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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Modelado del cáncer de mama en el tejido mamario humano utilizando un sistema microfisiológico

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

Este protocolo describe la construcción de un sistema microfisiológico in vitro para estudiar el cáncer de seno usando el tejido humano primario del pecho con los materiales del estante.

Abstract

El cáncer de mama (BC) sigue siendo una de las principales causas de muerte entre las mujeres. A pesar de más de $700 millones invertidos en la investigación de BC anualmente, el 97% de los fármacos candidatos a BC fracasan en los ensayos clínicos. Por lo tanto, se necesitan nuevos modelos para mejorar nuestra comprensión de la enfermedad. El programa de sistemas microfisiológicos (MPS) de los NIH se desarrolló para mejorar la traducción clínica de los descubrimientos de la ciencia básica y las nuevas estrategias terapéuticas prometedoras. Aquí presentamos un método para generar las P.M. para los cánceres de seno (BC-MPS). Este modelo adapta un enfoque previamente descrito de cultivo de tejido adiposo blanco humano primario (WAT) intercalando WAT entre las hojas de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) s. Los aspectos nuevos de nuestro BC-MPS incluyen la siembra de células bc en el tejido mamario humano no enfermo (HBT) que contiene matriz extracelular nativa, adipocitos maduros, fibroblastos residentes, y las células inmunes; y intercalar la mezcla BC-HBT entre las hojas asc derivadas de HBT. El BC-MPS resultante es estable en cultivo ex vivo durante al menos 14 días. Este sistema modelo contiene múltiples elementos del microambiente que influyen en bc incluyendo adipocitos, células del estroma, células inmunes, y la matriz extracelular. Por lo tanto, BC-MPS se puede utilizar para estudiar las interacciones entre BC y su microambiente.

Demostramos las ventajas de nuestro BC-MPS mediante el estudio de dos comportamientos de BC conocidos por influir en la progresión del cáncer y la metástasis: 1) la motilidad bc y 2) bc-HBT diafonía metabólica. Mientras que la movilidad de BC se ha demostrado previamente usando proyección de imagen intravital, BC-MPS permite la proyección de imagen de alta resolución del lapso de tiempo usando microscopia de la fluorescencia durante varios días. Además, mientras que la diafonía metabólica fue demostrada previamente usando las células de BC y los pre-adipocytes murine distinguidos en adipocytes inmaduros, nuestro modelo de BC-MPS es el primer sistema para demostrar esta diafonía entre los adipocytes mamarios humanos primarios y las células de BC in vitro.

Introduction

Cada año, más de 40.000 mujeres estadounidenses mueren de cáncer de mama (BC)1. A pesar de más de $700 millones invertidos en la investigación de BC anualmente, el 97% de los fármacos candidatos a BC fallan los ensayos clínicos2,3. Se necesitan nuevos modelos para mejorar la cartera de desarrollo de fármacos y nuestra comprensión de BC. El Programa Microfisiológico (MPS) de los NIH delineó las características requeridas para los modelos innovadores para mejorar la traducción de la ciencia básica en éxito clínico4. Éstos incluyeron el uso de células o de tejidos humanos primarios, estables en cultura por 4 semanas, y la inclusión de la arquitectura nativa del tejido y de la respuesta fisiológica.

Los modelos actuales in vitro de BC, como el cultivo bidimensional de líneas celulares de BC, el co-cultivo de inserto de membrana y los esferoides y organoides tridimensionales, no cumplen con los criterios de MPS de los NIH porque ninguno de estos recapitula la arquitectura del tejido mamario nativo. Cuando la matriz extracelular (ECM) se agrega a estos sistemas, el ECM del pecho no se utiliza; en su lugar, se utilizan geles de colágeno y matrices de membrana basal.

Los sistemas in vivo actuales, tales como xenoinjertos derivados pacientes (PDX), semejantemente no resuelven los criterios de la P.M. de nih porque los tejidos mamarios murine diferencian grandemente de pechos humanos. Por otra parte, las interacciones del sistema inmune-BC se reconocen cada vez más como dominantes en el desarrollo del tumor, pero los modelos murine immunocompromised usados para generar tumores de PDX carecen de las células de T maduras, de las células de B, y de las células de asesino naturales. Además, mientras que PDX permite que los tumores primarios del pecho sean mantenidos y ser ampliados, los tumores resultantes de PDX se infiltran con las células murine primarias del estroma y ECM5.

Para superar estos desafíos, hemos desarrollado un nuevo, ex vivo, tridimensional mamario humano MPS que cumple con los criterios de NIH MPS. La base de nuestro MPS mamario se realiza intercalando tejido mamario humano primario (HBT) entre dos láminas de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC), también aisladas de HBT(Figura 1). Los émbolos para transferir las hojas celulares para emparedar el HBT pueden imprimirse en 3D o estar hechos de plásticos acrílicos simples (Figura 1H,I). Esta técnica adapta nuestro enfoque previamente descrito para el cultivo de tejido de adipocitos blancos humanos primarios6,7. El MPS del pecho se puede entonces sembrar por un modelo de BC de la opción, extendiéndose de variedades de células estándar de BC a los tumores humanos primarios del pecho. Aquí, mostramos que estos BC-MPS son estables en cultivo durante varias semanas(Figura 2); incluyen elementos nativos de hbt tales como adipocytes mamarios, ECM, endotelio, células inmunes (Figura 3); y recapitular las interacciones fisiológicas entre BC y HBT como la diafonía metabólica(Figura 4). Por último, mostramos que BC-MPS permite el estudio del movimiento ameboide de las células BC a lo largo de hbt (Figura 5).

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Protocol

Todos los tejidos humanos se recogieron de acuerdo con el protocolo #9189 aprobado por la Oficina de la Junta de Revisión Institucional de LSUHSC.

1. Siembra de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) para hojas celulares

  1. Compre ASC de fuentes comerciales o aísle del tejido mamario humano primario siguiendo los protocolosestablecidos8,9. Semilla de ascs humanos del pecho en la densidad del 70% (área superficial ~80.000 cells/cm2) sobre las placas estándar de la cultura del tejido de 6 pozos en el medio modificado del águila de Dulbecco (DMEM) complementado con el suero bovino fetal del 10%, y la penicilina/la estreptomicina del 1% (medios de BC-MPS). Asegúrese de que los ASC que se utilizarán para formar las hojas de celdas deben ser menores que el pasaje 10.
    1. Para cada pocillo del sistema microfisiológico del cáncer de seno (BC-MPS) que será generado, las células de semilla en 1 pozo estándar de la cultura del tejido y 1 pocillo del tamaño similar en la placa plástica del tejido recubierta poli (N-isopropylacrylamide) (pNIPAAm). Una placa de 6 pozos de BC-MPS requerirá una placa estándar de cultivo de tejido de 6 pozos (inferior) y una placa recubierta de pNIPAAm (arriba). Las placas pNIPAAm se pueden comprar de fuentes comerciales o se pueden recubrir en el laboratorio10,11,12.
  2. Cultivo de ASCs en una incubadora de cultivo de tejidos a 37°C y al 5% deCO2. Cambie los medios cada 2-3 días en un gabinete de bioseguridad.
  3. Cultíe los ASC hasta que se vuelvan 100% confluentes y formen un patrón estriado. Dependiendo de la confluencia en la que fueron sembrados, esto tomará de 7 a 10 días. Las hojas confluentes de la célula se requieren para anclar el tejido adiposo boyante del pecho.

2. Preparación de los suministros necesarios para BC-MPS

  1. Para preparar la gelatina para placas de 6 pozos, haga una solución de gelatina al 12% en destiladoH2O. Mezcle 19 g de gelatina tipo B (concentración de gel de ~ 225 Bloom) y 125 mL de H2O en una botella de medio de vidrio de 250 ml. Añadir 1,6 mL de NaOH de 1 M a la solución para neutralizar el pH.
  2. Autoclave la solución bajo un ciclo líquido durante 25 min para esterilizar la solución.
  3. Deje que la solución se enfríe a 37 °C. En un armario de bioseguridad estéril añadir 16 mL de solución salina balanceada estéril de 10x Hanks (HBSS) a la solución para obtener un volumen final de 160 mL.
    NOTA: La solución de gelatina se puede utilizar de inmediato o almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior. La gelatina preparada es estable a temperatura ambiente durante 1 mes. Si sólo se necesitarán unos pocos émbolos, entonces se puede hacer una solución de 10 mL y filtrar estéril en el mismo día que se hace BC-MPS como se describió anteriormente7.
    1. Para preparar la solución de gelatina por esterilización por filtro, diluya 1 mL de 10x HBSS con 9 mL deH2O para hacer una solución de HBSS 1x en un tubo cónico de 15 mL. Añadir 100 μL de 1 M de NaOH a cada tubo de 10 mL y luego añadir 0,7 g de gelatina a la solución. Mezcle la solución vigorosamente para disolver la gelatina.
    2. Incubar el tubo en un baño de agua de 75 °C durante 20 min agitando cada 5 min. Use una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,22 μm para filtrar la solución de gelatina. Filtre la solución de gelatina directamente sobre los émbolos en un gabinete de bioseguridad.
  4. Impresión 3D o utilizar acrílico simple para hacer los émbolos utilizados para la transferencia de las hojas de la célula. Asegúrese de que los émbolos se ajusten holgadamente en el tamaño deseado del pozo. Un émbolo impreso en 3D estándar se muestra en la Figura 1. Los émbolos se pueden diseñar utilizando software de diseño asistido por ordenador estándar como TinkerCad e imprimirse utilizando impresoras 3D de filamentos que son compatibles con el ácido poliláctico (PLA)13,14.
  5. Para preparar un rack para sujetar los émbolos coloque un rack de tubo de 15 mL en un gabinete de bioseguridad. Coloque los émbolos boca abajo en el bastidor, de modo que la parte inferior de los émbolos esté boca arriba. Coloque una caja de plástico con una tapa para transportar BC-MPS en el gabinete de bioseguridad. Se recomienda que la caja tenga al menos 35,5 cm de largo x 28 cm de ancho x 8,25 cm de alto para adaptarse a 4 placas de BC-MPS. Retire la tapa de la caja y rocíe el estante, los émbolos y la caja con 70% de EtOH.
  6. Prepare cuchillas de afeitar estériles y pinzas de afeitar mediante autoclave o colocándolas en un gabinete de bioseguridad y lavándolas con 70% de EtOH.
  7. Rocíe los émbolos y la caja con 70% de EtOH y encienda la luz UV en el gabinete de bioseguridad durante al menos 30 minutos para esterilizar los suministros.

3. Preparar émbolos de gelatina y aplicar a las hojas de células superiores

  1. Si la solución de gelatina se preparó previamente, calentarla en un baño de agua de 37 ° C para derretirla.
  2. Pipetee la solución de gelatina sobre los émbolos en el gabinete de bioseguridad utilizando una pipeta serológica de 5 o 10 mL. Un émbolo para 1 pozo de una placa de 6 pozos requerirá ~ 2.5 mL de gelatina.
  3. Una vez que la gelatina se haya solidificado en los émbolos (~ 30-45 min) mueva las placas asc recubiertas de pNIPAAm al gabinete de bioseguridad. Coloque suavemente los émbolos en los pozos de las placas asc recubiertas de pNIPAAm para que la gelatina entre en contacto con los ASC. Coloque una arandela de metal (~ 7.5 g) en el émbolo para pesar el émbolo de modo que la gelatina esté en contacto directo con la hoja de células ASC. Deje los émbolos en las hojas de celdas ASC a temperatura ambiente durante 30 min.
  4. Mueva suavemente la placa con los émbolos en la caja estéril en el gabinete de bioseguridad y coloque la tapa sobre ella. Mueva la caja a una nevera de 4 °C durante 30 min. Si una nevera de 4 °C no está disponible, coloque la placa sobre hielo en un cubo de hielo en el gabinete de bioseguridad durante 30 min.

4. Preparación de líneas celulares de cáncer

  1. Sembra las líneas celulares de cáncer en un plato estándar de cultivo de tejido T75 y manténgalas en cultivo para que sean ~ 80% confluentes en el día en que se procesará BC-MPS. (Se necesitarán ~200,000 células cancerosas por BC-MPS). Cultivar las células cancerosas en medios normales.
    NOTA: Para identificar y aislar las células cancerosas se recomienda que las células se transfectan con una proteína fluorescente para distinguirlas de los ASC y del tejido mamario. El número de células cancerosas necesarias por BC-MPS se ha optimizado para las células MCF7 y MDA-MB-231. Otras líneas celulares pueden requerir una mayor optimización.
  2. El día en que se está preparando el BC-MPS, mueva el matraz que contiene las células cancerosas al gabinete de bioseguridad. Aspirar los medios del matraz. Lavar el matraz con 5 mL de PBS.
  3. Añadir 1 mL de solución de desprendimiento celular al matraz que contiene las células cancerosas y luego incubar el matraz en una incubadora de 37 °C hasta que las células se hayan desprendido (~2-5 min).
  4. En el gabinete de bioseguridad añadir 9 mL de PBS al matraz, transferir las células en PBS en un tubo cónico de 15 mL y contar el número de células utilizando un hemocitómetro.
  5. Centrifugar las células cancerosas a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Resuspend las células en medios BC-MPS de modo que haya 2 x 106 células/mL.
  7. Coloque las células cancerosas en un baño de agua de 37 °C hasta que estén listas para ser agregadas al tejido humano.

5. Procesamiento del tejido mamario humano

  1. En un gabinete de bioseguridad lavar el tejido mamario humano (HBT) 3x con 10 mL de PBS estéril.
  2. Use fórceps estériles y una cuchilla de afeitar para picar toscamente el BC-MPS y trate de eliminar la mayor cantidad posible de fascia y tejido conectivo. Si no se extirpa el tejido conectivo, es posible que la capa superior del ASC no ancle correctamente el HBT.
    NOTA: La fascia y el tejido conectivo se pueden identificar por su aspecto blanco o claro en comparación con el color amarillo del tejido adiposo.
  3. Una vez que el tejido conectivo ha sido eliminado utilizar una cuchilla de afeitar estéril para picar finamente el tejido hasta que tenga una consistencia líquida homogénea. El tejido se inglesa finamente cuando se puede pipetear fácilmente utilizando una punta serológica de 25 mL.
  4. Use una cuchilla de afeitar estéril para cortar la punta de una punta de pipeta p1000 para ayudar a pipetear el HBT picado.
  5. En un tubo de 1,5 mL, mezcle el HBT picado, las líneas celulares cancerosas y los medios BC-MPS (para 1 pozo de una placa de 6 pozos, esto requiere 200 μL de HBT picado, 100 μL de medios BC-MPS y 100 μL de células cancerosas).
  6. Mueva la placa ASC que se utilizará para la hoja de celda inferior de la incubadora al gabinete de bioseguridad. Aspirar el medio desde la placa ASC inferior. Pipetear la mezcla en el centro del pozo de la placa asc inferior utilizando una punta de pipeta p1000 que tenía el extremo distal cortado del paso 5.4
  7. Mueva la caja que contiene la placa ASC superior con los émbolos en ella al gabinete de bioseguridad. Retire suavemente los émbolos de gelatina de la placa recubierta de pNIPAAm y colóquele encima de la mezcla hbt. Agregue medios BC-MPS al pozo (para 1 pozo de una placa de 6 pozos agregue 2 mL de medios). Mueva cuidadosamente las placas ASC inferiores con la mezcla BC-MPS y los émbolos a la caja de plástico estéril y coloque la tapa de la caja para su transporte.
    NOTA: La tapa de la placa de 6 pozos no cabe de nuevo en la placa ASC mientras los émbolos están encendidos. Se debe tener cuidado para evitar contaminar la cultura.
  8. Incubar la placa inferior en la caja en una incubadora a 37 ° C hasta que la gelatina se haya derretido, y la capa superior de ASC haya comenzado a adherirse a la capa inferior (~ 30 min).
  9. Mueva la caja con las placas al gabinete de bioseguridad. Retire suavemente los émbolos de las placas inferiores. El tejido con las células cancerosas se anclará al fondo del pozo.
  10. Coloque la tapa de la placa de 6 pozos de nuevo en la placa inferior e incube a 37 ° C para fundir completamente la gelatina y permitir que la capa superior se ancle completamente a la capa inferior (~ 30-60 min).
  11. Mueva suavemente las placas a un gabinete de bioseguridad y aspire el medio con una pipeta serológica de 10 mL. Agregue 2 mL de medios frescos a cada pozo. Aspirar desde el borde del pozo y pipetear en el borde del pozo para evitar desalojar el tejido.
  12. Mantenga el BC-MPS a 37 °C y 5% de CO2 durante el período de tiempo deseado y cambie el medio cada 2-3 días.

6. Digestión de BC-MPS para análisis

  1. Cuando el BC-MPS esté listo para ser analizado, mueva la placa al gabinete de bioseguridad. Retire los medios con una pipeta serológica para evitar el despreocupamiento accidental de cualquier tejido.
  2. Agregue 1 volumen de PBS a cada pozo.
  3. Retire el PBS con una pipeta serológica.
  4. Agregue 1 mL de solución de disociación celular a cada pozo. Mueva la placa de vuelta a la incubadora e incube a 37 °C durante 5 min para permitir que las células se desprencien. En un gabinete de bioseguridad, use un raspador de células para separar completamente las células y el tejido de la placa de cultivo.
  5. Transferir la solución con el tejido a un tubo cónico de 15 mL utilizando una pipeta serológica. Agregue 2 mL de PBS a cada pozo para recolectar las células restantes y transferir esta solución al tubo cónico. Si las células son fluorescentes, envuelva el tubo en papel de aluminio para protegerlo de la luz.
  6. Incubar el tubo a 37 °C bajo agitación constante en una coctelera orbital a 1 x g durante 10-20 min para disociar completamente las células del tejido.
  7. En un gabinete de bioseguridad, utilice una pipeta serológica para interrumpir cualquier grupo restante de células en el tubo y filtrar la muestra a través de un colador de tejido de 250 μm en un nuevo tubo de 15 mL. Pipetear la solución lentamente a través del colador para que no se desborde.
  8. Enjuague el colador con 1 mL de PBS para recoger las células que aún están en el colador.
  9. Centrifugar las muestras a 500 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Después de la centrifugación, los adipocitos estarán flotando en la capa superior de la solución, mientras que las células cancerosas y los ASC se mezclarán en un gránulo en la parte inferior del tubo.
  10. Para aislar los adipocitos, vierta suavemente la capa superior en un nuevo tubo o, alternativamente, corte la punta de una punta de pipeta p1000 y transfiera la capa superior a un nuevo tubo. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min de nuevo y utilizar una jeringa y una aguja para extraer la solución de debajo de los adipocitos para que sólo queden los adipocitos. Los adipocitos ya están listos para el análisis
  11. Después de quitar los adipocytes de la solución, separe los ASCs y las células cancerosas el uno del otro para el análisis si las células cancerosas fueron transfectadas previamente con una proteína fluorescente. Aspirar la solución restante del tubo que contiene los ASC y las células cancerosas sin interrumpir el pellet celular. Resuspend el pellet en medios PBS o BC-MPS y utilice citometría de flujo para clasificar las células en función de la fluorescencia.

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Representative Results

Estabilidad en la cultura
BC-MPS es un sistema microfisiológico estable que se puede cultivar in vitro durante al menos 14 días. Se tomó una imagen de campo brillante de las hojas de celdas ASC a un aumento de 100x para mostrar el patrón estriado de la hoja confluente (Figura 2A). Las hojas celulares de ASC son estables en cultivo durante al menos 4 semanas. BC-MPS a los 14 días en cultivo en un pozo de una placa de 6 pozos fue foto fotoizado con una cámara a color demostrando que el HBT boyante todavía está anclado de manera estable por las hojas de celdas ASC al fondo del pozo después de 14 días (Figura 2B). Esto demuestra que la hoja celular utilizada para intercalar el tejido adiposo todavía está intacta. La línea celular triple negativa bc MDA-MB-231 que expresa RFP fue cultivada en HBT durante 14 días y luego foto fotociada con un microscopio fluorescente que demuestra la estabilidad de la BC-MPS con líneas celulares de salida a por lo menos 14 días (Figura 2C). La presencia de las células bc en el tejido demuestra la capacidad de las células cancerosas para invadir el HBT. Un explant triple negativo de PDX fue suprimido de un ratón, manchado con el rastreador CMTPX de la célula y cultivado con HBT. Se tomaron imágenes de microscopía fluorescente al día 6 para mostrar la estabilidad de BC-MPS con explantes tumorales durante al menos 6 días(Figura 2D). Esto demuestra que BC-MPS se puede utilizar para cultivar explantes tumorales con HBT, así como líneas celulares.

Elementos hbt nativos
BC-MPS contiene los elementos nativos de HBT en la cultura. BC-MPS que contenía el magnesio 100 de HBT fue cultivado in vitro por 14 días. El tejido fue foto fotoicado usando microscopía de campo brillante después de 14 días en cultivo (Figura 3A). Esta imagen demuestra la preservación de racimos de adipocytes maduros en 14 días en cultura. El tejido se fijó con formol al 10%, parafina incrustada, se seccionó a 5 μm utilizando un microtomo y luego se tiñe con la mancha pentacroma movats utilizando un protocolo estándar. Las secciones fijas fueron fotovidas a 100x (Figura 3B) o 20x (Figura 3C). Las imágenes demuestran que el BC-MPS contiene el colágeno nativo (púrpura), fibras reticulares (azul), y la forma unilocular grande de los adipocytes entre el tejido conectivo se preserva en 14 días en cultura. Para identificar macrófagos primarios en el sistema, HBT fue cultivado por 0, 3 y 7 días y después fijado y manchado con el anti-CD45, el anti-CD68, y el anti-CD206. CD45 fue utilizado como identificador general del leucocito. CD68 fue utilizado como mancha del monocito para identificar macrófagos mientras que CD206 identifica un receptor común presente en macrófagos. La tinción de los marcadores de macrófagos se cuantificó mediante un software de imagen (Figura 3D). Esto demuestra la preservación de macrófagos primarios después de 3 y 7 días en cultura. Estos datos demuestran que BC-MPS conserva los elementos nativos de HBT en la cultura. Otros experimentos se pueden llevar a cabo para estudiar cómo las células BC remodelan los elementos nativos de HBT. Esto puede incluir la evaluación de los cambios en los marcadores de macrófagos para determinar si están siendo alterados por la presencia de células BC. Los cambios en el ECM se pueden analizar más a fondo comparando la coloración pentacroma de Movats de las muestras que fueron cultivadas con o sin las células de BC para determinar si se cambia el contenido del colágeno y el tamaño de los adipocytes se puede comparar usando el software del análisis de la imagen tal como imagen J para determinar si las células de BC alteran tamaño del adipocyte.

Diafonía metabólica
la diafonía metabólica del Adipocyte-cáncer es un camino importante por el que el microambiente del tumor influya en la progresión del BC. Las células BC que acumulan lípidos intracelulares demuestran una mayor resistencia a los medicamentos y un fenotipo más invasivo15. Mientras que las células de BC se han mostrado para inducir lipólisis en adipocytes inmaduros, murine, la importancia fisiológica de esto ha seguido siendo confusa porque la diafonía metabólica entre el A.C. y los adipocytes mamarios humanos primarios nunca se ha mostrado. Para demostrar que BC-MPS puede modelar este adipocyte-BC diafonía metabólica RFP-etiquetado células MDA-MB-231 fueron cultivadas solas o en BC-MPS durante 14 días. Las células fueron digeridas enzimáticamente en suspensión unicelular, teñidas con el colorante lipídico neutro Bodipy, y analizadas por citometría de flujo (Figura 4A,B)16. La proporción de células MDA-MB-231 lípido-positivas fue de 26,2 veces seM +/- 2,5 mayor en bc-mps vs cultivo 2D (Figura 4C). Este aumento en la coloración del lípido demuestra que las células cancerosas están obrando recíprocamente con los adipocytes y tomando los lípidos lanzados de los adipocytes maduros. La clasificación celular se realizó para seleccionar las células RFP + Bodipy +. Después de clasificar, las células se platearon en cubiertas de vidrio recubiertas de colágeno I y se les permitió unirse durante la noche. Al día siguiente, las células se fijaron en paraformadehído al 4% durante 30 min y luego se fotografió en un microscopio fluorescente a un aumento de 100x. Las células cultivadas en BC-MP(Figura 4E)mostraron un aumento de las gotitas lipídicas en comparación con las células cultivadas en cultivo 2D estándar(Figura 4D). Esto demuestra la diafonía metabólica entre las células bc y el HBT y, también, muestra cómo la acumulación de lípidos puede ser analizada por citometría de flujo o por microscopía fluorescente. El análisis adicional de la acumulación del lípido en células cancerosas se puede hacer cuantificando el tamaño de las gotitas del lípido y el número de gotitas del lípido por la célula.

Movimiento ameboide
La conversación cruzada metabólica entre las células BC y los adipocitos aumenta la capacidad invasiva del cáncer. Para evaluar la capacidad invasor creciente de las células cancerosas cultivadas con el HBT la migración de células de BC a través de HBT fue evaluada por microscopia de la fluorescencia. La línea celular metastática MDA-MB-231 de TNBC que expresaba RPF fue cultivada en BC-MPS por 4 días para permitir que el sistema se estabilice. La microscopia de fluorescencia de lapso de tiempo se realizó después de 4 días para obtener imágenes de la motilidad MDA-MB-231 con una imagen capturada cada 20 min durante 19 h a 37 °C y 5% de CO2. El video resultante demostró patrones de movimiento ameboide y un grado sorprendentemente alto de motilidad para las células MDA-MB-231 (Figura 5 y Video 1). Esto demuestra un aumento en la capacidad invasor de las células de BC y la capacidad de las células de BC de invadir el HBT. La migración de las células BC en el HBT puede analizarse más a fondo utilizando métodos previamente publicados para cuantificar la velocidad y direccionalidad de las células migratorias17,18. Las células MDA-MB-231 también fueron observadas para aparecer experimentar mitosis. Estos comportamientos son constantes con su fenotipo agresivo, son comportamientos importantes para la progresión y la metástasis del cáncer, y destacan los nuevos comportamientos de BC que se pueden apuntar para las terapias de BC.

Figure 1
Figura 1:Flujo de trabajo general de la configuración de BC-MPS. (A) La gelatina se solidifica en un émbolo vertical. (B) El émbolo con gelatina se coloca en la lámina de células ASC superior termoresponsiva. (C)Se utiliza un peso para forzar a la gelatina a mantener el contacto con la lámina celular mientras las células incuban a temperatura ambiente durante 30 min seguido de incubación a 4 °C durante 30 min.(D)El émbolo se retira de la placa fría eliminando la hoja celular intacta con ella. (E) El émbolo con la hoja superior de la célula se transfiere a un plato que contiene la hoja de la célula inferior y las células picadas de HBT y BC. (F)La placa celular inferior con medios, émbolo, HBT, BC y ambas hojas celulares se incuban a 37 °C durante 30-60 min para permitir que la gelatina se derrita y las hojas celulares a partir de contactos. (G) La eliminación del émbolo deja el HBT y el BC intercalados entre dos hojas de células ASC. Un émbolo impreso en 3D fue diseñado utilizando el software en línea gratuito TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) e impreso en una impresora 3D. El émbolo está compuesto de ácido poliláctico. (H) Se indican las dimensiones de un émbolo para 1 pozo de una placa de 6 pozos. El hueco del émbolo es de 2,5 mm.(I)Se muestra una imagen del émbolo impreso en 3D real. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2:Estabilidad representativa de BC-MPS en cultivo. (A) Una imagen de campo brillante a 100x de aumento de los ASC confluentes que demuestra el patrón estriado de las células confluentes. Barra de escala = 100 μm.(B)BC-MPS, que contiene 100mg de HBT, se cultitó en una placa de 6 pozos. Después de 14 días se tomó una fotografía en color para demostrar que el HBT está anclado al fondo del pozo de una placa de 6 pozos. (C)La línea celular triple negativa de BC MDA-MB-231 que expresaba RFP fue cultivada con HBT por 14 días y después fotojada usando microscopia fluorescente en la ampliación de 40x. Las imágenes demuestran que las células MDA-MB-231 seguían siendo viables y crecían en el HBT. Barra de la escala = 200 μm D) PDX Los tumores del cáncer de seno triple negativo de ratones fueron picados enpedazos de 3 cm 2 y etiquetados con el centímetro rojo CMPTX del rastreador de la célula. Los pedazos fueron cultivados en HBT y el BC-MPS resultante fue foto fotoda usando un microscopio fluorescente en la ampliación de 40x el día 6 que demostraba su estabilidad en cultura. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3:Preservación representativa de elementos nativos de HBT presentes en BC-MPS. BC-MPS se cultionó durante 14 días y luego se fotograba con microscopía de campo brillante a 40x(A)y luego se fijó con formol al 10% y se tiñeron con la tinción pentacroma de Movats. Las imágenes fueron tomadas en 100x(B)o 20x(C). La proyección de imagen del HBT indica la preservación de los adipocytes uniloculor grandes agrupados juntos y las rebanadas del tejido indican la presencia de preservación del ECM nativo tal como colágeno (amarillo) y fibras reticulares entre los adipocytes (azul). Para demostrar la preservación de macrófagos en el modelo HBT fue cultivado por 0, 3, o 7 días, manchado para los marcadores del macrófago, e imagen usando microscopia confocal(d). La intensidad fluorescente de la coloración de los marcadores del macrófago fue cuantificada usando el software disponible en el comercio que demostraba que los macrófagos todavía están presentes en el tejido después de 3 y 7 días en cultura. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Diafonía metabólica representativa entre adipocitos y células cancerosas en BC-MPS. las células RFP-etiquetadas MDA-MB-231 fueron cultivadas en BC-MPS contra 2D por 14 días, después manchadas con Bodipy (250 nano) y analizadas por cytometry de flujo. (A)Flujo de células MDA-MB-231 manchadas de Bodipy después de 14 días en cultivo 2D. Las células en B2 fueron Bodipy+RFP+; las células en B1 eran Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3,26%, indicando la acumulación mínima del lípido. (B)Análisis citométrico de flujo de células MDA-MB-231 teñidas de Bodipy después de 14 días en BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85,35%, indicando la acumulación extensa del lípido. (C)Acumulación lipídica en células MDA-MB-231 después de 14 días en cultivo 2D frente a BC-MPS. El análisis de microscopía fluorescente de la tinción de Bodipy de MDA-MB-231 cultivada en 2D(D)vs BC-MPS(E)demuestra una mayor acumulación de lípidos en células cultivadas en BC-MPS. Barras de error indicadas SEM. ** p < 0.01, n=2 réplicas biológicas, Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5:Migración representativa de TNBC en BC-MPS. RFP-etiquetado MDA-MB-231 células se cultivaron en BC-MPS durante 4 días y luego las imágenes secuenciales de lapso de tiempo de bc-mps etiquetados con RFP + MDA-MB-231 células fueron capturados utilizando un microscopio de fluorescencia (un marco por 60 min, 100x aumento.) Asteriscos amarillos = evento mitótico. Caja amarilla = restos celulares utilizados como referencia posicional. Flechas azules = 231 células que muestran movimiento ameboide con seudópodos y alta motilidad. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1: Migración representativa de TNBC en BC-MPS. BC-MPS que contiene RFP-etiquetado MDA-MB-231 células se cultivaron durante 4 días y la microscopía fluorescente se utilizó para la imagen de las células cada 20 min a las 19 horas a 37 ° C y 5% CO2. Las imágenes se compilaron en un video (un fotograma por cada 60 minutos, aumento de 100x). Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

Se necesitan nuevos sistemas para modelar el cáncer de mama humano a fin de desarrollar una mejor comprensión de la enfermedad. El desarrollo de sistemas microfisiológicos humanos para modelar los ajustes de la enfermedad que incluyen ecm nativo y las células stromal aumentará el poder profético de estudios preclínicos. El modelo BC-MPS presentado aquí es un sistema de nuevo desarrollo que supera las limitaciones de los modelos anteriores permite la evaluación de BC en su entorno HBT nativo. Este sistema se puede utilizar con líneas celulares del cáncer o con explantes del tumor y es estable por lo menos 14 días. El etiquetado fluorescente de las células BC permite monitorizar su visualización en tiempo real de la motilidad de las células cancerosas y de las interacciones célula-célula, migración, viabilidad o proliferación, ya sea en tiempo real o en momentos específicos (Figura 3 y Figura 5). Este sistema modelo se puede utilizar para aclarar aspectos importantes sobre la biología del cáncer en lo que se refiere a las interacciones entre las células cancerosas y su microambiente. La interrogación de este sistema puede informar sobre la regulación de TME de la progresión del cáncer, de la respuesta de la droga, y de la iniciación de la metástasis.

Para configurar correctamente el sistema, hay algunos pasos críticos que deben seguirse. El primer paso crítico es el cultivo y la transferencia de las hojas de las células ASC. Las placas recubiertas con pNIPAAm son sensibles a la temperatura. Cuando las placas están por encima de 32 °C la superficie es hidrofóbica, y los ASC se adherirán a la superficie. La superficie se volverá hidrofílica por debajo de esta temperatura y las células comenzarán a desprenderse19. Por lo tanto, es necesario determinar qué tan rápido un tipo de celda dado comenzará a desprenderse de estas superficies. Para los ASC derivados de HBT esto tomará > 30 minutos si las células son confluentes. Para evitar que las células se desprencien durante el mantenimiento normal, el medio debe calentarse previamente a 37 °C y las placas de cultivo de tejidos no deben mantenerse a temperatura ambiente durante demasiado tiempo para evitar que las placas se enfríen y las células se desprenda. También es importante determinar el momento óptimo para que los émbolos de gelatina estén en las placas recubiertas de pNIPAAm para transferir toda la hoja celular. Los ASC deben ser confluentes y toda la hoja debe transferirse. Si la hoja de la célula superior no tiene tiempo para desprenderse completamente y unirse a la gelatina, entonces la hoja celular se romperá durante la transferencia. Si la hoja entera de la célula no se transfiere completamente, después los ASCs no podrán emparedar el tejido boyante del pecho.

Los ASCs usados para emparedar el HBT son las células stromal normales del microambiente del pecho que secretan ECM, los factores de crecimiento, y los cytokines que influencian BC20. Para intercalar el HBT entre dos hojas celulares, las hojas asc se transfieren utilizando placas de cultivo de tejido termoresponsivo. Esto permite que el ECM nativo secretado por los ASCs esté intacto y sirve para anclar los adipocitos boyantes en el tejido. Mediante el uso de ASCs derivados del tejido mamario humano esto asegura que las interacciones que los ASC tienen con las células cancerosas imitarán lo que ocurre en el cáncer de mama, ya que los ASC de diferentes depósitos muestran diferentes expresiones génicas y remodelación de ECM21.

El segundo paso crítico es el procesamiento del HBT. Es necesario utilizar HBT recién aislado para preservar la viabilidad del tejido. Al procesar el HBT es crítico picar finamente el tejido y quitar tanto de la faja como sea posible. Si se dejan grandes trozos de fascia en el HBT, esto evitará que las láminas celulares anclen correctamente el tejido boyante. Además, la fascia que queda en el tejido puede disociarse de la placa y tirará de múltiples grupos del HBT con él haciendo que el pozo sea inutilizable para una mayor experimentación. El HBT debe colocarse en el medio del pozo antes de agregar la hoja de celda superior, de lo contrario, los ASC no podrán intercalar adecuadamente el HBT y el tejido en el borde de los pozos no se anclará. Si se siguen estos pasos críticos, entonces el proceso de producción de BC-MPS es fácil de configurar.

El modelo que aquí se detalla es un sistema mejorado para el estudio de bc en su microambiente natural de HBT primaria que retiene los adipocitos maduros, ECM, y las células inmunes residentes (Figura 4). Los modelos preclínicos que imitan el microambiente adiposo carecen de múltiples elementos del microambiente, como adipocitos maduros, células inmunes, fibroblastos y la ECM. El uso de HBT completamente maduro permite la interrogación simultánea y recíproca de este ambiente complejo que incluye múltiples elementos que influyen en el desarrollo del cáncer, la respuesta al fármaco y la invasividad a través de la señalización paracrina y yuxtacrina22,23,24,25. Los fibroblastos residentes y los ASC influyen en la metástasis del cáncer a través de la remodelación de la ECM en los tejidos y a través de la señalización paracrina26,27. El ECM y su remodelación son esenciales para el inicio de la metástasis. Las alteraciones en la ECM del microambiente tumoral influyen en la migración y metástasis de la BC, pero la mayoría de los estudios de BC no incorporan la ECM nativa en sus estudios y en su lugar utilizan modelos simplificados compuestos por colágeno I o matrigel28,29. El ECM en BC-MPS es del HBT y del ASCs. Así, la manera que el ECM nativo se remodela en el microambiente del tumor en tejido del pecho e influencia la metástasis puede ser estudiada. Así, este modelo BC-MPS incorpora múltiples elementos del microambiente tumoral que los sistemas del modelo anterior no tenían.

Este modelo se puede utilizar para estudiar la diafonía metabólica entre los adipocitos completamente maduros y las células BC. Los modelos anteriores que estudian la interacción entre los adipocytes y las células cancerosas utilizan los pre-adipocytes que se diferencian in vitro. Los pre-adipocitos que se diferencian in vitro no maduran completamente en la misma medida que los adipocitos diferenciados in vivo30,31. Para entender cómo los adipocytes influencian la progresión del cáncer y la respuesta de la droga es vital imitar correctamente la composición molecular y química compleja de adipocytes nativos. Aquí hemos demostrado que nuestro sistema permite evaluar la diafonía metabólica que se produce entre los adipocitos y las células BC(Figura 4).

BC-MPS también se puede utilizar en la realización de estudios in vitro sobre cómo condiciones como la obesidad, que no se puede modelar correctamente utilizando líneas celulares estándar, influyen en la progresión del cáncer. La obesidad se asocia con la alteración del microambiente de la HBT y un aumento de la metástasis en la BC, aunque los mecanismos exactos no se entienden completamente32,33,34. Los fibroblastos, ascs, adipocytes y ECM se alteran durante obesidad y promueven más lejos la progresión y la metástasis del cáncer25,35,36. Por lo tanto, es importante utilizar células del estroma nativas y ECM del tejido obeso para entender cómo estas alteraciones en las células del estroma y la ECM influyen en bc. Utilizando HBT y ASCs de pacientes obesos o magros en el modelo de BC-MPS los mecanismos por los cuales la obesidad promueve un fenotipo metastático pueden ser aclarados.

El método presentado aquí está para cultivar las células del cáncer de seno en una cultura que abarque ASCs, los adipocytes maduros, y el ECM nativo. Los modelos anteriores de sistemas de cocultivos han estudiado cómo estos diferentes elementos individuales del entorno del estroma influyen en el cáncer. Como los ASC y los adipocitos influyen en la progresión de bc puede ser complicado determinar qué tipo de célula es responsable de influir en el BC. Sin embargo, esto se puede determinar comparando BC-MPS con modelos de co-cultivo más simples con un tipo de célula. Una de las ventajas de este sistema en comparación con los sistemas de bioimpresión o en un chip es que no se necesita ningún equipo especial para configurar el sistema más allá de las placas recubiertas de pNIPAAm que están disponibles comercialmente. Los sistemas modelo de tejido mamario han sido descritos previamente utilizando bioimpresión para depositar ASC en andamios que luego se diferencian en el cultivo22. Esto requiere 2-3 semanas adicionales para que las células se diferencien y los ASC diferenciados en cultivo no se diferencien completamente a los adipocitos maduros. Los adipocitos maduros del HBT en BC-MPS están listos para ser utilizados en el momento en que se retiran de un paciente.

El sistema modelo descrito aquí es un sistema útil para estudiar la diafonía entre las células cancerosas y el microambiente, sin embargo, tiene algunas limitaciones. Una de las principales limitaciones es la disponibilidad de tejido mamario humano primario. El tejido adiposo humano no puede ser criopreservado sin una pérdida de viabilidad y, por lo tanto, el tejido utilizado para la fabricación de BC-MPS necesita ser recién obtenido y utilizado37. Otra limitación es que el modelo tal como se presenta aquí es un sistema estático que se cultiva en placas regulares de 6 pozos. El sistema carece del flujo microfluídico que está presente en los órganos en un chip que puede influir en la disponibilidad de oxígeno y nutrientes, el estrés y la distribución de fármacos38,39. Una tercera limitación es la necesidad de que las células se separen entre sí al final del experimento si los diferentes tipos de células necesitan ser analizados individualmente. Esto requiere la necesidad de etiquetar las celdas para que puedan separarse entre sí.

La incorporación de muchos elementos del microambiente tumoral produce un modelo fisiológico para estudiar la progresión del cáncer y la iniciación de la metástasis. Además de poder estudiar las células cancerosas en un modelo más fisiológico, BC-MPS también se puede utilizar para estudiar los elementos individuales del microambiente y cómo están influenciados por el cáncer. Mientras que los datos representados aquí demuestran cómo BC-MPS se puede utilizar con una línea celular, BC-MPS se puede adaptar fácilmente para adaptarse a la necesidad experimental particular de un investigador. Por ejemplo, la HBT obesa se puede comparar con la HBT magra para determinar cómo la obesidad afecta la metástasis y la progresión del cáncer. Diferentes subtipos de BC se pueden sembrar en BC-MPS para estudiar cómo los subtipos de cáncer interactúan de manera diferente con el microambiente. Las técnicas de edición de genes se pueden emplear para determinar cómo genes específicos afectan la interacción entre BC y el microambiente. Este modelo y sus aplicaciones permitirán una comprensión más precisa de cómo el entorno del estroma y el cáncer de mama interactúan para promover la progresión del cáncer y la metástasis.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer al Núcleo de Citometría de Flujo y Clasificación Celular de Tulane, así como al Núcleo de Histología de Tulane por su soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por la Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant y la National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

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Modelado del cáncer de mama en el tejido mamario humano utilizando un sistema microfisiológico
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