Summary
Til dybdegående mekanistisk analyse af respiratorisk syncytial virus (RSV) RNA-syntese rapporterer vi en protokol om anvendelse af chaperonphoprotein (P) til coexpression af RNA-fri nucleoprotein (N0)til efterfølgende in vitro-samling af de virusspecifikke nucleocapsider (NCs).
Abstract
Brugen af en autentisk RNA-skabelon er afgørende for at fremme den grundlæggende viden om viral RNA-syntese, der kan guide både mekanistisk opdagelse og analyseudvikling inden for virologi. RNA-skabelonen af ikke-segmenterede RNA-vira (negative-sense) såsom respiratorisk syncytial virus (RSV) er ikke et RNA-molekyle alene, men snarere et nucleoprotein (N) indkapslet ribonukleoproteinkompleks. På trods af vigtigheden af den autentiske RNA-skabelon forbliver generering og samling af et sådant ribonukleoproteinkompleks sofistikeret og kræver dybdegående belysning. Den største udfordring er, at den overekspresserede RSV N binder ikke-specifikt til cellulære RNA'er til at danne tilfældige nucleocapsid-lignende partikler (NCB'er). Her etablerede vi en protokol for at opnå RNA-fri N (N0) først ved at co-udtrykke N med en chaperone phosphoprotein (P), derefter samle N0 med RNA oligos med RSV-specifikke RNA-sekvens for at opnå virus-specifikke nucleocapsids (NCs). Denne protokol viser, hvordan man overvinder vanskeligheden ved forberedelsen af dette traditionelt udfordrende virale ribonukleoproteinkompleks.
Introduction
Ikke-segmenterede RNA-vira (negative-sense) omfatter mange betydelige menneskelige patogener, såsom rabies, ebola og respiratorisk syncytial virus (RSV)1,2. RSV er den hyppigste årsag til luftvejssygdomme såsom bronchiolitis og lungebetændelse hos små børn og ældre voksne over hele verden3. I øjeblikket er der ingen effektive vacciner eller antivirale behandlinger til rådighed til at forebygge eller behandle RSV4. Som en del af livscyklussen fungerer RSV-genomet som skabelon for replikation af RSV RNA-afhængig RNA-polymerase for at producere et antigenom, som igen fungerer som skabelon til at generere et afkomgengenom. Både genom og antigenome RNA'er er helt indkapslet af nucleoprotein (N) til at danne nucleocapsids (NCs)3. Da NC'erne fungerer som skabeloner for både replikering og transskription af RSV-polymerasen, er korrekt NC-samling afgørende for, at polymerasen kan få adgang til skabelonerne til RNA-syntese5. Interessant, baseret på de strukturelle analyser af NNS virale polymeraser, er det hypotese, at flere N proteiner forbigående dissociate fra NCs at give adgang til polymerase og rebind til RNA efter RNA syntese6, 7,8,9,10,11,12.
I øjeblikket er RSV RNA polymeriseringsanalysen blevet etableret ved hjælp af renset RSV polymerase på korte nøgne RNA-skabeloner13,14. RSV-polymerase's aktiviteter når imidlertid ikke optimale, som observeret i de ikke-procesive og abortive produkter, der genereres af RSV polymerase, når du bruger nøgne RNA-skabeloner. Manglen på NC med virusspecifikt RNA er en primær barriere for den yderligere mekanistiske forståelse af RSV RNA-syntesen. Derfor bliver brug af en autentisk RNA-skabelon et kritisk behov for at fremme den grundlæggende viden om RSV RNA-syntese. De kendte strukturer af nucleocapsid-lignende partikler (NCPI'er) fra RSV og andre NNS RNA-vira afslører, at RNA'erne i NCLP'erne enten er tilfældige cellulære RNA'er eller gennemsnitlige virale genomiske RNA'er15,16,17,18,19. Sammen er den største forhindring, at N binder ikke-specifikt til cellulære RNA'er for at danne NCLPs, når N er overekspresseret i værtscellerne.
For at overvinde denne forhindring etablerede vi en protokol for at opnå RNA-fri (N0)først og samle N0 med autentisk viral genomisk RNA i NCLPs20. Princippet i denne protokol er at opnå en stor mængde rekombinant RNA-fri N (N0)ved at co-udtrykke N med en anstandsdame, N-terminal domæne RSV phosphoprotein (PNTD). Den rensede N0P kunne stimuleres og samles i NCB'er ved at tilføje RSV-specifikke RNA oligoer, og under samlingsprocessen forskydes chaperon PNTD ved tilsætning af RNA oligos.
Her beskriver vi en protokol for generering og samling af RSV RNA-specifikke NCs. I denne protokol beskriver vi molekylær kloning, proteinpræparat, in vitro-samling og validering af den komplekse samling. Vi fremhæver kloningsstrategien for at generere bi-cistronic konstruktioner til protein coexpression til molekylær kloning. Til proteinpræparat beskriver vi procedurerne for cellekultur, proteinudvinding og rensning af proteinkomplekset. Derefter diskuterer vi metoden til in vitro-samling af RSV RNA-specifikke NCs. Endelig bruger vi størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC) og negativ pletelektronmikroskopi (EM) til at karakterisere og visualisere de samlede NCKLU'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Molekylær kloning
BEMÆRK: Ligase Independent Cloning (LIC) blev brugt til at lave en RSV bi-cistronic coexpression construct plasmid. LIC er en metode udviklet i begyndelsen af 1990'erne, som bruger 3'-5' Exo aktivitet T4 DNA polymerase til at skabe udhæng med komplementaritet mellem vektoren og DNA indsætte21,22. Konstruktionerne blev lavet ved hjælp af 2BT-10 vektor DNA, som består af en 10x Hans tag på N-terminalen i Open Reading Frame (ORF) (Figur 1).
- Udfør linearisering af LIC-vektorer ved hjælp af SSPI-fordøjelsen.
- 10 μL SSPI 10X buffer, 4 μL SSPI-enzym kombineres i en koncentration på 5 U/μL, det tilsvarende volumen på 5 μg vektorminiprep DNA og steril ddH2O til 100 μL.
- Inkuber fordøjet i 3 timer ved 37 °C.
- Kør digesten på en 1,0% agarose gel til ekstraktion af vektor DNA.
- Brug et geludtrækningssæt til at udføre ekstraktion og rensning. Det endelige volumen af vektor-DNA suspenderes i 30 μL ddH2O, og det opbevares ved -20 °C.
- Forbered DNA-skær til N1-391 og P1-126 ved hjælp af N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer, og P1-126 Reverse Primer (Tabel 1).
BEMÆRK: Der er tilstrækkelig overlapning med den lineariserede vektor til at sikre en smeltetemperatur på mellem 55 °C og 60 °C. For den omvendte primer er der tilstrækkelig overlapning med den omvendte komplementære del af den lineariserede vektor af samme grund.- Udfør PCR-forstærkning af DNA-indsatsen ved hjælp af betingelserne i tabel 2 og tabel 3.
- Udtræk det forstærkede DNA-skær. Kør PCR-produkterne fra det foregående trin på en 1,0% agarosegel, og ekstrakter og rens derefter båndene ved gelekstraktion. Det endelige volumen af udvundet DNA suspenderes i 15 μL ddH2O.
- T4 DNA polymerasebehandling af vektor og indsætte DNA (tabel 4).
BEMÆRK: Behandlingen skal udføres separat for vektor-DNA'et og skær-DNA'et.- Inkubat blandingen i 40 minutter ved stuetemperatur. Derefter opvarmes polymerasen ved 75 °C i 20 minutter. Reaktionsblandingen opbevares ved -20 °C.
- Anneal LIC-vektoren og indsatsvektoren.
- Der skal oprettes en negativ kontrol med 2 μL LIC vektor-DNA og 2 μL steril ddH2O.
- 2 μL indsætnings-DNA og 2 μL LIC-vektor-DNA kombineres fra de tidligere T4 DNA-polymerasereaktioner i et 0,2 mL rør.
- Udfør udglødningsreaktionen ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Reaktionen forespørges med 1,3 μL EDTA ved en koncentration på 25 mM.
- Reaktionen omdannes til 100 μL E. coli Top10-kompetente celler, og de bestanddeles på en ampicillinudvælgel23,24.
- Identificer de positive konstruktioner.
- Forbered plasmid miniprep-opløsningen. Dette kan gøres gennem koloniplukning og podning i LB-medier. Normalt er 3 kolonier tilstrækkelige.
- Blandingen inkuberes natten over ved 37 °C.
- Centrifuger blandingen ved 4.560 x g i 10 minutter og kassér supernatanten.
- Genbrug pellets i 250 μL P1 buffer og forberede plasmid minipreps ved hjælp af en spin miniprep kit.
- Foretag en fordøjelsesanalyse af miniprep-produktet ved hjælp af aseI eller andre restriktionsenzymer.
- Læg prøverne på 0,8% agarose gel og kør den fordøjede plasmid. Analysér gelen under en UV-lampe.
- Brug en rækkefølgetjeneste til at validere rækkefølgen af det positive produkt.
- Få fat i COEXPRESSION DNA-indsatsen.
- Udfør PCR for at hente N1-391 og P1-126 ved hjælp af den tidligere konstruerede 2BT-10 N1-391 og 2BT-10 P1-126 som skabeloner.
- Udfør1. PCR for at opnå N1-391 fra 2BT-10 N1-391-konstruktionen ved hjælp af PCR-betingelserne i tabel 2 og tabel 3 med N1-391 Forward primer og Reverse Primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCCGGCGGCG
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - Udfør 2nd PCR for at få P1-126 fra 2BT-10 P1-126-konstruktionen ved hjælp af Forward primer: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́og P1-126 Omvendt primer (brug PCR-betingelserne i tabel 2 og tabel 3). - Endelig skal du udføre overlap PCR på de blandede produkter fra de tidligere 2 PCR-reaktioner for at fusionere N1-391 og P1-126. Brug N1-391 Forward primer og P1-126 Reverse primer. Brug PCR-betingelserne i tabel 5 og tabel 6.
- Deltag i vektoren og DNA-indsatsen.
- Behandl det overlappende PCR-produkt med T4 DNA-polymerase efter protokollen i trin 1.3.
- Anneal LIC vektor og PCR produkt efter protokollen i trin 1.4.
- Identificer de positive konstruktioner efter protokollen i trin 1.5.
2. Proteinudtryk og rensning
BEMÆRK: Brug E. coli til bi-cistronic konstruktion af coexpression af både N og P. Kultur cellerne ved 37 °C, men udføre udtrykket ved en reduceret temperatur (16 °C) natten over. Proteinkomplekserne renses gennem en kombination af koboltkolonne, ionbytning og størrelsesudelukkelseskromatografi (figur 2).
- Brug E. coli BL21(DE3) stammen til proteinproduktion. Der dyrkes 4 L-cellekulturer ved 37 °C i LB-medium (Luria Bouillon), indtil OD600 når 0,6.
- Sænk temperaturen til 16 °C. En time senere fremkalde udtrykket med 0,5 mM isopropyl 1-thio--D-galactopyranoside (IPTG) natten over.
- Centrifuge cellerne ved 4.104 x g i 25 min og derefter kassere supernatant.
- Resuspend cellepillerne i 200 mL lysis buffer A (50 mM natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol, 10% glycerol og 0,2% NP40). Brug 50 mL lysis buffer til at genbruge cellepillerne fra 1 L cellekultur.
- Lys cellerne ved sonikering i 15 minutter, 3 sekunder på, og 3 sekunder off. Derefter centrifuge celler på 37.888 x g i 40 min.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause ved at fryse cellerne før sonikering i en -80 °C fryser. - Supernatanten indlæses i en kobolttyngdekraftskolonne (diameter x længde: 2,5 cm x 10 cm) med ~10 mL perler, der er for ekvilibreret med 5-10 kolonnevolumener (CV) lysis buffer.
- Kolonnen vaskes med 5 CV af buffer B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% glycerol og 5 mM imidazol) og 5 CV buffer C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mMM NaCl, 10% glycerol og 5 mM imidazol).
- Elute proteinet fra perlerne ved hjælp af 2 CV buffer D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl og 250 mM imidazol).
- Det eluterede protein fortyndes 5x med QA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% Glycerol) til Q-kolonnen.
- 5 mL Q-kolonnen vaskes med QA-buffer for at afbalancere kolonnen, og læg derefter den fortyndede prøve i Q-kolonnen ved hjælp af den peristaltiske pumpe (f.eks. kanin).
- Indlæs kolonnen Q i HPLC-maskinen sammen med QA-buffer og QB-buffer(50 mM Tris-HCl pH7.4, 1,5 M NaCl, 5% glycerol). Konfigurer strømningshastigheden som 1 mL/min.
- Kør "pumpevask"-programmet for at vaske maskinen med QB-buffer efterfulgt af QA-buffer (1-2 CV'er/hver). Indstil systemflowet til 3 mL/min.
- Sæt UV1 til 280 nm og UV2 til 260 nm. Brug en 96 dyb-godt plade til at indsamle fraktioner.
- Elute proteiner ved hjælp af en trinvis gradient af elution agent (QB Buffer) anvender 3-4 CV for hver koncentration, øge procentdelen med 5% hver gang starter ved 0% QB. N0P protein kompleks vil komme ud på 15% QB Buffer.
- Når alt proteinet er elueret, vaskes kolonnen med 100% QB Buffer (2 CV).
- Proteinet isoleres ved gelfiltrering Superdex 200 Forøg 10/300 GL-søjlen (diameter x længde: 1,0 cm x 30 cm) og ekvilibrering med buffer E (20 mM HEPES pH 7,4 og 200 mM NaCl).
- Analyser proteinholdige fraktioner af SDS-PAGE.
3. In vitro-samling af den virusspecifikke NC
BEMÆRK: In vitro-samlingen af den RSV-specifikke NC (N:RNA) blev udført ved at inkubere det forberedte N0P-kompleks med RNA-oligoer. Derefter blev SEC-kromatografi brugt til at adskille samlingskomplekset fra N0P og overskydende RNA (Figur 2).
- Bland og inkuber det rensede N0P-kompleks med RNA-oligo med det molekylære forhold på 1:1.5 ved stuetemperatur i 1 time, normalt er 1 mL af proteinet N0P med en koncentration på 1 mg / mL nok til det næste trin. Opsæt kontrolprøven, som kun indeholder den samme mængde N0P-protein.
- Foralibrer gelfiltreringen Superdex 200 Forøg 10/300 GL-kolonnen med bufferen E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).
- Prøven centrifugeres med 21.130 x g i 15 minutter, eventuelle udfældningsudfældningsudledninger fjernes, og supernatanten indlæses i SEC-kolonnen.
- Sammenlign SEC-kromatografibillederne af N:RNA-samlingsprøven og N0P-kontrolprøven, kombiner forholdet A260/A280 for at identificere, hvilke toppe der er de samlede N-RNA, N0P og gratis RNA.
- Saml de maksimale brøker, kør SDS-PAGE gelen, eller lav gitre.
- For samlingen N-RNA kompleks, indsamle alle fraktioner af N-RNA peak, gøre RNA ekstraktion og køre Urea-PAGE gel til dobbelttjekke længden af specifikke RNA, hvilket er det samme som blandet og inkuberet ved første trin.
4. Fremstilling af negative pletgitter
BEMÆRK: Negativ pletelektronmikroskopi (EM) er en metode, hvor molekylerne adsorberes til en carbonfilm og derefter indlejres i et lag af tungmetalatomer. Negativ plet EM producerer en høj billedkontrast, hvilket gør det nemt at se og beregningsmæssigt justere partiklerne. En anden fordel er, at adsorption af partiklerne til en carbonfilm normalt får molekylerne til at klæbe til gitteret med få foretrukne orienteringer. Når molekylerne er i en lignende retning, er det let at adskille dem i strukturelt forskellige klasser. Negativ plet EM er således den rette teknik til at vejlede prøveforberedelse25,26 ( Figur3).
- Mikrobølgeovn eller varme 5 mL ddH2O i et lille glasbæger ved hjælp af en Wolfram varmelegeme, indtil det koger.
- Der afvejes 37,5 mg uranylformat, og der tilsættes 5 ml opvarmet ddH2O for at fremstille en 0,75% uranylformateringsopløsning. Rør under et aluminiumsfoliebeklædt bægerglas for at beskytte mod lys.
- Der tilsættes 4 μL på 10 M NaOH til farvningsopløsningen, og der omrøres fortsat i 15 minutter, beskyttet mod lyset.
- Opløsningen filtreres gennem et 0,22 mm filter i et reagensglas.
- Brug glødeudladning til at gøre de kontinuerlige kulbelagte EM-net hydrofile27.
BEMÆRK: Gitrene er placeret inde i et kammer, der er tilsluttet en strømforsyning. Når der påføres højspænding, ioniseres gassen i kammeret, og de negativt ladede ioner deponeres på kulstofgitterene for at gøre dem hydrofile. - Klip og fold en parafilmstrimmel. Rør 2 dråber buffer på den ene side af parafilmen på 40 μL, og rør yderligere 2 dråber på 40 μL farvningsopløsning til den anden side.
- For at gøre EM carbon grids, anvende 3 μL protein prøve i 1 minut.
- Blot gitterene mod en blotting papir.
BEMÆRK: Gitrene vaskes 2x med buffer og 1x med 0,75% uranylformat farvningsopløsning slettet efter hvert trin. - Hold gitteroverfladen i den anden dråbe på 0,75% uranylformat farvningsopløsning i 30 sekunder.
- Blot gitteret mod et blotting papir for at fjerne overskydende pletopløsning og lad gitteret lufttørre.
- Gem gitrene i gitterboksen før billedbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rensning af RNA-fri N0P protein
Med denne protokol kan der opnås et storstilet opløseligt heterodimerisk RSV N0P-kompleks. Den fulde længde af N og N terminal del af P proteiner blev co-udtrykt med 10X His-Tag på N protein i E. coli. N0P blev renset ved hjælp af en kobolt kolonne, ion udveksling, og størrelse udelukkelse kromatografi. N0P indeholder både N- og N-terminalen I fuld længde P, men indeholdt ikke cellulært RNA baseret på UV-absorbansen A260/A280-forholdet 20 (Figur 4).
Samling af N-RNA og kontrol med negativ plet
Vi demonstrerede derefter, at de rensede N0P kunne stimuleres og samles i Nuceloplasmid-lignende partikler (NCPI'er) ved at inkubere med specifikke RNA-oligoer. NCLPs blev samlet ved inkubation af N0P med RNA oligos med forholdet 1:1.5 ved stuetemperatur i 1 time og derefter køre gennem gelfiltreringskolonnen. Når N:RNA-komplekset dannes, viser det tre toppe:1. top er N:RNA,2. top er N0P, og 3rd peak er overskydende gratis RNA. Den højeste del af N:RNA-toppen skaber de negative pletgitter til kontrol med EM20 (Figur 5).
Figur 1. Illustrationen af plasmidkonstruktionerne. en. Konstruktionen af RSV N1-391; b. Konstruktionen af RSV P1-126; C. Den bi-cistronic konstruktion til coexpression af N1-391 og P1-126. Det første gen RSV N1-391, det andet gen RSV P1-126, det antibiotikaresistente gen (AmpR), og initiativtagerne er fremhævet i henholdsvis gule, cyan, lyserøde og orange kasser. Sammenfattende er genindsatserne i RSV N1-391 og RSV P1-126 konstrueret separat og samlet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Rutediagrammet for rensning af proteinkomplekset N1-391P1-126. Det skitserer podning og storstilet opvækst af E. coli cellekultur og høst af cellen ved centrifugering. Efterfulgt af celle lysis renses proteinprøverne af affinitetskromatografien (dvs. Co2+-kolonne), ionbytterkromatografi (dvs. Q-kolonne) og gelfiltreringsstørrelsesudelindring (SEC) kromatografi. Proteinprøverne analyseres yderligere af SDS-PAGE gelen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Forberedelse af negative plet EM-net til billeddannelse. A. Glow aflades gitrene. b. Proceduren for negative farvningsgitter vises. Pincetten bruges til at afhente et gitter, efterfulgt af at anvende proteinprøven i 1 minut. Gitterene er renset med blotting papir. Gitteret vaskes to gange med buffer og to gange med 0,75% uranyl format farvning løsning. Gitrene holdes i den anden farvningsopløsningsfald i 30 sekunder. Gitrene renses efter hver vask og lufttørres efter den endelige blotting. C. Gitrene gemmes i gitterboksen til billedbehandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative resultater af copurification af N1-391P1-126 komplekset. en. SEC profil N1-391P1-126. b. SEC profil af samlingen N1-391P1-126 med RNA. C. SDS-PAGE gelen viser kun N-proteinet for N-RNA-komplekset og båndene til både N- og P-proteiner i N1-391P1-126-komplekset. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentative billeder af N-RNA. A og B er repræsentative negative plet EM billeder af N-RNA fra N1-391-RNApeak i figur 4. N-RNA-komplekserne farves ved hjælp af den fremgangsmåde, der er beskrevet i figur 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Primere | |||
| N1-391 Fremad | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 Omvendt | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3' | ||
| P1-126 Fremad | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAGTTCGCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Omvendt | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTGTAGC-3' | ||
Tabel 1. Primer sekvenser.
| PCR forstærkning af DNA-skær | |
| 15 μL | 10x Pfu polymerase reaktionsbuffer |
| 3 μL | Fremadprimer (koncentration på 100 μM) |
| 3 μL | Omvendt primer (koncentration på 100 μM) |
| 15 μL | dNTP-blanding ved 2,5 mM koncentration |
| 6 μL | Plasmid DNA indeholder genet N eller P (100ng/ μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polymerase ved 2,5U/μL |
| Volumen, der skal fyldes til 150 μL | Steril ddH2O |
Tabel 2. PCR forstærkning af DNA-skær reagenser.
| PCR-amplication af DNA-skær | |||
| skridt | Tidspunkt | temperatur | Cykler |
| Denaturering | 4 min. | 95 ºC | 1 |
| Denaturering | 45 sek. | 95 ºC | 30 |
| Udglødning | 30 sek. | 62 ºC | |
| Udvidelse* | 90 sek. | 72 ºC | |
| forlængelse | 10 min. | 72 ºC | 1 |
| holde | ∞ | 4 ºC | 1 |
| Blandingen på 150 μL kan køres i tre separate PCR-reaktioner (3 x 50μL). | |||
| *For Pfu DNA-polymerasen er 1 kb/min den anbefalede hastighed for forlængelsesfasen. Her er både længden af N1-391 genet eller P1-126 genet kortere end 1,5 Kb. | |||
| Således blev der brugt 90 sekunder til udvidelsestrinnet. | |||
Tabel 3 . PCR forstærkning af DNA indsætte termocycling program.
| T4 DNA polymerase behandling | |
| 10 x Buffer | 2 μL |
| Vektor/Indsæt DNA (0,1 pmolvektor eller 0,2 pmolindsats) | 5 μL |
| dNTP* ved 25 mM | 2 μL |
| DTT ved 100 mM | 1 μL |
| T4 DNA polymerase (LIC kvalificeret) | 0,4 μL (1,25 U) |
| Steril ddH2O | 9,6 μL |
| *dGTP blev brugt til vektoren, og dCTP blev brugt til skær-DNA'et. | |
Tabel 4 . T4 DNA polymerase behandling.
| Overlappe pcr | |
| 15 μL | 10 X Pfu polymerase reaktionsbuffer |
| 3 μL | Fremadprimer (100 μM) |
| 3 μL | Omvendt primer (100 μM) |
| 15 μL | dNTP-blanding (2,5 mM) |
| 3 μL | DNA fra1. runde PCR, som indeholder genet N1-391 (100 ng/μL) |
| 3 μL | DNA fra1. runde PCR, som indeholder genet P1-126 (100 ng/μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polymerase (2,5 U/μL) |
| Volumen, der skal fyldes til 150 μL | Steril ddH2O |
Tabel 5 . Overlapper PCR-reagenser.
| Overlappe pcr | |||
| skridt | Tidspunkt | temperatur | Cykler |
| Denaturering | 4 min. | 95 °C | 1 |
| Denaturering | 45 sek. | 95 °C | 30 |
| Udglødning | 30 sek. | 62 °C | |
| Udvidelse* | 2 min. | 72 °C | |
| forlængelse | 10 min. | 72 °C | 1 |
| holde | ∞ | 4 °C | 1 |
| Blandingen på 150 μL kan køres i tre separate PCR-reaktioner (3 x 50 μL). | |||
| *For Pfu DNA-polymerasen er 1 kb/min den anbefalede hastighed for forlængelsesfasen. Her er den samlede længde af genet N1-391 og P1-126 kortere end 2,0 Kb. Således blev der brugt 2 minutter til udvidelsestrinnet. | |||
Tabel 6 - Oversigt Overlap PCR termocycling program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kendte nucleocapsid-lignende partikel (NCLP) strukturer af nonsegmented negative-sense (NNS) RNA-vira viser, at de samlede NCLPs er de komplekse N med vært cellulære RNA'er, når overekspresseret i bakterielle eller eukaryote udtrykssystemer15,16,17,18,19. Tidligere undersøgelser har forsøgt at få RNA gratis N med en række forskellige metoder, såsom RNase A fordøjelsen, høj salt vask, eller justere forskellige pH buffere til at fjerne de uspecifikke cellulæreRNA'er 28,29. Ingen af ovenstående metoder kan dog bruges med succes til samling af de virusspecifikke NCs. For at opnå den RNA-fri RSV N prøvede vi også en kombination af metoder, herunder RNase A fordøjelse, høj salt (1.5M NaCl) vask, justering af buffer pH fra pH 5.0 til pH 9.0, protein denaturering og renaturation. Efter mange mislykkede forsøg kunne vi stadig ikke få RNA-fri N med ovenstående metoder. Vi vil kort drøfte forsøgene og de potentielle årsager.
En metode til at opnå RNA-fri N er at fordøje vært cellulære RNA i samlet NCKLU'er med RNase A. I VSV fjernede inkubationen af den rensede NCLP med RNase A ved en endelig koncentration på 1 mg/ml ved 37 °C i 1 h RNA fuldstændigt fra NC28. Renset tom oligomerisk N blev derefter inkuberet med poly-A (250-nt eller længere) i et molarforhold på 1:5 i nærværelse af RNase-hæmmere. En analyse af RNA isoleret fra rekonstitueret N:poly-A viste, at RNA'et var ca. 90 nt langt. Dette antydede, at RNA uden for nucleoprotein er modtagelig for uspecifik fordøjelse af den forurenede RNase A fra det foregående trin. Strategien for RNase A fordøjelsen for at fjerne RNA var ikke vellykket, når den anvendes til RSV. Dette kan skyldes to grunde. For det første vil forurenet RNase A fordøje det RSV-specifikke RNA, som efterfølgende vil blive inkuberet og samlet med N. For det andet er effektiviteten af RNase A fordøjelsen meget lavere i RSV. Dette skyldes, at RNA'erne samles forskelligt i forskellige NNS-vira. De kendte krystalstrukturer i N:RNA viser, at RNA binder uden for NC'en i VSV, men inde i NC i RSV30,31. Konfigurationen af RNA-binding indad af NC'en kan føre til lav effektivitet for RNase A at få adgang til og fordøje.
En anden metode til at få RNA-fri N er at foretage afkortninger, der skærer både N-terminal motiv (N-arm) og C-terminal motiv (C-arm) af N. Denne afkortede RNA-fri N kan dog ikke bruges til at samle med RNA i en stabil NC, fordi N-armen af N er foldet ind i de tilstødende underenheder ved at interagere med C-terminaldomænet (CTD) i den overordnede N-underenhed. Den udvidede C-arm er placeret til CTD for den næste N-underenhed31.
En ekstra metode til at få RNA-fri N er at forberede mutant N. For eksempel viste resultatet opnået ved Galloux et al., at RSV RNA-fri N0P-kompleks kunne opnås ved coexpression af en K170A/R185A dobbelt N-mutant med N-endestationen af P i bakterier32. Det har dog to potentielle problemer for yderligere strukturelle karakteristik. Et spørgsmål er den lave stabilitet i dette mutantkompleks ved høje koncentrationer. Det andet problem er, at det mutante kompleks mistede RNA-bindingsevnen, som ikke kan bruges i næste trin i samlingen.
På trods af de enorme udfordringer, har vi etableret og optimeret protokollen for at opnå virus-specifikke NCs ved hjælp af coexpression af N med en anstandsdame P. For nylig, en anden vellykket metode er at gøre en kimær fusion konstruktion kodning til P1-50-TEV-N1-405-8xHis for MeV33,34. N0P kan fås efter TEV protease kavalergang. Renheden af N0P afhænger af effektiviteten af TEV-kløfter, som skærer den kimære fusion mellem N- og P-protein.
I stedet for at bruge kimær fusionsmetoden designede vi en bi-cistronic coexpression konstruktion. Specifikt er coexpression konstruktioner af N0P kompleks er designet og konstrueret i to åbne læserammer, der omfatter den fulde længde af N (1-391) med en 10x His-tag på N-terminal i første ORF, og N-terminal peptider (1-126) fra P i den anden ORF20. Kort sagt, den overordnede procedure for N0P rensning er at rense His-tagged N0P og N-RNA fra cellulære lysis prøver med kobolt perler, fjerne den uspecifikke RNA og N: cellulære RNA kompleks med Q kolonne, og få en ren N0P kompleks med SEC kolonne. I SEC-trinnet kan forholdet mellem A260/A280 overvåges og dobbelttjekkes med RNA-ekstraktion fra N0P-topfraktionerne.
Samlet set er de mest kritiske trin i denne protokol strategien om at designe konstruktionen af coexpression af N0P-komplekset og bruge en række affinitets- og ionbytterkolonne til at adskille RNA-fri N0P-komplekset fra de andre N-cellulære RNA-komplekser. Coexpression-strategiens effektivitet for at få N0P-komplekset er relativt lav; omkring 50% N protein er stadig N-cellulære RNA kompleks. Protokollen kan også anvendes til at få RNA gratis N0P og samling med specifikke RNA med N for at få N: RNA kompleks af andre NNS virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskningsprogrammerne i Liang-laboratoriet på Emory støttes af US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH) under tildelingsnummer R01GM130950 og Research Start-Up Fund på Emory University School of Medicine. Forfatteren anerkender medlemmerne af Liang laboratoriet for nyttig støtte og kritisk diskussion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
