Summary
Pour l’analyse mécaniste approfondie de la synthèse respiratoire syncytiale d’ARN du virus (RSV), nous rapportons un protocole d’utilisation de la phosphoprotéine chaperon (P) pour la coexpression de la nucléoprotéine ARN-libre (N0)pour l’assemblage in vitro suivant des nucléocapsides virus-spécifiques (NCs).
Abstract
L’utilisation d’un modèle d’ARN authentique est essentielle pour faire progresser les connaissances fondamentales sur la synthèse de l’ARN viral qui peuvent guider à la fois la découverte mécaniste et le développement d’essais en virologie. Le modèle d’ARN des virus à ARN non segmentés à sens négatif (NNS), tels que le virus respiratoire syncytial (RSV), n’est pas une molécule d’ARN seule, mais plutôt un complexe de ribonucléoprotéines encapsulées de nucléoprotéines (N). Malgré l’importance du modèle d’ARN authentique, la génération et l’assemblage d’un tel complexe ribonucléoprotéique restent sophistiqués et nécessitent une élucidation en profondeur. Le principal défi est que le RSV N surexprimé se lie non spécifiquement aux ARN cellulaires pour former des particules aléatoires de type nucléocoside (NCLPs). Ici, nous avons établi un protocole pour obtenir N sans ARN(N0)d’abord en co-exprimant N avec une phosphoprotéine chaperon (P), puis en assemblantN0 avec des oligos d’ARN avec la séquence d’ARN spécifique au RSV pour obtenir des nucléopsides spécifiques au virus (NCs). Ce protocole montre comment surmonter la difficulté dans la préparation de ce complexe viral traditionnellement provocant de ribonucleoprotein.
Introduction
Les virus à ARN à sens négatif (NNS) non segmentés comprennent de nombreux agents pathogènes humains importants, tels que la rage, Ebola et le virus respiratoire syncytial (RSV)1,2. Le RSV est la principale cause de maladies respiratoires telles que la bronchiolite et la pneumonie chez les jeunes enfants et les adultes plus âgés dans le monde3. À l’heure actuelle, il n’existe aucun vaccin ou traitement antiviral efficace pour prévenir ou traiter le RSV4. Dans le cadre du cycle de vie, le génome du RSV sert de modèle pour la réplication par l’ARN polymérase dépendante de l’ARN du RSV pour produire un antigénique, qui à son tour agit comme modèle pour générer un génome de progéniture. Les ARN du génome et de l’antigène sont entièrement encapsulés par la nucléoprotéine (N) pour former les nucléocapsides (NCs)3. Étant donné que les NCs servent de modèles pour la réplication et la transcription par la polymérase RSV, un assemblage NC approprié est crucial pour que la polymérase accède aux modèles pour la synthèse de l’ARN5. Fait intéressant, sur la base des analyses structurelles des polymérases virales NNS, on émet l’hypothèse que plusieurs protéines N se dissocient transitoirement des NCs pour permettre l’accès de la polymérase et se rebinent à l’ARN après la synthèse de l’ARN6,7,8,9,10,11,12.
Actuellement, le test de polymérisation de l’ARN RSV a été établi en utilisant de la polymérase RSV purifiée sur de courts modèles d’ARN nu13,14. Cependant, les activités de la polymérase RSV n’atteignent pas optimales, comme observé dans les produits non processifs et abortifs générés par la polymérase RSV lors de l’utilisation de modèles d’ARN nu. L’absence de NC avec l’ARN spécifique au virus est un obstacle principal à la compréhension mécaniste de la synthèse de l’ARN du RSV. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle d’ARN authentique devient un besoin critique pour faire progresser les connaissances fondamentales de la synthèse de l’ARN du RSV. Les structures connues des particules de type nucléoscopique (NCLPs) provenant du RSV et d’autres virus à ARN NNS révèlent que les ARN dans les NCLPs sont soit des ARN cellulaires aléatoires, soit des ARN génomiques viraux moyens15,16,17,18,19. Ensemble, le principal obstacle est que N se lie non spécifiquement aux ARN cellulaires pour former des NCLPs lorsque N est surexprimé dans les cellules hôtes.
Pour surmonter cet obstacle, nous avons établi un protocole pour obtenir d’abord sans ARN(N0)et assemblerN0 avec de l’ARN génomique viral authentique en NCLPs20. Le principe de ce protocole est d’obtenir une grande quantité de N(N0)sans ARN recombinant en co-exprimant N avec un chaperon, le domaine N-terminal de la phosphoprotéine RSV (PNTD). Le N0P purifié pourrait être stimulé et assemblé en NCLPs en ajoutant des oligos d’ARN spécifiques au RSV, et pendant le processus d’assemblage, le chaperon PNTD est déplacé lors de l’ajout d’oligos d’ARN.
Ici, nous détaillons un protocole pour la génération et l’assemblage de CN spécifiques à l’ARN RSV. Dans ce protocole, nous décrivons le clonage moléculaire, la préparation de protéine, l’assemblage in vitro, et la validation de l’assemblage complexe. Nous mettons en évidence la stratégie de clonage pour générer des constructions bi-cistroniques pour la coexpression de protéines pour le clonage moléculaire. Pour la préparation des protéines, nous décrivons les procédures de culture cellulaire, d’extraction des protéines et de purification du complexe protéique. Ensuite, nous discutons de la méthode d’assemblage in vitro des CN spécifiques à l’ARN RSV. Enfin, nous utilisons la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et la microscopie électronique à taches négatives (EM) pour caractériser et visualiser les NCLPs assemblés.
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Protocol
1. Clonage moléculaire
REMARQUE: Le clonage indépendant de ligase (LIC) a été utilisé pour fabriquer un plasmide de construction de coexpression bi-cistronique RSV. LIC est une méthode développée au début des années 1990, qui utilise l’activité Exo 3'-5' de l’ADN polymérase T4 pour créer des surplombs avec complémentarité entre le vecteur et l’insert d’ADN21,22. Les constructions ont été réalisées à l’aide de l’ADN vectoriel 2BT-10, qui consiste en une balise His 10x au N-terminal du cadre de lecture ouvert (ORF)(Figure 1).
- Effectuer la linéarisation des vecteurs LIC à l’aide de la digestion SSPI.
- Combiner 10 μL de tampon SSPI 10X, 4 μL d’enzyme SSPI à une concentration de 5 U/μL, le volume équivalent de 5 μg d’ADN de miniprémption vectorielle et ddHstérile de 2O à 100 μL.
- Incuber le digeste pendant 3 heures à 37 °C.
- Exécutez le digest sur un gel d’agarose à 1,0% pour l’extraction de l’ADN vecteur.
- Utilisez un kit d’extraction de gel pour effectuer l’extraction et la purification. Suspendre le volume final d’ADN vectoriel dans30 μL de ddH2 O et le stocker à -20 °C.
- Préparer les inserts d’ADN pour N1-391 et P1-126 à l’aide de l’amorce avant N1-391, de l’amorce inverse N1-391, de l’amorce avant P1-126 et de l’amorce inverse P1-126 (tableau 1).
NOTA: Il y a suffisamment de chevauchement avec le vecteur linéarisé pour assurer une température de fusion comprise entre 55 °C et 60 °C. Pour l’amorce inverse, il y a un chevauchement suffisant avec le brin complémentaire inverse du vecteur linéarisé pour la même raison.- Effectuer une amplification PCR de l’insert d’ADN en utilisant les conditions des tableaux 2 et 3.
- Extraire l’insert d’ADN amplifié. Exécutez les produits PCR de l’étape précédente sur un gel d’agarose à 1,0%, puis extrayez et purifiez les bandes par extraction de gel. Suspendre le volume final d’ADN extrait dans 15 μL deddH2O.
- Traitement de l’ADN polymérase T4 de l’ADN vecteur et de l’ADN insert (Tableau 4).
REMARQUE: Le traitement doit être effectué séparément pour l’ADN vecteur et l’ADN insert.- Incuber le mélange pendant 40 minutes à température ambiante. Ensuite, inactivez la polymérase à la chaleur à 75 °C pendant 20 minutes. Conserver le mélange réactionnel à -20 °C.
- Recuit le vecteur LIC et le vecteur d’insertion.
- Mettre en place un témoin négatif avec 2 μL d’ADN vectoriel LIC et 2 μL de ddH2O stérile.
- Combiner 2 μL d’ADN d’insertion et 2 μL d’ADN vectoriel LIC des réactions précédentes de l’ADN polymérase T4 dans un tube de 0,2 mL.
- Effectuer la réaction de recuit à température ambiante pendant 10 minutes.
- Éteindre la réaction avec 1,3 μL d’EDTA à une concentration de 25 mM.
- Transformer la réaction en 100 μL de cellules compétentes E. coli Top10 et les plaquer sur une plaque de sélection d’ampicilline23,24.
- Identifiez les constructions positives.
- Préparez la solution de minipréparation du plasmide. Cela peut être fait par la cueillette et l’inoculation des colonies dans les milieux LB. Habituellement, 3 colonies suffisent.
- Incuber le mélange pendant une nuit à 37 °C.
- Centrifuger le mélange à 4 560 x g pendant 10 minutes et jeter le surnageant.
- Ressusciter les pastilles dans 250 μL de tampon P1 et préparer des minipréses plasmidiques à l’aide d’une trousse de minipréparation de spin.
- Effectuer une analyse de digestion du produit miniprep en utilisant AseI ou d’autres enzymes de restriction.
- Chargez les échantillons sur du gel d’agarose à 0,8% et faites fonctionner le plasmide digéré. Analyser le gel sous une lampe UV.
- Utilisez un service de séquençage pour valider la séquence du produit positif.
- Obtenir l’insert d’ADN de coexpression.
- Exécutez la PCR pour obtenir N1-391 et P1-126 en utilisant les modèles 2BT-10 N1-391 et 2BT-10 P1-126 précédemment construits.
- Effectuez la1ère PCR pour obtenir N1-391 à partir de la construction 2BT-10 N1-391 en utilisant les conditions PCR du tableau 2 et du tableau 3 avec l’amorce N1-391 avant et l’amorce inverse 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCG
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - Effectuez la 2e PCR pour obtenir P1-126 à partir de la construction 2BT-10 P1-126 à l’aide de l’amorce avant: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 et l’amorce inverse P1-126 (utilisez les conditions PCR des tableaux 2 et 3). - Enfin, effectuer une PCR de chevauchement sur les produits mélangés des 2 réactions PCR précédentes pour fusionnerN1-391 etP1-126. Utilisez l’amorce N1-391 Forward et l’amorce inverse P1-126. Utilisez les conditions PCR du tableau 5 et du tableau 6.
- Joignez le vecteur et l’insert d’ADN.
- Traiter le produit PCR de chevauchement avec de l’ADN polymérase T4 en suivant le protocole de l’étape 1.3.
- Recuit le vecteur LIC et le produit PCR suivant le protocole de l’étape 1.4.
- Identifiez les constructions positives suivant le protocole à l’étape 1.5.
2. Expression et purification des protéines
REMARQUE: Utilisez E. coli pour la construction bi-cistronique de la coexpression de N et de P. Faites la culture des cellules à 37 °C, mais effectuez l’expression à une température réduite (16 °C) pendant la nuit. Purifier les complexes protéiques grâce à une combinaison de colonne de cobalt, d’échange d’ions et de chromatographie d’exclusion de taille (Figure 2).
- Utilisez la souche E. coli BL21(DE3) pour la production de protéines. Cultiver des cultures cellulaires de 4 L à 37 °C dans un milieu LB (Luria Broth) jusqu’à ce que la DO600 atteigne 0,6.
- Abaisser la température à 16 °C. Une heure plus tard, induisez l’expression avec 0.5 mM isopropyl 1-thio--D-galactopyranoside (IPTG) pendant la nuit.
- Centrifuger les cellules à 4 104 x g pendant 25 min, puis jeter le surnageant.
- Ressusciter les pastilles cellulaires dans 200 mL de tampon de lyse A (phosphate de sodium 50 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazole 5 mM, glycérol à 10 % et NP40 à 0,2 %). Utilisez 50 mL de tampon de lyse pour ressusciter les pastilles cellulaires de 1 L de culture cellulaire.
- Lyser les cellules par sonication pendant 15 min, 3 secondes et 3 secondes éteintes. Puis centrifuger les cellules à 37 888 x g pendant 40 min.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause en congelant les cellules avant la sonication dans un congélateur à -80 ° C. - Chargez le surnageant dans une colonne de gravité de cobalt (diamètre x longueur: 2,5 cm x 10 cm) avec ~ 10 ml de perles pré-équilibrées avec 5-10 volumes de colonne (CV) de tampon de lyse.
- Laver la colonne avec 5 CV de tampon B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% glycérol et 5 mM imidazole) et 5 CV de tampon C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% glycérol et 5 mM imidazole).
- Éluer la protéine des billes à l’aide de 2 CV de tampon D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl et 250 mM imidazole).
- Diluer la protéine éluée 5x avec un tampon QA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% Glycérol) pour la colonne Q.
- Laver la colonne Q de 5 mL avec un tampon QA pour équilibrer la colonne, puis charger l’échantillon dilué dans la colonne Q à l’aide de la pompe péristaltique (p. ex. Rabbit).
- Chargez la colonne Q dans la machine HPLC avec le tampon QA et le tampon QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% glycérol). Définissez le débit sur 1 mL/min.
- Exécutez le programme de « lavage de la pompe » pour laver la machine avec un tampon QB suivi d’un tampon QA (1-2 CV / chacun). Réglez le débit du système sur 3 mL/min.
- Réglez l’UV1 à 280 nm et l’UV2 à 260 nm. Utilisez une plaque de 96 puits profonds pour recueillir les fractions.
- Protéines élués à l’aide d’un gradient par étapes de l’agent d’élution (QB Buffer) en appliquant 3-4 CV de chaque concentration, augmentant le pourcentage de 5% à chaque fois à partir de 0% QB. Le complexeprotéiqueN 0 P sortira à 15% QB Buffer.
- Une fois que toute la protéine est éluée, lavez la colonne avec 100% QB Buffer (2 CV).
- Isolez la protéine par filtration sur gel Superdex 200 Augmenter la colonne 10/300 GL (diamètre x longueur : 1,0 cm x 30 cm) et équilibrer avec le tampon E (20 mM HEPES pH 7,4 et 200 mM NaCl).
- Analyser les fractions contenant des protéines par SDS-PAGE.
3. Assemblage in vitro du NC spécifique au virus
REMARQUE: L’assemblage in vitro du NC spécifique au RSV (N: ARN) a été réalisé en incubant le complexe N0P préparé avec des oligos d’ARN. Ensuite, la chromatographie SEC a été utilisée pour séparer le complexe d’assemblage duN0P et de l’excès d’ARN(figure 2).
- Mélanger et incuber le complexeN0P purifié avec de l’ARN oligo avec le rapport moléculaire de 1:1,5 à température ambiante pendant 1 heure, généralement 1 mL de la protéineN0P avec une concentration de 1 mg/mL suffit pour l’étape suivante. Configurez l’échantillon témoin, qui ne contient que la même quantité de protéineN0P.
- Pré-équilibrer la colonne filtration sur gel Superdex 200 Increase 10/300 GL avec le tampon E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).
- Centrifuger l’échantillon avec 21 130 x g pendant 15 min, éliminer toute précipitation et charger le surnageant dans la colonne SEC.
- Comparez les images de chromatographie SEC de l’échantillon d’assemblage N:ARN et de l’échantillon témoin N0P, combinez le rapport A260/A280 pour identifier quels pics sont l’ARN N assemblé, le N0P et l’ARN libre.
- Collectez les fractions de crête, exécutez le gel SDS-PAGE ou faites des grilles.
- Pour l’assemblage du complexe N-ARN, recueillir toutes les fractions de pic de N-ARN, faire l’extraction de l’ARN et exécuter le gel Urée-PAGE pour revérifier la longueur de l’ARN spécifique, qui est la même que mélangé et incube à la première étape.
4. Faire des grilles de coloration négatives
REMARQUE: La microscopie électronique à coloration négative (EM) est une méthode dans laquelle les molécules sont adsorbées sur un film de carbone, puis incorporées dans une couche d’atomes de métaux lourds. La tache négative EM produit un contraste d’image élevé, ce qui facilite la vue et l’alignement informatique des particules. Un autre avantage est que l’adsorption des particules sur un film de carbone induit généralement les molécules à adhérer à la grille avec peu d’orientations préférées. Lorsque les molécules sont dans une orientation similaire, il est facile de les séparer en classes structurellement distinctes. La coloration négative EM est donc la technique appropriée pour guider la préparation des échantillons25,26 (figure 3).
- Micro-ondes ou chauffer 5 mL de ddH2O dans un petit bécher en verre à l’aide d’un appareil de chauffage au tungstène jusqu’à ébullition.
- Peser 37,5 mg d’uranyl formate et ajouter à 5 mL de ddH2O chauffé pour faire une solution de coloration à 0,75% uranyl formate. Remuer sous un bécher recouvert de papier d’aluminium pour vous protéger de la lumière.
- Ajouter 4 μL de NaOH 10 M à la solution de coloration et continuer à agiter pendant 15 min, à l’abri de la lumière.
- Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 mm dans un tube à essai.
- Utilisez la décharge luminescente pour rendre les grilles EM continues revêtues de carbonehydrophiles 27.
REMARQUE: Les grilles sont placées à l’intérieur d’une chambre connectée à une alimentation électrique. Lorsque la haute tension est appliquée, le gaz à l’intérieur de la chambre s’ionise et les ions chargés négativement se déposent sur les grilles de carbone pour les rendre hydrophiles. - Couper et plier une bande de parafilm. Pipet 2 gouttes de 40 μL du tampon d’un côté du parafilm, et pipetez 2 autres gouttes de 40 μL de solution de coloration de l’autre côté.
- Pour faire les grilles de carbone EM, appliquez 3 μL d’échantillon de protéines pendant 1 minute.
- Épongez les grilles contre un papier buvard.
REMARQUE: Les grilles sont lavées 2x avec tampon, et 1x avec la solution de coloration uranyl formate 0.75% blotted après chaque étape. - Maintenez la surface de la grille dans la deuxième goutte de solution de coloration au formate d’uranyle à 0,75% pendant 30 secondes.
- Épongez la grille contre un papier buvard pour éliminer l’excès de solution de coloration et permettre à la grille de sécher à l’air.
- Stockez les grilles dans la zone de grille avant l’imagerie.
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Representative Results
Purification de la protéine N0P sans ARN
Avec ce protocole, un complexe hétérodimérique soluble RSVN0P à grande échelle peut être obtenu. Toute la longueur de la partie terminale N et N des protéines P a été co-exprimée avec 10X His-Tag sur la protéine N dans E. coli. N0P a été purifié utilisant une colonne de cobalt, un échange d’ions, et une chromatographie d’exclusion de taille. N0P contient à la fois le terminal N et N terminal P pleine longueur mais ne contenait pas d’ARN cellulaire basé sur l’absorbance UV A260/A280rapport20 (figure 4).
Assemblage d’ARN-N et vérification avec une tache négative
Nous avons ensuite démontré que le N0P purifié pouvait être stimulé et assemblé en particules de type Nuceloplasmid (NCLPs) en incubant avec des oligos d’ARN spécifiques. Les NCLPs ont été assemblés en incubant leN0P avec des oligos d’ARN avec le rapport de 1:1.5 à température ambiante pendant 1 heure, puis en passant à travers la colonne de filtration du gel. Lorsque le complexe N:ARN se forme, il montre trois pics: le1er pic est N: ARN, le 2nd pic est N0P, et le 3ème pic est l’excès d’ARN libre. La fraction la plus élevée du pic N:RNA crée les grilles de coloration négatives pour vérifier avec EM20 (Figure 5).
Figure 1. L’illustration des constructions plasmidiques. un. La construction du RSV N1-391; B. La construction du RSV P1-126; C. La construction bi-cistronique pour la coexpression de N1-391 et P1-126. Le premier gène RSV N1-391,le deuxième gène RSV P1-126,le gène résistant aux antibiotiques (AmpR) et les promoteurs sont surlignés dans des boîtes jaunes, cyan, roses et orange, respectivement. En résumé, les inserts de gènes du RSV N1-391 et du RSV P1-126 sont construits séparément et assemblés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. L’organigramme de la purification du complexe protéique N1-391P1-126. Il décrit l’inoculation et les croissances à grande échelle de la culture cellulaire de E. coli et la récolte de la cellule par centrifugation. Suivis de la lyse cellulaire, les échantillons de protéines sont purifiés par la chromatographie d’affinité (c.-à-d. colonne co2+), la chromatographie par échange d’ions (c.-à-d. colonne Q) et la chromatographie d’exclusion de taille de filtration sur gel (SEC). Les échantillons de protéines sont ensuite analysés par le gel SDS-PAGE. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Préparation des grilles négatives d’EM de tache pour l’imagerie. A. Glow décharge les grilles. B. La procédure pour les grilles de coloration négatives est illustrée. La pince à épiler est utilisée pour ramasser une grille, suivie de l’application de l’échantillon de protéines pendant 1 minute. Les grilles sont effacées avec du papier buvard. La grille est lavée deux fois avec un tampon et deux fois avec la solution de coloration au formate d’uranyle à 0,75%. Les grilles sont maintenues dans la deuxième goutte de solution de coloration pendant 30 secondes. Les grilles sont effacées après chaque lavage et séchées à l’air après le buvard final. C. Les grilles sont stockées dans la boîte de grille pour l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Résultats représentatifs de la copurification du complexe N1-391P1-126. un. Le profil SEC de N1-391P1-126. B. Profil SEC de l’ensembleN1-391P1-126 avec ARN. C. Le gel SDS-PAGE montre la protéine N uniquement pour le complexe N-ARN et les bandes pour les protéines N et P du complexe N1-391P1-126. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Images représentatives de l’ARN-N. A et B sont des images EM de coloration négatives représentatives de l’ARN-N du pic d’ARN N1-391sur la figure 4. Les complexes N-ARN sont colorés selon le procédé décrit à la figure 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Amorces | |||
| N1-391 Vers l’avant | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 Inverse | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3' | ||
| P1-126 Avant | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Inverse | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3' | ||
Tableau 1. Séquences d’amorce.
| Amplification par PCR d’un insert d’ADN | |
| 15 μL | 10x tampon de réaction de Pfu polymérase |
| 3 μL | Amorce avant (concentration de 100 μM) |
| 3 μL | Amorce inverse (concentration de 100 μM) |
| 15 μL | Mélange de dNTP à une concentration de 2,5 mM |
| 6 μL | L’ADN plasmidique contient le gène de N ou P (100ng/ μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polymérase à 2,5U/μL |
| Volume à remplir à 150 μL | DdH2O stérile |
Tableau 2. Amplification par PCR de réactifs d’insertion d’ADN.
| Amplication PCR de l’insert d’ADN | |||
| pas | Heure | température | Cycles |
| dénaturation | 4 min. | 95 ºC | 1 |
| dénaturation | 45 sec. | 95 ºC | 30 |
| recuit | 30 sec. | 62 ºC | |
| Prolongation* | 90 sec. | 72 ºC | |
| extension | 10 min. | 72 ºC | 1 |
| tenir | ∞ | 4 ºC | 1 |
| Le mélange de 150 μL peut être exécuté dans trois réactions de PCR distinctes (3 x 50 μL). | |||
| *Pour l’ADN polymérase Pfu, 1 kb/min est la vitesse recommandée pour la phase d’extension. Ici, les longueurs du gène N1-391 ou du gène P1-126 sont plus courtes que 1,5 Kb. | |||
| Ainsi, 90 secondes ont été utilisées pour l’étape d’extension. | |||
Tableau 3. Amplification PCR du programme thermocycling d’insertion d’ADN.
| Traitement de l’ADN polymérase T4 | |
| 10 x tampon | 2 μL |
| Adn vectoriel/insert (0,1 pmol vecteur ou 0,2 pmol insert) | 5 μL |
| dNTP* à 25 mM | 2 μL |
| TNT à 100 mM | 1 μL |
| ADN polymérase T4 (qualifiée LIC) | 0,4 μL (1,25 U) |
| DdH2O stérile | 9,6 μL |
| *Le dGTP a été utilisé pour le vecteur, et le dCTP a été utilisé pour l’ADN d’insertion. | |
Tableau 4. Traitement de l’ADN polymérase T4.
| PCR de chevauchement | |
| 15 μL | 10 X tampon de réaction de la Pfu polymérase |
| 3 μL | Amorce avant (100 μM) |
| 3 μL | Amorce inverse (100 μM) |
| 15 μL | Mélange dNTP (2,5 mM) |
| 3 μL | ADN de la PCR ronde 1er qui contient le gène N1-391 (100 ng/μL) |
| 3 μL | ADN de1ère PCR ronde contenant le gèneP1-126 (100 ng/μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polymérase (2,5 U/μL) |
| Volume à remplir à 150 μL | DdH2O stérile |
Tableau 5. Chevauchement des réactifs PCR.
| PCR de chevauchement | |||
| pas | Heure | température | Cycles |
| dénaturation | 4 min. | 95 °C | 1 |
| dénaturation | 45 sec. | 95 °C | 30 |
| recuit | 30 sec. | 62 °C | |
| Prolongation* | 2 min. | 72 °C | |
| extension | 10 min. | 72 °C | 1 |
| tenir | ∞ | 4 °C | 1 |
| Le mélange de 150 μL peut être exécuté dans trois réactions de PCR distinctes (3 x 50 μL). | |||
| *Pour l’ADN polymérase Pfu, 1 kb/min est la vitesse recommandée pour la phase d’extension. Ici, la longueur totale des gènes N1-391 et P1-126 est inférieure à 2,0 Kb. Ainsi, 2 minutes ont été utilisées pour l’étape d’extension. | |||
Tableau 6. Chevauchement du programme de thermocyclisme PCR.
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Discussion
Les structures connues de particules de type nucléocopside (NCLP) des virus à ARN non segmentés à sens négatif (NNS) montrent que les NCLPs assemblés sont le complexe N avec des ARN cellulaires hôtes lorsqu’ils sont surexprimés dans les systèmes d’expression bactérienne ou eucaryote15,16,17,18,19. Des études antérieures ont tenté d’obtenir l’ARN libre D’N avec une variété de méthodes, telles que la digestion RNase A, le lavage au sel élevé, ou l’ajustement de différents tampons de pH pour éliminer les ARN cellulaires non spécifiques28,29. Cependant, aucune des méthodes ci-dessus ne peut être utilisée avec succès pour l’assemblage des CN spécifiques au virus. Pour obtenir le RSV N sans ARN, nous avons également essayé une combinaison de méthodes, y compris la digestion de la RNase A, le lavage à haute teneur en sel (NaCl 1,5 M), l’ajustement du pH tampon de pH 5,0 à pH 9,0, la dénaturation des protéines et la renaturation. Après de nombreux essais infructueuses, nous n’avons toujours pas pu obtenir d’A sans ARN avec les méthodes ci-dessus. Nous discuterons brièvement des tentatives et des raisons potentielles.
Une méthode pour obtenir de l’A sans ARN consiste à digérer l’ARN cellulaire de l’hôte dans des NCLPs assemblés avec la RNase A. Dans le VSV, l’incubation du NCLP purifié avec la RNase A à une concentration finale de 1mg/ml à 37°C pendant 1 h a complètement éliminé l’ARN du NC28. Le N oligomère vide purifié a été alors incubé avec le poly-A (250-nt ou plus longtemps) dans un rapport molaire de 1:5 en présence des inhibiteurs de RNase. L’analyse de l’ARN isolé de N: poly-A reconstitué a prouvé que l’ARN était approximativement 90 nt de longueur. Ceci a suggéré que l’ARN en dehors de la nucléoprotéine soit susceptible à la digestion non spécifique par la RNase A contaminée de l’étape précédente. La stratégie de la digestion de la RNase A pour éliminer l’ARN n’était pas réussie lorsqu’elle était appliquée au RSV. Cela peut être dû à deux raisons. Tout d’abord, la RNase A contaminée digérera l’ARN spécifique au RSV, qui sera ensuite incubé et assemblé avec de l’A. Deuxièmement, l’efficacité de la digestion RNase A est beaucoup plus faible dans le RSV. En effet, les ARN s’assemblent différemment dans différents virus NNS. Les structures cristallines connues de N:ARN montrent que l’ARN se lie en dehors du NC dans le VSV, mais à l’intérieur du NC dans le RSV30,31. La configuration de la liaison de l’ARN vers l’intérieur du NC peut conduire à une faible efficacité pour la RNase A d’accéder et de digérer.
Une autre méthode pour obtenir N sans ARN est de faire les troncations qui coupent à la fois le motif N-terminal (N-bras) et le motif C-terminal (C-bras) de N. Cependant, ce N tronqué sans ARN ne peut pas être utilisé pour s’assembler avec l’ARN en un NC stable car le bras N de N est plié dans ses sous-unités voisines en interagissant avec le domaine C-terminal (CTD) de la sous-unité N précédente. Le bras C étendu est positionné au CTD de la sous-unité N suivante31.
Une méthode supplémentaire pour obtenir de l’ARN sans ARN consiste à préparer le mutant N. Par exemple, le résultat obtenu par Galloux et al. a montré que le complexeN0P libre d’ARN RSV pouvait être obtenu par coexpression d’un double mutant K170A/R185A double N avec le N-terminus de P dans les bactéries32. Cependant, il présente deux problèmes potentiels pour d’autres caractérisations structurelles. Un problème est la faible stabilité de ce complexe mutant à des concentrations élevées. L’autre problème est que le complexe mutant a perdu la capacité de liaison de l’ARN, qui ne peut pas être utilisée à l’étape suivante de l’assemblage.
Malgré les énormes défis, nous avons établi et optimisé le protocole pour obtenir des NCs spécifiques au virus en utilisant la coexpression de N avec un chaperon P. Récemment, une autre méthode réussie est de faire un codage de construction de fusion chimérique pour P1-50-TEV-N1-405-8xHis pour MeV33,34. N0P peut être obtenu après clivage de la TEV protéase. La pureté deN0P dépend de l’efficacité des clivages TEV, qui coupent la fusion chimérique entre les protéines N et P.
Au lieu d’utiliser la méthode de fusion chimérique, nous avons conçu une construction de coexpression bi-cistronique. Plus précisément, les constructions de coexpression du complexe N0P ont été conçues et conçues dans deux cadres de lecture ouverts, comprenant toute la longueur de N (1-391) avec une his-tag 10x à N-terminal dans le premier ORF, et les peptides N-terminaux (1-126) de P dans le deuxième ORF20. En bref, la procédure globale de la purification N0P consiste à purifier l’ARN N0P et N-RNA marqués par His à partir d’échantillons de lyse cellulaire avec des billes de cobalt, à éliminer l’ARN non spécifique et le complexe d’ARN N: cellulaire avec colonne Q, et à obtenir un complexe N0P pur avec la colonne SEC. Dans l’étape SEC, le rapport de A260/A280 peut être surveillé et revérifié avec l’extraction de l’ARN à partir des fractions de crête N0P.
Collectivement, dans ce protocole, les étapes les plus critiques sont la stratégie de conception de la construction de la coexpression du complexeN0P et l’utilisation d’une colonne d’affinité de série et d’échange d’ions pour séparer le complexe N0P sans ARN des autres complexes d’ARN N-cellulaire. L’efficacité de la stratégie de coexpression pour obtenir le complexeN0P est relativement faible; environ 50% de protéine n est encore N-cellular ARN complexe. Le protocole peut également être appliqué pour obtenir de l’ARN libre N0P et l’assemblage avec de l’ARN spécifique avec N pour obtenir le complexe N:ARN d’autres virus NNS.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les programmes de recherche du laboratoire Liang à Emory sont soutenus par le National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) des États-Unis, les National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de bourse R01GM130950 et le Research Start-Up Fund de l’École de médecine de l’Université Emory. L’auteur remercie les membres du laboratoire Liang pour leur soutien utile et leur discussion critique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
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