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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Modellazione del cancro al seno nel tessuto mammario umano utilizzando un sistema microfisiologico

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

Questo protocollo descrive la costruzione di un sistema microfisiologico in vitro per lo studio del cancro al seno utilizzando il tessuto mammario umano primario con materiali di prima qualità.

Abstract

Il cancro al seno (BC) rimane una delle principali cause di morte per le donne. Nonostante oltre 700 milioni di dollari investiti nella ricerca BC ogni anno, il 97% dei farmaci BC candidati fallisce gli studi clinici. Pertanto, sono necessari nuovi modelli per migliorare la nostra comprensione della malattia. Il programma NIH Microphysiological Systems (MPS) è stato sviluppato per migliorare la traduzione clinica delle scoperte scientifiche di base e promettendo nuove strategie terapeutiche. Qui presentiamo un metodo per generare MPS per i tumori al seno (BC-MPS). Questo modello adatta un approccio precedentemente descritto di coltivare il tessuto adiposo bianco umano primario (WAT) incattando WAT tra fogli di cellule staminali derivate da adiposi (ASC). Nuovi aspetti della nostra BC-MPS includono la semina di cellule BC in tessuto mammario umano non danneggiato (HBT) contenente matrice extracellulare nativa, adipociti maturi, fibroblasti residenti e cellule immunitarie; e l'incastro dell'admixture BC-HBT tra fogli ASC derivati da HBT. Il BC-MPS risultante è stabile in coltura ex vivo per almeno 14 giorni. Questo sistema modello contiene più elementi del microambiente che influenzano BC tra cui adipociti, cellule stromali, cellule immunitarie e matrice extracellulare. Quindi BC-MPS può essere usato per studiare le interazioni tra BC e il suo microambiente.

Dimostriamo i vantaggi della nostra BC-MPS studiando due comportamenti BC noti per influenzare la progressione del cancro e la metastasi: 1) motilità BC e 2) crosstalk metabolico BC-HBT. Mentre la motilità BC è stata precedentemente dimostrata utilizzando l'imaging intravitale, BC-MPS consente l'imaging time-lapse ad alta risoluzione utilizzando la microscopia a fluorescenza per diversi giorni. Inoltre, mentre il crosstalk metabolico è stato precedentemente dimostrato utilizzando cellule BC e pre-adipociti murini differenziati in adipociti immaturi, il nostro modello BC-MPS è il primo sistema a dimostrare questo crosstalk tra adipociti mammari umani primari e cellule BC in vitro.

Introduction

Ogni anno, più di 40.000 donne negli Stati Uniti muoiono di cancro al seno (BC)1. Nonostante oltre 700 milioni di dollari investiti nella ricerca BC ogni anno, il 97% dei farmaci BC candidati fallisce gli studiclinici 2,3. Sono necessari nuovi modelli per migliorare la pipeline di sviluppo dei farmaci e la nostra comprensione di BC. Il programma NIH Microphysiological (MPS) ha delineato le caratteristiche necessarie per modelli rivoluzionari per migliorare la traduzione della scienza di base in successo clinico4. Questi includevano l'uso di cellule o tessuti umani primari, stabili in coltura per 4 settimane, e l'inclusione dell'architettura dei tessuti nativi e della risposta fisiologica.

Gli attuali modelli BC in vitro, come la coltura bidimensionale delle linee cellulari BC, la co-coltura dell'inserto a membrana e gli sferoidi tridimensionali e gli organoidi, non soddisfano i criteri delle MPS del NIH perché nessuno di questi riassume l'architettura nativa del tessuto mammario. Quando a questi sistemi viene aggiunta una matrice extracellulare (ECM), l'ECM mammario non viene utilizzato; invece, vengono utilizzati gel di collagene e matrici di membrana basale.

Gli attuali sistemi in vivo, come gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), allo stesso modo non soddisfano i criteri delle MPS del NIH perché i tessuti mammari murini differiscono notevolmente dal seno umano. Inoltre, le interazioni sistema immunitario-BC sono sempre più riconosciute come chiave nello sviluppo tumorale, ma i modelli murini immunocompro compromessi utilizzati per generare tumori PDX mancano di cellule T mature, cellule B e cellule natural killer. Inoltre, mentre pdx consente di mantenere ed espandere i tumori del seno primario, i tumori PDX risultanti vengono infiltrati con cellule stromali murine primarie e ECM5.

Per superare queste sfide, abbiamo sviluppato una nuova MPS mammario umano tridimensionale, ex vivo, che soddisfa i criteri NIH MPS. Il fondamento della nostra MPS mammario è costituito dall'incastro del tessuto mammario umano primario (HBT) tra due fogli di cellule staminali derivate da adiposi (ASC), anche isolate dall'HBT(Figura 1). I pistoni per il trasferimento dei fogli cellulari per sandwich l'HBT può essere stampato in 3D o realizzato con semplici plastiche acriliche (Figura 1H, I). Questa tecnica adatta il nostro approccio precedentemente descritto per coltivare il tessuto adipocite bianco umano primario6,7. La MPS mammario può quindi essere seminata da un modello bc di scelta, che va dalle linee cellulari BC standard ai tumori al seno umani primari. Qui mostriamo che questi BC-MPS sono stabili in coltura per più settimane(Figura 2); includere elementi nativi dell'HBT come adipociti mammari, ECM, endotelio, cellule immunitarie (Figura 3); e ricapitolare le interazioni fisiologiche tra BC e HBT come il crosstalk metabolico (Figura 4). Infine, mostriamo che BC-MPS consente lo studio del movimento ameboide delle cellule BC in tutta l'HBT(Figura 5).

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Protocol

Tutti i tessuti umani sono stati raccolti in conformità con il protocollo #9189 approvato dall'Ufficio del Comitato di Revisione Istituzionale della LSUHSC.

1. Semina di cellule staminali derivate da adiposi (ASC) per fogli cellulari

  1. Acquistare ASC da fonti commerciali o isolare dal tessuto mammario umano primario seguendo i protocollistabiliti 8,9. Sementi di ASC mammari umani a densità del 70% (~80.000 cellule/cm2 superficie) su piastre di coltura tissutale standard a 6 porri nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con siero bovino fetale al 10% e 1% penicillina/streptomicina (BC-MPS Media). Assicurarsi che gli ASC da utilizzare per formare i fogli cellulari siano inferiori al passaggio 10.
    1. Per ogni pozzo del sistema microfisiologico del cancro al seno (BC-MPS) che verrà generato, cellule di semi in 1 pozzo di coltura tissutale standard e 1 pozzo di dimensioni simili su placca plastica di coltura tissutale rivestita in poli(N-isopropilacrylamide) (pNIPAAm). Una piastra da 6 pozzi di BC-MPS richiederà una coltura tissutale standard 6 piastra del pozzo (in basso) e una piastra rivestita con pNIPAAm (in alto). Le piastre pNIPAAm possono essere acquistate da fonti commerciali o possono essere rivestite in laboratorio10,11,12.
  2. ASC di coltura in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO2. Cambia i supporti ogni 2-3 giorni in un armadietto per la biosicurezza.
  3. Cultura gli ASC fino a diventare confluenti al 100% e formare un modello striato. A seconda della confluenza in cui sono stati seminati, ci saranno 7-10 giorni. I fogli cellulari confluenti sono necessari per ancorare il tessuto mammario adiposo vivace.

2. Preparazione delle forniture necessarie per BC-MPS

  1. Per preparare la gelatina per piatti a 6 porvili fare una soluzione di gelatina al 12% in H2O distillato. Mescolare 19 g di gelatina di tipo B (resistenza al gel di ~225 Bloom) e 125 ml di H2O in una bottiglia di supporto di vetro da 250 ml. Aggiungere 1,6 mL di 1 M NaOH alla soluzione per neutralizzare il pH.
  2. Autoclavare la soluzione sotto un ciclo liquido per 25 minuti per sterilizzare la soluzione.
  3. Lasciare raffreddare la soluzione a 37 °C. In un armadio sterile per la biosicurezza aggiungere 16 mL di soluzione di sale bilanciato sterile 10x Hanks (HBSS) alla soluzione per ottenere un volume finale di 160 mL.
    NOTA: La soluzione di gelatina può essere utilizzata immediatamente o conservata a temperatura ambiente per un uso successivo. La gelatina preparata è stabile a temperatura ambiente per 1 mese. Se saranno necessari solo pochi pistoni, è possibile realizzare una soluzione da 10 mL e filtrare sterilemente lo stesso giorno della realizzazione di BC-MPS come descrittoin precedenza 7.
    1. Per preparare la soluzione di gelatina mediante sterilizzazione del filtro, diluire 1 ml di 10x HBSS con 9 ml di H2O per fare una soluzione DI HBSS 1x in un tubo conico da 15 ml. Aggiungere 100 μL di 1 M NaOH a ciascun tubo da 10 ml, quindi aggiungere 0,7 g di gelatina alla soluzione. Mescolare vigorosamente la soluzione per sciogliere la gelatina.
    2. Incubare il tubo in un bagno d'acqua a 75 °C per 20 minuti tremando ogni 5 minuti. Utilizzare una siringa da 10 ml e un filtro siringa da 0,22 μm per filtrare la soluzione di gelatina. Filtrare la soluzione di gelatina direttamente sui pistoni in un armadio per la biosicurezza.
  4. Stampa 3D o utilizzare un semplice acrilico per realizzare i pistoni utilizzati per il trasferimento dei fogli cellulari. Assicurarsi che i pistoni si adattino liberamente alla dimensione desiderata del pozzo. Un pistone stampato in 3D standard è mostrato nella figura 1. Gli stantuffo possono essere progettati utilizzando software di progettazione standard attrezzato per computer come TinkerCad e stampati utilizzando stampanti 3D a filamento compatibili con l'acido polilattico (PLA)13,14.
  5. Per preparare un rack per tenere i pistoni posizionare un rack per tubi da 15 ml in un armadio per la biosicurezza. Posizionare i pistoni a testa in giù nel rack, in modo che il fondo dei pistoni sia rivolto verso l'alto. Posizionare una scatola di plastica con un coperchio per il trasporto di BC-MPS nell'armadio per la biosicurezza. Si consiglia di che la scatola sia lunga almeno 35,5 cm x 28 cm di larghezza x 8,25 cm di altezza per adattarsi a 4 piastre di BC-MPS. Rimuovere il coperchio dalla scatola e spruzzare il rack, i pistoni e la scatola con 70% EtOH.
  6. Preparare lamette e forcep sterili in autoclave o mettendole in un armadio di biosicurezza e lavandole con 70% EtOH.
  7. Spruzzare i pistoni e la scatola con 70% EtOH e accendere la luce UV nell'armadio di biosicurezza per almeno 30 minuti per sterilizzare le forniture.

3. Preparare i pistoni di gelatina e applicare sui fogli delle cellule superiori

  1. Se la soluzione di gelatina è stata preparata in precedenza, scaldarla in un bagno d'acqua a 37 ° C per scioglierla.
  2. Pipettare la soluzione di gelatina sugli stantuffo nell'armadio di biosicurezza utilizzando una pipetta sierologica da 5 o 10 mL. Uno stantuffo per 1 pozzo di una piastra da 6 po 'richiederà ~ 2,5 mL di gelatina.
  3. Una volta che la gelatina si è solidificata sui pistoni (~ 30-45 min) spostare le piastre ASC rivestite con pNIPAAm nell'armadio di biosicurezza. Posizionare delicatamente i pistoni nei pozzi delle piastre ASC rivestite con pNIPAAm in modo che la gelatina contatti gli ASC. Posizionare una rondella metallica (~7,5 g) sullo stantuffo per appesantire lo stantuffo in modo che la gelatina sia a diretto contatto con la lastra cellulare ASC. Lasciare i pistoni sui fogli cellulari ASC a temperatura ambiente per 30 minuti.
  4. Spostare delicatamente la piastra con i pistoni nella scatola sterile nell'armadio di biosicurezza e posizionare il coperchio su di esso. Spostare la scatola in un frigorifero a 4 °C per 30 minuti. Se non è disponibile un frigorifero a 4 °C, posizionare la piastra sul ghiaccio in un secchio di ghiaccio nell'armadio per la biosicurezza per 30 minuti.

4. Preparazione delle linee cellulari tumorali

  1. Sementi le linee cellulari tumorali in un piatto standard di coltura tissutale T75 e tienile in coltura in modo che siano ~80% confluenti il giorno in cui BC-MPS verrà elaborato. (~200.000 cellule tumorali saranno necessarie per BC-MPS). Far crescere le cellule tumorali nei media normali.
    NOTA: Per identificare e isolare le cellule tumorali si raccomanda che le cellule siano trasfette da una proteina fluorescente per distinguerle dagli ASC e dal tessuto mammario. Il numero di cellule tumorali necessarie per BC-MPS è stato ottimizzato per le cellule MCF7 e MDA-MB-231. Altre linee cellulari potrebbero richiedere un'ulteriore ottimizzazione.
  2. Il giorno in cui la BC-MPS è in fase di preparazione spostare il pallone contenente le cellule tumorali nell'armadietto della biosicurezza. Aspirare il supporto dal pallone. Lavare il pallone con 5 ml di PBS.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione di distacco cellulare al pallone contenente le cellule tumorali e quindi incubare il pallone in un incubatore di 37 °C fino a quando le cellule non si sono staccate (~ 2-5 min).
  4. Nell'armadio della biosicurezza aggiungere 9 ml di PBS al pallone, trasferire le cellule in PBS in un tubo conico da 15 ml e contare il numero di cellulare usando un emocitometro.
  5. Centrifugare le cellule tumorali a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Rimosoppo le celle nei supporti BC-MPS in modo che ci siano 2 x 106 celle/mL.
  7. Mettere le cellule tumorali in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando non sono pronte per essere aggiunte al tessuto umano.

5. Trattamento del tessuto mammario umano

  1. In un armadio di biosicurezza lavare il tessuto mammario umano (HBT) 3x con 10 mL di PBS sterile.
  2. Utilizzare forcelle sterili e una lama di rasoio per tritare grossolanamente la BC-MPS e cercare di rimuovere quanta più fascia e tessuto connettivo possibile. La mancata rimozione del tessuto connettivo può comportare che lo strato superiore asc non ancora correttamente l'HBT.
    NOTA: La fascia e il tessuto connettivo possono essere identificati dal suo aspetto bianco o chiaro rispetto al colore giallo del tessuto adiposo.
  3. Una volta rimosso il tessuto connettivo, utilizzare una lama di rasoio sterile per tritare finemente il tessuto fino a quando non ha una consistenza liquida omogenea. Il tessuto viene tritato finemente quando può essere facilmente pipettato utilizzando una punta sierologica da 25 mL.
  4. Utilizzare una lama sterile per tagliare la punta da una punta della pipetta p1000 per facilitare la pipetta dell'HBT tritato.
  5. In un tubo da 1,5 ml mescolare l'HBT tritato, le linee cellulari tumorali e i supporti BC-MPS (per 1 pozzo di una piastra di 6 pozzetti questo richiede 200 μL di HBT tritato, 100 μL di supporti BC-MPS e 100 μL di cellule tumorali).
  6. Spostare la piastra ASC che verrà utilizzata per il foglio di cellule inferiori dall'incubatore all'armadio di biosicurezza. Aspirare il supporto dalla piastra ASC inferiore. Pipettare la miscela al centro del pozzo della piastra ASC inferiore utilizzando una punta di pipetta p1000 con l'estremità distale tagliata dal passo 5.4
  7. Spostare la scatola contenente la piastra ASC superiore con i pistoni su di essa nell'armadio di biosicurezza. Rimuovere delicatamente i pistoni di gelatina dalla piastra rivestita con pNIPAAm e posizionarla sopra la miscela HBT. Aggiungere i supporti BC-MPS al pozzo (per 1 pozzo di una piastra a 6 porsi aggiungere 2 mL di supporti). Spostare con cura le piastre ASC inferiori con la miscela BC-MPS e i pistoni nella scatola di plastica sterile e posizionare il coperchio della scatola per il trasporto.
    NOTA: Il coperchio della piastra a 6 po porsi non si adatta di nuovo alla piastra ASC mentre i pistoni sono su. Occorre fare attenzione ad evitare di contaminare la cultura.
  8. Incubare la piastra inferiore nella scatola in un'incubatrice a 37 ° C fino a quando la gelatina non si è sciolta e lo strato ASC superiore ha iniziato ad aderire allo strato inferiore (~ 30 min).
  9. Spostare la scatola con le piastre nell'armadio per la biosicurezza. Rimuovere delicatamente i pistoni dalle piastre inferiori. Il tessuto con le cellule tumorali sarà ancorato al fondo del pozzo.
  10. Riposizionare il coperchio della piastra a 6 pozzi sulla piastra inferiore e incubare a 37 °C per sciogliere completamente la gelatina e consentire allo strato superiore di ancorarsi completamente allo strato inferiore (~ 30-60 min).
  11. Spostare delicatamente le piastre in un armadio di biosicurezza e aspirare il supporto con una pipetta sierologica da 10 mL. Aggiungere 2 mL di supporti freschi ad ogni pozzo. Aspirare dal bordo del pozzo e pipettare sul bordo del pozzo per evitare di slogare il tessuto.
  12. Mantenere il BC-MPS a 37 °C e 5% CO2 per il periodo di tempo desiderato e cambiare supporto ogni 2-3 giorni.

6. Digestione di BC-MPS per l'analisi

  1. Quando il BC-MPS è pronto per essere analizzato, spostare la piastra nell'armadio di biosicurezza. Rimuovere i supporti con una pipetta sierologica per evitare lo slogaggio accidentale di qualsiasi tessuto.
  2. Aggiungere 1 volume di PBS a ciascun pozzo.
  3. Rimuovere il PBS con una pipetta sierologica.
  4. Aggiungere 1 mL di soluzione di dissociazione cellulare ad ogni pozzo. Spostare la piastra di nuovo nell'incubatrice e incubare a 37 °C per 5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi. In un armadio di biosicurezza, utilizzare un raschietto cellulare per staccare completamente le cellule e il tessuto dalla piastra di coltura.
  5. Trasferire la soluzione con il tessuto in un tubo conico da 15 ml utilizzando una pipetta sierologica. Aggiungere 2 ml di PBS ad ogni pozzo per raccogliere tutte le celle rimanenti e trasferire questa soluzione al tubo conico. Se le celle sono fluorescenti, avvolgere il tubo in un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
  6. Incubare il tubo a 37 °C sotto agitazione costante in uno shaker orbitale a 1 x g per 10-20 minuti per dissociare completamente le cellule dal tessuto.
  7. In un armadio di biosicurezza utilizzare una pipetta sierologica per interrompere eventuali grumi di cellule rimanenti nel tubo e filtrare il campione attraverso un colino tissutale da 250 μm in un nuovo tubo da 15 ml. Pipettare lentamente la soluzione attraverso il colino in modo che non trabocca.
  8. Risciacquare il colino con 1 mL PBS per raccogliere tutte le cellule ancora nel colino.
  9. Centrifugare i campioni a 500 x g a temperatura ambiente per 5 min. Dopo la centrifugazione, gli adipociti galleggiano sullo strato superiore della soluzione mentre le cellule tumorali e gli ASC saranno mescolati insieme in un pellet nella parte inferiore del tubo.
  10. Per isolare gli adipociti versare delicatamente lo strato superiore in un nuovo tubo o, in alternativa, tagliare la punta da una punta della pipetta p1000 e trasferire lo strato superiore su un nuovo tubo. Centrifugare nuovamente il campione a 500 x g per 5 minuti e utilizzare una siringa e un ago per rimuovere la soluzione dal basso degli adipociti in modo che rimangano solo gli adipociti. Gli adipociti sono ora pronti per l'analisi
  11. Dopo aver rimosso gli adipociti dalla soluzione, separare gli ASC e le cellule tumorali l'uno dall'altro per l'analisi se le cellule tumorali sono state precedentemente trasfette con una proteina fluorescente. Aspirare la soluzione rimanente dal tubo contenente gli ASC e le cellule tumorali senza interrompere il pellet cellulare. Risospendare il pellet nei supporti PBS o BC-MPS e utilizzare la citometria del flusso per ordinare le cellule in base alla fluorescenza.

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Representative Results

Stabilità nella cultura
BC-MPS è un sistema microfisiologico stabile che può essere coltivato in vitro per un massimo di almeno 14 giorni. Un'immagine a campo luminoso dei fogli cellulari ASC è stata scattata con ingrandimento 100x per visualizzare il modello striato del foglio confluente (Figura 2A). I fogli cellulari ASC sono stabili in coltura per almeno 4 settimane. BC-MPS a 14 giorni di coltura in un pozzo di una piastra a 6 poggiaso è stata con un'immagine di una fotocamera a colori che dimostra che l'HBT vivace è ancorato stabilmente dai fogli cellulari ASC nella parte inferiore del pozzo dopo 14 giorni(Figura 2B). Ciò dimostra che il foglio cellulare utilizzato per incastre il tessuto adiposo è ancora intatto. La tripla linea cellulare BC negativa MDA-MB-231 che esprime RFP è stata coltivata in HBT per 14 giorni e quindi con un microscopio fluorescente che dimostra la stabilità del BC-MPS con linee cellulari fino ad almeno 14 giorni(Figura 2C). La presenza delle cellule BC nel tessuto dimostra la capacità delle cellule tumorali di invadere l'HBT. Un triplo espianto PDX negativo è stato asportato da un mouse, macchiato con Cell Tracker CMTPX e coltivato con HBT. Le immagini di microscopia fluorescente sono state scattate al giorno 6 per mostrare la stabilità della BC-MPS con espianto tumorale per almeno 6 giorni (Figura 2D). Ciò dimostra che BC-MPS può essere utilizzato per coltura di espianto tumorale con HBT e linee cellulari.

Elementi HBT nativi
BC-MPS contiene gli elementi nativi di HBT nelle impostazioni cultura. Bc-MPS contenente 100 mg di HBT sono stati coltivati in vitro per 14 giorni. Il tessuto è stato immaginato utilizzando la microscopia a campo brillante dopo 14 giorni di coltura (Figura 3A). Questa immagine dimostra la conservazione di cluster di adipociti maturi a 14 giorni di cultura. Il tessuto è stato quindi fissato con formalina al 10%, paraffina incorporata, sessata a 5 μm utilizzando un microtomo e poi macchiata con macchia pentacroma movats utilizzando un protocollo standard. Le sezioni fisse sono state immagini a 100x(Figura 3B) o 20x(Figura 3C). Le immagini dimostrano che la BC-MPS contiene il collagene nativo (viola), le fibre reticolari (blu) e gli adipociti di grande forma unilocolare tra il tessuto connettivo sono conservati a 14 giorni di coltura. Per identificare i macrofagi primari nel sistema, HBT è stato coltivato per 0, 3 e 7 giorni e quindi fissato e macchiato con l'anti-CD45, anti-CD68 e anti-CD206. CD45 è stato usato come identificatore generale dei leucociti. Cd68 è stato usato come macchia monocita per identificare i macrofagi mentre CD206 identifica un recettore comune presente sui macrofagi. La colorazione dei marcatori macrofagi è stata quantificata utilizzando un software di imaging (Figura 3D). Ciò dimostra la conservazione dei macrofagi primari dopo 3 e 7 giorni di cultura. Questi dati dimostrano che BC-MPS conserva gli elementi nativi di HBT nella cultura. Ulteriori esperimenti possono essere effettuati per studiare come le cellule BC rimodellano gli elementi nativi dell'HBT. Ciò può includere la valutazione delle variazioni nei marcatori di macrofagi per determinare se vengono alterati dalla presenza di cellule BC. I cambiamenti nell'ECM possono essere ulteriormente analizzati confrontando la colorazione pentacroma dei Movats di campioni che sono stati coltivati con o senza cellule BC per determinare se il contenuto di collagene viene modificato e le dimensioni degli adipociti possono essere confrontate utilizzando software di analisi delle immagini come Image J per determinare se le cellule BC alterano le dimensioni degli adipociti.

Crosstalk metabolico
Il crosstalk metabolico adipocite-cancro è un percorso importante per cui il microambiente tumorale influenza la progressione bc. Le cellule BC che accumulano lipidi intracellulari dimostrano una maggiore resistenza ai farmaci e un fenotipo15 più invasivo. Mentre le cellule BC hanno dimostrato di indurre la lialisi in adipociti murini immaturi, la rilevanza fisiologica di questo è rimasta poco chiara perché il crosstalk metabolico tra BC e gli adipociti mammari umani primari non è mai stato mostrato. Per dimostrare che BC-MPS è in grado di modellare queste cellule MDA-MB-231 con etichetta RFP con marchio RFP adipocite-BC sono state coltivate da sole o in BC-MPS per 14 giorni. Le cellule sono state digerite enzimaticamente in sospensione a singola cellula, macchiate con il colorante lipidico neutro Bodipy e analizzate per citometria a flusso (Figura 4A, B)16. La proporzione di cellule MDA-MB-231 lipidiche-positive era di 26,2 volte SEM +/- 2,5 maggiore nella coltura BC-MPS rispetto a quella 2D (Figura 4C). Questo aumento della colorazione lipidica dimostra che le cellule tumorali interagiscono con gli adipociti e assumono lipidi rilasciati dagli adipociti maturi. L'ordinamento delle celle è stato eseguito per selezionare le celle RFP+ Bodipy+. Dopo lo smistamento, le cellule sono state placcate con collagene che ho rivestito di coverlips di vetro e mi è stato permesso di attaccare durante la notte. Il giorno seguente le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% per 30 minuti e poi immagini su un microscopio fluorescente con ingrandimento 100x. Le cellule coltivate in BC-MP (Figura 4E) hanno mostrato un aumento delle goccioline lipidiche rispetto alle cellule coltivate in coltura 2D standard (Figura 4D). Ciò dimostra il crosstalk metabolico tra le cellule BC e l'HBT e, inoltre, mostra come l'accumulo lipidico possa essere analizzato dalla citometria del flusso o dalla microscopia fluorescente. Un'ulteriore analisi dell'accumulo lipidico nelle cellule tumorali può essere effettuata quantificando le dimensioni delle goccioline lipidiche e il numero di goccioline lipidiche per cellula.

Movimento ameboide
Il cross talk metabolico tra cellule BC e adipociti aumenta la capacità invasiva del cancro. Per valutare l'accresciuta capacità invasiva delle cellule tumorali coltivate con l'HBT, la migrazione delle cellule BC in tutta l'HBT è stata valutata mediante microscopia a fluorescenza. La linea cellulare metastatica TNBC MDA-MB-231 che esprime RPF è stata coltivata in BC-MPS per 4 giorni per consentire al sistema di stabilizzarsi. La microscopia a fluorescenza time-lapse è stata eseguita dopo 4 giorni per l'immagine della motilità MDA-MB-231 con un'immagine catturata ogni 20 minuti per 19 ore a 37 °C e 5% CO2. Il video risultante ha dimostrato modelli di movimento ameboide e un grado sorprendentemente elevato di motilità per le celle MDA-MB-231(Figura 5 e Video 1). Ciò dimostra un aumento della capacità invasiva delle cellule BC e la capacità delle cellule BC di invadere l'HBT. La migrazione delle celle BC nell'HBT può essere ulteriormente analizzata utilizzando metodi pubblicati in precedenza per quantificare la velocità e la direzionalitàdelle celle migratorie 17,18. Le cellule MDA-MB-231 sembrano anche subire la mitosi. Questi comportamenti sono coerenti con il suo fenotipo aggressivo, sono comportamenti importanti per la progressione del cancro e la metastasi ed evidenziano nuovi comportamenti BC che possono essere mirati per le terapie BC.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro generale dell'impostazione BC-MPS. (A) La gelatina viene solidificata in uno stantuffo verticale. (B) Lo stantuffo con gelatina viene posizionato sul foglio cellulare ASC superiore termoresponsivo. (C) Un peso viene utilizzato per costringere la gelatina a mantenere il contatto con la scheda cellulare mentre le cellule incubano a temperatura ambiente per 30 minuti seguita da incubazione a 4 °C per 30 min. (E) Lo stantuffo con il foglio della cella superiore viene trasferito su un piatto contenente il foglio della cella inferiore e le celle TRITATE HBT e BC. (F) La piastra della cella inferiore con supporto, pistone, HBT, BC ed entrambi i fogli cellulari viene incubata a 37 °C per 30-60 minuti per consentire alla gelatina di sciogliersi e ai fogli cellulari di direttamente dai contatti. (G) La rimozione dello stantuffo lascia l'HBT e il BC incastrato tra due fogli cellulari ASC. Uno stantuffo stampato in 3D è stato progettato utilizzando il software online gratuito TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) e stampato su una stampante 3D. Lo stantuffo è composto da acido polilattico. (H) Sono indicate le dimensioni di uno stantuffo per 1 pozzo di una piastra a 6 po' . La rientranza dello stantuffo è di 2,5 mm (I) Viene visualizzata un'immagine dell'attuale pistone stampato in 3D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Stabilità rappresentativadi BC-MPS nelle coltura. (A) Un'immagine a campo luminoso con ingrandimento 100x degli ASC confluenti che dimostrano il modello striato delle celle confluenti. La barra di scala = 100 μm. (B) BC-MPS, contenente 100 mg di HBT, è stata coltivata in una piastra da 6 pota. Dopo 14 giorni è stata scattata una fotografia a colori per dimostrare che l'HBT è ancorato al fondo del pozzo di una piastra da 6 poggi. (C) La tripla linea cellulare BC negativa MDA-MB-231 che esprime RFP è stata coltivata con HBT per 14 giorni e quindi stampata utilizzando la microscopia fluorescente con ingrandimento 40x. Le immagini dimostrano che le celle MDA-MB-231 erano ancora vitali e in crescita nell'HBT. Barra di scala = 200 μm D) I tumori PDX del cancro al seno triplo negativo dei topi sono stati tritati in 3 cm2 pezzi ed etichettati con Cell Tracker Red CMPTX. I pezzi sono stati coltivati in HBT e il BC-MPS risultante è stato immaginato utilizzando un microscopio fluorescente con ingrandimento 40x il giorno 6 dimostrando la sua stabilità nella coltura. Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Conservazione rappresentativa degli elementi nativi dell'HBT presenti in BC-MPS. BC-MPS è stato coltivato per 14 giorni e poi sia immaginato con microscopia a campo brillante a 40x (A) e poi fissato con formalina al 10% e macchiato con macchia pentacroma movats. Le immagini sono state scattate a 100x (B) o 20x (C). L'imaging dell'HBT indica la conservazione di grandi adipociti uniloculori raggruppati insieme e le fette di tessuto indicano la presenza di conservazione dell'ECM nativo come collagene (giallo) e fibre reticolari tra gli adipociti (blu). Per dimostrare la conservazione dei macrofagi nel modello HBT è stato coltivato per 0, 3 o 7 giorni, macchiato per marcatori macrofagi e immaginato utilizzando microscopia confocale (D). L'intensità fluorescente della colorazione dei marcatori di macrofagi è stata quantificata utilizzando un software disponibile in commercio che dimostra che i macrofagi sono ancora presenti nel tessuto dopo 3 e 7 giorni in coltura. Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Crosstalk metabolico rappresentativo tra adipociti e cellule tumorali in BC-MPS. Le cellule MDA-MB-231 etichettate RFP sono state coltivate in BC-MPS rispetto al 2D per 14 giorni, quindi macchiate con Bodipy (250 nM) e analizzate per citometria del flusso. (A) Flusso di cellule MDA-MB-231 macchiate di Bodipy dopo 14 giorni in coltura 2D. Le cellule in B2 erano Bodipy+RFP+; le cellule in B1 erano Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3,26%, indicando un minimo accumulo lipidico. (B) Analisi citometrica del flusso delle cellule MDA-MB-231 macchiate di Bodipy dopo 14 giorni in BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85,35%, indicando un ampio accumulo lipidico. (C) Accumulo lipidico nelle cellule MDA-MB- 231 dopo 14 giorni in coltura 2D rispetto a BC-MPS. L'analisi della microscopia fluorescente della colorazione Bodipy dell'MDA-MB-231 coltivata in 2D (D) vs BC-MPS (E) dimostra un aumento dell'accumulo lipidico nelle cellule coltivate in BC-MPS. ** p < 0,01, n=2 repliche biologiche, barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Migrazione rappresentativa della TNBC in BC-MPS. Le celle MDA-MB-231 con etichetta RFP sono state coltivate in BC-MPS per 4 giorni e quindi le immagini sequenziali time-lapse delle cellule BC-MPS + MDA-MB-231 con etichetta RFP sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza (un fotogramma per 60 minuti, ingrandimento 100x). Asterischi gialli = evento mitotico. Scatola gialla = detriti cellulari utilizzati per il riferimento posizionale. Frecce blu = 231 cellule che mostrano movimento ameboide con pseudopodi e alta motilità. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Migrazione rappresentativa di TNBC in BC-MPS. Le cellule MDA-MB-231 con etichetta RFP sono state coltivate per 4 giorni e la microscopia fluorescente è stata utilizzata per immaginire le cellule ogni 20 minuti a 19 ore a 37 ° C e 5% CO2. Le immagini sono state compilate in un video (un fotogramma ogni 60 minuti, ingrandimento 100x). Clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

Sono necessari nuovi sistemi per modellare il cancro al seno umano per sviluppare una migliore comprensione della malattia. Lo sviluppo di sistemi microfisiologici umani per modellare le impostazioni delle malattie che includono ECM nativo e cellule stromali aumenterà il potere predittivo degli studi preclinici. Il modello BC-MPS qui presentato è un sistema di nuova sviluppo che supera i limiti dei modelli precedenti consente la valutazione di BC nel suo ambiente HBT nativo. Questo sistema può essere utilizzato con linee cellulari tumorali o con espianto tumorale ed è stabile per almeno 14 giorni. L'etichettatura fluorescente delle cellule BC consente di monitorare la loro visualizzazione in tempo reale della motilità delle cellule tumorali e delle interazioni cellulare-cellula, la migrazione, la vitalità o la proliferazione in tempo reale o in punti specifici (Figura 3 e Figura 5). Questo sistema modello può essere utilizzato per chiarire aspetti importanti sulla biologia del cancro in relazione alle interazioni tra le cellule tumorali e il loro microambiente. L'interrogazione di questo sistema può informare sulla regolazione TME della progressione del cancro, della risposta ai farmaci e dell'inizio della metastasi.

Per configurare correttamente il sistema, è necessario seguire alcuni passaggi critici. Il primo passo critico è la coltivazione e il trasferimento dei fogli di cellule ASC. Le piastre rivestite in pNIPAAm sono sensibili alla temperatura. Quando le piastre sono superiori a 32 °C la superficie è idrofobica e gli ASC aderirono alla superficie. La superficie diventerà idrofila al di sotto di questa temperatura e le cellule inizieranno a staccarsi19. Pertanto, è necessario determinare la velocità con cui un determinato tipo di cella inizierà a staccarsi da queste superfici. Per gli ASC derivati da HBT questo richiederà > 30 minuti se le celle sono confluenti. Per evitare che le cellule si staccherino durante la normale manutenzione, il supporto deve essere preri riscaldato a 37 °C e le piastre di coltura tissutale non devono essere mantenute a temperatura ambiente per troppo tempo per evitare che le piastre si raffreddano e le cellule si distaccano. È anche importante determinare il tempo ottimale per i pistoni di gelatina sulle piastre rivestite con pNIPAAm per trasferire l'intero foglio cellulare. Gli ASC devono essere confluenti e l'intero foglio deve essere trasferito. Se il foglio della cella superiore non ha il tempo di staccarsi completamente e legarsi alla gelatina, il foglio cellulare verrà rotto durante il trasferimento. Se l'intero foglio cellulare non viene completamente trasferito, gli ASC non saranno in grado di sandwichare il tessuto mammario vivace.

Gli ASC utilizzati per sandwich l'HBT sono normali cellule stromali del microambiente mammario che secernono ECM, fattori di crescita e citochine che influenzano BC20. Per incastre l'HBT tra due fogli cellulari, i fogli ASC vengono trasferiti utilizzando piastre di coltura tissutale termoresponsive. Ciò consente all'ECM nativo secreto dagli ASC di essere intatto e serve ad ancorare gli adipociti royant nei tessuti. Utilizzando ASC derivati dal tessuto mammario umano, ciò garantisce che le interazioni che le ASC hanno con le cellule tumorali imitano ciò che accade nel cancro al seno poiché gli ASC di diversi depositi mostrano diverse espressioni geniche e il rimodellamento dell'ECM21.

Il secondo passo critico è l'elaborazione dell'HBT. È necessario utilizzare HBT appena isolato per preservare la vitalità del tessuto. Durante l'elaborazione dell'HBT è fondamentale tritare finemente il tessuto e rimuovere il più possibile la fascia. Se nell'HBT vengono lasciati grandi pezzi di fascia, ciò impedirà ai fogli cellulari di ancorare correttamente il tessuto dinamismoe. Inoltre, la fascia lasciata nel tessuto può dissociarsi dalla piastra e tirerà più ammassi dell'HBT con esso rendendo il pozzo inutilizzabile per ulteriori sperimentazioni. L'HBT deve essere posizionato al centro del pozzo prima di aggiungere il foglio della cella superiore altrimenti gli ASC non saranno in grado di sandwichare adeguatamente l'HBT e il tessuto sul bordo dei pozzi non sarà ancorato. Se vengono seguiti questi passaggi critici, il processo di produzione di BC-MPS è immediatamente impostato.

Il modello qui descritto è un sistema migliorato per lo studio del BC nel suo microambiente naturale di HBT primario che trattiene gli adipociti maturi, l'ECM e le cellule immunitarie residenti (Figura 4). I modelli preclinali che imitano il microambiente adiposo mancano di più elementi del microambiente, come adipociti maturi, cellule immunitarie, fibroblasti e ECM. L'utilizzo di HBT completamente maturo consente l'interrogatorio simultaneo e reciproco di questo ambiente complesso che include più elementi che influenzano lo sviluppo del cancro, la risposta ai farmaci e l'invasività attraverso la segnalazione paracrina e giustaprena22,23,24,25. I fibroblasti residenti e le ASC influenzano la metastasi tumorale attraverso il rimodellamento dell'ECM nei tessuti e attraverso la segnalazione paracrina26,27. L'ECM e il suo rimodellamento sono essenziali per l'inizio della metastasi. Le alterazioni nell'ECM del microambiente tumorale influenzano la migrazione e la metastasi del BC, ma la maggior parte degli studi BC non incorporano ECM nativo nei loro studi e utilizzano invece modelli semplificati composti da collagene I o matrigel28,29. L'ECM in BC-MPS proviene dall'HBT e dagli ASC. Pertanto, è possibile studiare il modo in cui l'ECM nativo viene rimodellato nel microambiente tumorale nel tessuto mammario e influenza la metastasi. Pertanto, questo modello BC-MPS incorpora più elementi del microambiente tumorale che i precedenti sistemi modello non aveva.

Questo modello può essere utilizzato per studiare il crosstalk metabolico tra adipociti completamente maturi e cellule BC. I modelli precedenti che studiano l'interazione tra adipociti e cellule tumorali usano pre-adipociti differenziati in vitro. I pre-adipociti differenziati in vitro non maturano completamente nella stessa misura degli adipociti differenziati in vivo30,31. Per capire come gli adipociti influenzano la progressione del cancro e la risposta ai farmaci è fondamentale imitare correttamente la complessa composizione molecolare e chimica degli adipociti nativi. Qui abbiamo dimostrato che il nostro sistema consente di valutare il crosstalk metabolico che si verifica tra adipociti e cellule BC (Figura 4).

Bc-MPS può anche essere utilizzato per eseguire studi in vitro su come condizioni come l'obesità, che non può essere adeguatamente modellata utilizzando linee cellulari standard, influenzano la progressione del cancro. L'obesità è associata all'alterazione del microambiente dell'HBT e ad un aumento della metastasi in BC anche se i meccanismiesatti non sono pienamente compresi 32,33,34. Fibroblasti, ASC, adipociti ed ECM vengono alterati durante l'obesità e promuovono ulteriormente la progressione e la metastasidel cancro 25,35,36. Pertanto, è importante utilizzare cellule stromali native ed ECM dal tessuto obeso per capire come queste alterazioni nelle cellule stromali e nell'ECM influenzano BC. Utilizzando HBT e ASC da pazienti obesi o magri nel modello BC-MPS, i meccanismi con cui l'obesità promuove un fenotipo metastatico possono essere chiariti.

Il metodo qui presentato è per coltivare le cellule tumorali del seno in una cultura che comprende ASC, adipociti maturi e ECM nativo. Precedenti modelli di sistemi di co-culture hanno studiato come questi singoli elementi diversi dell'ambiente stromale influenzino il cancro. Poiché gli ASC e gli adipociti influenzano entrambi la progressione BC, può essere complicato determinare quale tipo di cella è responsabile dell'influenza del BC. Tuttavia, questo può essere determinato confrontando BC-MPS con modelli di co-coltura più semplici con un tipo di cella. Uno dei vantaggi di questo sistema rispetto ai sistemi on-a-chip o biostampa è che non sono necessarie attrezzature speciali per configurare il sistema oltre le piastre rivestite pNIPAAm che sono disponibili in commercio. I sistemi modello del tessuto mammario sono stati precedentemente descritti utilizzando la biostamtamgrafia per depositare gli ASC in impalcature che vengono poi differenziate nellacoltura 22. Ciò richiede altre 2-3 settimane per la differenziazione delle cellule e gli ASC differenziati in coltura non si differenziano completamente per gli adipociti maturi. Gli adipociti maturi dell'HBT in BC-MPS sono pronti per essere utilizzati nel momento in cui vengono rimossi da un paziente.

Il sistema modello qui descritto è un sistema utile per studiare il crosstalk tra le cellule tumorali e il microambiente, tuttavia, ha alcuni limiti. Uno dei principali limiti è la disponibilità del tessuto mammario umano primario. Il tessuto adiposo umano non può essere crioconservato senza perdita di vitalità e quindi il tessuto utilizzato per la produzione di BC-MPS deve essere appena ottenuto e utilizzato37. Un'altra limitazione è che il modello qui presentato è un sistema statico che viene coltivato in normali piastre a 6 pozzi. Il sistema manca del flusso microfluidico presente negli organi su un chip che può influenzare la disponibilità di ossigeno e nutrienti, lo stress puro e la distribuzione deifarmaci 38,39. Una terza limitazione è la necessità che le cellule siano separate l'una dall'altra alla fine dell'esperimento se i diversi tipi di cellule devono essere analizzati individualmente. Ciò richiede la necessità di etichettare le celle in modo che possano essere separate l'una dall'altra.

L'incorporazione di molti elementi del microambiente tumorale produce un modello fisiologico per studiare la progressione del cancro e l'inizio della metastasi. Oltre ad essere in grado di studiare le cellule tumorali in un modello più fisiologico, bc-MPS può anche essere utilizzato per studiare i singoli elementi del microambiente e come sono influenzati dal cancro. Mentre i dati qui rappresentati dimostrano come BC-MPS può essere utilizzato con una linea cellulare, BC-MPS può essere facilmente adattato per soddisfare la particolare esigenza sperimentale di un ricercatore. Ad esempio, l'HBT obeso può essere paragonato all'HBT magro per determinare come l'obesità influisce sulla metastasi e sulla progressione del cancro. Diversi sottotipi di BC possono essere seminati in BC-MPS per studiare come i sottotipi di cancro interagiscono in modo diverso con il microambiente. Le tecniche di editing genico possono essere utilizzate per determinare in che modo geni specifici influenzano l'interazione tra BC e il microambiente. Questo modello e le sue applicazioni consentiranno una comprensione più accurata di come interagiscono l'ambiente stromale e il cancro al seno per promuovere la progressione del cancro e la metastasi.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare il Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core e il Tulane Histology Core per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal Southeastern Society of Plastic & Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant e dalla National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

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