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Cancer Research

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

doi: 10.3791/62009 Published: April 23, 2021

Summary

이 프로토콜은 선반 재료가 없는 1차 인간 유방 조직을 사용하여 유방암을 연구하기 위한 체외 미생물 시스템의 건설을 설명합니다.

Abstract

유방암 (BC)은 여성을위한 주요 사망 원인으로 남아 있습니다. 매년 BC 연구에 7억 달러 이상을 투자했음에도 불구하고 BC 주 약의 97%가 임상 시험에 실패합니다. 따라서 질병에 대한 우리의 이해를 향상시키기 위해 새로운 모델이 필요합니다. NIH 미생물시스템(MPS) 프로그램은 기초과학 발견의 임상번역을 개선하고 새로운 치료 전략을 약속하기 위해 개발되었다. 여기에서 우리는 유방암을 위한 MPS를 생성하는 방법을 제시합니다 (BC-MPS). 이 모델은 지방 유래 줄기 세포 시트 (ASC) 사이에 WAT를 끼운하여 1 차 인간 백색 지방 조직 (WAT)을 배양하는 이전에 설명된 접근 방식을 조정합니다. 우리의 BC-MPS의 새로운 양상은 종아메리카세포 외 매트릭스, 성숙한 세포세포, 상주 섬유아세포 및 면역 세포를 포함하는 비병인간 유방 조직 (HBT)으로 BC 세포를 종향하는 것을 포함합니다; 및 HBT 유래 ASC 시트 사이에 BC-HBT 혼화제를 끼우고. 결과 BC-MPS는 적어도 14 일 동안 문화 전 생체 에서 안정적입니다. 이 모델 시스템에는 선포세포, 기질 세포, 면역 세포 및 세포 외 매트릭스를 포함하여 BC에 영향을 미치는 마이크로 환경의 여러 요소가 포함되어 있습니다. 따라서 BC-MPS는 BC와 그 마이크로 환경 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 암 진행과 전이에 영향을 미치는 것으로 알려진 두 개의 BC 동작을 연구하여 BC-MPS의 장점을 보여줍니다 : 1) BC 운동성과 2) BC-HBT 대사 크로스토크. BC 운동성은 이전에 인트라바이탈 이미징을 사용하여 입증되었지만 BC-MPS는 며칠 동안 형광 현미경 검사를 사용하여 고해상도 시간 경과 이미징을 허용합니다. 더욱이, 대사 크로스토크는 이전에 BC 세포와 미숙한 선포세포로 분화된 뮤린 프리-아포세포를 사용하여 입증되었지만, 우리의 BC-MPS 모델은 1차 인간 유방 선포세포와 체외세포 사이의 이 교차토크를 보여주는 최초의 시스템입니다.

Introduction

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매년 40,000명 이상의 미국 여성이 유방암(BC)1로사망합니다. 매년 BC 연구에 7억 달러 이상을 투자했음에도 불구하고, 후보 BC 약물의 97%가 임상 시험2,3에실패합니다. 신약 개발 파이프라인과 BC에 대한 이해를 개선하기 위해서는 새로운 모델이 필요합니다. NIH 미생물학(MPS) 프로그램은 기본 과학을 임상성공4로 번역하는 것을 개선하기 위한 획기적인 모델에 필요한 특징을 설명했습니다. 이들은 1 차적인 인간 세포 또는 조직의 사용을 포함, 4 주 동안 문화에 안정, 네이티브 조직 아키텍처 및 생리 반응의 포함.

BC 세포주 2차원 배양, 멤브레인 삽입 공동 배양, 3차원 스페로이드 및 오르가노이드와 같은 현재 시험관 내 BC 모델은 NIH의 MPS 기준을 충족시키지 못하기 때문에 이러한 생체 조직 아키텍처를 재구성하지 않기 때문이다. 세포 외 매트릭스 (ECM)가 이러한 시스템에 추가되면 유방 ECM이 사용되지 않습니다. 대신 콜라겐 젤과 지하 멤브레인 행렬이 사용됩니다.

환자 유래 제노이식(PDX)과 같은 생체 내 시스템은 유사하게 Murine 유방 조직이 인간의 가슴과 크게 다르기 때문에 NIH의 MPS 기준을 충족시키지 못합니다. 더욱이, 면역 계통-BC 상호 작용은 종양 발달에 있는 열쇠로 점점 인식되고 있습니다, 그러나 PDX 종양을 생성하기 위하여 이용된 면역타협한 뮤린 모형은 성숙한 T 세포, B 세포 및 자연적인 살인자 세포부족. 더욱이, PDX는 1차 유방 종양을 유지 및 확장할 수 있도록 허용하지만, 생성된 PDX 종양은 1차 뮤린 기질 세포 및 ECM5로침투된다.

이러한 과제를 극복하기 위해 NIH MPS 기준을 충족하는 새로운 ex vivo, 입체적인 인간 유방 MPS를 개발했습니다. 우리의 유방 MPS의 기초는 또한 HBT(그림 1)에서분리된 지방 유래 줄기 세포의 2장 사이 1 차 인간 유방 조직 (HBT)를 샌드위치해서 만들어집니다. HBT를 샌드위치로 셀 시트를 전송하는 플런저는 간단한 아크릴 플라스틱(그림 1H,I)으로3D 인쇄 되거나 만들 수 있습니다. 이 기술은 1 차적인 인간 백색 반포세포 조직을 배양하기 위한 우리의 이전에 기술된 접근 방식을 적응합니다6,7. 유방 MPS는 표준 BC 세포주에서 1 차적인 인간 유방 종양에 구역 수색하는 선택의 BC 모형에 의해 그 때 시드될 수 있습니다. 여기서, 우리는 이러한 BC-MPS가 여러 주 동안 문화에서 안정되어 있음을 보여줍니다(그림 2); 유방 선포세포, ECM, 내피, 면역 세포와 같은 HBT의 토착 요소를 포함한다(도 3); 대사 크로스토크(도4)와같은 BC와 HBT 간의 생리적 상호작용을 재구성한다. 마지막으로, BC-MPS는 HBT(도5)를통해 BC 세포의 아모에이드 이동연구를 허용한다는 것을 보여준다.

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Protocol

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모든 인간 조직은 LSUHSC의 기관 검토 위원회 사무소의 승인에 따라 프로토콜 #9189 따라 수집되었습니다.

1. 세포 시트에 대한 Adipose 유래 줄기 세포 (ASC)의 파종

  1. 상용 소스에서 ASC를 구입하거나 확립 된프로토콜8을따라 1 차 인간 유방 조직으로부터 분리8,9. 종자 인간 유방 ASC70% 밀도 (~80,000 세포/cm2 표면적) 6-well 표준 조직 배양 플레이트에 덜벡코의 수정된 독수리 매체 (DMEM) 보충 10% 태아 소 혈 청, 그리고 1% 페니실린/스트렙토마이신 (BC-MPS 미디어). 세포 시트를 형성하는 데 사용되는 ASC가 통과 10 보다 적어야 하는지 확인합니다.
    1. 유방암 미생물학적 시스템(BC-MPS)의 각 웰에 대해, 1표준 조직 배양에서 종자 세포는 폴리(N-iso프로필acrylamide)에 유사한 크기의 1웰(N-iso프로필acrylamide)(pNIPAAm)-코팅조직 배양 플라스틱 플레이트에 있다. BC-MPS의 6웰 플레이트 1개에는 하나의 표준 조직 배양 6 웰 플레이트(아래)와 1개의 pNIPAAm 코팅 플레이트(상단)가 필요합니다. pNIPAAm 플레이트는 상업용 소스에서 구입할 수 있거나 실험실 내10,11,12로코팅할 수 있다.
  2. 37 ° C 및 5 % CO2에서조직 배양 인큐베이터에서 의 배양 ASC. 바이오 세이프티 캐비닛에서 2-3일마다 미디어를 변경합니다.
  3. ASC가 100% 수렴될 때까지 문화하고 줄무늬 패턴을 형성합니다. 시드를 받은 합류에 따라 7-10일이 소요됩니다. 부력 지방 유방 조직을 고정하려면 컨런트 세포 시트가 필요합니다.

2. BC MPS에 필요한 소모품 준비

  1. 6웰 플레이트용 젤라틴을 준비하려면 250mL 유리 미디어 병에 블라틴 B형 B(젤 강도 ~225블룸)와 H2O125mL의 증류된 H2O. 믹스 19g에 12% 젤라틴 용액을 만듭니다. pH를 중화하기 위해 용액에 1M NaOH의 1.6mL를 추가합니다.
  2. 용액을 살균하기 위해 25분 동안 액체 사이클에서 용액을 오토클레이브합니다.
  3. 용액이 37°C로 냉각되도록 합니다. 멸균 생물안전 캐비닛에서 16mL의 멸균 10x 행크스 균형 소금 용액(HBSS)을 용액에 첨가하여 최종 부피를 160mL로 획득한다.
    참고: 젤라틴 용액을 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 실온에서 저장할 수 있습니다. 준비된 젤라틴은 실온에서 1개월 동안 안정적입니다. 몇 플런서만 필요한 경우 10mL 용액을 만들고 이전에 설명한 대로 BC-MPS를 만드는 것과 같은 날에 걸러질 수있습니다.
    1. 필터 살균에 의해 젤라틴 용액을 준비하기 위해 10x HBSS 1mL을 H2O9mL로 희석하여 15mL 원문 튜브에서 1x HBSS 용액을 만듭니다. 각 10mL 튜브에 1M NaOH의 100 μL을 추가한 다음 용액에 0.7 g의 젤라틴을 추가합니다. 젤라틴을 용해시키기 위해 용액을 적극적으로 섞습니다.
    2. 튜브를 75°C의 수조에 20분 동안 배양하여 5분마다 흔들어 보냅니다. 젤라틴 용액을 필터링하려면 10mL 주사기와 0.22 μm 주사기 필터를 사용합니다. 젤라틴 용액을 생물 안전 캐비닛의 플런스터에 직접 필터링합니다.
  4. 3D 인쇄 또는 간단한 아크릴을 사용하여 셀 시트를 전송하는 데 사용되는 플런저를 만듭니다. 플런저가 원하는 크기의 우물크기에 느슨하게 맞는지 확인하십시오. 표준 3D 인쇄 플런저그림 1에표시됩니다. 플런처는 팅커캐드와 같은 표준 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 설계할 수 있으며 폴리락산(PLA)13,14와호환되는 필라멘트 3D 프린터를 사용하여 인쇄할 수 있습니다.
  5. 플런저를 잡기 위한 랙을 준비하려면 15mL 튜브 랙을 생물 안전 캐비닛에 놓습니다. 플런저 의 바닥이 위를 향하고 있도록 랙에 거꾸로 플런저를 배치합니다. 생물 안전 캐비닛에 BC-MPS를 운반하기 위해 뚜껑이 있는 플라스틱 상자를 놓습니다. BC-MPS 4 플레이트에 맞게 35.5cm 길이 x 28cm 너비 x 8.25 cm 높이 8.25 cm 이상이어야 합니다. 상자에서 뚜껑을 제거하고 70 % EtOH로 랙, 플런지 및 상자를 스프레이합니다.
  6. 멸균 면도날과 집게를 자동화하거나 생물 안전 캐비닛에 넣고 70% EtOH로 세척하여 멸균 면도날과 집게를 준비합니다.
  7. 플런서와 박스에 70% EtOH를 분사하고 생체 안전 캐비닛에 UV 광을 최소 30분 동안 켜서 보급품을 살균합니다.

3. 젤라틴 플런서를 준비하고 상부 셀 시트에 적용

  1. 젤라틴 용액이 이전에 준비된 경우 37° C 수조에서 가열하여 녹입니다.
  2. 5-또는 10mL 세로지컬 파이펫을 사용하여 생물 안전 캐비닛의 플런저에 젤라틴 용액을 피펫. 6웰 플레이트의 1웰에 대한 플런저에는 ~2.5mL의 젤라틴이 필요합니다.
  3. 젤라틴이 플런저(~30-45분)에 고화되면 pNIPAAm 코팅 ASC 플레이트를 생물 안전 캐비닛으로 옮습니다. 젤라틴이 ASC에 접촉할 수 있도록 pNIPAAm 코팅 ASC 플레이트의 우물에 플런지를 부드럽게 배치합니다. 플런저에 금속 와셔(~7.5g)를 배치하여 플런저를 계량하여 젤라틴이 ASC 셀 시트와 직접 접촉하도록 합니다. 30 분 동안 실온에서 ASC 셀 시트에 플런저를 둡니다.
  4. 플런저로 접시를 부드럽게 움직여 생물 안전 캐비닛의 멸균 상자에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 상자를 4°C 냉장고로 30분 동안 이동합니다. 4°C 냉장고를 사용할 수 없는 경우 30분 동안 바이오 세이프티 캐비닛의 얼음 양동이에 접시를 놓습니다.

4. 암 세포 주 준비

  1. 표준 T75 조직 배양 접시에 암 세포 주를 시드하 고 BC-MPS가 처리 될 날에 ~ 80 % 컨실수 되도록 배양에 보관하십시오. (~200,000암세포는 BC-MPS당 필요합니다). 정상 매체에서 암세포를 성장시다.
    참고: 암세포를 확인하고 분리하려면 세포가 형광 단백질로 전염되어 ASC 및 유방 조직과 구별하는 것이 좋습니다. BC-MPS 당 필요한 암세포의 수는 MCF7 및 MDA-MB-231 세포에 최적화되었습니다. 그밖 세포주추가 최적화를 요구할 수 있습니다.
  2. BC-MPS가 준비되고 있는 날에는 암세포를 함유한 플라스크를 생물안전 캐비닛으로 이동시한다. 플라스크에서 미디어를 흡인. PBS의 5mL로 플라스크를 씻으세요.
  3. 암세포를 함유하는 플라스크에 세포 분리 용액 1mL을 추가한 다음 세포가 분리될 때까지 플라스크를 37°C 인큐베이터로 배양한다(~2-5분).
  4. 생물안전 성 캐비닛에서 플라스크에 PBS의 9mL를 추가하고, PBS의 세포를 15mL 원추형 튜브로 옮기고 혈종계를 사용하여 세포 수를 계산한다.
  5. 실온에서 5 분 동안 500 x g의 암세포를 원심 분리합니다.
  6. 2 x 106 셀/mL이 있도록 BC-MPS 미디어에서 세포를 다시 중단합니다.
  7. 암세포를 인간 조직에 첨가할 준비가 될 때까지 37°C 의 수조에 넣습니다.

5. 인간 유방 조직의 처리

  1. 생체 안전 캐비닛에서 멸균 PBS의 10mL로 인간 유방 조직 (HBT) 3배 세척.
  2. 멸균 집게와 면도날을 사용하여 BC-MPS를 거칠게 다진 다음 가능한 한 많은 근막과 결합 조직을 제거하십시오. 결합 조직을 제거하지 못하면 ASC 상층이 HBT를 제대로 고정하지 못할 수 있습니다.
    참고: 근막 과 결합 조직은 지방 조직의 황색에 비해 흰색 또는 명확한 외관에 의해 식별 될 수있다.
  3. 결합 조직이 제거되면 균질성 액체 일관성이 될 때까지 조직을 미세하게 다진 멸균 면도날을 사용하십시오. 조직은 25 mL 세로릭 팁을 사용하여 쉽게 파이프화 될 수있을 때 미세하게 다진다.
  4. 멸균 면도날을 사용하여 p1000 파이펫 팁에서 팁을 잘라 다진 HBT를 파이펫팅에 지원합니다.
  5. 1.5mL 튜브에서 다진 HBT, 암 세포주 및 BC-MPS 미디어를 혼합합니다(6웰 플레이트의 1웰은 다진 HBT 200 μL, BC-MPS 미디어의 100 μL 및 암세포의 100 μL)이 필요합니다.
  6. 인큐베이터에서 바이오 세이프티 캐비닛으로 하단 셀 시트에 사용되는 ASC 플레이트를 이동합니다. 하단 ASC 플레이트에서 미디어를 흡인합니다. 5.4 단계에서 절단된 단종 끝이 있는 p1000 파이펫 팁을 사용하여 바닥 ASC 플레이트의 우물 중앙에 혼합물을 파이펫
  7. 상부 ASC 플레이트가 들어 있는 상자를 생체 안전 캐비닛에 플런서로 이동합니다. pNIPAAm 코팅 플레이트에서 젤라틴 플런지를 부드럽게 제거하고 HBT 혼합물 위에 놓습니다. 우물에 BC-MPS 미디어를 추가합니다 (6 웰 플레이트의 1 웰에 2 mL의 미디어를 추가). BC-MPS 혼합물과 플런저로 바닥 ASC 플레이트를 멸균 플라스틱 상자에 조심스럽게 옮기고 상자 뚜껑을 배치하여 운송합니다.
    참고: 플런서가 켜지는 동안 6웰 플레이트 뚜껑이 ASC 플레이트에 다시 맞지 않습니다. 문화를 오염하지 않도록 주의를 기울여야 합니다.
  8. 젤라틴이 녹을 때까지 37 ° C의 인큐베이터에서 상자내의 바닥 플레이트를 배양하고 상단 ASC 층이 바닥 층 (~30 분)에 부착되기 시작했습니다.
  9. 플레이트가 있는 상자를 생물안전 캐비닛으로 이동합니다. 바닥 플레이트에서 플런저를 부드럽게 제거합니다. 암세포를 가진 조직은 우물의 바닥에 고정될 것입니다.
  10. 6웰 플레이트의 뚜껑을 다시 하단 플레이트에 놓고 37°C에서 배양하여 젤라틴을 완전히 녹여 서 상단 층이 바닥 층(~30-60분)에 완전히 고정되도록 합니다.
  11. 플레이트를 생물안전 캐비닛으로 부드럽게 이동하고 10mL 세로지학적 파이펫으로 미디어를 흡인합니다. 각 웰에 신선한 미디어의 2 mL을 추가합니다. 우물의 가장자리에서 흡인하고 조직을 해피하지 않도록 우물의 가장자리에 파이펫.
  12. 원하는 시간 동안 BC-MPS를 37°C 및 5%CO2로 유지하고 2-3일마다 미디어를 변경한다.

6. 분석을 위한 BC-MPS의 소화

  1. BC-MPS를 분석할 준비가 되면 플레이트를 생물 안전 캐비닛으로 이동합니다. 조직의 우발적 인 탈지방지를 위해 혈청 피펫으로 미디어를 제거하십시오.
  2. 각 웰에 1볼륨의 PBS를 추가합니다.
  3. 세로지학적 파이펫으로 PBS를 제거합니다.
  4. 각 웰에 1mL의 셀 분리 솔루션을 추가합니다. 플레이트를 다시 인큐베이터로 이동하고 37°C에서 5분 동안 배양하여 세포가 분리되도록 합니다. 생물 안전 캐비닛에서 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포와 조직을 배양판에서 완전히 분리하십시오.
  5. 조직으로 용액을 15mL 원문 튜브로 이체피를 이용하여 전달한다. 남은 세포를 수집하고 이 솔루션을 원물 튜브로 전송하기 위해 각 웰에 PBS 2mL을 추가합니다. 세포가 형광인 경우 튜브를 알루미늄 호일로 감싸빛으로부터 보호하십시오.
  6. 조직으로부터 세포를 완전히 해리하기 위해 10-20 분 동안 1 x g에서 궤도 셰이커에서 일정한 동요 하에서 37 °C에서 튜브를 배양합니다.
  7. 생물 안전 캐비닛에서 혈청 피펫을 사용하여 튜브에 남아있는 세포 덩어리를 방해하고 250 μm 조직 여과기를 통해 샘플을 새로운 15 mL 튜브로 필터링합니다. 스트레이너를 통해 솔루션을 천천히 피펫하여 오버플로하지 않도록 합니다.
  8. 스트레이너를 1mL PBS로 헹구어 여과기에 남아 있는 모든 세포를 수집합니다.
  9. 원심 분리는 5 분 동안 실온에서 500 x g에서 샘플을 원심 분리합니다. 원심분리 후, 암세포와 ASC가 튜브 바닥의 펠릿에 함께 혼합되는 동안, 심포세포는 용액의 상단 층에 떠있을 것이다.
  10. 지방세포가 상단 층을 새 튜브에 부드럽게 붓거나 p1000 파이펫 팁에서 팁을 잘라내고 상단 층을 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 원심분리기 샘플을 500 x g에서 5분 동안 다시 사용하고 주사기와 바늘을 사용하여 교포 세포 아래에서 용액을 제거하여 교포세포만 남게 됩니다. 이제 분석 준비가 되었습니다.
  11. 용액으로부터 아디포세포를 제거한 후, 암세포가 이전에 형광단백질로 전감염되었는지 분석을 위해 ASC및 암세포를 서로 분리한다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 ASC 및 암세포를 포함하는 관에서 나머지 용액을 흡인. PBS 또는 BC-MPS 매체에서 펠릿을 다시 중단하고 유동 세포측정을 사용하여 형광에 기초하여 세포를 정렬합니다.

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Representative Results

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문화의 안정성
BC-MPS는 적어도 14 일 동안 시험관 내에서 배양 될 수있는 안정적인 미생물 학적 시스템입니다. ASC 세포 시트의 브라이트필드 이미지는 컨서크시트(도 2A)의줄무늬 패턴을 표시하기 위해 100배율로 촬영하였다. ASC 세포 시트는 적어도 4 주 동안 배양에서 안정적입니다. BC-MPS는 14일 동안 6웰 플레이트의 한 우물에서 양문화되어 부력 HBT가 여전히 14일(도2B)이끝난 후 ASC 셀 시트에 의해 안정적으로 고정되어 있음을 보여주는 컬러 카메라로 이미지되었다. 이것은 지방 조직을 샌드위치하는 데 사용되는 세포 시트가 여전히 손상되지 않았다는 것을 보여줍니다. RFP를 발현하는 삼중 음성 BC 세포주 MDA-MB-231은 14일 동안 HBT에서 배양된 다음, 세포주를 가진 BC-MPS의 안정성을 입증한 형광 현미경으로 14일이상(그림 2C)을발양하였다. 조직에 있는 BC 세포의 존재는 HBT를 침략하는 암세포의 기능을 보여줍니다. 삼중 음성 PDX 절제는 마우스에서 절제되었고, 셀 트래커 CMTPX로 염색되어 HBT로 배양되었습니다. 형광 현미경 이미지는 6 일째에 종양 이질이 있는 BC-MPS의 안정성을 보여주기 위해촬영되었다(도 2D). 이것은 BC-MPS가 세포주뿐만 아니라 HBT와 종양 이양을 배양하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다.

네이티브 HBT 요소
BC-MPS에는 문화권에서 HBT의 기본 요소가 포함되어 있습니다. BC-MPS 포함 100 HBT의 mg 14 일 동안 체외에서 배양 되었다. 조직은 배양(도3A)에서14일 후에 밝은 필드 현미경 검사를 사용하여 이미지화되었다. 이 이미지는 문화에서 14 일 동안 성숙한 지방 세포의 클러스터의 보존을 보여줍니다. 조직은 그 때 10% 포르말린, 파라핀 내장으로 고정되고, 마이크로토메를 사용하여 5 μm에서 단면한 다음 표준 프로토콜을 사용하여 Movats 펜타크롬 얼룩으로 염색하였다. 고정 된 섹션은 100x(그림 3B)또는 20x(그림 3C)로이미지되었습니다. 이미지는 BC-MPS가 네이티브 콜라겐(보라색), 망상 섬유(blue)를 포함하고, 결합 조직 사이의 큰 외야 모양이 배양에서 14일 후에 보존된다는 것을 보여준다. 시스템에서 기본 대식대를 식별하기 위해 HBT는 0, 3 및 7일 동안 배양한 다음 안티 CD45, 안티 CD68 및 안티 CD206으로 고정 및 염색되었습니다. CD45는 일반 백혈구 식별자로 사용되었다. CD68은 대식세포를 식별하는 모노사이클 스테인으로 사용되었으며 CD206은 대식세포에 존재하는 공통 수용체를 식별한다. 대식세포 마커의 염색은 이미징소프트웨어(도 3D)를사용하여 정량화되었다. 이는 3일과 7일 후 의 주요 대식세포 보존을 보여 준다. 이러한 데이터는 BC-MPS가 문화에서 HBT의 기본 요소를 보존한다는 것을 보여줍니다. 추가 실험은 BC 세포가 HBT의 네이티브 요소를 리모델링하는 방법을 연구하기 위해 수행 될 수있다. 이것은 그들이 BC 세포의 존재에 의해 변경되고 있는지 확인하기 위해 대식세포 마커의 변화를 평가하는 포함 할 수있다. ECM의 변화는 BC 세포유무에 배양된 시료의 모바츠 펜타크롬 염색을 비교하여 콜라겐 함량이 변경되는지 여부를 결정하고 이미지 J와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 백혈구가 교신구 크기를 변경하는지 여부를 결정할 수 있다.

신진 대사 크로스토크
아디포세포암 대사 크로스토크는 종양 미세환경이 BC 진행에 영향을 미치는 중요한 통로이다. 세포 내 지질을 축적하는 BC 세포는 증가된 약물 내성 및 보다 침습적인표현형(15)을보여준다. BC 세포는 미숙한, 뮤린 백분 세포에 있는 lipolysis를 유도하기 위하여 보였지만, BC와 1 차적인 인간 유방 선포세포 사이 신진 대사 상호 줄기가 결코 보여주지 않았기 때문에 이것의 생리적인 관련성은 불분명하게 남아 있습니다. BC-MPS가 이 반포세포-BC 대사 크로스토크 RFP-표지MDA-MB-231 세포를 14일 동안 단독으로 또는 BC-MPS에서 배양하였다. 세포는 단일 세포 현탁액으로 효소적으로 소화되었고, 중성 지질 염료 Bodipy로 염색하고, 혈류 세포측정(도4A,B)16에의해 분석되었다. 지질 양성 MDA-MB-231 세포의 비율은 26.2배 SEM +/- 2.5배 로 BC-MPS 대 2D 배양(도4C)이었다. 지질 염색의 이 증가는 암세포가 지방세포와 상호 작용하고 성숙한 지방세포에서 풀어 놓인 지질을 취하고 있다는 것을 보여줍니다. 세포 정렬은 RFP+ Bodipy+ 셀에 대해 선택하도록 수행되었다. 정렬 후, 세포는 콜라겐에 도금되었다 나는 유리 커버립을 코팅하고 하룻밤 부착 할 수 있었다. 다음 날 세포는 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 고정 된 다음 100 배율에서 형광 현미경으로 이미지화되었습니다. BC-MP(도4E)에서배양된 세포는 표준 2D 배양(도4D)에서배양된 세포에 비해 지질 방울이 증가하였다. 이것은 BC 세포와 HBT 사이 신진 대사 교차토크를 보여주고, 또한, 지질 축적이 유동 세포측정법 또는 형광 현미경 검사법에 의해 어떻게 분석될 수 있는지 보여줍니다. 암세포에 있는 지질 축적의 추가 분석은 지질 물방울의 크기와 세포 당 지질 물방울의 수를 정량화하여 행해질 수 있습니다.

아모에보이드 무브먼트
BC 세포와 선포세포 간의 대사 교차 이야기는 암의 침습적 능력을 증가시킵니다. HBT로 배양된 암세포의 증가된 침습능력을 평가하기 위해 HBT 를 통해 BC 세포의 이주를 형광 현미경 검사법에 의해 평가하였다. RPF를 발현하는 전이성 TNBC 세포주 MDA-MB-231은 시스템이 안정화될 수 있도록 4일 동안 BC-MPS에서 배양되었다. 시간 경과 형광 현미경 검사는 MDA-MB-231 운동성을 37°C에서 19시간 동안 20분마다 캡처한 1개의 영상으로, 5%CO2를이미지화하기 위해 4일 후에 수행되었다. 결과 비디오는 MDA-MB-231세포(그림 5비디오 1)에대한 아모에이드 운동 패턴과 놀라울 정도로 높은 수준의 운동성을 입증하였다. 이것은 BC 세포의 침략적인 능력 및 HBT를 침략하는 BC 세포의 기능에 있는 증가를 보여줍니다. HBT내의 BC 세포의 이동은 마이그레이션셀(17,18)의속도와 방향성을 정량화하기 위한 이전에 발표된 방법을 사용하여 더욱 분석될 수 있다. MDA-MB-231 세포는 또한 미토시스를 겪는 것으로 나타났다. 이 행동은 그것의 공격적인 표현형과 일치하고, 암 진행 및 전이를 위한 중요한 행동이고, BC 치료를 위해 표적으로 할 수 있는 새로운 BC 행동을 강조합니다.

Figure 1
그림 1: BC-MPS 설정의 일반 워크플로우입니다. (A)젤라틴은 직립 플런저로 고화된다. (B)젤라틴플런저를 장착한 플런저를 열반응 상부 ASC 셀 시트에 배치한다. (C)무게는 젤라틴이 세포시트와의 접촉을 유지하도록 강제하는 데 사용되며, 세포는 30분 동안 실온에서 인큐베이션을 한 후 4°C에서 30분 동안 배양하는 동안.(D)플런저는 차가운 접시로부터 그대로 셀 시트를 제거한다. (E)상부 셀 시트를 가진 플런저는 바닥 세포 시트 및 다진 HBT 및 BC 세포를 포함하는 접시로 전달된다. (F)매체, 플런저, HBT, BC 및 두 세포 시트를 가진 바닥 셀 접시는 젤라틴이 녹고 세포 시트가 접지로부터 까지 37°C에서 37°C로 배양됩니다. (G)플런저를 제거하면 HBT와 BC가 두 개의 ASC 세포 시트 사이에 끼워 져 나뭇잎. 3D 프린팅 플런저는 무료 온라인 소프트웨어 인 TinkerCad (https://www.tinkercad.com/)를 사용하여 설계되었으며 3D 프린터에 인쇄되었습니다. 플런저는 폴리락산으로 구성됩니다. (H)6웰 플레이트의 1웰에 대한 플런거의 치수가 표시됩니다. 플런저의 오목은 2.5 mm.(I)실제 3D 인쇄 플런저의 이미지가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 문화에서 BC-MPS의 대표적인 안정성. (A)컨물수 있는 ASC의 100배율에서 밝은 필드 이미지가 컨서트 셀의 수축패턴을 보여 주는 것이다. 비늘 바 = 100 μm.(B)BC-MPS, HBT의 100mg을 포함하는, 6 웰 플레이트에서 배양하였다. 14일 후, HBT가 6웰 플레이트의 우물 바닥에 고정되어 있음을 보여주기 위해 컬러 사진을 촬영했습니다. (C)RFP를 발현하는 삼중 음성 BC 세포주 MDA-MB-231은 14일 동안 HBT로 배양된 후 40배율배율에서 형광 현미경을 사용하여 배양하였다. 이미지는 MDA-MB-231 세포가 HBT에서 아직도 실행 가능하고 성장하고 있었다는 것을 보여줍니다. 스케일 바 = 200 μm D) 마우스에서 삼중 음성 유방암의 PDX 종양은 3cm2 개로 다진 및 세포 추적기 레드 CMPTX로 표시하였다. 이 조각들은 HBT에서 배양되었고, 그 결과 BC-MPS는 배양의 안정성을 입증하는 6일째에 40배배율로 형광 현미경을 사용하여 이미지화되었다. 스케일 바 = 200 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

Figure 3
그림 3: BC-MPS에 존재하는 HBT의 기본 요소의 대표 보존. BC-MPS는 14일 동안 배양한 다음 40x(A)에서 밝은필드 현미경으로 촬영한 다음 10% 포르말린으로 고정하고 모바츠 펜타크롬 얼룩으로 염색하였다. 이미지는 100x(B)또는 20x(C)로 촬영하였다. HBT의 이미징은 함께 클러스터된 대형 단엽구 분광세포의 보존을 나타내며 조직 조각은 교원질(yellow) 및 지방세포(blue) 사이의 망상 섬유와 같은 네이티브 ECM의 보존의 존재를 나타낸다. 모델 HBT에서 대식세포의 보존을 입증하기 위해 0, 3 또는 7일 동안 배양되었고, 대식세포 마커에 염색하고, 공초점현미경검사(D)를사용하여 이미지화하였다. 대식세포 마커의 염색의 형광 강도는 대식세포가 문화에서 3 및 7일 후에 조직에 여전히 존재한다는 것을 보여주는 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다. 스케일 바 = 200 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

Figure 4
그림 4: BC-MPS에서 세포와 암세포 사이의 대표적인 대사 화후. RFP-표지MDA-MB-231 세포는 14일 동안 BC-MPS 대 2D로 배양된 다음 Bodipy(250 nM)로 염색하고 유동 세포측정에 의해 분석하였다. (A)2D 배양에서 14일 후 보디피 염색 MDA-MB-231 세포의 흐름. B2의 세포는 Bodipy+RFP+; B1의 세포는 Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3.26%, 최소한의 지질 축적을 나타낸다. (B)BC-MPS에서 14일 후 보디피 염색 MDA-MB-231 세포의 유동 세포 분석. B2/(B1+B2) = 85.35%, 광범위한 지질 축적을 나타낸다. (C)MDA-MB-231 세포에서 지질 축적 2D 배양에서 14 일 후 BC-MPS. 2D(D)vs BC-MPS(E)에서 배양된 MDA-MB-231의 보디피 염색의형광 현미경 분석은 BC-MPS에서 자란 세포에서 지질 축적이 증가했음을 보여준다. 오류 막대는 SEM을 표시했습니다. ** p < 0.01, n=2 생물학적 복제, 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: BC-MPS에서 TNBC의 대표 마이그레이션. RFP-표지MDA-MB-231 세포는 4일 동안 BC-MPS에서 배양된 다음 RFP-MPS + MDA-MB-231 세포의 순차적 타임랩스 이미지가 형광 현미경(60분당 1프레임, 100x 배율)을 사용하여 포획하였다. 노란색 별표 = 미토틱 이벤트. 노란색 상자 = 위치 참조에 사용되는 셀룰러 이물질. 파란색 화살표 = 231 세포는 의사 포드와 높은 운동성으로 아모에이드 운동을 나타낸다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: BC-MPS에서 TNBC의 대표 마이그레이션. RFP-표지MDA-MB-231 세포를 포함하는 BC-MPS는 4일 동안 배양되었고 형광 현미경 검사는 37° C에서 19시간마다 20분마다 세포를 이미지화하고 5%CO2를 사용하였다. 이미지는 비디오로 컴파일되었습니다 (60 분 당 하나의 프레임, 100 배율). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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인간의 유방암 모델링을 위한 새로운 시스템은 질병의 더 나은 이해를 개발하기 위하여 필요합니다. 네이티브 ECM 및 기질 세포를 포함하는 질병 설정을 모델링하는 인간 미생물 시스템의 개발은 전임상 연구의 예측 능력을 증가시킬 것이다. 여기에 제시된 BC-MPS 모델은 기존 모델의 한계를 극복하여 네이티브 HBT 환경에서 BC를 평가할 수 있는 새로 개발된 시스템입니다. 이 시스템은 암 세포주 또는 종양 이질과 함께 사용될 수 있으며 적어도 14 일 동안 찌그러집니다. BC 세포를 형광으로 표시하면 암 세포 운동성 및 세포 상호 작용, 마이그레이션, 생존 가능성 또는 증식을 실시간으로 또는 특정 시점에서 모니터링할 수있습니다(그림 3도 5). 이 모형 시스템은 암세포와 그들의 마이크로 환경 사이 상호 작용에 관하여 암 생물학에 관하여 중요한 양상을 명구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 시스템의 심문은 암 진행, 약물 반응 및 전이개시의 TME 조절에 알릴 수 있습니다.

시스템을 성공적으로 설정하려면 따라야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 ASC 셀 시트의 배양 및 전달입니다. pNIPAAm 코팅 플레이트는 온도에 민감합니다. 플레이트가 32°C 이상이면 표면은 소수성이며, ASC는 표면에 부착됩니다. 표면은 이 온도 의 밑에 친수성이 되고 세포는19를분리하기 시작합니다. 따라서 주어진 셀 유형이 이러한 표면에서 분리되기 시작하는 방법을 빨리 결정할 필요가 있습니다. HBT 유래 ASC의 경우 세포가 수렴되는 경우 30분 > 소요됩니다. 정상적인 유지 보수 중에 세포가 분리되는 것을 방지하기 위해 미디어는 37 °C로 미리 데워져야하며 조직 배양 판은 플레이트가 냉각 및 세포 분리를 방지하기 위해 너무 오래 실온에서 유지되어서는 안됩니다. 전체 셀 시트를 전송하는 pNIPAAm 코팅 플레이트에 있을 젤라틴 플런저에 대한 최적의 시간을 결정하는 것도 중요합니다. ASC는 컨서크해야 하며 전체 시트를 전송해야 합니다. 상단 셀 시트가 완전히 분리하고 젤라틴에 결합 할 시간이없는 경우 전송 하는 동안 셀 시트가 파손됩니다. 전체 세포 시트가 완전히 전달되지 않으면 ASC는 부력 유방 조직을 샌드위치 할 수 없습니다.

HBT를 샌드위치하는 데 사용되는 ASC는 BC20에영향을 미치는 ECM, 성장 인자 및 사이토카인을 분비하는 유방 미세 환경의 정상 기질 세포입니다. 두 세포 시트 사이에 HBT를 샌드위치하기 위해 ASC 시트는 열 반응 조직 배양 판을 사용하여 전달됩니다. 이를 통해 ASC에 의해 분비된 네이티브 ECM이 그대로 유지될 수 있으며 조직에 부력 선포를 고정하는 역할을 합니다. 인간 유방 조직에서 파생된 ASC를 사용하여 이것은 다른 창고에서 ASC가 다른 유전자 발현 및 ECM 리모델링21을표시하기 때문에 암세포와 ASC가 갖는 상호 작용이 유방암에서 발생하는 것을 모방할 것을 보장한다.

두 번째 중요한 단계는 HBT의 처리입니다. 조직의 생존력을 유지하기 위해 갓 분리 된 HBT를 사용할 필요가 있습니다. HBT를 처리 할 때 조직을 미세하게 다진 하고 가능한 한 많은 근막을 제거하는 것이 중요합니다. 큰 근막조각이 HBT에 남아 있으면 세포시트가 부력 조직을 제대로 고정하는 것을 방지할 수 있습니다. 또한, 조직에 남겨진 근막은 플레이트로부터 해리될 수 있으며 HBT의 여러 클러스터를 당겨 추가 실험을 위해 잘 사용할 수 없게 만듭니다. HBT는 상단 셀 시트를 추가하기 전에 우물의 중간에 배치되어야하며 그렇지 않으면 ASC가 HBT를 적절히 샌드위치 할 수 없으며 우물 가장자리에있는 조직은 고정되지 않습니다. 이러한 중요한 단계를 따르는 경우 BC-MPS를 생성하는 프로세스가 바로 앞으로 설정됩니다.

여기에 상세히 설명된 모델은 성숙한 반포세포, ECM 및 상주 면역 세포를 유지하는 1 차 HBT의 자연적인 미세 환경에서 BC를 연구하기위한 개선 된 시스템입니다(그림 4). 지방 미세 환경을 모방하는 전임상 모델은 성숙한 지방세포, 면역 세포, 섬유아세포 및 ECM과 같은 마이크로 환경의 여러 요소가 부족합니다. 완전히 성숙한 HBT를 사용하면 파라크리네 및 병스타틴 시그널링22,23,24,25를통해 암 발달, 약물 반응 및 침습성에 영향을 미치는 여러 요소를 포함하는 이러한 복잡한 환경의 동시 및 상호 심문을 허용한다. 상주 섬유아세포 및 ASC는 조직에서 ECM의 리모델링을 통해 및 파라크리온 신호26,27을통해 암 전이에 영향을 미친다. ECM과 리모델링은 전이의 개시에 필수적입니다. 종양 미세 환경의 ECM의 변경은 BC의 이동 및 전이에 영향을 미치지만, 대부분의 BC 연구는 그들의 연구에 네이티브 ECM을 통합하지 않고 대신 콜라겐 I 또는 matrigel28,29로구성된 단순화 된 모델을 사용합니다. BC-MPS의 ECM은 HBT 및 ASC에서 온 것입니다. 따라서, 네이티브 ECM이 유방 조직에서 종양 미세 환경에서 리모델링되고 전이에 영향을 미치는 방식을 연구할 수 있다. 따라서, 이러한 BC-MPS 모델은 이전 모델 시스템이 갖지 못했던 종양 미세환경의 다중 요소를 통합한다.

이 모델은 완전히 성숙한 안도세포와 BC 세포 사이의 대사 상호 토크를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 선포세포와 암세포 사이의 상호 작용을 연구하는 이전 모델은 체외에서 분화되는 사전 지방세포를 사용합니다. 시험관내에서 분화되는 사전 형광구는 생체 내에서 분화된 반포세포(30) 및31로완전히 성숙하지 않는다. 아디포세포가 암 진행및 약물 반응에 어떻게 영향을 미치는지 이해하려면 토착 반포세포의 복잡한 분자 및 화학 적 조성물을 적절히 모방하는 것이 중요합니다. 여기서 우리는 우리의 시스템이 백혈구와 BC 세포 사이에서 발생하는 신진 대사 크로스토크를 평가할 수 있음을 입증했습니다(도 4).

BC-MPS는 또한 표준 세포주를 사용하여 제대로 모델링될 수 없는 비만과 같은 조건이 암의 진행에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 시험관 내 연구를 수행하는 데 사용될 수 있습니다. 비만은 정확한 기계장치가 완전히 이해되지 않더라도 HBT의 미세 환경의 변경 및 BC에 있는 전이의 증가와 연관됩니다32,33,34. 섬유아세포, ASC, 선포세포 및 ECM은 비만 중에 변경되고암 25,35,36의진행 및 전이를 더욱 촉진한다. 따라서, 기질 세포와 ECM에 있는 이 변경이 BC에 어떻게 영향을 미치는지 이해하기 위하여 뚱뚱한 조직에서 네이티브 기질 세포 및 ECM을 사용하는 것이 중요합니다. BC-MPS 모델에서 비만 또는 린 환자로부터 HBT 및 ASC를 활용함으로써 비만이 전이성 표현형을 촉진하는 메커니즘을 해명할 수 있다.

여기에 제시된 방법은 ASC, 성숙한 선포세포 및 네이티브 ECM을 포함하는 배양에서 유방암 세포를 배양하기 위한 것입니다. 공동 배양 시스템의 이전 모델은 기질 환경의 이러한 개별 적인 다른 요소가 암에 어떻게 영향을 미치는지 연구했습니다. ASC와 지방세포가 모두 BC 진행에 영향을 미치면 BC 진행에 영향을 미치는 세포 유형이 BC에 영향을 미치는지 결정하는 것이 복잡할 수 있습니다. 그러나, 이는 BC-MPS를 하나의 세포 유형으로 보다 간단한 공동 배양 모델과 비교하여 결정될 수 있다. 이 시스템의 장점 중 하나는 온-칩 또는 바이오 프린팅 시스템과 비교하여 시판되는 pNIPAAm 코팅 플레이트 를 넘어 시스템을 설정하는 특별한 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 유방 조직의 모형 시스템은 이전에문화22에서분화되는 비계로 ASC를 예금하기 위하여 bioprinting를 사용하여 기술되었습니다. 이것은 세포가 분화하기 위하여 추가 2-3 주를 요구하고 문화에서 분화된 ASC는 성숙한 교피를 완전히 분화하지 않습니다. BC-MPS의 HBT의 성숙한 지방세포는 환자에서 제거되는 순간을 사용할 준비가 되어 있습니다.

여기서 설명된 모델 시스템은 암세포와 미세환경 간의 교차토크를 연구하기 위한 유용한 시스템이지만, 몇 가지 한계가 있다. 주요 제한 중 하나는 1 차적인 인간 유방 조직의 가용성입니다. 인간 지방 조직은 생존력의 손실 없이 냉동 보존될 수 없고 따라서 BC-MPS를 만들기 위하여 이용된 조직은 신선하게 얻어지고37를이용될 필요가 있습니다. 또 다른 제한 사항은 여기에 제시된 모델이 일반 6 웰 플레이트에서 배양되는 정적 시스템이라는 것입니다. 이 시스템은 산소와 영양 가용성, 순수한 스트레스 및 약물분포(38,39)에영향을 미칠 수 있는 장기-온-어칩에 존재하는 미세유체 흐름이 부족하다. 세 번째 제한은 상이한 세포 유형을 개별적으로 분석해야 하는 경우 실험이 끝날 때 서로 분리되어야 하는 세포에 대한 필요성이다. 이렇게 하려면 서로 분리될 수 있도록 셀에 레이블을 지정해야 합니다.

종양 미세 환경의 많은 요소의 통합은 암 진행 및 전이의 개시를 연구하는 생리적 모델을 생성합니다. BC-MPS는 더 생리적인 모형에서 암세포를 공부할 수 있을 뿐만 아니라, 마이크로 환경의 개별 적인 요소를 연구하고 어떻게 암에 의해 영향을 받는지 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 여기에 표시된 데이터는 BC-MPS가 하나의 세포주와 함께 어떻게 사용될 수 있는지를 보여 주지만 BC-MPS는 연구원의 특정 실험적 필요에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다. 예를 들면, 뚱뚱한 HBT는 비만이 암 전이 및 진행에 어떻게 영향을 미치는지 결정하기 위하여 마른 HBT에 비교될 수 있습니다. BC의 다른 특수형은 암의 특수형이 마이크로 환경과 어떻게 다르게 상호 작용하는지 연구하기 위해 BC-MPS로 종자 할 수 있습니다. 유전자 편집 기술은 특정 유전자가 BC와 마이크로 환경 사이의 상호 작용에 미치는 영향을 결정하기 위해 사용될 수 있습니다. 이 모형 및 그것의 응용은 기질 환경 및 유방암이 암 진행및 전이를 승진시키기 위하여 상호 작용하는 방법의 더 정확한 이해를 허용할 것입니다.

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Disclosures

저자는 그들이 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

툴레인 플로우 세포측정및 셀 정렬 코어뿐만 아니라 툴레인 히스토로지 코어에 기술 지원을 감사드립니다. 이 작품은 성형 및 재건 외과 의사의 남동부 사회에 의해 지원되었다 2019 연구 보조금과 국립 과학 재단 (EPSCoR 트랙 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링
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Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).More

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).

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