תאי BC מאפשר לנטר בזמן אמת את תנועתיות התאים הסרטניים ואת האינטראקציות בין תאי התא, ההגירה, הכדאיות או ההתפשטות בזמן אמת או בנקודות זמן ספציפיות (איור 3 ואיור 5). מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להבהיר היבטים חשובים על ביולוגיה של סרטן כפי שהוא מתייחס האינטראקציות בין תאים סרטניים microenvironment שלהם. חקירה של מערכת זו יכולה להודיע על ויסות TME של התקדמות סרטן, תגובה לתרופות, ואת החניכה של גרורות.

כדי להגדיר בהצלחה את המערכת, קיימים מספר שלבים קריטיים שיש לבצע. הצעד הקריטי הראשון הוא culturing והעברה של גיליונות תאים ASC. הלוחות מצופים pNIPAAm רגישים לטמפרטורה. כאשר הלוחות הם מעל 32 מעלות צלזיוס פני השטח הוא הידרופובי, ואת ASCs יהיה לדבוק על פני השטח. פני השטח יהפכו הידרופיליים מתחת לטמפרטורה זו והתאים יתחילו להתנתק19. לכן, יש צורך לקבוע באיזו מהירות סוג תא נתון יתחיל להתנתק משטחים אלה. עבור ASCs נגזר HBT זה ייקח > 30 דקות אם התאים הם confluent. כדי למנוע את התאים מלהתנתק במהלך תחזוקה רגילה התקשורת צריכה להיות מחוממת מראש ל 37 מעלות צלזיוס ואת צלחות תרבית הרקמה לא צריך להישמר בטמפרטורת החדר במשך זמן רב מדי כדי למנוע את הצלחות מקירור ואת התאים ניתוק. חשוב גם לקבוע את הזמן האופטימלי עבור בוכנות ג'לטין להיות על הצלחות מצופה pNIPAAm להעביר את כל גיליון התא. ASCs צריך להיות confluent ואת הגיליון כולו צריך להיות מועבר. אם גיליון התא העליון אין זמן להתנתק לחלוטין לאגד את הג'לטין אז גיליון התא יהיה שבור במהלך ההעברה. אם גיליון התא כולו לא מועבר לחלוטין, אז ASCs לא יוכלו כריך רקמת השד ציפה.

ASCs המשמש כריך HBT הם תאים סטרומה נורמלי של microenvironment השד כי להפריש ECM, גורמי גדילה, ציטוקינים המשפיעים על BC20. כדי כריך HBT בין שני גיליונות תא, גיליונות ASC מועברים באמצעות צלחות תרבית רקמה תרמורסיבית. זה מאפשר ECM המקורי מופרש על ידי ASCs להיות שלם ומשמש לעגן את adipocytes ציפה ברקמה. באמצעות ASCs נגזר רקמת השד האנושית זה מבטיח כי האינטראקציות שיש ASCs עם התאים הסרטניים יהיה לחקות את מה שקורה בסרטן השד כמו ASCs ממחסנים שונים להציג ביטוי גנים שונים ו ECM שיפוץ21.

השלב הקריטי השני הוא העיבוד של HBT. יש צורך להשתמש HBT מבודד טרי כדי לשמר את הכדאיות של הרקמה. בעת עיבוד HBT זה קריטי כדי לטחון דק את הרקמה ולהסיר כמה שיותר fascia ככל האפשר. אם חתיכות גדולות של fascia נשארים HBT, זה ימנע את גיליונות התא מעגן כראוי את הרקמה ציפה. בנוסף, fascia שמאל ברקמה יכול לנתק מן הצלחת וזה ימשוך אשכולות מרובים של HBT עם זה מה שהופך את הבאר שמיש לניסויים נוספים. HBT צריך להיות ממוקם באמצע הבאר לפני הוספת גיליון התא העליון אחרת ASCs לא יוכלו כראוי כריך HBT ואת הרקמה על קצה הבארות לא יהיה מעוגן. אם צעדים קריטיים אלה מתבצעים, אז התהליך של הפקת BC-MPS הוא ישר קדימה כדי להגדיר.

המודל המפורט כאן הוא מערכת משופרת לחקר BC במיקרו-ווירון הטבעי של HBT ראשוני השומר על אדיפוציטים בוגרים, ECM ותאי חיסון מקומיים (איור 4). מודלים פרה-קליניים המחקים את השומן מיקרו-וירוס חסרים אלמנטים מרובים של המיקרו-וירוס, כגון אדיפוציטים בוגרים, תאי חיסון, פיברובלסטים ו- ECM. באמצעות HBT בוגר לחלוטין מאפשר חקירה בו זמנית והדדית של סביבה מורכבת זו הכוללת אלמנטים מרובים המשפיעים על התפתחות סרטן, תגובת סמים, ופולשנות באמצעות פרמקרין ו juxtacrine איתות22,23,24,25. פיברובלסטים תושב ASCs להשפיע גרורות סרטן באמצעות שיפוץ של ECM ברקמה באמצעות paracrine איתות26,27. ה- ECM ושיפוצו חיוניים לייזום גרורות. שינויים ב- ECM של microenvironment הגידול להשפיע על הגירה גרורות של BC, אבל רוב המחקרים BC אינם משלבים ECM מקורי לתוך המחקרים שלהם ובמקום להשתמש מודלים פשוטים המורכב קולגן אני או matrigel28,29. ה- ECM ב- BC-MPS הוא מ- HBT ומ- ASCs. לכן, ניתן ללמוד את האופן שבו ECM הילידי משופץ במיקרו-וירוס הגידול ברקמת השד ומשפיע על גרורות. לכן, מודל BC-MPS זה משלב אלמנטים מרובים של microenvironment הגידול כי מערכות מודל הקודם לא היה.

מודל זה יכול לשמש כדי ללמוד crosstalk מטבולית בין adipocytes בוגרת לחלוטין ותאי BC. מודלים קודמים הלומדים את האינטראקציה בין אדיפוציטים לתאי סרטן משתמשים בקדם-אדיפוציטים המובחנים במבחנה. טרום adipocytes כי הם מובחנים במבחנה אינם מתבגרים באופן מלא באותה מידה כמו adipocytes מובחנים vivo30,31. כדי להבין כיצד adipocytes להשפיע על התקדמות סרטן תגובה סמים חיוני כדי לחקות כראוי את ההרכב המולקולרי והכימי המורכב של adipocytes יליד. כאן הוכחנו שהמערכת שלנו מאפשרת להעריך את ההצלבה המטבולית המתרחשת בין אדיפוציטים לתאי BC (איור 4).

BC-MPS יכול לשמש גם בביצוע מחקר במבחנה על איך תנאים כגון השמנת יתר, אשר לא ניתן לדגמן כראוי באמצעות קווי תאים סטנדרטיים, להשפיע על התקדמות הסרטן. השמנת יתר קשורה לשינוי של microenvironment של HBT ועלייה גרורות ב- BC למרות המנגנונים המדויקים אינם מובנים במלואם32,33,34. Fibroblasts, ASCs, adipocytes ו ECM משתנים במהלך השמנת יתר ולקדם עוד יותר התקדמות גרורות של סרטן25,35,36. לכן, חשוב להשתמש בתאים סטרומה מקוריים ו- ECM מרקמה שמנה כדי להבין כיצד שינויים אלה בתאים סטרומה ו ECM משפיע לפני הספירה. על ידי ניצול HBT ו ASCs מחולים שמנים או רזים במודל BC-MPS המנגנונים שבאמצעותם השמנת יתר לקדם פנוטיפ גרורתי ניתן להבהיר.

השיטה המוצגת כאן היא עבור culturing תאים סרטניים בשד בתרבות הכוללת ASCs, adipocytes בוגרת, ו ECM יליד. מודלים קודמים של מערכות שיתוף תרבויות למדו כיצד אלמנטים שונים אלה של הסביבה סטרומה להשפיע על סרטן. כמו ASCs ואת adipocytes הן להשפיע על התקדמות BC זה יכול להיות מסובך כדי לקבוע איזה סוג תא אחראי להשפיע על BC. עם זאת, ניתן לקבוע זאת על-ידי השוואת BC-MPS למודלים פשוטים יותר של תרבות משותפת עם סוג תא אחד. אחד היתרונות של מערכת זו בהשוואה למערכות על שבב או ביו-הדפסה הוא שאין צורך בציוד מיוחד כדי להקים את המערכת מעבר ללוחות מצופים pNIPAAm הזמינים מסחרית. מערכות מודל של רקמת השד תוארו בעבר באמצעות bioprinting להפקיד ASCs לתוך פיגומים כי הם מובחנים אז בתרבות22. זה דורש 2-3 שבועות נוספים עבור התאים להבדיל ASCs מובחנים בתרבות אינם מבדילים באופן מלא אדיפוציטים בוגרים. adipocytes בוגרת מן HBT ב BC-MPS מוכנים לשמש ברגע שהם מוסרים מחולה.

מערכת המודל המתוארת כאן היא מערכת שימושית לחקר crosstalk בין תאים סרטניים microenvironment, עם זאת, יש לו כמה מגבלות. אחת המגבלות העיקריות היא הזמינות של רקמת השד האנושית העיקרית. רקמת שומן אנושית לא ניתן cryopreserved ללא אובדן הכדאיות ולכן הרקמה המשמשת להכנת BC-MPS צריך להיות מושגת טרי בשימוש37. מגבלה נוספת היא שהמודל כפי שמוצג כאן הוא מערכת סטטית המתרבתת ב-6 צלחות באר רגילות. המערכת חסרה את הזרימה המיקרופלואידית הקיימת באיברים על שבב אשר יכול להשפיע על זמינות חמצן וחומרים מזינים, מתח מוחלט, והפצת תרופות38,39. מגבלה שלישית היא הצורך להפריד בין התאים בסוף הניסוי אם יש לנתח את סוגי התאים השונים בנפרד. פעולה זו דורשת את הצורך לתייג את התאים כך שניתן יהיה להפרידם זה מזה.

שילוב של אלמנטים רבים של microenvironment הגידול מייצר מודל פיזיולוגי ללמוד התקדמות סרטן ואת החניכה של גרורות. בנוסף ליכולת ללמוד תאים סרטניים במודל פיזיולוגי יותר, BC-MPS יכול לשמש גם כדי ללמוד את האלמנטים הבודדים של microenvironment וכיצד הם מושפעים מסרטן. בעוד שהנתונים המיוצגים כאן מדגימים כיצד ניתן להשתמש ב- BC-MPS עם קו תא אחד, ניתן להתאים בקלות BC-MPS כך שיתאים לצורך הניסיוני המסוים של החוקר. לדוגמה, HBT שמנים ניתן להשוות HBT רזה כדי לקבוע כיצד השמנת יתר משפיעה על גרורות סרטן והתקדמות. תת סוגים שונים של BC ניתן לזרוע לתוך BC-MPS כדי ללמוד כיצד תת סוגים של סרטן אינטראקציה שונה עם microenvironment. ניתן להציע טכניקות לעריכת גנים כדי לקבוע כיצד גנים ספציפיים משפיעים על האינטראקציה בין BC למיקרו-וירוס. מודל זה ויישומים שלה יאפשר הבנה מדויקת יותר של איך הסביבה סטרומה וסרטן השד אינטראקציה כדי לקדם את התקדמות הסרטן גרורות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לסיטומטריית זרימת טוליין וליבת מיון התאים, כמו גם לליבת ההיסטולוגיה של טוליין על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה הדרום-מזרחית למנתחים פלסטיים ומשחזרים 2019 מענק מחקר והקרן הלאומית למדע (מסלול EPSCoR 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020).
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

חקר הסרטן גיליון 170 סרטן השד מערכת מיקרופיזיולוגית רקמת שד אנושית תאי גזע שמקורם בשומן תרבות ראשונית פיתוח תרופות crosstalk מטבולית
דוגמנות סרטן השד ברקמת השד האנושית באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. M., Hebert, K. L.,… More

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter