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Cancer Research

एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम का उपयोग कर मानव स्तन ऊतक में स्तन कैंसर मॉडलिंग

doi: 10.3791/62009 Published: April 23, 2021

Summary

यह प्रोटोकॉल शेल्फ सामग्री के साथ प्राथमिक मानव स्तन ऊतक का उपयोग करके स्तन कैंसर का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम के निर्माण का वर्णन करता है।

Abstract

स्तन कैंसर (बीसी) महिलाओं के लिए मौत का एक प्रमुख कारण बना हुआ है । सालाना बीसी अनुसंधान में $ 700 मिलियन से अधिक निवेश के बावजूद, 97% उम्मीदवार बीसी दवाएं नैदानिक परीक्षणों में विफल हो जाती हैं। इसलिए, रोग के बारे में हमारी समझ में सुधार करने के लिए नए मॉडलों की जरूरत है । NIH माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम्स (एमपीएस) कार्यक्रम बुनियादी विज्ञान खोजों के नैदानिक अनुवाद में सुधार और नई चिकित्सीय रणनीतियों का वादा करने के लिए विकसित किया गया था । यहां हम स्तन कैंसर (बीसी-एमपीएस) के लिए एमपीएस पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल आदिपोस-व्युत्पन्न स्टेम सेल शीट्स (एएससी) एस के बीच वाट सैंडविचिंग द्वारा प्राथमिक मानव सफेद एडीपोज ऊतक (वाट) को बनाने के पहले वर्णित दृष्टिकोण को अनुकूलित करता है। हमारे बीसी-एमपीएस के उपन्यास पहलुओं में बीसी कोशिकाओं को गैर-रोगग्रस्त मानव स्तन ऊतक (एचबीटी) में सीडिंग करना शामिल है जिसमें देशी एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स, परिपक्व एडिपोसाइट्स, निवासी फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं; और एचबीटी-व्युत्पन्न एएससी शीट्स के बीच बीसी-एचबीटी मिश्रण सैंडविचिंग । जिसके परिणामस्वरूप बीसी-एमपीएस संस्कृति पूर्व वीवो में कम से 14 दिनों के लिए स्थिर है । इस मॉडल प्रणाली में माइक्रोएनवायरमेंट के कई तत्व होते हैं जो ईसा पूर्व को प्रभावित करते हैं जिसमें एडिपोसाइट्स, स्ट्रोमल कोशिकाएं, प्रतिरक्षा कोशिकाएं और बाह्य कोशिकाएं शामिल हैं। इस प्रकार बीसी-एमपीएस का उपयोग बीसी और इसके माइक्रोएनवायरमेंट के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

हम कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस को प्रभावित करने के लिए जाने जाने वाले दो बीसी व्यवहारों का अध्ययन करके अपने बीसी-एमपीएस के फायदों को प्रदर्शित करते हैं: 1) बीसी मोटिविटी और 2) बीसी-एचबीटी मेटाबोलिक क्रॉसटॉक। जबकि बीसी मोटिविटी को पहले इंट्राविटल इमेजिंग का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है, बीसी-एमपीएस कई दिनों में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, जब मेटाबोलिक क्रॉसटॉक को पहले बीसी कोशिकाओं और मुरीन प्री-एडिपोसाइट्स का उपयोग करके अपरिपक्व एडीपोसाइट्स में विभेदित किया गया था, तो हमारा बीसी-एमपीएस मॉडल प्राथमिक मानव स्तन एडिपोसाइट्स और विट्रो में बीसी कोशिकाओं के बीच इस क्रॉसटॉक को प्रदर्शित करने वाली पहली प्रणाली है।

Introduction

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हर साल, ४०,० से अधिक अमेरिकी महिलाओं को स्तन कैंसर (ईसा पूर्व)1से मर जाते हैं । सालाना बीसी अनुसंधान में $ 700 मिलियन से अधिक निवेश के बावजूद, 97% उम्मीदवार बीसी ड्रग्स नैदानिक परीक्षणों में विफल रहते हैं2,3। दवा विकास पाइपलाइन और बीसी की हमारी समझ में सुधार करने के लिए नए मॉडलों की जरूरत है । एनआईएच माइक्रोफिजियोलॉजिकल (एमपीएस) कार्यक्रम ने बुनियादी विज्ञान को नैदानिक सफलता4में अनुवाद में सुधार के लिए सफलता मॉडल के लिए आवश्यक सुविधाओं को चित्रित किया । इनमें प्राथमिक मानव कोशिकाओं या ऊतकों का उपयोग, 4 सप्ताह के लिए संस्कृति में स्थिर, और देशी ऊतक वास्तुकला और शारीरिक प्रतिक्रिया को शामिल करना शामिल था।

वर्तमान इन विट्रो बीसी मॉडल, जैसे बीसी सेल लाइनों की दो-आयामी संस्कृति, झिल्ली सम्मिलित सह-संस्कृति, और त्रि-आयामी स्फेरॉइड और ऑर्गेनॉइड, एनआईएच के एमपीएस मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं क्योंकि इनमें से कोई भी देशी स्तन ऊतक वास्तुकला को फिर से नहीं बनाता है। जब इन प्रणालियों में एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) जोड़ा जाता है, तो स्तन ईसीएम का उपयोग नहीं किया जाता है; इसके बजाय, कोलेजन जैल और बेसमेंट झिल्ली मैट्रिस का उपयोग किया जाता है।

वीवो सिस्टम में वर्तमान, जैसे रोगी व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स), इसी तरह एनआईएच के एमपीएस मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं क्योंकि मुरीन स्तन ऊतक मानव स्तनों से काफी भिन्न होते हैं। इसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रणाली-ईसा पूर्व बातचीत तेजी से ट्यूमर के विकास में महत्वपूर्ण के रूप में मांयता प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन PDX ट्यूमर पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया इम्यूनोसमझौता मुरीन मॉडल परिपक्व टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं की कमी है । इसके अलावा, जबकि पीडीएक्स प्राथमिक स्तन ट्यूमर को बनाए रखने और विस्तारित करने की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप पीडीएक्स ट्यूमर प्राथमिक मुरीन स्ट्रोमल कोशिकाओं और ईसीएम5के साथ घुसपैठ कर रहे हैं।

इन चुनौतियों से उबरने के लिए हमने एक उपन्यास, पूर्व वीवो, त्रि-आयामी मानव स्तन सांसदों का विकास किया है जो एनआईएच एमपीएस मानदंडों को पूरा करता है । हमारे स्तन सांसदों की नींव आदिपोस-व्युत्पन्न स्टेम सेल (ASCs) की दो चादरों के बीच प्राथमिक मानव स्तन ऊतक (एचबीटी) सैंडविचिंग द्वारा बनाई गई है, यह भीHBT (चित्रा 1)से अलग । सेल शीट्स को सैंडविच में स्थानांतरित करने के लिए प्लंपर्स एचबीटी 3 डी मुद्रित या सरल ऐक्रेलिक प्लास्टिक(चित्रा 1H,I) से बनाया जा सकताहै। यह तकनीक प्राथमिक मानव सफेद आदिपोसाइट ऊतक6,7को बनाने के लिए हमारे पहले वर्णित दृष्टिकोण को अनुकूलित करती है । स्तन सांसदों तो पसंद के एक बीसी मॉडल द्वारा वरीयता प्राप्त किया जा सकता है, मानक बीसी सेल लाइनों से प्राथमिक मानव स्तन ट्यूमर को लेकर । यहां, हम बताते हैं कि ये बीसी-एमपीएस कई हफ्तों के लिए संस्कृति में स्थिर हैं(चित्र 2); एचबीटी के मूल तत्वों जैसे स्तन एडीपोसाइट्स, ईसीएम, एंडोथेलियम, प्रतिरक्षा कोशिकाएं(चित्र 3);शामिल करें; और बीसी और एचबीटी जैसे मेटाबोलिक क्रॉसटॉक(चित्रा 4)के बीच शारीरिक बातचीत को फिर से बढ़ाएं । अंत में, हम बताते हैं कि बीसी-एमपीएस पूरेएचबीटी (चित्रा 5)में बीसी कोशिकाओं के अमीबाइड आंदोलन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है।

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Protocol

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सभी मानव ऊतकों को प्रोटोकॉल #9189 के अनुसार एकत्र किया गया था जैसा कि एलएसयूएचएससी के संस्थागत समीक्षा बोर्ड कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. सेल शीट्स के लिए एडिपोस-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एएससी) की सीडिंग

  1. स्थापित प्रोटोकॉल8,9का पालन करके वाणिज्यिक स्रोतों से एएससी खरीदें या प्राथमिक मानव स्तन ऊतक से अलग करें । 70% घनत्व पर बीज मानव स्तन ASCs (~ 80,000 कोशिकाओं/सेमी2 सतह क्षेत्र) Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में 6 अच्छी तरह से मानक ऊतक संस्कृति प्लेटों पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक, और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (बीसी-एमपीएस मीडिया) । सुनिश्चित करें कि कोशिका पत्रक बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली एएससी 10 मार्ग से कम होनी चाहिए।
    1. स्तन कैंसर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (बीसी-एमपीएस) के प्रत्येक कुएं के लिए जो उत्पन्न होगा, 1 मानक ऊतक संस्कृति में बीज कोशिकाएं अच्छी तरह से और पॉली (एन-आइसोप्रोपाइल्लाक्रियालैमाइड) (pNIPAAm) पर समान आकार की 1 अच्छी तरह से-लेपित ऊतक संस्कृति प्लास्टिक प्लेट। एक 6-अच्छी तरह से बीसी की थाली-सांसदों एक मानक ऊतक संस्कृति 6 अच्छी तरह से थाली (नीचे) और एक pNIPAAm-लेपित प्लेट (ऊपर) की आवश्यकता होगी । PNIPAAm प्लेटों को वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदा जा सकता है या प्रयोगशाला में लेपित किया जा सकता है10,11,12
  2. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में संस्कृति ASCs। बायोसेफ्टी कैबिनेट में हर 2-3 दिन में मीडिया बदलें।
  3. संस्कृति ASCs जब तक वे १००% ढुलमुल हो जाते है और एक स्ट्रेटेड पैटर्न फार्म । जिस संगम पर उन्हें वरीयता दी गई थी, उसके आधार पर इसमें 7-10 दिन लगेंगे । स्तन ऊतक को प्रसन्न करने वाले को लंगर देने के लिए कॉन्फ्ल्यूरेंट सेल शीट्स की आवश्यकता होती है।

2. बीसी-एमपीएस के लिए आवश्यक आपूर्ति की तैयारी

  1. 6-अच्छी प्लेटों के लिए जिलेटिन तैयार करने के लिए आसुत एच 2 ओ में12%जिलेटिन समाधान बनाएं जिलेटिन टाइप बी के 19 ग्राम मिक्स (~ 225 ब्लूम की जेल ताकत) और 250 एमएल ग्लास मीडिया बोतल में एच 2 ओ की125एमएल। पीएच को बेअसर करने के लिए समाधान में 1 एम नाओएच का 1.6 एमएल जोड़ें।
  2. समाधान को स्टरलाइज करने के लिए 25 मिनट के लिए तरल चक्र के तहत समाधान को ऑटोक्लेव करें।
  3. समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें। एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में 160 मिलीएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए समाधान के लिए बाँझ 10x हैंक्स संतुलित नमक समाधान (एचबीबीएस) के 16 एमएल जोड़ें।
    नोट: जिलेटिन समाधान तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या बाद में उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत । तैयार जिलेटिन 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर है। यदि केवल कुछ प्लंजर की आवश्यकता होगी तो 10 एमएल समाधान किया जा सकता है और उसी दिन बाँझ फ़िल्टर किया जा सकता है जैसा कि बीसी-एमपीएस बनाने के रूप में पहले7वर्णित है।
    1. फिल्टर नसबंदी द्वारा जिलेटिन समाधान तैयार करने के लिए, एच 2 ओ के 9 एमएल के साथ 10x एचबीएसएस के1एमएल को पतला करें ताकि 15 एमएल शंकु नली में 1x एचबीबीएस घोल बनाया जा सके। प्रत्येक 10 एमएल ट्यूब में 1 एम नाओएच का 100 माइक्रोन जोड़ें और फिर समाधान में 0.7 ग्राम जिलेटिन जोड़ें। जिलेटिन को भंग करने के लिए समाधान को सख्ती से मिलाएं।
    2. हर 5 मिनट में 20 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में ट्यूब को इनक्यूबेट करें। जिलेटिन के घोल को फिल्टर करने के लिए 10 एमएल सिरिंज और 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का इस्तेमाल करें। जिलेटिन समाधान को सीधे बायोसेफ्टी कैबिनेट में प्लंजर्स पर फ़िल्टर करें।
  4. 3डी प्रिंट करें या सेल शीट्स को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लंजर बनाने के लिए सरल ऐक्रेलिक का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि प्लंजर अच्छी तरह से वांछित आकार में शिथिल फिट होते हैं। एक मानक 3डी मुद्रित प्लंजर चित्रा 1में दिखाया गया है। प्लंजर्स को मानक कंप्यूटर एडेड डिजाइन सॉफ्टवेयर जैसे टिंकरकैड और मुद्रित फिलामेंट 3डी प्रिंटर का उपयोग करके डिजाइन किया जा सकता है जो पॉलीलैक्टिक एसिड (पीएलए)13, 14के साथ संगत हैं।
  5. प्लंजर रखने के लिए एक रैक तैयार करने के लिए एक जैवसेफ्टी कैबिनेट में 15 एमएल ट्यूब रैक रखें। रैक में उल्टा प्लंजर रखें, ताकि प्लंजर के नीचे ऊपर का सामना करना पड़ रहा है । जैवसेफ्टी कैबिनेट में बीसी-एमपीएस के परिवहन के लिए ढक्कन के साथ एक प्लास्टिक बॉक्स रखें। यह सिफारिश की जाती है कि बॉक्स बीसी-एमपीएस की 4 प्लेटों को फिट करने के लिए कम से कम 35.5 सेमी लंबाई x 28 सेमी चौड़ाई x 8.25 सेमी ऊंचाई हो। बॉक्स से ढक्कन निकालें और 70% EtOH के साथ रैक, प्लंजर और बॉक्स नीचे स्प्रे करें।
  6. बाँझ रेजर ब्लेड तैयार करें और ऑटोक्लेविंग द्वारा या उन्हें जैवसेफ्टी कैबिनेट में रखकर और 70% एटोह के साथ धोने के द्वारा संदंश करें।
  7. 70% एटोह के साथ प्लंजर और बॉक्स स्प्रे करें और आपूर्ति को स्टरलाइज करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए बायोसेफ्टी कैबिनेट में यूवी लाइट चालू करें।

3. जिलेटिन प्लंजर तैयार करें और ऊपरी सेल शीट्स पर लागू करें

  1. यदि जिलेटिन समाधान पहले तैयार किया गया था, तो इसे पिघलाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में गर्म करें।
  2. 5 या 10-एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके बायोसेफ्टी कैबिनेट में प्लंजर्स पर जिलेटिन समाधान को पिपेट करें। 6-अच्छी प्लेट के 1 कुएं के लिए एक प्लंजर को जिलेटिन के ~ 2.5 एमएल की आवश्यकता होगी।
  3. एक बार जिलेटिन प्लंजर्स (~ 30-45 मिनट) पर जम गया है जो बायोसेफ्टी कैबिनेट में pNIPAAm-लेपित एएससी प्लेटों को स्थानांतरित करते हैं। धीरे-धीरे प्लंपर्स को pNIPAAm-लेपित एएससी प्लेटों के कुओं में रखें ताकि जिलेटिन एएससी से संपर्क करे। प्लंजर को तौलने के लिए प्लंजर पर एक धातु वॉशर (~ 7.5 ग्राम) रखें ताकि जिलेटिन एएससी सेल शीट के सीधे संपर्क में रहे। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एएससी सेल शीट पर प्लंजर छोड़ दें ।
  4. धीरे-धीरे प्लेट को बायोसेफ्टी कैबिनेट में बाँझ बॉक्स में प्लंपर्स के साथ स्थानांतरित करें और उस पर ढक्कन रखें। बॉक्स को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में ले जाएं। यदि 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज उपलब्ध नहीं है तो 30 मिनट के लिए बायोसेफ्टी कैबिनेट में बर्फ की बाल्टी में बर्फ पर प्लेट रखें।

4. कैंसर सेल लाइनों की तैयारी

  1. एक मानक T75 ऊतक संस्कृति पकवान में कैंसर सेल लाइनों बीज और उन्हें संस्कृति में रखने के लिए इतना है कि वे दिन ईसा पूर्व सांसदों पर ~ 80% ढुलमुल हैं संसाधित किया जाएगा. (~ 200,000 कैंसर कोशिकाओं की आवश्यकता होगी प्रति बीसी-एमपीएस)। सामान्य मीडिया में कैंसर कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    नोट: कैंसर कोशिकाओं की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए यह सिफारिश की जाती है कि कोशिकाओं को एएससी और स्तन ऊतक से अलग करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन से संक्रमित किया जाता है। एमसीएफ7 और एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के लिए प्रति बीसी-एमपीएस की आवश्यकता वाले कैंसर कोशिकाओं की संख्या को अनुकूलित किया गया है। अन्य सेल लाइनों को और अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
  2. जिस दिन बीसी-एमपीएस तैयार किया जा रहा है, कैंसर कोशिकाओं से युक्त फ्लास्क को बायोसेफ्टी कैबिनेट में ले जाया जा रहा है । फ्लास्क से मीडिया को आकांक्षी । फ्लास्क को पीबीएस के 5 एमएल से धोएं।
  3. कैंसर कोशिकाओं वाले फ्लास्क में सेल टुकड़ी के 1 एमसीएल जोड़ें और फिर कोशिकाओं को अलग होने तक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में फ्लास्क को इनक्यूबेट करें (~ 2-5 मिनट)।
  4. जैवसेफ्टी कैबिनेट में पीबीएस के 9 एमएल को फ्लास्क में जोड़ें, पीबीएस में कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर गिनें।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर कैंसर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।
  6. बीसी-एमपीएस मीडिया में कोशिकाओं को फिर से रीसुइपेंड करें ताकि 2 x 106 कोशिकाएं/एमएल हों ।
  7. कैंसर कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में तब तक रखें जब तक कि वे मानव ऊतक में जोड़े जाने के लिए तैयार न हों।

5. मानव स्तन ऊतक का प्रसंस्करण

  1. एक जैव बचाव कैबिनेट में बाँझ PBS के 10 एमएल के साथ मानव स्तन ऊतक (एचबीटी) 3x धोने ।
  2. बीसी-एमपीएस को मोटे तौर पर कीमा बनाने के लिए बाँझ संदंश और एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें और जितना संभव हो उतना प्रावरणी और संयोजी ऊतक को हटाने की कोशिश करें। कनेक्टिव टिश्यू को हटाने में विफलता के परिणामस्वरूप एएससी ऊपरी परत एचबीटी को ठीक से एंकर नहीं कर सकती है।
    नोट: प्रावरणी और संयोजी ऊतक आदिपोस ऊतक के पीले रंग की तुलना में अपने सफेद या स्पष्ट उपस्थिति से पहचाना जा सकता है।
  3. एक बार कनेक्टिव ऊतक हटा दिया गया है एक बाँझ रेजर ब्लेड का उपयोग करने के लिए बारीक ऊतक कीमा जब तक यह एक समरूप तरल स्थिरता है । ऊतक को बारीक कीमा बनाया जाता है जब इसे आसानी से 25 एमएल सीरोलॉजिकल टिप का उपयोग करके पिपेट किया जा सकता है।
  4. कीमा बनाया हुआ HBT पाइपिंग में सहायता करने के लिए एक p1000 पिपेट टिप से टिप काटने के लिए एक बाँझ रेजर ब्लेड का प्रयोग करें।
  5. एक 1.5 एमएल ट्यूब मिश्रण में कीमा बनाया हुआ एचबीटी, कैंसर सेल लाइनों, और बीसी-एमपीएस मीडिया (एक 6 अच्छी तरह से थाली के 1 अच्छी तरह से के लिए यह कीमा बनाया हुआ HBT के 200 माइक्रोन, बीसी-एमपीएस मीडिया के 100 माइक्रोन, और कैंसर कोशिकाओं के 100 माइक्रोन की आवश्यकता है)।
  6. एएससी प्लेट को स्थानांतरित करें जिसका उपयोग बॉटम सेल शीट के लिए इनक्यूबेटर से बायोसेफ्टी कैबिनेट में किया जाएगा। नीचे एएससी प्लेट से मीडिया को आकांक्षी । एक p1000 पिपेट टिप का उपयोग करके नीचे एएससी प्लेट के कुएं के केंद्र पर मिश्रण को पिपेट करें जिसमें डिस्टल एंड चरण 5.4 से काट दिया गया था
  7. ऊपरी एएससी प्लेट वाले बॉक्स को बायोसेफ्टी कैबिनेट में प्लंपर्स के साथ ले जाएं। धीरे-धीरे पैनीपाम-लेपित प्लेट से जिलेटिन प्लंजर को हटा दें और एचबीटी मिश्रण के शीर्ष पर रखें। अच्छी तरह से बीसी-एमपीएस मीडिया जोड़ें (6-अच्छी प्लेट के 1 अच्छी तरह से मीडिया के 2 एमएल जोड़ें)। ध्यान से बीसी-एमपीएस मिश्रण और प्लंजर के साथ नीचे एएससी प्लेटों को बाँझ प्लास्टिक बॉक्स में ले जाएं और परिवहन के लिए बॉक्स के ढक्कन को रखें।
    नोट: 6 अच्छी तरह से थाली ढक्कन वापस ASC प्लेट पर फिट नहीं होगा, जबकि प्लंजर पर हैं । संस्कृति को दूषित करने से बचने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए ।
  8. बॉक्स में नीचे की प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि जिलेटिन पिघल न जाए, और शीर्ष एएससी परत नीचे की परत (~ 30 मिनट) का पालन करना शुरू कर दिया है।
  9. प्लेटों के साथ बॉक्स को जैवसेफ्टी कैबिनेट में ले जाएं। धीरे-धीरे नीचे प्लेटों से प्लंजर निकालें। कैंसर कोशिकाओं के साथ ऊतक कुएं के नीचे लंगर डाले जाएंगे।
  10. 6-अच्छी तरह से प्लेट के ढक्कन को नीचे की प्लेट पर वापस रखें और जिलेटिन को पूरी तरह से पिघलाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और शीर्ष परत को पूरी तरह से नीचे की परत (~ 30-60 मिनट) में लंगर े होने दें।
  11. प्लेटों को धीरे-धीरे जैवसेफ्टी कैबिनेट में ले जाएं और मीडिया को 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ एएसपिट करें। प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा मीडिया के 2 एमएल जोड़ें। ऊतक को उखाड़ फेंकने से बचने के लिए कुएं के किनारे से ऊपर और पाइपेट से एस्पिरेट करें।
  12. बीसी-एमपीएस को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को वांछित समय के लिए बनाए रखें और हर 2-3 दिनों में मीडिया बदलें।

6. विश्लेषण के लिए बीसी-एमपीएस का पाचन

  1. जब बीसी-एमपीएस विश्लेषण करने के लिए तैयार है, तो प्लेट को जैवसेफ्टी कैबिनेट में ले जाएं। किसी भी ऊतक के आकस्मिक विस्थापित होने से बचने के लिए सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ मीडिया को हटा दें।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस की 1 मात्रा जोड़ें।
  3. पीबीएस को सीरोलॉजिकल पिपेट से हटा दें।
  4. प्रत्येक कुएं में सेल असंबद्धता समाधान का 1 एमएल जोड़ें। प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस ले जाएं और कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक जैव बचाव कैबिनेट में, संस्कृति प्लेट से कोशिकाओं और ऊतकों को पूरी तरह से अलग करने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
  5. सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके ऊतक के साथ समाधान को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने और शंकु नली के लिए इस समाधान को स्थानांतरित करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के 2 एमएल जोड़ें। यदि कोशिकाएं फ्लोरोसेंट हैं, तो ट्यूब को प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें।
  6. ऊतक से कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग करने के लिए 10-20 मिनट के लिए 1 x ग्राम पर एक कक्षीय शेखर में लगातार आंदोलन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  7. एक जैवसेफ्टी कैबिनेट में ट्यूब में कोशिकाओं के किसी भी शेष झुरमुट को बाधित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें और एक नए 15 एमएल ट्यूब में 250 माइक्रोन ऊतक छलनी के माध्यम से नमूने को फ़िल्टर करें। छन्नी के माध्यम से धीरे-धीरे समाधान को पिपेट करें ताकि यह ओवरफ्लो न हो।
  8. छलनी में अभी भी किसी भी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 1 एमएल पीबीएस के साथ छलनी कुल्ला।
  9. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 500 x ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें। अपकेंद्रित्र के बाद, adipocytes समाधान के शीर्ष परत पर तैर रहा होगा, जबकि कैंसर की कोशिकाओं और ASCs ट्यूब के तल पर एक गोली में एक साथ मिलाया जाएगा ।
  10. एडिपोसाइट्स को अलग करने के लिए धीरे-धीरे शीर्ष परत को एक नई ट्यूब में डालें या वैकल्पिक रूप से एक p1000 पिपेट टिप से टिप काटें और शीर्ष परत को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नमूना फिर से अपकेंद्रित्र करें और एडिपोसाइट्स के नीचे से समाधान को हटाने के लिए एक सिरिंज और सुई का उपयोग करें ताकि केवल एडिपोसाइट्स शेष रहें। एडिपोसाइट्स अब विश्लेषण के लिए तैयार हैं
  11. समाधान से adipocytes हटाने के बाद, विश्लेषण के लिए एक दूसरे से ASCs और कैंसर की कोशिकाओं को अलग अगर कैंसर की कोशिकाओं को पहले एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन से संक्रमित थे । कोशिका गोली को बाधित किए बिना एएससीएस और कैंसर कोशिकाओं युक्त ट्यूब से शेष समाधान को एस्पिरेट करें। पीबीएस या बीसी-एमपीएस मीडिया में गोली को फिर से खर्च करें और फ्लोरेसेंस के आधार पर कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करें।

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Representative Results

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संस्कृति में स्थिरता
बीसी-एमपीएस एक स्थिर माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम है जिसे कम से कम 14 दिनों तक विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है। एएससी सेल शीट्स की एक ब्राइटफील्ड इमेज को 100x आवर्धन पर लिया गया था ताकि कॉन्फ्लूंट शीट(चित्रा 2 ए)के स्ट्रिएटेड पैटर्न को प्रदर्शित किया जा सके । एएससी सेल शीट्स संस्कृति में कम से 4 सप्ताह के लिए स्थिर हैं । एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में संस्कृति में 14 दिनों में बीसी-एमपीएस एक रंग कैमरे का प्रदर्शन है कि उछाल HBT अभी भी छुरा 14 दिनों के बाद अच्छी तरह से नीचे करने के लिए ASC सेल चादरें द्वारा लंगर डाले है के साथ छवि थी(चित्रा 2B)। यह दर्शाता है कि एडीपोज ऊतक सैंडविच के लिए इस्तेमाल किया सेल शीट अभी भी बरकरार है । ट्रिपल निगेटिव बीसी सेल लाइन एमडीए-एमबी-231 व्यक्त आरएफपी को एचबीटी में 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था और फिर बीसी-एमपीएस की स्थिरता का प्रदर्शन करने वाले फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ कम से कम 14 दिनों(चित्रा 2 सी)तक चित्रा किया गया था। ऊतक में बीसी कोशिकाओं की उपस्थिति कैंसर कोशिकाओं की क्षमता को दर्शाता है HBT पर आक्रमण करने के लिए । एक ट्रिपल नकारात्मक पीडीएक्स एक्सप्लांट को माउस से उत्पादित किया गया था, जो सेल ट्रैकर सीएमटीपीएक्स से सना हुआ था और एचबीटी के साथ सुसंस्कृत था। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों को 6 दिन में लिया गया था ताकि कम से कम 6 दिनों(चित्रा 2D)के लिए ट्यूमर एक्सप्लांट के साथ बीसी-एमपीएस की स्थिरता दिखाई जा सके। यह दर्शाता है कि बीसी-एमपीएस का उपयोग एचबीटी के साथ-साथ सेल लाइनों के साथ ट्यूमर एक्सप्लांट को संस्कृति के लिए किया जा सकता है।

देशी एचबीटी तत्व
बीसी-एमपीएस में संस्कृति में एचबीटी के मूल तत्व शामिल हैं। 100 मिलीग्राम एचबीटी वाले बीसी-एमपीएस को 14 दिनों के लिए विट्रो में सुसंस्कृत किया गया था। ऊतक संस्कृति में 14 दिनों के बाद ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि थी(चित्रा 3A)। यह छवि संस्कृति में 14 दिनों में परिपक्व adipocytes के समूहों के संरक्षण को दर्शाता है । ऊतक तो 10% फॉर्मेलिन, पैराफिन एम्बेडेड, एक माइक्रोटॉम का उपयोग कर 5 माइक्रोन पर अनुभागित और फिर एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर Movats पेंटाक्रोम दाग के साथ दाग के साथ तय किया गया था । तय सेक्शन को 100x(चित्रा 3B)या 20x(चित्रा 3C)पर इमेज किया गया था । छवियों को प्रदर्शित करता है कि बीसी-एमपीएस में देशी कोलेजन (बैंगनी), रेटिकुलर फाइबर (नीला) होता है, और संयोजी ऊतक के बीच में adipocytes बड़े unilocular आकार संस्कृति में 14 दिनों में संरक्षित है । सिस्टम में प्राथमिक मैक्रोफेज की पहचान करने के लिए, एचबीटी को 0, 3 और 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था और फिर एंटी-सीडी 45, एंटी-सीडी68 और एंटी-सीडी 206 के साथ तय और दाग दिया गया था। CD45 का उपयोग एक सामान्य ल्यूकोसाइट पहचानकर्ता के रूप में किया गया था। CD68 का उपयोग मैक्रोफेज की पहचान करने के लिए मोनोसाइट दाग के रूप में किया जाता था जबकि सीडी 206 मैक्रोफेज पर मौजूद एक आम रिसेप्टर की पहचान करता है। मैक्रोफेज मार्कर के धुंधला एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर(चित्रा 3 डी)का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया गया था । यह संस्कृति में 3 और 7 दिनों के बाद प्राथमिक मैक्रोफेज के संरक्षण को दर्शाता है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि बीसी-एमपीएस संस्कृति में एचबीटी के मूल तत्वों को बरकरार रखता है । बीसी कोशिकाओं को एचबीटी के मूल तत्वों को फिर से तैयार करने के तरीके का अध्ययन करने के लिए आगे के प्रयोग किए जा सकते हैं। इसमें मैक्रोफेज मार्कर में परिवर्तन का आकलन करना शामिल हो सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या उन्हें बीसी कोशिकाओं की उपस्थिति से बदला जा रहा है। ईसीएम में परिवर्तन ों को उन नमूनों के मोवत्स पेंटाक्रोम धुंधला की तुलना करके आगे विश्लेषण किया जा सकता है जो बीसी कोशिकाओं के साथ या उसके बिना सुसंस्कृत थे ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि कोलेजन सामग्री बदली जाती है या नहीं और एडीपोसाइट्स के आकार की तुलना छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर जैसे इमेज जे का उपयोग करके की जा सकती है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि बीसी कोशिकाएं आदिपोसाइट आकार को बदलती हैं या नहीं।

मेटाबोलिक क्रॉसटॉक
Adipocyte-कैंसर मेटाबोलिक क्रॉसटॉक एक महत्वपूर्ण मार्ग है जिससे ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट बीसी प्रगति को प्रभावित करता है। अंतरकोशिकीय लिपिड जमा करने वाली बीसी कोशिकाएं दवा प्रतिरोध और अधिक आक्रामक फेनोटाइप15को प्रदर्शित करती हैं । जबकि बीसी कोशिकाओं को अपरिपक्व, मुरीन एडिपोसाइट्स में लिपोलिसिस को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, इसकी शारीरिक प्रासंगिकता अस्पष्ट बनी हुई है क्योंकि बीसी और प्राथमिक मानव स्तन आदिपोसाइट्स के बीच मेटाबोलिक क्रॉसटॉक कभी नहीं दिखाया गया है। यह प्रदर्शित करने के लिए कि बीसी-एमपीएस इस एडिपोसाइट-बीसी मेटाबोलिक क्रॉसटॉक आरएफपी-लेबल एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं को अकेले या बीसी-एमपीएस में 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से एकल कोशिका निलंबन में पचाया गया था, तटस्थ लिपिड डाई बॉडीपी के साथ दाग दिया गया था, और प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 4A,बी)16द्वारा विश्लेषण किया गया था। लिपिड-पॉजिटिव एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं का अनुपात बीसी-एमपीएस बनाम 2डी कल्चर(चित्रा 4C)में २६.२ गुना एसईएम +/-२.५ अधिक था । लिपिड धुंधला में यह वृद्धि दर्शाता है कि कैंसर की कोशिकाएं एडिपोसाइट्स के साथ बातचीत कर रही हैं और परिपक्व एडिपोसाइट्स से जारी लिपिड ले रही हैं। आरएफपी + बॉडीपी + कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए सेल छंटाई की गई थी। छंटाई के बाद, कोशिकाओं कोलेजन मैं लेपित ग्लास कवरस्लिप पर चढ़ाया गया था और रातोंरात संलग्न करने की अनुमति दी । अगले दिन कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था और फिर 100x आवर्धन पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर इमेज किया गया था। बीसी-एमपी(चित्रा 4E)में सुसंस्कृत कोशिकाओं ने मानक 2डी संस्कृति(चित्रा 4D)में सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में बढ़ी हुई लिपिड बूंदों को प्रदर्शित किया। यह बीसी कोशिकाओं और एचबीटी के बीच मेटाबोलिक क्रॉसटॉक को दर्शाता है और यह भी दिखाता है कि लिपिड संचय का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा कैसे किया जा सकता है । कैंसर कोशिकाओं में लिपिड संचय का आगे विश्लेषण लिपिड बूंदों के आकार और प्रति कोशिका लिपिड बूंदों की संख्या की मात्रा के माध्यम से किया जा सकता है।

अमीबाइड आंदोलन
बीसी कोशिकाओं और एडिपोसाइट्स के बीच मेटाबॉलिक क्रॉस टॉक कैंसर की आक्रामक क्षमता को बढ़ाता है। एचबीटी के साथ सुसंस्कृत कैंसर कोशिकाओं की बढ़ी हुई आक्रामक क्षमता का आकलन करने के लिए पूरे एचबीटी में बीसी कोशिकाओं के प्रवास का आकलन फ्लोरेसेस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था । मेटास्टैटिक टीएनबीसी सेल लाइन एमडीए-एमबी-231 व्यक्त आरपीएफ को 4 दिनों के लिए बीसी-एमपीएस में सुसंस्कृत किया गया था ताकि सिस्टम को स्थिर किया जा सके। समय-चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी 4 दिनों के बाद किया गया था छवि के लिए एमडीए-एमबी-२३१ गतिशीलता एक छवि के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 19 घंटे के लिए हर20मिनट पर कब्जा कर लिया । परिणामस्वरूप वीडियो अमीबाइड आंदोलन पैटर्न और एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं(चित्रा 5 और वीडियो 1)के लिए गतिशीलता की एक आश्चर्यजनक उच्च डिग्री का प्रदर्शन किया । यह बीसी कोशिकाओं की आक्रामक क्षमता में वृद्धि और बीसी कोशिकाओं की एचबीटी पर आक्रमण करने की क्षमता को दर्शाता है। एचबीटी में बीसी कोशिकाओं के प्रवास को 17,18 , 18को माइग्रेटकोशिकाओं के वेग और दिशात्मकता की मात्रा निर्धारित करने के लिए पहले प्रकाशित तरीकों का उपयोग करके और विश्लेषण किया जा सकता है । एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं को भी माइटोसिस से गुजरना देखा गया। ये व्यवहार इसके आक्रामक फेनोटाइप के अनुरूप हैं, कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण व्यवहार हैं, और नए बीसी व्यवहारों को उजागर करते हैं जिन्हें बीसी उपचारों के लिए लक्षित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:बीसी-एमपीएस सेटअप का सामान्य कार्यप्रवाह। (क)जिलेटिन एक ईमानदार प्लंजर में जम जाता है । (ख)जिलेटिन के साथ प्लंजर थर्मोरेपोंसिव अपर एएससी सेल शीट पर रखा जाता है। (ग)जिलेटिन को कोशिका पत्रक के साथ संपर्क बनाए रखने के लिए मजबूर करने के लिए एक वजन का उपयोग किया जाता है जबकि कोशिकाएं 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करती हैं और इसके बाद 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन होती हैं ।(घ)प्लंजर को ठंड पकवान से हटा दिया जाता है इसके साथ बरकरार सेल शीट को हटा दिया जाता है । (ई)ऊपरी सेल शीट के साथ प्लंजर को नीचे की कोशिका पत्रक और कीमा बनाया हुआ एचबीटी और बीसी कोशिकाओं वाले पकवान में स्थानांतरित किया जाता है । (F)मीडिया, प्लंजर, एचबीटी, बीसी और दोनों सेल शीट्स के साथ बॉटम सेल डिश को 30-60 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया जाता है ताकि जिलेटिन पिघलने की अनुमति दे सके और सेल शीट्स को संपर्कों से । (जी)प्लंजर को हटाने से एचबीटी और बीसी सैंडविच को दो एएससी सेल शीट्स के बीच छोड़ दिया जाता है । एक 3डी मुद्रित प्लंजर को मुफ्त ऑनलाइन सॉफ्टवेयर टिंकरकैड (https://www.tinkercad.com/) का उपयोग करके डिजाइन किया गया था और 3डी प्रिंटर पर मुद्रित किया गया था। प्लंजर पॉलीलैक्टिक एसिड से बना है। (ज)6-वेल प्लेट के 1 कुएं के लिए एक प्लंजर के आयामों को इंगित किया जाता है। प्लंजर का अवकाश 2.5 मिमी है।(I)वास्तविक 3 डी मुद्रित प्लंजर की एक छवि दिखाई जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:संस्कृति में बीसी-एमपीएस की प्रतिनिधि स्थिरता। (ए)कन्फ्लूंट कोशिकाओं के स्ट्रेटेड पैटर्न का प्रदर्शन करने वाले 100x एएससी के 100x आवर्धन पर एक उज्ज्वल छवि। स्केल बार = 100 माइक्रोन.(बी)बीसी-एमपीएस, जिसमें एचबीटी का 100 मिलीग्राम था, को 6 अच्छी तरह से प्लेट में सुसंस्कृत किया गया था। 14 दिनों के बाद एक रंग तस्वीर को प्रदर्शित करने के लिए लिया गया था कि एचबीटी एक 6 अच्छी तरह से थाली के कुएं के नीचे लंगर डाले हुए है । (ग)ट्रिपल निगेटिव बीसी सेल लाइन एमडीए-एमबी-231 व्यक्त आरएफपी को एचबीटी के साथ 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था और फिर 40x आवर्धन पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया गया था । छवियों को प्रदर्शित करता है कि एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं को अभी भी व्यवहार्य और HBT में बढ़ रहे थे । स्केल बार = 200 माइक्रोन डी) चूहों से ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर के पीडीएक्स ट्यूमर को 3 सेमी2 टुकड़ों में कीमा बनाया गया था और सेल ट्रैकर रेड सीएमपीटएक्स के साथ लेबल किया गया था। टुकड़े एचबीटी में सुसंस्कृत थे और जिसके परिणामस्वरूप बीसी-एमपीएस को संस्कृति में अपनी स्थिरता का प्रदर्शन करते हुए 6 दिन में 40x आवर्धन पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3-बीसी-एमपीएस में मौजूद एचबीटी के मूल तत्वों का प्रतिनिधि संरक्षण। बीसी-एमपीएस को 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था और फिर या तो 40x(ए)पर उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ चित्रित किया गया था और फिर 10% फॉर्मेलिन के साथ तय किया गया था और मोवत्स पेंटाक्रोम दाग के साथ दाग दिया गया था। छवियां 100x(B)या 20x(C)पर ली गई थीं। एचबीटी की इमेजिंग एक साथ संकुल बड़े यूनिलियोकुलर एडिपोसाइट्स के संरक्षण को इंगित करती है और ऊतक स्लाइस देशी ईसीएम जैसे कोलेजन (पीले) और एडीपोसाइट्स (नीले) के बीच रेटिकुलर फाइबर के संरक्षण की उपस्थिति को इंगित करता है। मॉडल एचबीटी में मैक्रोफेज के संरक्षण को प्रदर्शित करने के लिए 0, 3 या 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था, मैक्रोफेज मार्कर के लिए दाग, और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(डी)का उपयोग करके चित्रित किया गया था। मैक्रोफेज मार्कर के धुंधला होने की फ्लोरोसेंट तीव्रता को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जिसमें यह प्रदर्शित किया गया था कि संस्कृति में 3 और 7 दिनों के बाद मैक्रोफेज अभी भी ऊतक में मौजूद हैं। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4:बीसी-एमपीएस में एडिपोसाइट्स और कैंसर कोशिकाओं के बीच प्रतिनिधि मेटाबोलिक क्रॉसटॉक। आरएफपी-लेबल एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं को 14 दिनों के लिए बीसी-एमपीएस बनाम 2डी में सुसंस्कृत किया गया था, फिर बॉडीपी (250 एनएम) के साथ दाग दिया गया और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया। }2डी कल्चर में 14 दिन बाद बॉडीपी-दागदार एमडीए-एमबी-231 सेल्स का फ्लो। बी 2 में कोशिकाएं बोदपी+आरएफपी+थीं; बी 1 में कोशिकाएं बॉडीपी-आरएफपी+थीं । B2/(B1 +B2) = 3.26%, न्यूनतम लिपिड संचय का संकेत देता है। (ख)बीसी-एमपीएस में 14 दिन बाद बॉडीपी-दाग एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। B2/(B1 +B2) = 85.35%, व्यापक लिपिड संचय का संकेत देता है। (ग)एमडीए-एमबी में लिपिड संचय- 2डी संस्कृति बनाम बीसी-एमपीएस में 14 दिनों के बाद 231 कोशिकाएं। 2डी(डी)बनाम बीसी-एमपीएस(ई)में सुसंस्कृत एमडीए-एमबी-231 के बॉडीपी धुंधला का फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विश्लेषण बीसी-एमपीएस में उगाई जाने वाली कोशिकाओं में लिपिड संचय में वृद्धि को दर्शाता है। त्रुटि सलाखों ने SEM को संकेत दिया। ** पी < 0.01, n= 2 जैविक प्रतिकृति, स्केल बार = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5:बीसी-एमपीएस में टीएनबीसी का प्रतिनिधि प्रवास। आरएफपी-लेबल एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं को बीसी-एमपीएस में 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था और फिर आरएफपी-लेबल बीसी-एमपीएस + एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं की अनुक्रमिक समय-चूक छवियों को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (एक फ्रेम प्रति 60 मिनट, 100x आवर्धन) का उपयोग करके कब्जा कर लिया गया था। पीला तारक = माइटोटिक घटना। पीला बॉक्स = सेलुलर मलबे स्थितीय संदर्भ के लिए इस्तेमाल किया। नीले तीर = 231 कोशिकाओं छद्मpods और उच्च गतिशीलता के साथ अमीबाइड आंदोलन दिखा। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: बीसी-एमपीएस में टीएनबीसी का प्रतिनिधि प्रवास। आरएफपी-लेबल वाले बीसी-एमपीएस-एमबी-231 कोशिकाओं को 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 19 घंटे में हर20 मिनट में कोशिकाओं को छवि देने के लिए किया गया था। छवियों को एक वीडियो (प्रति 60 मिनट, 100x आवर्धन पर एक फ्रेम) में संकलित किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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मानव स्तन कैंसर मॉडलिंग के लिए नई प्रणालियों की जरूरत है रोग की एक बेहतर समझ विकसित करने के लिए । मानव माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम का मॉडल रोग सेटिंग्स में विकास जिसमें देशी ईसीएम और स्ट्रोमल कोशिकाएं शामिल हैं, पूर्व-नैदानिक अध्ययनों की भविष्य कहनेवाला शक्ति में वृद्धि करेंगे। बीसी-एमपीएस मॉडल यहां प्रस्तुत एक नव विकसित प्रणाली है जो पिछले मॉडलों की सीमाओं पर काबू पा रही है जो अपने मूल एचबीटी वातावरण में बीसी के मूल्यांकन के लिए अनुमति देती है। इस प्रणाली का उपयोग कैंसर सेल लाइनों के साथ या ट्यूमर एक्सप्लांट के साथ किया जा सकता है और कम से कम 14 दिनों के लिए स्थिर है। फ्लोरोसेंटली लेबलिंग बीसी कोशिकाओं को कैंसर सेल गतिशीलता और सेल-सेल इंटरैक्शन, माइग्रेशन, व्यवहार्यता, या प्रसार के वास्तविक समय में या विशिष्ट समय बिंदुओं(चित्र 3 और चित्रा 5)पर निगरानी करने की अनुमति देता है। इस मॉडल प्रणाली का उपयोग कैंसर जीव विज्ञान के बारे में महत्वपूर्ण पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है क्योंकि यह कैंसर कोशिकाओं और उनके माइक्रोएनवायरमेंट के बीच बातचीत से संबंधित है। इस प्रणाली से पूछताछ कैंसर प्रगति, दवा प्रतिक्रिया, और मेटास्टेसिस की दीक्षा के TME विनियमन पर सूचित कर सकते हैं ।

इस प्रणाली को सफलतापूर्वक स्थापित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए गए हैं जिनका पालन किए जाने की आवश्यकता है । पहला महत्वपूर्ण कदम एएससी कोशिकाओं की चादरों की खेती और हस्तांतरण है। PNIPAAm-लेपित प्लेटें तापमान संवेदनशील हैं । जब प्लेटें 32 डिग्री सेल्सियस से ऊपर होती हैं तो सतह हाइड्रोफोबिक होती है, और एएससी सतह का पालन करेगा। सतह इस तापमान से नीचे हाइड्रोफिलिक हो जाएगी और कोशिकाएं19को अलग करना शुरू कर देंगी । इस प्रकार, यह निर्धारित करना आवश्यक है कि किसी दिए गए सेल प्रकार को इन सतहों से कितनी जल्दी अलग करना शुरू कर देंगे। एचबीटी-व्युत्पन्न एएससी के लिए यह 30 मिनट > ले जाएगा अगर कोशिकाओं को संकुचित कर रहे हैं । सामान्य रखरखाव के दौरान कोशिकाओं को अलग होने से रोकने के लिए मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-गर्म किया जाना चाहिए और प्लेटों को ठंडा होने और कोशिकाओं को अलग करने से रोकने के लिए टिश्यू कल्चर प्लेट्स को कमरे के तापमान पर बहुत लंबे समय तक नहीं रखा जाना चाहिए। पूरे सेल शीट को स्थानांतरित करने के लिए pNIPAAm-लेपित प्लेटों पर होने के लिए जिलेटिन प्लंजर्स के लिए इष्टतम समय निर्धारित करना भी महत्वपूर्ण है। एएससी को ढुलमुल बनाने की जरूरत है और पूरी शीट को ट्रांसफर करने की जरूरत है । यदि शीर्ष सेल शीट में पूरी तरह से अलग होने और जिलेटिन से बांधने का समय नहीं है तो स्थानांतरण के दौरान सेल शीट टूट जाएगी। यदि पूरी सेल शीट पूरी तरह से स्थानांतरित नहीं की जाती है, तो एएससी प्रसन्नचित्त स्तन ऊतक को सैंडविच नहीं कर पाएगा।

एचबीटी को सैंडविच करने के लिए उपयोग की जाने वाली एएससी स्तन माइक्रोएनवायरमेंट की सामान्य स्ट्रोमल कोशिकाएं हैं जो ईसीएम, विकास कारकों और साइटोकिन्स को स्रावित करती हैं जो बीसी20को प्रभावित करती हैं। दो सेल शीट्स के बीच एचबीटी को सैंडविच करने के लिए, एएससी शीट्स को थर्मोरेस्पाशील टिश्यू कल्चर प्लेट्स का उपयोग करके स्थानांतरित किया जाता है। यह एएससी द्वारा स्रावित देशी ईसीएम को बरकरार रखने की अनुमति देता है और ऊतक में प्रसन्नचित्त एडीपोसाइट्स को एंकर करने का कार्य करता है। मानव स्तन ऊतक से प्राप्त एएससी का उपयोग करके यह सुनिश्चित करता है कि कैंसर कोशिकाओं के साथ एएससी की बातचीत स्तन कैंसर में क्या होती है, इसकी नकल करेगी क्योंकि विभिन्न डिपो से एएससी विभिन्न जीन अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं और ईसीएम रीमॉडलिंग21

दूसरा महत्वपूर्ण कदम एचबीटी की प्रोसेसिंग है । ऊतक की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए हौसले से अलग एचबीटी का उपयोग करना आवश्यक है। एचबीटी को संसाधित करते समय ऊतक को बारीक कीमा बनाना और जितना संभव हो उतना प्रावरणी को हटाना महत्वपूर्ण है। यदि प्रावरणी के बड़े टुकड़े एचबीटी में छोड़ दिए जाते हैं, तो इससे सेल शीट्स को उछाल वाले ऊतकों को ठीक से एंकरिंग करने से रोका जा सकेगा । इसके अलावा, ऊतक में छोड़ दिया प्रावरणी थाली से अलग कर सकते है और यह एचबीटी के कई समूहों के साथ यह अच्छी तरह से आगे प्रयोग के लिए अनुपयोगी बना खींच जाएगा । टॉप सेल शीट जोड़ने से पहले एचबीटी को बीच में ही रखा जाए अन्यथा एएससी एचबीटी को पर्याप्त रूप से सैंडविच नहीं कर पाएगा और कुओं के किनारे पर टिश्यू लंगर नहीं लगाए जाएंगे। यदि इन महत्वपूर्ण कदमों का पालन किया जाता है, तो बीसी-एमपीएस के उत्पादन की प्रक्रिया सीधे आगे स्थापित करने के लिए है ।

यहां विस्तृत मॉडल प्राथमिक एचबीटी के अपने प्राकृतिक माइक्रोएनवायरमेंट में बीसी का अध्ययन करने के लिए एक बेहतर प्रणाली है जो परिपक्व एडीपोसाइट्स, ईसीएम और निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं(चित्रा 4) कोबरकरार रखती है। एडिपोस माइक्रोएनवायरमेंट की नकल करने वाले प्री-क्लीनिकल मॉडल में माइक्रोएनवायरमेंट के कई तत्वों की कमी होती है, जैसे परिपक्व एडिपोसाइट्स, इम्यून सेल्स, फाइब्रोब्लास्ट और ईसीएम। पूरी तरह से परिपक्व एचबीटी का उपयोग इस जटिल वातावरण की एक साथ और पारस्परिक पूछताछ के लिए अनुमति देता है जिसमें कई तत्व शामिल हैं जो पैराक्राइन और जुक्ट्टाक्रीन सिग्नलिंग22,23, 24, 25के माध्यम से कैंसर केविकास,दवा प्रतिक्रिया और आक्रामकता को प्रभावित करते हैं। निवासी फाइब्रोब्लास्ट और एएससी ऊतक में ईसीएम के रीमॉडलिंग के माध्यम से और पैराक्रिन सिग्नलिंग26,27के माध्यम से कैंसर मेटास्टेसिस को प्रभावित करते हैं । मेटास्टेसिस की दीक्षा के लिए ईसीएम और इसकी रीमॉडलिंग जरूरी है। ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के ईसीएम में परिवर्तन ईसा पूर्व के प्रवास और मेटास्टेसिस को प्रभावित करते हैं, लेकिन अधिकांश बीसी अध्ययन देशी ईसीएम को अपने अध्ययन में शामिल नहीं करते हैं और इसके बजाय कोलेजन I या मैट्रिक्स28,29से बने सरलीकृत मॉडल का उपयोग करते हैं। बीसी-एमपीएस में ईसीएम एचबीटी से और एएससी से है। इस प्रकार, जिस तरह से देशी ईसीएम स्तन ऊतक में ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट में फिर से तैयार किया जाता है और मेटास्टेसिस को प्रभावित करता है, उसका अध्ययन किया जा सकता है। इस प्रकार, इस बीसी-एमपीएस मॉडल में ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के कई तत्वों को शामिल किया गया है जो पिछले मॉडल सिस्टम में नहीं थे।

इस मॉडल का उपयोग पूरी तरह से परिपक्व एडिपोसाइट्स और बीसी कोशिकाओं के बीच मेटाबोलिक क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। एडिपोसाइट्स और कैंसर कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने वाले पिछले मॉडल प्री-एडिपोसाइट्स का उपयोग करते हैं जो विट्रो में विभेदित होते हैं। प्री-एडिपोसाइट्स जो विट्रो में विभेदित होतेहैं,उसी हद तक पूरी तरह परिपक्व नहीं होते हैं, जैसे वीवो30,31में विभेदित एडिपोसाइट्स । यह समझने के लिए कि एडिपोसाइट्स कैंसर की प्रगति और दवा प्रतिक्रिया को कैसे प्रभावित करते हैं, यह देशी एडिपोसाइट्स की जटिल आणविक और रासायनिक संरचना की ठीक से नकल करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां हमने दिखा दिया है कि हमारी प्रणाली मेटाबोलिक क्रॉसटॉक का आकलन करने की अनुमति देती है जो एडिपोसाइट्स और बीसी कोशिकाओं(चित्र 4) केबीच होती है।

बीसी-एमपीएस का उपयोग इन विट्रो अध्ययन करने में भी किया जा सकता है कि मोटापे जैसी स्थितियां, जिन्हें मानक सेल लाइनों का उपयोग करके ठीक से मॉडलिंग नहीं की जा सकती है, कैंसर की प्रगति को प्रभावित करती है। मोटापा एचबीटी के माइक्रोएनवायरमेंट में बदलाव और ईसा पूर्व में मेटास्टेसिस में वृद्धि से जुड़ा हुआ है , हालांकि सटीक तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहा है32,33,34. मोटापे के दौरान फाइब्रोब्लास्ट, एएससी, एडिपोसाइट्स और ईसीएम को बदल दिया जाता है और कैंसर25, 35,36की प्रगति और मेटास्टेसिस को बढ़ावादेताहै। इस प्रकार, मोटापे से ग्रस्त ऊतकों से देशी स्ट्रोमल कोशिकाओं और ईसीएम का उपयोग करना महत्वपूर्ण है ताकि यह समझा जा सके कि स्ट्रोमल कोशिकाओं और ईसीएम में ये परिवर्तन बीसी को कैसे प्रभावित करते हैं। बीसी-एमपीएस मॉडल में मोटापे से ग्रस्त या दुबला रोगियों से एचबीटी और ASCs का उपयोग करके तंत्र जिसके द्वारा मोटापा एक मेटास्टैटिक फेनोटाइप को बढ़ावा देने के स्पष्ट किया जा सकता है ।

यहां प्रस्तुत विधि एक संस्कृति में स्तन कैंसर कोशिकाओं को बनाने के लिए है जिसमें एएससी, परिपक्व एडिपोसाइट्स और देशी ईसीएम शामिल हैं। सह-संस्कृतियों प्रणालियों के पिछले मॉडलों ने अध्ययन किया है कि स्ट्रोमल पर्यावरण के ये व्यक्तिगत विभिन्न तत्व कैंसर को कैसे प्रभावित करते हैं। एएससी और एडिपोसाइट्स दोनों बीसी प्रगति को प्रभावित करते हैं, यह निर्धारित करने के लिए जटिल हो सकता है कि बीसी को प्रभावित करने के लिए कौन सा सेल प्रकार जिम्मेदार है। हालांकि, यह बीसी-एमपीएस की तुलना एक सेल प्रकार के साथ सरल सह-संस्कृति मॉडल से करके किया जा सकता है। ऑन-ए-चिप या बायोप्रिंटिंग सिस्टम की तुलना में इस प्रणाली के फायदों में से एक यह है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध pNIPAAm लेपित प्लेटों से परे प्रणाली स्थापित करने के लिए किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है। स्तन ऊतकों की मॉडल प्रणालियों को पहले बायोप्रिंटिंग का उपयोग करके एएससी को मचानों में जमा करने के लिए वर्णित किया गया है जो तब संस्कृति22में विभेदित हैं । इसके लिए कोशिकाओं को अंतर करने के लिए अतिरिक्त 2-3 सप्ताह की आवश्यकता होती है और संस्कृति में अंतर करने वाले एएससी परिपक्व एडिपोसाइट्स के लिए पूरी तरह से अंतर नहीं करते हैं। बीसी-एमपीएस में एचबीटी से परिपक्व एडिपोसाइट्स एक मरीज से निकाले जाने के समय इस्तेमाल करने के लिए तैयार हैं ।

यहां वर्णित मॉडल प्रणाली कैंसर कोशिकाओं और माइक्रोएनवायरमेंट के बीच क्रॉसटॉक का अध्ययन करने के लिए उपयोगी प्रणाली है, हालांकि, इसकी कुछ सीमाएं हैं। प्रमुख सीमाओं में से एक प्राथमिक मानव स्तन ऊतक की उपलब्धता है। मानव आदिपोस ऊतक को व्यवहार्यता की हानि के बिना क्रायोप्रेयर नहीं किया जा सकता है और इस प्रकार बीसी-एमपीएस बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतकों को हौसले से प्राप्त करने और37का उपयोग करने की आवश्यकता है। एक और सीमा यह है कि मॉडल के रूप में यहां प्रस्तुत एक स्थिर प्रणाली है कि नियमित रूप से 6 अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत है । इस प्रणाली में माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह का अभाव है जो अंगों-ऑन-ए-चिप में मौजूद है जो ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की उपलब्धता, सरासर तनाव और दवा वितरण38,39को प्रभावित कर सकता है। एक तीसरी सीमा कोशिकाओं के लिए प्रयोग के अंत में एक दूसरे से अलग होने की जरूरत है अगर विभिन्न कोशिका प्रकार के लिए व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण की जरूरत है । इसके लिए कोशिकाओं को लेबल करने की जरूरत होती है ताकि उन्हें एक-दूसरे से अलग किया जा सके ।

ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के कई तत्वों का समावेश कैंसर की प्रगति और मेटास्टेसिस की दीक्षा का अध्ययन करने के लिए एक शारीरिक मॉडल पैदा करता है। अधिक शारीरिक मॉडल में कैंसर कोशिकाओं का अध्ययन करने में सक्षम होने के अलावा, बीसी-एमपीएस का उपयोग माइक्रोएनवायरमेंट के व्यक्तिगत तत्वों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है और वे कैंसर से कैसे प्रभावित होते हैं। जबकि यहां प्रतिनिधित्व डेटा प्रदर्शित कैसे बीसी-एमपीएस एक सेल लाइन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, बीसी-सांसदों को आसानी से एक शोधकर्ता की विशेष प्रयोगात्मक जरूरत के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, मोटापे से ग्रस्त एचबीटी की तुलना दुबला एचबीटी से की जा सकती है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि मोटापा कैंसर मेटास्टेसिस और प्रगति को कैसे प्रभावित करता है। बीसी के विभिन्न उपप्रकारों को बीसी-एमपीएस में वरीयता दी जा सकती है ताकि यह अध्ययन किया जा सके कि कैंसर के उपप्रकार माइक्रोएनवायरमेंट के साथ अलग तरह से कैसे बातचीत करते हैं। जीन संपादन तकनीकों को यह निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है कि विशिष्ट जीन बीसी और माइक्रोएनवायरमेंट के बीच बातचीत को कैसे प्रभावित करते हैं । इस मॉडल और उसके अनुप्रयोगों कैसे स्ट्रोमल पर्यावरण और स्तन कैंसर कैंसर प्रगति और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने के लिए बातचीत की एक अधिक सटीक समझ के लिए अनुमति देगा ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी हितों की है ।

Acknowledgments

हम ट्यूलेन फ्लो साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग कोर के साथ-साथ तुलेन हिस्टोलॉजी कोर को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को साउथईस्टर्न सोसाइटी ऑफ प्लास्टिक एंड रिकंटेनिव सर्जन्स 2019 रिसर्च ग्रांट और नेशनल साइंस फाउंडेशन (ईपीएसकोआर ट्रैक 2 आरआईआई, ओआईए 1632854) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

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References

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एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम का उपयोग कर मानव स्तन ऊतक में स्तन कैंसर मॉडलिंग
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Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).More

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).

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