Summary
Für eine eingehende mechanistische Analyse der RNA-Synthese des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) berichten wir über ein Protokoll zur Verwendung des Chaperonphosphoproteins (P) zur Koexpression des RNA-freien Nukleoproteins (N0)für die anschließende in vitro-Assemblierung der virusspezifischen Nukleokapside (NCs).
Abstract
Die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage ist entscheidend, um das grundlegende Wissen über die virale RNA-Synthese zu erweitern, das sowohl die mechanistische Entdeckung als auch die Assay-Entwicklung in der Virologie leiten kann. Die RNA-Vorlage von NNS-RNA-Viren (Nonsegmented Negative Sense) wie dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV) ist kein RNA-Molekül allein, sondern ein Nukleoprotein (N) -verkapselter Ribonukleoproteinkomplex. Trotz der Bedeutung der authentischen RNA-Vorlage bleiben die Erzeugung und der Aufbau eines solchen Ribonukleoproteinkomplexes anspruchsvoll und erfordern eine eingehende Aufklärung. Die größte Herausforderung besteht darin, dass das überexprimierte RSV N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um zufällige nukleokapsidähnliche Partikel (NCLPs) zu bilden. Hier haben wir ein Protokoll etabliert, um RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem wir zuerst N mit einem Chaperonphosphoprotein (P) co-exprimieren und dann N0 mit RNA-Oligos mit der RSV-spezifischen RNA-Sequenz zusammensetzen, um virusspezifische Nukleokapside (NCs) zu erhalten. Dieses Protokoll zeigt, wie die Schwierigkeiten bei der Herstellung dieses traditionell herausfordernden viralen Ribonukleoproteinkomplexes überwunden werden können.
Introduction
Nicht segmentierte NNS-RNA-Viren (Negative Sense) umfassen viele signifikante menschliche Krankheitserreger wie Tollwut, Ebola und respiratorisches Synzytialvirus (RSV)1,2. RSV ist die Hauptursache für Atemwegserkrankungen wie Bronchiolitis und Lungenentzündung bei kleinen Kindern und älteren Erwachsenen weltweit3. Derzeit stehen keine wirksamen Impfstoffe oder antiviralen Therapien zur Verfügung, um RSV4zu verhindern oder zu behandeln. Als Teil des Lebenszyklus dient das RSV-Genom als Vorlage für die Replikation durch die RSV-RNA-abhängige RNA-Polymerase, um ein Antigenom zu produzieren, das wiederum als Vorlage für die Erzeugung eines Nachkommengenoms dient. Sowohl Genom- als auch Antigenom-RNAs werden vollständig durch das Nukleoprotein (N) verkapselt, um die Nukleokapsiden (NCs) zu bilden3. Da die NCs als Vorlagen für die Replikation und Transkription durch die RSV-Polymerase dienen, ist die richtige NC-Assemblierung entscheidend, damit die Polymerase Zugang zu den Vorlagen für die RNA-Synthese erhält5. Interessanterweise wird aufgrund der Strukturanalysen der NNS-Viruspolymerasen die Hypothese aufgestellt, dass mehrere N-Proteine vorübergehend von den NCs dissoziieren, um den Zugang der Polymerase zu ermöglichen und nach der RNA-Synthese wieder an RNA zu binden6,7,8,9,10,11,12.
Derzeit wurde der RSV-RNA-Polymerisationsassay unter Verwendung von gereinigter RSV-Polymerase auf kurzen nackten RNA-Vorlagen13,14etabliert. Die Aktivitäten der RSV-Polymerase erreichen jedoch nicht optimal, wie bei den nicht-prozessiven und abtreibenden Produkten beobachtet wird, die von der RSV-Polymerase bei der Verwendung nackter RNA-Schablonen erzeugt werden. Das Fehlen von NC mit virusspezifischer RNA ist eine primäre Barriere für das weitere mechanistische Verständnis der RSV-RNA-Synthese. Daher wird die Verwendung einer authentischen RNA-Vorlage zu einem kritischen Bedürfnis, um das grundlegende Wissen über die RSV-RNA-Synthese zu erweitern. Die bekannten Strukturen der nucleocapsid-like particles (NCLPs) von RSV und anderen NNS-RNA-Viren zeigen, dass die RNAs in den NCLPs entweder zufällige zelluläre RNAs oder durchschnittliche virale genomische RNAssind 15,16,17,18,19. Zusammen besteht die Haupthürde darin, dass N unspezifisch an zelluläre RNAs bindet, um NCLPs zu bilden, wenn N in den Wirtszellen überexprimiert wird.
Um diese Hürde zu überwinden, haben wir ein Protokoll erstellt, um zuerst RNA-freie (N0)zu erhalten und N0 mit authentischer viraler genomischer RNA zu NCLPs20zusammenzusetzen. Das Prinzip dieses Protokolls besteht darin, eine große Menge rekombinantes RNA-freies N (N0)zu erhalten, indem N mit einem Chaperon, der N-terminalen Domäne des RSV-Phosphoproteins (PNTD),co-exprimiert wird. Das gereinigteN0P konnte stimuliert und durch Zugabe von RSV-spezifischen RNA-Oligos zu NCLPs zusammengesetzt werden, und während des Assemblierungsprozesses wird das Chaperon PNTD durch die Zugabe von RNA-Oligos verdrängt.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung und Densembierung von RSV-RNA-spezifischen NCs. In diesem Protokoll beschreiben wir das molekulare Klonen, die Proteinpräparation, die In-vitro-Assemblierung und die Validierung der komplexen Assemblierung. Wir stellen die Klonierungsstrategie zur Generierung bi-cistronischer Konstrukte für die Proteinkoexpression für das molekulare Klonen vor. Für die Proteinpräparation beschreiben wir die Verfahren der Zellkultur, Proteinextraktion und der Aufreinigung des Proteinkomplexes. Anschließend diskutieren wir die Methode zur in vitro Assemblierung der RSV-RNA-spezifischen NCs. Schließlich verwenden wir Größenausschlusschromatographie (SEC) und negative Färbungselektronenmikroskopie (EM), um die zusammengesetzten NCLPs zu charakterisieren und zu visualisieren.
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Protocol
1. Molekulares Klonen
HINWEIS: Ligase Independent Cloning (LIC) wurde verwendet, um ein RSV bi-cistronic Coexpressionskonstrukt Plasmid herzustellen. LIC ist eine in den frühen 1990er Jahren entwickelte Methode, die die 3'-5' Exo-Aktivität der T4-DNA-Polymerase nutzt, um Überhänge mit Komplementarität zwischen dem Vektor und dem DNA-Insert21,22zu erzeugen. Die Konstrukte wurden unter Verwendung der 2BT-10-Vektor-DNA hergestellt, die aus einem 10-fachen His-Tag am N-Terminal des Open Reading Frame (ORF) besteht(Abbildung 1).
- Linearisierung von LIC-Vektoren mit SSPI-Aufschluss.
- Kombinieren Sie 10 μL SSPI 10X-Puffer, 4 μL SSPI-Enzym in einer Konzentration von 5 U/ μL, das äquivalente Volumen von 5 μg Vektor-Miniprep-DNA und sterile ddH2O bis 100 μL.
- Den Digest 3 Stunden bei 37 °C inkubieren.
- Führen Sie den Digest mit einem 1,0% igen Agarosegel für die Extraktion von Vektor-DNA aus.
- Verwenden Sie ein Gelextraktionskit, um die Extraktion und Reinigung durchzuführen. Suspendieren Sie das endende Volumen der Vektor-DNA in 30 μL ddH2O und lagern Sie es bei -20 °C.
- Bereiten Sie die DNA-Inserts fürN 1-391 und P1-126 mit dem N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer und P1-126 Reverse Primer vor (Tabelle 1).
HINWEIS: Es gibt eine ausreichende Überlappung mit dem linearisierten Vektor, um eine Schmelztemperatur zwischen 55 °C und 60 °C zu gewährleisten. Für den umgekehrten Primer gibt es aus dem gleichen Grund eine ausreichende Überlappung mit dem umgekehrten komplementären Strang des linearisierten Vektors.- Führen Sie eine PCR-Amplifikation des DNA-Inserts unter Verwendung der Bedingungen in Tabelle 2 und Tabelle 3 durch.
- Extrahieren Sie den amplifizierten DNA-Insert. Führen Sie die PCR-Produkte aus dem vorherigen Schritt auf einem 1,0% igen Agarosegel aus, extrahieren und reinigen Sie dann die Bänder durch Gelextraktion. Suspendieren Sie das endvolumen der extrahierten DNA in 15 μL ddH2O.
- T4 DNA Polymerase Behandlung von Vektor- und Insert-DNA (Tabelle 4).
HINWEIS: Die Behandlung muss getrennt für die Vektor-DNA und die Insert-DNA durchgeführt werden.- Inkubieren Sie die Mischung für 40 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wird die Polymerase bei 75 °C für 20 Minuten heiß inaktiviert. Lagern Sie das Reaktionsgemisch bei -20 °C.
- Glühen Sie den LIC-Vektor und den Insert-Vektor.
- Richten Sie eine Negativkontrolle mit 2 μL LIC-Vektor-DNA und 2 μL sterilem ddH2O ein.
- Kombinieren Sie 2 μL Insert-DNA und 2 μL LIC-Vektor-DNA aus den vorherigen T4-DNA-Polymerase-Reaktionen in einem 0,2-ml-Röhrchen.
- Führen Sie die Glühreaktion bei Raumtemperatur für 10 Minuten durch.
- Löschen Sie die Reaktion mit 1,3 μL EDTA in einer Konzentration von 25 mM.
- Wandeln Sie die Reaktion in 100 μL E. coli Top10 kompetente Zellen um und platten Sie sie auf einer Ampicillin-Selektionsplatte23,24.
- Identifizieren Sie die positiven Konstrukte.
- Bereiten Sie die Plasmid-Miniprep-Lösung vor. Dies kann durch Kolonie-Picking und Impfung in LB-Medien erfolgen. Normalerweise sind 3 Kolonien ausreichend.
- Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei 37 °C.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 4.560 x g für 10 Minuten und entsorgen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Pellets in 250 μL P1-Puffer und bereiten Sie Plasmid-Minipreps mit einem Spin-Miniprep-Kit vor.
- Führen Sie eine Verdauungsanalyse des Miniprep-Produkts mit AseI oder anderen Restriktionsenzymen durch.
- Laden Sie die Proben auf 0,8% Agarosegel und führen Sie das verdaute Plasmid aus. Analysieren Sie das Gel unter einer UV-Lampe.
- Verwenden Sie einen Sequenzierungsdienst, um die Sequenz des positiven Produkts zu validieren.
- Erhalten Sie den Coexpressions-DNA-Insert.
- Führen Sie eine PCR durch, um N1-391 und P1-126 unter Verwendung der zuvor konstruierten 2BT-10 N1-391 und 2BT-10 P1-126 als Vorlagen zu erhalten.
- Führen Sie die1. PCR durch, um N1-391 aus dem Konstrukt 2BT-10N 1-391 unter Verwendung der PCR-Bedingungen in Tabelle 2 und Tabelle 3 mit dem N1-391 Forward Primer und Reverse Primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCG zu erhalten.
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - Führen Sie die2. PCR durch, um P1-126 aus dem 2BT-10 P1-126-Konstrukt mit dem Forward Primer: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC zu erhalten.
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́und der P1-126 Reverse Primer (verwenden Sie die PCR-Bedingungen in Tabelle 2 und Tabelle 3). - Schließlich wird eine Überlappungs-PCR an den gemischten Produkten der vorherigen 2 PCR-Reaktionen durchgeführt, um N1-391 und P1-126zu verschmelzen. Verwenden Sie den N1-391 Forward Primer und den P1-126 Reverse Primer. Verwenden Sie die PCR-Bedingungen in Tabelle 5 und Tabelle 6.
- Verbinden Sie den Vektor und den DNA-Insert.
- Behandeln Sie das Überlappungs-PCR-Produkt mit T4-DNA-Polymerase gemäß dem Protokoll in Schritt 1.3.
- Glühen Sie den LIC-Vektor und das PCR-Produkt nach dem Protokoll in Schritt 1.4.
- Identifizieren Sie die positiven Konstrukte nach dem Protokoll in Schritt 1.5.
2. Proteinexpression und -reinigung
HINWEIS: Verwenden Sie E. coli für das bi-cistronische Konstrukt der Koexpression von N und P. Kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C, führen Sie die Expression jedoch bei einer reduzierten Temperatur (16 °C) über Nacht durch. Reinigen Sie die Proteinkomplexe durch eine Kombination aus Kobaltsäule, Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie (Abbildung 2).
- Verwenden Sie den Stamm E. coli BL21(DE3) für die Proteinproduktion. Züchten Sie 4 L Zellkulturen bei 37 °C in LB (Luria Broth) Medium, bis OD600 0,6 erreicht.
- Senken Sie die Temperatur auf 16 °C. Eine Stunde später induzieren Sie die Expression mit 0,5 mM Isopropyl 1-thio--D-Galactopyranosid (IPTG) über Nacht.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4.104 x g für 25 min und verwerfen Sie dann den Überstand.
- Die Zellpellets werden in 200 ml Lysepuffer A (50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazol, 10% Glycerin und 0,2% NP40) resuspendiert. Verwenden Sie 50 ml Lysepuffer, um die Zellpellets aus 1 L Zellkultur wieder aufzubelasten.
- Lyse der Zellen durch Beschallung für 15 minuten, 3 Sekunden an und 3 Sekunden aus. Dann Zentrifugenzellen bei 37.888 x g für 40 min.
HINWEIS: Das Protokoll kann durch Einfrieren der Zellen vor der Beschallung in einem -80 °C-Gefrierschrank unterbrochen werden. - Laden Sie den Überstand in eine Kobalt-Schwerkraftsäule (Durchmesser x Länge: 2,5 cm x 10 cm) mit ~10mL Perlen vorbalanviert mit 5-10 Säulenvolumina (CV) des Lysepuffers.
- Waschen Sie die Säule mit 5 CV Puffer B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% Glycerin und 5 mM Imidazol) und 5 CV Puffer C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10% Glycerin und 5 mM Imidazol).
- Eluieren Sie das Protein aus den Perlen mit 2 CV Puffer D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl und 250 mM Imidazol).
- Verdünnen Sie das eluierte Protein 5x mit QA-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% Glycerin) für die Q-Säule.
- Waschen Sie die 5 ml Q-Säule mit QA-Puffer, um die Säule auszugleichen, und laden Sie dann die verdünnte Probe mit der Peristaltikpumpe (z. B. Kaninchen) in die Q-Säule.
- Laden Sie die Q-Säule zusammen mit QA-Puffer und QB-Puffer (50 mM Tris-HCl pH7,4, 1,5 M NaCl, 5% Glycerin) in die HPLC-Maschine. Stellen Sie den Durchfluss auf 1 ml/min ein.
- Führen Sie das Programm "Pump Wash" aus, um die Maschine mit QB-Puffer zu waschen, gefolgt von QA-Puffer (1-2 CVs / jeweils). Stellen Sie den Systemdurchfluss auf 3 ml/min ein.
- Stellen Sie UV1 auf 280 nm und UV2 auf 260 nm ein. Verwenden Sie eine 96-Tiefbrunnenplatte, um die Fraktionen zu sammeln.
- Elute Proteine mit einem schrittweisen Gradienten des Elutionsmittels (QB Buffer), wobei 3-4 CV jeder Konzentration angewendet werden, wobei der Prozentsatz jedes Mal ab 0% QB um 5% erhöht wird. N0P Proteinkomplex wird bei 15% QB Buffer herauskommen.
- Sobald das gesamte Protein eluiert ist, waschen Sie die Säule mit 100% QB Buffer (2 CV).
- Isolieren Sie das Protein durch Gelfiltration Superdex 200 Erhöhen Sie die 10/300 GL Säule (Durchmesser x Länge: 1,0 cm x 30 cm) und gleichen Sie mit Puffer E (20 mM HEPES pH 7,4 und 200 mM NaCl) aus.
- Analysieren Sie proteinhaltige Fraktionen mit SDS-PAGE.
3. In-vitro-Assemblierung der virusspezifischen NC
HINWEIS: Die In-vitro-Assemblierung des RSV-spezifischen NC (N:RNA) wurde durch Inkubation des präpariertenN0P-Komplexes mit RNA-Oligos durchgeführt. Dann wurde die SEC-Chromatographie verwendet, um den Assemblierungskomplex von der N0P und überschüssiger RNA zu trennen (Abbildung 2).
- Mischen und inkubieren Sie den gereinigtenN0P-Komplex mit RNA-Oligo mit dem molekularen Verhältnis von 1:1,5 bei Raumtemperatur für 1 Stunde, in der Regel reicht 1 ml des Proteins N0P mit einer Konzentration von 1 mg/ml für den nächsten Schritt. Richten Sie die Kontrollprobe ein, die nur die gleiche Menge an N0P-Protein enthält.
- Vorgleichung der Gelfiltration Superdex 200 Erhöhen Sie die 10/300 GL Säule mit dem Puffer E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).
- Zentrifugieren Sie die Probe mit 21.130 x g für 15 min, entfernen Sie eventuelle Niederschläge und laden Sie den Überstand in die SEC-Säule.
- Vergleichen Sie die SEC-Chromatographiebilder von N:RNA-Assemblierungsprobe und N0P-Kontrollprobe, kombinieren Sie das A260/A280-Verhältnis, um zu identifizieren, welche Peaks die zusammengesetzte N-RNA,N 0P und freie RNA sind.
- Sammeln Sie die Spitzenfraktionen, führen Sie das SDS-PAGE-Gel aus oder erstellen Sie Gitter.
- Sammeln Sie für den N-RNA-Komplex alle Fraktionen des N-RNA-Peaks, führen Sie die RNA-Extraktion durch und führen Sie das Urea-PAGE-Gel aus, um die Länge der spezifischen RNA zu überprüfen, die im ersten Schritt gemischt und inkubiert wird.
4. Negative Fleckengitter erstellen
HINWEIS: Die Negativfleckenelektronenmikroskopie (EM) ist eine Methode, bei der die Moleküle an einen Kohlenstofffilm adsorbiert und dann in eine Schicht aus Schwermetallatomen eingebettet werden. Negative Flecken EM erzeugt einen hohen Bildkontrast, so dass es einfach ist, die Partikel zu sehen und rechnerisch auszurichten. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Adsorption der Partikel an einen Kohlenstofffilm die Moleküle in der Regel dazu veranlasst, mit wenigen bevorzugten Orientierungen am Gitter zu haften. Wenn sich die Moleküle in einer ähnlichen Ausrichtung befinden, ist es einfach, sie in strukturell unterschiedliche Klassen zu unterteilen. Negative Flecken-EM ist daher die geeignete Technik, um die Probenvorbereitung zu leiten25,26 ( Abbildung3).
- Mikrowelle oder Erhitzen Sie 5 mL ddH 2 O ineinemkleinen Glasbecherglas mit einer Wolframheizung, bis es kocht.
- Wiegen Sie 37,5 mg Uranylformiat und fügen Sie 5 ml erhitztes ddH2O hinzu, um eine 0,75% ige Uranylformiat-Färbelösung herzustellen. Unter einem mit Aluminiumfolie überzogenen Becherglas zum Schutz vor Licht umrühren.
- 4 μL 10 M NaOH in die Färbelösung geben und 15 min vor Licht geschützt weiterrühren.
- Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-mm-Filter in ein Reagenzglas.
- Verwenden Sie Glühentladung, um die kontinuierlichen kohlenstoffbeschichteten EM-Gitter hydrophil zu machen27.
HINWEIS: Die Netze befinden sich in einer Kammer, die an eine Stromversorgung angeschlossen ist. Wenn Hochspannung angelegt wird, ionisiert das Gas in der Kammer und die negativ geladenen Ionen lagern sich auf den Kohlenstoffgittern ab, um sie hydrophil zu machen. - Schneiden und falten Sie einen Parafilmstreifen. Pipetieren Sie 2 Tropfen des Puffers auf einer Seite des Parafilms und pipetieren Sie weitere 2 Tropfen 40 μL Färbelösung auf die andere Seite.
- Um die EM-Kohlenstoffgitter herzustellen, tragen Sie 3 μL Proteinprobe für 1 Minute auf.
- Bloten Sie die Gitter gegen ein Löschpapier.
HINWEIS: Die Gitter werden 2x mit Puffer und 1x mit der 0,75% igen Uranylformiat-Färbelösung nach jedem Schritt gewaschen. - Halten Sie die Gitteroberfläche im zweiten Tropfen von 0,75% Uranylformiat-Färbelösung für 30 Sekunden.
- Das Gitter gegen ein Löschpapier abtreichen, um überschüssige Fleckenlösung zu entfernen und das Gitter an der Luft trocknen zu lassen.
- Speichern Sie die Raster vor der Bildgebung im Rasterfeld.
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Representative Results
Aufreinigung des RNA-freienN0P-Proteins
Mit diesem Protokoll kann ein großräumiger löslicher heterodimerer RSV N0P-Komplex erhalten werden. Die volle Länge des N- und N-terminalen Teils der P-Proteine wurde mit 10X His-Tag auf dem N-Protein in E. colico-exprimiert. N0P wurde mit einer Kobaltsäule, Ionenaustausch und Größenausschlusschromatographie gereinigt. N0P enthält sowohl das N- als auch das N-Terminal P in voller Länge, enthielt jedoch keine zelluläre RNA basierend auf der UV-Absorption A260/ A280-Verhältnis 20 (Abbildung 4).
Aufbau von N-RNA und Überprüfung mit negativer Färbung
Wir zeigten dann, dass das gereinigteN0P stimuliert und zu Nuceloplasmid-ähnlichen Partikeln (NCLPs) zusammengesetzt werden kann, indem es mit spezifischen RNA-Oligos inkubiert wird. Die NCLPs wurden zusammengesetzt, indem dasN0P mit RNA-Oligos im Verhältnis 1:1,5 bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert und dann durch die Gelfiltrationssäule geführt wurde. Wenn sich der N:RNA-Komplex bildet, zeigt er drei Peaks: Der1. Peak ist N:RNA, der2. Peak ist N0P und der3. Peak ist überschüssige freie RNA. Der höchste Anteil des N:RNA-Peaks erzeugt die negativen Fleckengitter zur Überprüfung mit EM20 (Abbildung 5).
Abbildung 1. Die Illustration der Plasmidkonstruktionen. a. Das Konstrukt der RSV N1-391; H. Das Konstrukt des RSV P1-126; C. Das bi-cistronische Konstrukt für die Koexpression von N1-391 und P1-126. Das erste Gen RSV N1-391, das zweite Gen RSV P1-126, das antibiotikaresistente Gen (AmpR) und die Promotoren sind in gelben, cyanischen, rosa und orangefarbenen Boxen hervorgehoben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Geneinsätze des RSV N1-391 und des RSV P1-126 getrennt aufgebaut und zusammengesetzt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Das Flussdiagramm der Aufreinigung des Proteinkomplexes N1-391P1-126. Es beschreibt die Impfung und das großflächige Wachstum der E. coli-Zellkultur und die Ernte der Zelle durch Zentrifugation. Nach der Zelllyse werden die Proteinproben durch die Affinitätschromatographie (d. H. Co2+-Säule), die Ionenaustauschchromatographie (d. H. Q-Säule) und die Gelfiltrationsgrößenausschlusschromatographie (SEC) gereinigt. Die Proteinproben werden mit dem SDS-PAGE Gel weiter analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Herstellung von negativen Flecken-EM-Gittern für die Bildgebung. A. Glühen entlädt die Gitter. H. Das Verfahren für negative Färbegitter wird gezeigt. Die Pinzette wird verwendet, um ein Gitter aufzunehmen, gefolgt von der Anwendung der Proteinprobe für 1 Minute. Die Gitter sind mit Löschpapier gestopft. Das Gitter wird zweimal mit Puffer und zweimal mit der 0,75% igen Uranylformiat-Färbelösung gewaschen. Die Gitter werden im zweiten Färbelösungstropfen für 30 Sekunden gehalten. Die Gitter werden nach jeder Wäsche gelöscht und nach dem abschließenden Blotting an der Luft getrocknet. C. Die Raster werden in der Rasterbox für die Bildgebung gespeichert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse der Copurifikation des N1-391P1-126 Komplexes. a. Das SEC-Profil von N1-391P1-126. H. Das SEC-Profil der Baugruppe N1-391P1-126 mit RNA. C. Das SDS-PAGE Gel zeigt das N-Protein nur für den N-RNA-Komplex und die Bänder für N- und P-Proteine des N1-391P1-126-Komplexes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Repräsentative Bilder von N-RNA. A und B sind repräsentative negative Gefärbt-EM-Bilder von N-RNA aus dem N1-391-RNA-Peakin Abbildung 4. Die N-RNA-Komplexe werden mit dem in Abbildung 3beschriebenen Verfahren gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zündkapseln | |||
| N1-391 Vorwärts | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 Rückwärts | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTTGTGTCCTTGG-3' | ||
| P1-126 Vorwärts | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Rückwärts | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3' | ||
Tabelle 1. Primer-Sequenzen.
| PCR-Amplifikation des DNA-Inserts | |
| 15 μL | 10x Pfu-Polymerase-Reaktionspuffer |
| 3 μL | Vorwärtsprimer (100 μM Konzentration) |
| 3 μL | Reverse Primer (100 μM Konzentration) |
| 15 μL | dNTP-Mischung bei 2,5 mM Konzentration |
| 6 μL | Plasmid-DNA enthält das Gen von N oder P (100ng/ μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu-Polymerase bei 2,5U/μL |
| Zu füllenes Volumen bis 150 μL | Steril ddH2O |
Tabelle 2. PCR-Amplifikation von DNA-Insert-Reagenzien.
| PCR-Amplikation von DNA-Insert | |||
| Schritt | Zeit | Temperatur | Zyklen |
| Denaturierung | 4 Min. | 95 ºC | 1 |
| Denaturierung | 45 Sek. | 95 ºC | 30 |
| Glühen | 30 Sek. | 62 ºC | |
| Erweiterung* | 90 Sek. | 72 ºC | |
| Erweiterung | 10 Min. | 72 ºC | 1 |
| halten | ∞ | 4 ºC | 1 |
| Das 150 μL-Gemisch kann in drei separaten PCR-Reaktionen (3 x 50μL) betrieben werden. | |||
| *Für die Pfu-DNA-Polymerase ist 1 kb/min die empfohlene Geschwindigkeit für die Verlängerungsphase. Hier sind sowohl die Längen des N1-391-Gens als auch des P1-126-Gens kürzer als 1,5 Kb. | |||
| Somit wurden 90 Sekunden für den Verlängerungsschritt genutzt. | |||
Tabelle 3. PCR-Amplifikation des DNA-Insert-Thermocycling-Programms.
| T4 DNA Polymerase Behandlung | |
| 10 x Puffer | 2 μL |
| Vektor/Insert-DNA (0,1 pmol Vektor oder 0,2 pmol Insert) | 5 μL |
| dNTP* bei 25 mM | 2 μL |
| DTT bei 100 mM | 1 μL |
| T4 DNA Polymerase (LIC qualifiziert) | 0,4 μL (1,25 U) |
| Steril ddH2O | 9,6 μL |
| *dGTP wurde für den Vektor und dCTP für die Insert-DNA verwendet. | |
Tabelle 4. T4 DNA Polymerase Behandlung.
| Überlappung PCR | |
| 15 μL | 10 X Pfu-Polymerase-Reaktionspuffer |
| 3 μL | Vorwärtsgrundierung (100 μM) |
| 3 μL | Umkehrgrundierung (100 μM) |
| 15 μL | dNTP Mix (2,5 mM) |
| 3 μL | DNA aus1. Runde PCR, die das Gen N1-391 (100 ng/μL) enthält |
| 3 μL | DNA aus1. Runde PCR, die das Gen P1-126 (100 ng/μL) enthält |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu-Polymerase (2,5 U/μL) |
| Zu füllenes Volumen bis 150 μL | Steril ddH2O |
Tabelle 5. Überlappende PCR-Reagenzien.
| Überlappung PCR | |||
| Schritt | Zeit | Temperatur | Zyklen |
| Denaturierung | 4 Min. | 95 °C | 1 |
| Denaturierung | 45 Sek. | 95 °C | 30 |
| Glühen | 30 Sek. | 62 °C | |
| Erweiterung* | 2 Min. | 72 °C | |
| Erweiterung | 10 Min. | 72 °C | 1 |
| halten | ∞ | 4 °C | 1 |
| Die 150 μL-Mischung kann in drei separaten PCR-Reaktionen (3 x 50 μL) betrieben werden. | |||
| *Für die Pfu-DNA-Polymerase ist 1 kb/min die empfohlene Geschwindigkeit für die Verlängerungsphase. Hier ist die Gesamtlänge des Gens N1-391 und P1-126 kürzer als 2,0 Kb. Somit wurden 2 Minuten für den Verlängerungsschritt genutzt. | |||
Tabelle 6. Überlappungs-PCR-Thermocycling-Programm.
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Discussion
Die bekannten Nukleokapsid-ähnlichen Partikelstrukturen (NCLP) der nicht segmentierten NNS-RNA-Viren (Negative-Sense) zeigen, dass die zusammengesetzten NCLPs das komplexe N mit wirszellulären RNAs sind, wenn sie in bakteriellen oder eukaryotischen Expressionssystemen überexprimiert werden15,16,17,18,19. Frühere Studien haben versucht, das RNA-freie N mit einer Vielzahl von Methoden zu erhalten, wie der RNase A-Verdauung, dem Waschen mit hohem Salzgehalt oder der Anpassung verschiedener pH-Puffer, um die unspezifischen zellulären RNAs zu entfernen28,29. Keine der oben genannten Methoden kann jedoch erfolgreich für die Montage der virusspezifischen NCs verwendet werden. Um das RNA-freie RSV N zu erhalten, haben wir auch eine Kombination von Methoden ausprobiert, darunter RNase A-Verdauung, Salzwäsche (1,5 M NaCl), Anpassung des Puffer-pH-Werts von pH 5,0 auf pH 9,0, Proteindenaturierung und Renaturierung. Nach vielen gescheiterten Studien konnten wir mit den oben genannten Methoden immer noch kein RNA-freies N erhalten. Wir werden kurz auf die Versuche und möglichen Gründe eingehen.
Eine Methode, um RNA-freies N zu erhalten, besteht darin, die zelluläre RNA des Wirts in zusammengesetzten NCLPs mit RNase A zu verdauen. Bei VSV wurde durch die Inkubation des gereinigten NCLP mit RNase A bei einer Endkonzentration von 1mg/ml bei 37 °C für 1 h die RNA vollständig aus demNC28entfernt. Gereinigtes leeres oligomeres N wurde dann mit Poly-A (250-nt oder länger) in einem molaren Verhältnis von 1:5 in Gegenwart von RNase-Inhibitoren inkubiert. Die Analyse der aus rekonstituierten N:poly-A isolierten RNA zeigte, dass die RNA etwa 90 nt lang war. Dies deutete darauf hin, dass die RNA außerhalb des Nukleoproteins anfällig für unspezifische Verdauung durch die kontaminierte RNase A aus dem vorherigen Schritt ist. Die Strategie der RNase A-Verdauung zur Entfernung von RNA war bei Anwendung auf RSV nicht erfolgreich. Dies kann zwei Gründe haben. Zunächst verdaut kontaminierte RNase A die RSV-spezifische RNA, die anschließend inkubiert und mit N zusammengesetzt wird. Zweitens ist die Effizienz der RNase A-Verdauung bei RSV viel geringer. Dies liegt daran, dass sich die RNAs in verschiedenen NNS-Viren unterschiedlich zusammensetzen. Die bekannten Kristallstrukturen von N:RNA zeigen, dass RNA außerhalb des NC in VSV, aber innerhalb des NC in RSV30,31bindet. Die Konfiguration der RNA-Bindung nach innen des NC kann zu einer geringen Effizienz für den Zugriff und die Verdauung von RNase A führen.
Eine andere Methode, um RNA-freies N zu erhalten, besteht darin, die Kürzungen vorzunehmen, die sowohl das N-terminale Motiv (N-Arm) als auch das C-terminale Motiv (C-Arm) von N schneiden. Dieses abgeschnittene RNA-freie N kann jedoch nicht verwendet werden, um sich mit RNA zu einem stabilen NC zusammenzusetzen, da der N-Arm von N durch Interaktion mit der C-terminalen Domäne (CTD) der Präzedenzfälle-N-Untereinheit in seine benachbarten Untereinheiten gefaltet wird. Der verlängerte C-Bogen ist zum CTD der nächsten N-Untereinheit31 positioniert.
Eine zusätzliche Methode, um RNA-freies N zu erhalten, ist die Herstellung von mutiertem N. Zum Beispiel zeigte das von Galloux et al. erhaltene Ergebnis, dass RSV-RNA-freier N0P-Komplex durch Koexpression einer K170A/R185A-Doppel-N-Mutante mit dem N-Terminus von P in Bakterien32erhalten werden konnte. Es hat jedoch zwei potenzielle Probleme für weitere strukturelle Charakterisierungen. Ein Problem ist die geringe Stabilität dieses Mutantenkomplexes bei hohen Konzentrationen. Das andere Problem ist, dass der mutierte Komplex die RNA-Bindungsfähigkeit verloren hat, die im nächsten Schritt der Montage nicht verwendet werden kann.
Trotz der enormen Herausforderungen haben wir das Protokoll etabliert und optimiert, um virusspezifische NCs unter Verwendung der Koexpression von N mit einem Chaperon P zu erhalten. Vor kurzem ist eine weitere erfolgreiche Methode, eine chimäre Fusionskonstruktionskodierung für P1-50-TEV-N1-405-8xHis für MeV33,34zu erstellen. N0P kann nach der TEV-Proteasespaltung erhalten werden. Die Reinheit von N0P hängt von der Effizienz der TEV-Spaltungen ab, die die chimäre Fusion zwischen N- und P-Protein schneiden.
Anstatt die chimäre Fusionsmethode zu verwenden, haben wir ein bi-cistronisches Koexpressionskonstrukt entwickelt. Konkret wurden die Koexpressionskonstrukte des N0P-Komplexes in zwei offenen Leserahmen entworfen und konstruiert, bestehend aus der vollen Länge von N (1-391) mit einem 10-fachen His-Tag am N-Terminal im ersten ORF und den N-terminalen Peptiden (1-126) von P im zweiten ORF20. Kurz gesagt, das Gesamtverfahren der N0P-Reinigung besteht darin, His-markierte N0P und N-RNA aus zellulären Lyseproben mit Kobaltperlen zu reinigen, die unspezifische RNA und den N: zellulären RNA-Komplex mit Q-Säule zu entfernen und einen reinen N0P-Komplex mit der SEC-Säule zu erhalten. Im SEC-Schritt kann das Verhältnis von A260/A280 überwacht und mit RNA-Extraktion aus den N0P Peak-Fraktionen überprüft werden.
Insgesamt sind in diesem Protokoll die kritischsten Schritte die Strategie, die Konstruktion der Koexpression des N0P-Komplexes zu entwerfen und eine Reihenaffinitäts- und Ionenaustauschsäule zu verwenden, um den RNA-freien N0P-Komplex von den anderen N-zellulären RNA-Komplexen zu trennen. Die Effizienz der Koexpressionsstrategie, um N0P-Komplex zu erhalten, ist relativ gering; etwa 50% N-Protein ist immer noch N-zellulärer RNA-Komplex. Das Protokoll kann auch angewendet werden, um RNA-freies N0P zu erhalten und mit spezifischer RNA mit N zusammenzustellen, um N: RNA-Komplex anderer NNS-Viren zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Forschungsprogramme im Liang-Labor in Emory werden vom US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), den National Institutes of Health (NIH) unter der Vergabenummer R01GM130950 und dem Research Start-Up Fund der Emory University School of Medicine unterstützt. Der Autor dankt den Mitgliedern des Liang-Labors für hilfreiche Unterstützung und kritische Diskussion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
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