Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Modellering av brystkreft i humant brystvev ved hjelp av et mikrofysiologisk system

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver byggingen av et in vitro mikrofysiologisk system for å studere brystkreft ved hjelp av primært humant brystvev med hyllematerialer.

Abstract

Brystkreft (BC) er fortsatt en ledende dødsårsak for kvinner. Til tross for mer enn $ 700 millioner investert i BC-forskning årlig, mislykkes 97% av kandidaten BC-legemidler kliniske studier. Derfor er det nødvendig med nye modeller for å forbedre vår forståelse av sykdommen. NIH Microphysiological Systems (MPS)-programmet ble utviklet for å forbedre den kliniske oversettelsen av grunnleggende vitenskapsfunn og lovende nye terapeutiske strategier. Her presenterer vi en metode for å generere MPS for brystkreft (BC-MPS). Denne modellen tilpasser en tidligere beskrevet tilnærming til å dyrke primært humant hvitt fettvev (WAT) ved å smøre WAT mellom fettavledede stamceller (ASC) s. Nye aspekter ved bc-MPS inkluderer såing BC celler i ikke-syke menneskelige brystvev (HBT) som inneholder innfødt ekstracellulær matrise, modne adipocytter, bosatte fibroblaster og immunceller; og smøring av BC-HBT-blandingen mellom HBT-avledede ASC-ark. Den resulterende BC-MPS er stabil i kultur ex vivo i minst 14 dager. Dette modellsystemet inneholder flere elementer i mikromiljøet som påvirker BC, inkludert adipocytter, stromale celler, immunceller og den ekstracellulære matrisen. Dermed kan BC-MPS brukes til å studere interaksjonene mellom BC og dets mikromiljø.

Vi demonstrerer fordelene ved vår BC-MPS ved å studere to BC-atferd som er kjent for å påvirke kreftprogresjon og metastase: 1) BC motilitet og 2) BC-HBT metabolsk krysstale. Mens BC-motilitet tidligere har blitt demonstrert ved hjelp av intravital avbildning, tillater BC-MPS høyoppløselig tidsforløpavbildning ved hjelp av fluorescensmikroskopi over flere dager. Videre, mens metabolsk krysstale tidligere ble demonstrert ved hjelp av BC-celler og murine pre-adipocytter differensiert til umodne adipocytter, er vår BC-MPS-modell det første systemet som demonstrerer denne krysstale mellom primære menneskelige pattedyr adipocytter og BC celler in vitro.

Introduction

Hvert år dør mer enn 40 000 amerikanske kvinner av brystkreft (BC)1. Til tross for mer enn $ 700 millioner investert i BC forskning årlig, 97% av kandidaten BC narkotika mislykkes kliniske studier2,3. Nye modeller er nødvendig for å forbedre rørledningen for narkotikautvikling og vår forståelse av BC. NIH Microphysiological (MPS) Program avgrenset funksjonene som kreves for banebrytende modeller for å forbedre oversettelsen av grunnleggende vitenskap til klinisk suksess4. Disse inkluderte bruk av primære menneskelige celler eller vev, stabil i kultur i 4 uker, og inkludering av innfødt vevsarkitektur og fysiologisk respons.

Nåværende in vitro BC-modeller, for eksempel todimensjonal kultur av BC-cellelinjer, membraninnsatskokultur og tredimensjonale sfæroider og organoider, oppfyller ikke NIHs MPS-kriterier fordi ingen av disse rekapitulerer innfødt brystvevsarkitektur. Når ekstracellulær matrise (ECM) legges til disse systemene, brukes ikke bryst ECM; I stedet brukes kollagengeler og kjellermembranmatriser.

Nåværende in vivo-systemer, som pasientavledede xenografter (PDX), oppfyller på samme måte ikke NIHs MPS-kriterier fordi murinpattedyrvev i stor grad skiller seg fra menneskelige bryster. Videre er immunsystem-BC interaksjoner i økende grad anerkjent som nøkkelen i tumorutvikling, men de immunkompromitterte murinmodellene som brukes til å generere PDX-svulster, mangler modne T-celler, B-celler og naturlige morderceller. Videre, mens PDX tillater at primære brystsvulster opprettholdes og utvides, blir de resulterende PDX-svulstene infiltrert med primære murinstromale celler og ECM5.

For å overvinne disse utfordringene har vi utviklet en roman, ex vivo, tredimensjonal human breast MPS som oppfyller NIH MPS-kriteriene. Grunnlaget for vårt bryst MPS er laget ved å smøre primært humant brystvev (HBT) mellom to ark med fettavledede stamceller (ASC), også isolert fra HBT (Figur 1). Stempel for overføring av cellearkene til sandwich HBT kan skrives ut eller lages av enkel akrylplast (Figur 1H,I). Denne teknikken tilpasser vår tidligere beskrevne tilnærming for å dyrke primært humant hvitt adipocyttvev6,7. Brystet MPS kan deretter bli sådd av en BC modell av valg, alt fra standard BC cellelinjer til primære menneskelige bryst svulster. Her viser vi at disse BC-MPS er stabile i kultur i flere uker (Figur 2); inkluderer innfødte elementer av HBT som pattedyr adipocytter, ECM, endotel, immunceller (Figur 3); og rekapitulere de fysiologiske interaksjonene mellom BC og HBT, for eksempel metabolsk krysstale (figur 4). Til slutt viser vi at BC-MPS tillater studiet av amoeboid bevegelse av BC-celler gjennom HBT (Figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle humant vev ble samlet inn i samsvar med protokoll #9189 som godkjent av Institutional Review Board Office of LSUHSC.

1. Såing av fettavledede stamceller (ASC) for celleark

  1. Kjøp ASCer fra kommersielle kilder eller isoler fra primær menneskelig brystvev ved å følge etablerte protokoller8,9. Frø menneskelig bryst ASCs på 70% tetthet (~ 80,000 celler / cm2 overflateareal) på 6-brønns standard vev kultur plater i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% foster bovine serum, og 1% Penicillin / Streptomycin (BC-MPS Media). Påse at ASC-ene som skal brukes til å danne cellearkene, skal være mindre enn passering 10.
    1. For hver brønn av brystkreft mikrofysiologisk system (BC-MPS) som vil bli generert, frøceller i 1 standard vev kultur godt og 1 brønn av lignende størrelse på poly (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm)-belagt vev kultur plastplate. En 6-brønns plate av BC-MPS vil kreve en standard vevskultur 6 brønnplate (bunn) og en pNIPAAm-belagt plate (topp). pNIPAAm-platene kan kjøpes fra kommersielle kilder eller kan belegges i laboratoriet10,11,12.
  2. Kultur ASCs i en vev kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Bytt media hver 2-3 dager i et biosikkerhetsskap.
  3. Kultur ASCene til de blir 100% sammenfallende og danner et strikket mønster. Avhengig av samløpet der de ble frøet, vil dette ta 7-10 dager. Konfluente celleplater er nødvendig for å forankre det oppdrifts fettet brystvev.

2. Forberedelse av forsyninger som trengs for BC-MPS

  1. For å forberede gelatin til 6-brønns plater lage en 12% gelatinoppløsning i destillert H2O. Bland 19 g gelatin type B (gelstyrke på ~ 225 Bloom) og 125 ml H2O i en 250 ml glassmedieflaske. Tilsett 1,6 ml 1 M NaOH til løsningen for å nøytralisere pH.
  2. Autoklaver oppløsningen under en væskesyklus i 25 min for å sterilisere løsningen.
  3. La oppløsningen avkjøles til 37 °C. I et sterilt biosikkerhetsskap tilsettes 16 ml steril 10x Hanks balansert saltoppløsning (HBSS) til løsningen for å oppnå et sluttvolum på 160 ml.
    MERK: Gelatinoppløsningen kan brukes med en gang eller oppbevares ved romtemperatur for senere bruk. Den tilberedte gelatin er stabil ved romtemperatur i 1 måned. Hvis bare noen få stempel vil være nødvendig, kan en 10 ml løsning gjøres og steril filtreres på samme dag som bc-MPS som tidligere beskrevet7.
    1. For å forberede gelatinoppløsning ved filtersterilisering, fortynn 1 ml 10x HBSS med 9 ml H2O for å lage en 1x HBSS-løsning i et 15 ml konisk rør. Tilsett 100 μL 1 M NaOH i hvert 10 ml rør og tilsett deretter 0,7 g gelatin til løsningen. Bland løsningen kraftig for å oppløse gelatin.
    2. Inkuber røret i et 75 °C vannbad i 20 minutter og rist hvert 5. Bruk en 10 ml sprøyte og et 0,22 μm sprøytefilter for å filtrere gelatinoppløsningen. Filtrer gelatinoppløsningen direkte på stempelet i et biosikkerhetsskap.
  4. 3D-utskrift eller bruk enkel akryl for å lage stempelet som brukes til å overføre cellearkene. Pass på at stempelet sitter løst i ønsket brønnstørrelse. Et standard 3D-utskrevet stempel vises i figur 1. Stempelet kan utformes ved hjelp av standard programvare for datamaskinassistert design, for eksempel TinkerCad, og skrives ut ved hjelp av filament 3D-skrivere som er kompatible med polylaktisk syre (PLA)13,14.
  5. For å klargjøre et stativ for å holde stempelet, plasser et 15 ml rørstativ i et biosikkerhetsskap. Plasser stempelet opp ned i stativet, slik at bunnen av stempelet vender opp. Plasser en plastboks med lokk for transport av BC-MPS i biosikkerhetsskapet. Det anbefales at boksen har en lengde på minst 35,5 cm x 28 cm bredde x 8,25 cm høyde for å passe til 4 plater BC-MPS. Fjern lokket fra esken og spray ned stativet, stempelet og esken med 70% EtOH.
  6. Forbered sterile barberblader og tang ved autoklavering eller ved å plassere dem i et biosikkerhetsskap og vask med 70% EtOH.
  7. Spray stempelet og boksen med 70% EtOH og slå på UV-lyset i biosikkerhetsskapet i minst 30 minutter for å sterilisere forsyningene.

3. Forbered gelatinstemperinger og påfør på de øvre celleplatene

  1. Hvis gelatinoppløsningen tidligere ble tilberedt, varme den i et 37 ° C vannbad for å smelte det.
  2. Pipette gelatinoppløsningen på stempelet i biosikkerhetsskapet ved hjelp av en 5- eller 10 ml serologisk pipette. Et stempel for 1 brønn av en 6-brønns plate vil kreve ~ 2,5 ml gelatin.
  3. Når gelatinet har størknet på stempelet (~ 30-45 min) flytt pNIPAAm-belagte ASC-plater til biosikkerhetsskapet. Plasser stempelet forsiktig i brønnene på de pNIPAAm-belagte ASC-platene slik at gelatinet kommer i kontakt med ASC-ene. Plasser en metallskive (~ 7,5 g) på stempelet for å veie ned stempelet slik at gelatin er i direkte kontakt med ASC-cellearket. La stempelet stå på ASC-celleplatene ved romtemperatur i 30 min.
  4. Beveg platen forsiktig med stempelet inn i den sterile boksen i biosikkerhetsskapet og legg lokket på den. Flytt esken til et kjøleskap på 4 °C i 30 minutter. Hvis et kjøleskap på 4 °C ikke er tilgjengelig, plasser platen på isen i en isbøtte i biosikkerhetsskapet i 30 minutter.

4. Utarbeidelse av kreftcellelinjer

  1. Frø kreftcellelinjene i en standard T75 vevskulturrett og hold dem i kultur slik at de er ~ 80% sammenfallende den dagen BC-MPS vil bli behandlet. (~200 000 kreftceller vil være nødvendig i henhold til BC-MPS). Vokse kreftcellene i normale medier.
    MERK: For å identifisere og isolere kreftcellene anbefales det at cellene transfektes med et fluorescerende protein for å skille dem fra ASC og brystvev. Antall kreftceller som trengs per BC-MPS er optimalisert for MCF7- og MDA-MB-231-celler. Andre cellelinjer kan kreve ytterligere optimalisering.
  2. Den dagen BC-MPS forberedes, flytt kolben som inneholder kreftcellene til biosikkerhetsskapet. Aspirer media fra kolben. Vask kolben med 5 ml PBS.
  3. Tilsett 1 ml celleavløsningsløsning i kolben som inneholder kreftcellene, og inkuber deretter kolben i en 37 °C inkubator til cellene har løsnet (~2-5 min).
  4. I biosikkerhetsskapet legger du til 9 ml PBS i kolben, overfører cellene i PBS til et 15 ml konisk rør og teller cellenummeret ved hjelp av et hemocytometer.
  5. Sentrifuger kreftcellene ved 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  6. Resuspend cellene i BC-MPS media slik at det er 2 x 106 celler / ml.
  7. Plasser kreftcellene i et 37 °C vannbad til de er klare til å legges til det menneskelige vevet.

5. Behandling av humant brystvev

  1. I et biosikkerhetsskap vaskes det menneskelige brystvevet (HBT) 3x med 10 ml steril PBS.
  2. Bruk sterile tang og et barberblad for grovt å hakke BC-MPS og prøve å fjerne så mye fascia og bindevev som mulig. Hvis du ikke fjerner bindevevet, kan det føre til at ASC øvre lag ikke forankrer HBT på riktig måte.
    MERK: Fascia og bindevev kan identifiseres med sitt hvite eller klare utseende sammenlignet med den gule fargen på fettvevet.
  3. Når bindevevet er fjernet, bruk et sterilt barberblad for å fint hakke vevet til det har en homogen væskekonsistens. Vevet er fint hakket når det lett kan pipettes ved hjelp av en 25 ml serologisk spiss.
  4. Bruk et sterilt barberblad til å kutte spissen av en p1000 pipettespiss for å hjelpe til med å pipettere hakket HBT.
  5. I en 1,5 ml rørblanding blander hakket HBT, kreftcellelinjer og BC-MPS-medier (for 1 brønn av en 6 brønnplate krever dette 200 μL hakket HBT, 100 μL BC-MPS-medier og 100 μL kreftceller).
  6. Flytt ASC-platen som skal brukes til bunncellearket fra inkubatoren til biosikkerhetsskapet. Aspirer mediet fra den nederste ASC-platen. Pipette blandingen på midten av brønnen på den nederste ASC-platen ved hjelp av en p1000 pipettespiss som fikk den distale enden avskåret fra trinn 5.4
  7. Flytt esken som inneholder den øvre ASC-platen med stempelet på til biosikkerhetsskapet. Fjern gelatinstempelet forsiktig fra den pNIPAAmbelagte platen og legg dem på toppen av HBT-blandingen. Legg BC-MPS-medier til brønnen (for 1 brønn av en 6-brønns plate tilsett 2 ml medier). Beveg forsiktig de nederste ASC-platene med BC-MPS-blandingen og stempelet til den sterile plastboksen og sett lokket på esken for transport.
    MERK: 6-brønnsplatelokket passer ikke tilbake på ASC-platen mens stempelet er på. Det må utvises forsiktighet for å unngå å forurense kulturen.
  8. Inkuber bunnplaten i esken i en inkubator ved 37 ° C til gelatin har smeltet, og det øverste ASC-laget har begynt å holde seg til bunnlaget (~ 30 min).
  9. Flytt esken med platene til biosikkerhetsskapet. Fjern stempelet forsiktig fra bunnplatene. Vevet med kreftcellene vil bli forankret til bunnen av brønnen.
  10. Sett lokket på 6-brønnsplaten tilbake på bunnplaten og inkuber ved 37 °C for å smelte gelatinet helt og la det øverste laget forankres helt til bunnlaget (~30-60 min).
  11. Flytt platene forsiktig til et biosikkerhetsskap og aspirer mediet med en 10 ml serologisk pipette. Tilsett 2 ml ferske medier til hver brønn. Aspirer fra kanten av brønnen og pipetten på kanten av brønnen for å unngå å løsne vevet.
  12. Vedlikehold BC-MPS ved 37 °C og 5 % CO2 i ønsket tidsperiode og bytt medium hver 2-3.

6. Fordøyelse av BC-MPS for analyse

  1. Når BC-MPS er klar til å analyseres, flytt platen til biosikkerhetsskapet. Fjern medier med en serologisk pipette for å unngå utilsiktet løsnelse av noe vev.
  2. Tilsett 1 volum PBS i hver brønn.
  3. Fjern PBS med en serologisk pipette.
  4. Tilsett 1 ml celledisassosiasjonsløsning i hver brønn. Flytt platen tilbake til inkubatoren og inkuber ved 37 °C i 5 minutter for å la cellene løsne. I et biosikkerhetsskap, bruk en celleskraper for å løsne cellene og vevet helt fra kulturplaten.
  5. Overfør løsningen med vevet til et 15 ml konisk rør ved hjelp av en serologisk pipette. Tilsett 2 ml PBS i hver brønn for å samle eventuelle gjenværende celler og overfør denne løsningen til det koniske røret. Hvis cellene er fluorescerende, pakk røret i aluminiumsfolie for å beskytte det mot lys.
  6. Inkuber røret ved 37 °C under konstant agitasjon i en orbital shaker ved 1 x g i 10-20 min for å fullstendig fjerne celler fra vevet.
  7. I et biosikkerhetsskap bruker du en serologisk pipette for å forstyrre eventuelle gjenværende klumper av celler i røret og filtrere prøven gjennom en 250 μm vevsil i et nytt 15 ml rør. Pipette løsningen sakte gjennom silen slik at den ikke overløper.
  8. Skyll silen med 1 ml PBS for å samle celler som fortsatt er i silen.
  9. Sentrifuger prøvene ved 500 x g ved romtemperatur i 5 min. Etter sentrifugering vil adipocyttene flyte på det øverste laget av løsningen, mens kreftcellene og ASC-ene blandes sammen i en pellets nederst på røret.
  10. For å isolere adipocyttene helles forsiktig topplaget i et nytt rør eller alternativt kutte spissen av en p1000 pipettespiss og overføre topplaget til et nytt rør. Sentrifuger prøven på 500 x g i 5 min igjen og bruk en sprøyte og nål for å fjerne oppløsningen fra under adipocyttene slik at bare adipocyttene er igjen. Apokacyttene er nå klare for analyse
  11. Etter å ha fjernet adipocyttene fra løsningen, separer ASC-ene og kreftcellene fra hverandre for analyse hvis kreftcellene tidligere ble transfektert med et fluorescerende protein. Aspirer den gjenværende løsningen fra røret som inneholder ASC-ene og kreftcellene uten å forstyrre cellepelleten. Resuspend pellet i PBS eller BC-MPS media og bruke strømning cytometri til å sortere cellene basert på fluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stabilitet i kultur
BC-MPS er et stabilt mikrofysiologisk system som kan dyrkes in vitro i opptil minst 14 dager. Et lysfeltbilde av ASC-cellearkene ble tatt ved 100x forstørrelse for å vise det strikkede mønsteret til det sammenfallende arket (figur 2A). ASC-cellearkene er stabile i kultur i minst 4 uker. BC-MPS på 14 dager i kultur i en brønn av en 6 brønnplate ble avbildet med et fargekamera som viser at den oppdriftsformede HBT fortsatt er stabilt forankret av ASC-cellearkene til bunnen av brønnen etter 14 dager (Figur 2B). Dette viser at cellearket som brukes til å smøre fettvevet fortsatt er intakt. Den trippelnegative BC-cellelinjen MDA-MB-231 som uttrykte RFP, ble dyrket i HBT i 14 dager og deretter avbildet med et fluorescerende mikroskop som demonstrerer stabiliteten til BC-MPS med cellelinjer ut til minst 14 dager (figur 2C). Tilstedeværelsen av BC-cellene i vevet demonstrerer kreftcellens evne til å invadere HBT. En trippel negativ PDX-utvisning ble utskilt fra en mus, farget med Cell Tracker CMTPX og dyrket med HBT. Fluorescerende mikroskopibilder ble tatt på dag 6 for å vise stabiliteten til BC-MPS med tumorekster i minst 6 dager (figur 2D). Dette viser at BC-MPS kan brukes til å dyrke tumorutløp med HBT så vel som cellelinjer.

Opprinnelige HBT-elementer
BC-MPS inneholder de opprinnelige elementene i HBT i kulturen. BC-MPS som inneholder 100 mg HBT ble dyrket in vitro i 14 dager. Vevet ble avbildet ved hjelp av brightfield mikroskopi etter 14 dager i kultur (Figur 3A). Dette bildet demonstrerer bevaring av klynger av modne adipocytter på 14 dager i kulturen. Vevet ble deretter festet med 10% formalin, parafin innebygd, seksjonert på 5 μm ved hjelp av en mikrotom og deretter farget med Movats pentachrome flekk ved hjelp av en standardprotokoll. De faste delene ble avbildet ved 100x (figur 3B) eller 20x (figur 3C). Bildene viser at BC-MPS inneholder det opprinnelige kollagenet (lilla), retikulære fibre (blå), og de adipocytter store unilocular form i mellom bindevevet er bevart på 14 dager i kulturen. For å identifisere primære makrofager i systemet ble HBT dyrket i 0, 3 og 7 dager og deretter festet og farget med anti-CD45, anti-CD68 og anti-CD206. CD45 ble brukt som en generell leukocyttidentifikator. CD68 ble brukt som en monocyttflekk for å identifisere makrofager mens CD206 identifiserer en vanlig reseptor tilstede på makrofager. Fargingen av makrofagmarkørene ble kvantifisert ved hjelp av en bildebehandlingsprogramvare (Figur 3D). Dette viser bevaring av primære makrofager etter 3 og 7 dager i kultur. Disse dataene viser at BC-MPS bevarer de opprinnelige elementene i HBT i kulturen. Ytterligere eksperimenter kan utføres for å studere hvordan BC-cellene ombygger de innfødte elementene i HBT. Dette kan omfatte å vurdere endringer i makrofagindikatorer for å finne ut om de endres ved tilstedeværelsen av BC-celler. Endringer i ECM kan analyseres ytterligere ved å sammenligne Movats pentachrome farging av prøver som ble dyrket med eller uten BC-celler for å avgjøre om kollageninnhold endres og størrelsen på adipocyttene kan sammenlignes ved hjelp av bildeanalyseprogramvare som bilde J for å avgjøre om BC-celler endrer adipocyttstørrelse.

Metabolsk krysstale
Adipocytkreft metabolsk krysstale er en viktig vei der tumormikromiljøet påvirker BC-progresjonen. BC-celler som akkumulerer intracellulære lipider viser økt legemiddelresistens og en mer invasiv fenotype15. Mens BC-celler har vist seg å indusere lipolyse i umodne, murin-adipocytter, har den fysiologiske relevansen av dette forblitt uklart fordi metabolsk krysstale mellom BC og primære humane pattedyr adipocytter aldri har blitt vist. For å demonstrere at BC-MPS kan modellere denne adipocytt-BC metabolske krysstale RFP-merket MDA-MB-231 celler ble dyrket alene eller i BC-MPS i 14 dager. Cellene ble enzymatisk fordøyd i encellet suspensjon, farget med det nøytrale lipidfargen Bodipy, og analysert ved strømningscytometri (Figur 4A, B)16. Andelen lipidpositive MDA-MB-231 celler var 26,2 ganger SEM +/- 2,5 større i BC-MPS vs. 2D-kultur (figur 4C). Denne økningen i lipidfarging viser at kreftcellene samhandler med adipocyttene og tar opp lipider frigjort fra de modne adipocyttene. Cellesortering ble utført for å velge for RFP+ Bodipy+-celler. Etter sortering ble cellene belagt på kollagen I belagt glassdeksler og fikk lov til å feste over natten. Neste dag ble cellene festet i 4% paraformaldehyd i 30 min og deretter avbildet på et fluorescerende mikroskop ved 100x forstørrelse. Celler som ble dyrket i BC-MP (figur 4E) viste økte lipiddråper sammenlignet med celler som var dyrket i standard 2D-kultur (figur 4D). Dette demonstrerer metabolsk krysstale mellom BC-cellene og HBT og viser også hvordan lipidakkumulering kan analyseres ved strømningscytometri eller ved fluorescerende mikroskopi. Videre analyse av lipidakkumulering i kreftceller kan gjøres ved å kvantifisere størrelsen på lipiddråper og antall lipiddråper per celle.

Amoeboid bevegelse
Metabolsk kryssprat mellom BC-celler og adipocytter øker kreftens invasive evne. For å vurdere den økte invasive evnen til kreftcellene som ble dyrket med HBT, ble migrasjonen av BC-celler gjennom HBT vurdert ved fluorescensmikroskopi. Den metastatiske TNBC-cellelinjen MDA-MB-231 som uttrykte RPF ble dyrket i BC-MPS i 4 dager for å tillate systemet å stabilisere seg. Tidsforløp fluorescensmikroskopi ble utført etter 4 dager for å avbilde MDA-MB-231-motiliteten med ett bilde tatt hver 20 min i 19 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Den resulterende videoen viste amoeboid bevegelsesmønstre og en overraskende høy grad av motilitet for MDA-MB-231-cellene (Figur 5 og Video 1). Dette viser en økning i BC-cellenes invasive evne og BC-cellenes evne til å invadere HBT. Overføringen av BC-cellene i HBT kan analyseres ytterligere ved hjelp av tidligere publiserte metoder for å kvantifisere hastigheten og direksjonaliteten til migrerende celler17,18. MDA-MB-231-cellene ble også observert å se ut til å gjennomgå mitose. Disse atferdene er i samsvar med sin aggressive fenotype, er viktige atferd for kreftprogresjon og metastase, og fremhever nye BC-atferd som kan være rettet mot BC-terapier.

Figure 1
Figur 1: Generell arbeidsflyt for BC-MPS-oppsett. (A) Gelatin størknes i et oppreist stempel. (B) Stempelet med gelatin plasseres på det termoresponsive øvre ASC-cellearket. (C) En vekt brukes til å tvinge gelatin til å opprettholde kontakt med cellearket mens cellene inkuberer ved romtemperatur i 30 minutter etterfulgt av inkubasjon ved 4 °C i 30 min. (D) Stempelet fjernes fra kjølefatet og fjerner det intakte cellearket med det. (E) Stempelet med det øvre cellearket overføres til en tallerken som inneholder det nederste cellearket og de hakkede HBT- og BC-cellene. (F) Den nederste cellefatet med media, stempel, HBT, BC og begge celleplatene inkuberes ved 37 °C i 30-60 minutter slik at gelatinet smelter og celleplatene kommer fra kontakter. (G) Fjerning av stempelet etterlater HBT og BC smurt mellom to ASC-celleark. Et 3D-trykt stempel ble designet ved hjelp av den gratis online programvaren TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) og trykt på en 3D-skriver. Stempelet består av polylaktisk syre. (H) Dimensjonene på et stempel for 1 brønn på en 6-brønns plate er indikert. Stempelets utsparing er 2,5 mm. (I) Et bilde av det faktiske 3D-trykte stempelet vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativ stabilitet for BC-MPS i kultur. (A) Et brightfield-bilde ved 100x forstørrelse av de sammenfallende ASCene som demonstrerer det strikkede mønsteret til konfluentecellene. Skalastang = 100 μm. (B) BC-MPS, som inneholder 100 mg HBT, ble dyrket i en 6 brønnplate. Etter 14 dager ble det tatt et fargefotografi for å demonstrere at HBT er forankret til bunnen av brønnen på en 6 brønnplate. (C) Den trippelnegative BC-cellelinjen MDA-MB-231 som uttrykker RFP, ble dyrket med HBT i 14 dager og deretter avbildet ved hjelp av fluorescerende mikroskopi ved 40x forstørrelse. Bildene viser at MDA-MB-231-cellene fortsatt var levedyktige og vokste i HBT. Skala bar = 200 μm D) PDX Tumorer av trippel negativ brystkreft fra mus ble hakket i 3 cm2 stykker og merket med Cell Tracker Red CMPTX. Brikkene ble dyrket i HBT og den resulterende BC-MPS ble avbildet ved hjelp av et fluorescerende mikroskop ved 40x forstørrelse på dag 6 som demonstrerer stabiliteten i kulturen. Skalastang = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativ bevaring av innfødte elementer av HBT til stede i BC-MPS. BC-MPS ble dyrket i 14 dager og deretter enten avbildet med lysfeltmikroskopi ved 40x (A) og deretter festet med 10% formalin og farget med Movats pentachrome flekk. Bilder ble tatt ved 100x (B) eller 20x (C). Avbildning av HBT indikerer bevaring av store uniloculor adipocytter gruppert sammen og vev skiver indikerer tilstedeværelsen av bevaring av den innfødte ECM som kollagen (gul) og retikulære fibre mellom adipocytter (blå). For å demonstrere bevaring av makrofager i modellen hbt ble dyrket i 0, 3 eller 7 dager, farget for makrofag markører, og avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi (D). Den fluorescerende intensiteten av fargingen av makrofagmarkørene ble kvantifisert ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare som viser at makrofager fortsatt er til stede i vevet etter 3 og 7 dager i kulturen. Skalastang = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representativ metabolsk krysstale mellom adipocytter og kreftceller i BC-MPS. RFP-merkede MDA-MB-231 celler ble dyrket i BC-MPS vs. 2D i 14 dager, deretter farget med Bodipy (250 nM) og analysert ved strømningcytometri. (A) Flyt av Bodipy-farget MDA-MB-231 celler etter 14 dager i 2D-kultur. Celler i B2 var Bodipy+RFP+; cellene i B1 var Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3,26 %, noe som indikerer minimal lipidakkumulering. (B) Strømningscytometrianalyse av Bodipy-farget MDA-MB-231 celler etter 14 dager i BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85,35 %, noe som indikerer omfattende lipidakkumulering. (C) Lipid akkumulering i MDA-MB- 231 celler etter 14 dager i 2D-kultur vs. BC-MPS. Fluorescerende mikroskopianalyse av Bodipy farging av MDA-MB-231 dyrket i 2D (D) vs BC-MPS (E) viser økt lipidakkumulering i celler dyrket i BC-MPS. Feilfelt angitt SEM. ** p < 0,01, n = 2 biologiske replikeringer, Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representativ migrering av TNBC i BC-MPS. RFP-merkede MDA-MB-231-celler ble dyrket i BC-MPS i 4 dager, og deretter ble sekvensielle tidsforløpbilder av RFP-merkede BC-MPS + MDA-MB-231-celler tatt ved hjelp av et fluorescensmikroskop (en ramme per 60 min, 100x forstørrelse.) Gule stjerner = mititotisk hendelse. Gul boks = cellulært rusk som brukes til posisjonsreferanse. Blå piler = 231 celler som viser amoeboid bevegelse med pseudopoder og høy bevegelighet. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Representativ migrering av TNBC i BC-MPS. BC-MPS som inneholder RFP-merkede MDA-MB-231 celler ble dyrket i 4 dager og fluorescerende mikroskopi ble brukt til å avbilde cellene hver 20 min ved 19 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Bildene ble kompilert til en video (Ett bilde per 60 minutter, 100x forstørrelse). Klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nye systemer for modellering av human brystkreft er nødvendig for å utvikle en bedre forståelse av sykdommen. Utvikling av menneskelige mikrofysiologiske systemer for å modellere sykdomsinnstillinger som inkluderer innfødte ECM- og stromale celler, vil øke den prediktive kraften i prekliniske studier. BC-MPS-modellen som presenteres her, er et nyutviklet system som overvinner begrensningene til tidligere modeller som gjør det mulig å evaluere BC i sitt opprinnelige HBT-miljø. Dette systemet kan brukes med kreftcellelinjer eller med tumorutløp og er stabilt i minst 14 dager. Fluorescerende merking av BC-cellene gjør det mulig å overvåke deres sanntidsvisualisering av kreftcellemotilitet og cellecelleinteraksjoner, migrasjon, levedyktighet eller spredning enten i sanntid eller på bestemte tidspunkter (Figur 3 og figur 5). Dette modellsystemet kan brukes til å belyse viktige aspekter ved kreftbiologi når det gjelder samspillet mellom kreftceller og deres mikromiljø. Avhør av dette systemet kan informere om TME-regulering av kreftprogresjon, legemiddelrespons og initiering av metastase.

Det er noen viktige trinn som må følges for å kunne konfigurere systemet. Det første kritiske trinnet er dyrking og overføring av ASC-cellearkene. De pNIPAAm-belagte platene er temperaturfølsomme. Når platene er over 32 °C er overflaten hydrofob, og ASC-ene vil holde seg til overflaten. Overflaten blir hydrofil under denne temperaturen, og cellene begynner å løsne19. Dermed er det nødvendig å bestemme hvor raskt en gitt celletype vil begynne å løsne fra disse overflatene. For HBT-avledede ASCer vil dette ta > 30 min hvis cellene er sammenløpte. For å forhindre at cellene løsner under normalt vedlikehold, bør mediet forvarmes til 37 °C, og vevskulturplatene bør ikke oppbevares ved romtemperatur for lenge for å hindre at platene avkjøles og cellene løsner. Det er også viktig å bestemme den optimale tiden for gelatinstempelet å være på pNIPAAm-belagte plater for å overføre hele cellearket. ASC-ene må være flytende, og hele arket må overføres. Hvis det øverste cellearket ikke har tid til å løsne helt og binde seg til gelatinet, blir cellearket ødelagt under overføringen. Hvis hele cellearket ikke er fullstendig overført, vil ASC-ene ikke kunne smøre det oppdriftsbrystvevet.

ASC-ene som brukes til å smøre HBT er normale stromale celler i brystmikromiljøet som skiller ut ECM, vekstfaktorer og cytokiner som påvirker BC20. For å smøre HBT mellom to celleark overføres ASC-arkene ved hjelp av termoresponsive vevskulturplater. Dette gjør det mulig for de innfødte ECM utskilt av ASC-ene å være intakte og tjener til å forankre oppdriftsapokacyttene i vev. Ved å bruke ASCs avledet fra humant brystvev sikrer dette at interaksjonene som ASC-ene har med kreftcellene vil etterligne det som skjer i brystkreft som ASCer fra forskjellige depoter viser forskjellige genuttrykk og ECM-ombygging21.

Det andre kritiske trinnet er behandlingen av HBT. Det er nødvendig å bruke nyisolert HBT for å bevare vevets levedyktighet. Ved behandling av HBT er det viktig å fint hakke vevet og fjerne så mye av fascia som mulig. Hvis store biter av fascia er igjen i HBT, vil dette forhindre at celleplatene forankrer oppdriftsvevet riktig. I tillegg kan fascia igjen i vevet dissosiere seg fra platen, og det vil trekke flere klynger av HBT med det noe som gjør brønnen ubrukelig for videre eksperimentering. HBT bør plasseres midt i brønnen før du legger til toppcellearket, ellers vil ASC-ene ikke kunne smøre HBT tilstrekkelig, og vevet på kanten av brønnene vil ikke være forankret. Hvis disse kritiske trinnene følges, er prosessen med å produsere BC-MPS rett frem for å sette opp.

Modellen som er beskrevet her er et forbedret system for å studere BC i sin naturlige mikromiljø av primære HBT som beholder modne adipocytter, ECM og bosatte immunceller (Figur 4). Prekliniske modeller som etterligner fettmikromiljøet mangler flere elementer i mikromiljøet, for eksempel modne adipocytter, immunceller, fibroblaster og ECM. Ved hjelp av fullt moden HBT tillater samtidig og gjensidig avhør av dette komplekse miljøet som inkluderer flere elementer som påvirker kreftutvikling, narkotikarespons og invasivitet gjennom parakrine og jukstakrinsignalering22,23,24,25. Bosatte fibroblaster og ASC påvirker kreftmetastase gjennom ombygging av ECM i vev og gjennom parakrinesignalering26,27. ECM og ombyggingen er avgjørende for oppstart av metastase. Endringer i ECM av tumormikromiljøet påvirker migrasjon og metastase av BC, men de fleste BC-studier inkorporerer ikke innfødt ECM i studiene og bruker i stedet forenklede modeller sammensatt av kollagen I eller matrigel28,29. ECM i BC-MPS er fra HBT og ASC-ene. Dermed kan måten den innfødte ECM ombygges i tumormikromiljøet i brystvev og påvirker metastase studeres. Dermed inkorporerer denne BC-MPS-modellen flere elementer i tumormikromiljøet som tidligere modellsystemer ikke hadde.

Denne modellen kan brukes til å studere metabolsk krysstale mellom fullt modne adipocytter og BC-celler. Tidligere modeller som studerer samspillet mellom adipocytter og kreftceller bruker pre-adipocytter som er differensiert in vitro. Pre-adipocytter som er differensiert in vitro, modnes ikke fullt ut i samme grad som adipocytter differensiert in vivo30,31. For å forstå hvordan adipocyttene påvirker kreftprogresjon og legemiddelrespons er det viktig å etterligne den komplekse molekylære og kjemiske sammensetningen av innfødte adipocytter riktig. Her har vi demonstrert at systemet vårt gjør det mulig å vurdere den metabolske krysstale som oppstår mellom adipocytter og BC-celler (figur 4).

BC-MPS kan også brukes til å utføre in vitro-studier på hvordan forhold som fedme, som ikke kan modelleres riktig ved hjelp av standard cellelinjer, påvirker utviklingen av kreft. Fedme er forbundet med endring av mikromiljøet i HBT og en økning i metastase i BC, selv om de eksakte mekanismene ikke er fullt ut forstått32,33,34. Fibroblaster, ASCs, adipocytter og ECM endres under fedme og fremmer videre progresjon og metastase av kreft25,35,36. Dermed er det viktig å bruke innfødte stromale celler og ECM fra overvektig vev for å forstå hvordan disse endringene i de stromale cellene og ECM påvirker BC. Ved å bruke HBT og ASCs fra overvektige eller magre pasienter i BC-MPS-modellen mekanismene som fedme fremmer en metastatisk fenotype kan belyses.

Metoden som presenteres her er for å dyrke brystkreftceller i en kultur som omfatter ASCs, modne adipocytter og innfødt ECM. Tidligere modeller av samkultursystemer har studert hvordan disse individuelle forskjellige elementene i det stromale miljøet påvirker kreft. Ettersom ASCene og adipocyttene begge påvirker BC-progresjonen, kan det være komplisert å avgjøre hvilken celletype som er ansvarlig for å påvirke BC. Dette kan imidlertid bestemmes ved å sammenligne BC-MPS med enklere samkulturmodeller med en celletype. En av fordelene med dette systemet sammenlignet med on-a-chip eller bioprinting systemer er at det ikke er nødvendig med spesialutstyr for å sette opp systemet utover pNIPAAm belagte plater som er kommersielt tilgjengelige. Modellsystemer av brystvev har tidligere blitt beskrevet ved hjelp av bioprinting for å deponere ASCs i stillaser som deretter differensieres i kultur22. Dette krever ytterligere 2-3 uker for cellene å skille og ASC differensiert i kultur skiller ikke fullt ut til modne adipocytter. De modne adipocyttene fra HBT i BC-MPS er klare til å brukes i det øyeblikket de fjernes fra en pasient.

Modellsystemet som er beskrevet her er nyttig system for å studere krysstale mellom kreftceller og mikromiljøet, men det har noen begrensninger. En av de viktigste begrensningene er tilgjengeligheten av primært humant brystvev. Humant fettvev kan ikke kryopreserveres uten tap av levedyktighet, og dermed må vevet som brukes til å lage BC-MPS, fås ferskt og brukes37. En annen begrensning er at modellen slik den presenteres her er et statisk system som dyrkes i vanlige 6 brønnplater. Systemet mangler den mikrofluidiske strømmen som er tilstede i organer-på-en-chip som kan påvirke oksygen- og næringstilgjengelighet, ren stress og legemiddelfordeling38,39. En tredje begrensning er behovet for at cellene skilles fra hverandre på slutten av eksperimentet hvis de forskjellige celletypene må analyseres individuelt. Dette krever behov for å merke cellene slik at de kan skilles fra hverandre.

Inkorporering av mange elementer i tumormikromiljøet produserer en fysiologisk modell for å studere kreftprogresjon og initiering av metastase. I tillegg til å kunne studere kreftceller i en mer fysiologisk modell, kan BC-MPS også brukes til å studere de enkelte elementene i mikromiljøet og hvordan de påvirkes av kreft. Mens dataene som er representert her demonstrerer hvordan BC-MPS kan brukes med en cellelinje, kan BC-MPS lett tilpasses for å passe til en forskers spesielle eksperimentelle behov. For eksempel kan overvektig HBT sammenlignes med mager HBT for å bestemme hvordan fedme påvirker kreftmetastase og progresjon. Ulike undertyper av BC kan frøs inn i BC-MPS for å studere hvordan undertyper av kreft samhandler annerledes med mikromiljøet. Genredigeringsteknikker kan brukes til å bestemme hvordan spesifikke gener påvirker samspillet mellom BC og mikromiljøet. Denne modellen og dens anvendelser vil gi en mer nøyaktig forståelse av hvordan det stromale miljøet og brystkreften samhandler for å fremme kreftprogresjon og metastase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi vil takke Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core samt Tulane Histology Core for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant og National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020).
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

Kreftforskning Utgave 170 brystkreft mikrofysiologisk system humant brystvev fettavledede stamceller primærkultur legemiddelutvikling metabolsk krysstale
Modellering av brystkreft i humant brystvev ved hjelp av et mikrofysiologisk system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. M., Hebert, K. L.,… More

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter