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Biochemistry

श्वसन सिंकिटियल वायरस के वायरस-विशिष्ट न्यूक्लियोकैप्सिड्स की पीढ़ी और असेंबली

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/62010
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

Summary

श्वसन सिंकिटियल वायरस (आरएसवी) आरएनए संश्लेषण के गहन यंत्रवादी विश्लेषण के लिए, हम वायरस-विशिष्ट न्यूक्लियोकैप्सिड्स (एनसीएस) के विट्रो असेंबली में बाद में आरएनए-मुक्त न्यूकोप्रोटीन (एन0)के सह-प्रसार के लिए चैपरवन फॉस्फोप्रोटीन (पी) का उपयोग करने के प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।

Abstract

वायरल आरएनए संश्लेषण के मौलिक ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए एक प्रामाणिक आरएनए टेम्पलेट का उपयोग महत्वपूर्ण है जो वायरोलॉजी में मशीनी खोज और परख विकास दोनों का मार्गदर्शन कर सकता है। नॉनसगमेंटेड निगेटिव-सेंस (एनएनएस) आरएनए वायरस का आरएनए टेम्पलेट, जैसे श्वसन सिंक्सिटियल वायरस (आरएसवी), अकेले आरएनए अणु नहीं बल्कि एक न्यूक्लियोप्रोटीन (एन) एनकैप्सीडेटेड रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स है । प्रामाणिक आरएनए टेम्पलेट के महत्व के बावजूद, इस तरह के राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसर की पीढ़ी और असेंबली परिष्कृत रहती है और गहराई से स्पष्ट करने की आवश्यकता होती है। मुख्य चुनौती यह है कि अतिव्यक्त आरएसवी एन यादृच्छिक न्यूक्लियोकैप्सिड जैसे कणों (एनसीएलआरपीएस) बनाने के लिए गैर-विशेष रूप से सेलुलर आरएनए को बांधता है। यहां, हमने आरएनए-फ्री एन (एन0)को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया, जो पहले एक चैपरवन फॉस्फोप्रोटीन (पी) के साथ एन को सह-व्यक्त करता है, फिर वायरस-विशिष्ट न्यूकॉकैप्सिड (एनसी) प्राप्त करने के लिए आरएसवी-विशिष्ट आरएनए अनुक्रम के साथ आरएनए ओलिगोस के साथ एन0 को इकट्ठा करता है। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि इस पारंपरिक रूप से चुनौतीपूर्ण वायरल रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स की तैयारी में कठिनाई को कैसे दूर किया जाए।

Introduction

गैर-संरक्षित नकारात्मक-भावना (एनएनएस) आरएनए वायरस में रेबीज, इबोला और श्वसन सिंक्टियल वायरस (आरएसवी)1,2जैसे कई महत्वपूर्ण मानव रोगजनक शामिल हैं। आरएसवी3साल के छोटे बच्चों और बड़े वयस्कों में ब्रोंकिओलाइटिस और निमोनिया जैसी श्वसन बीमारी का प्रमुख कारण है । वर्तमान में, आरएसवी4को रोकने या इलाज करने के लिए कोई प्रभावी टीके या एंटीवायरल उपचार उपलब्ध नहीं हैं। जीवन चक्र के हिस्से के रूप में, आरएसवी जीनोम आरएसवी आरएनए निर्भर आरएनए पॉलीमरेज द्वारा प्रतिकृति के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है ताकि एक एंटीजेनोम का उत्पादन किया जा सके, जो बदले में एक संतान जीनोम उत्पन्न करने के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। जीनोम और एंटीजेनोम आरएनए दोनों को न्यूक्लियोप्टोप्रोटीन (एन) द्वारा न्यूक्लियोकैप्सिड्स (एनसी) 3 बनाने के लिए पूरीतरहसे समाहित किया गया है। चूंकि एनसी आरएसवी पॉलीमरेज द्वारा प्रतिकृति और प्रतिलेखन दोनों के लिए टेम्पलेट्स के रूप में काम करते हैं, इसलिए पॉलीमरेज के लिए आरएनए संश्लेषण5के लिए टेम्पलेट्स तक पहुंच प्राप्त करने के लिए उचित एनसी असेंबली महत्वपूर्ण है। दिलचस्प बात यह है कि एनएनएस वायरल पॉलीमेरेरेस के संरचनात्मक विश्लेषणों के आधार पर, यह परिकल्पना की जाती है कि कई एन प्रोटीन एनसी से क्षणिक रूप से अलग होते हैं ताकि आरएनए संश्लेषण6,7,8,8, 9,11,12के बाद पॉलीमरेज और आरईएन तक पुनर्विष्कार की पहुंच की अनुमति दी जा सके।

वर्तमान में, आरएसवी आरएनए बहुलकीकरण परख को छोटे नग्न आरएनए टेम्पलेट्स13, 14पर शुद्ध आरएसवी पॉलीमरेज का उपयोग करकेस्थापितकिया गया है। हालांकि, आरएसवी पॉलीमरेज की गतिविधियां इष्टतम तक नहीं पहुंचती हैं, जैसा कि नग्न आरएनए टेम्पलेट्स का उपयोग करते समय आरएसवी पॉलीमरेज द्वारा उत्पन्न गैर-प्रक्रियाशील और निष्फल उत्पादों में मनाया जाता है। वायरस विशिष्ट आरएनए के साथ नेकां की कमी आरएसवी आरएनए संश्लेषण की आगे की यंत्रवादी समझ के लिए एक प्राथमिक बाधा है । इसलिए, एक प्रामाणिक आरएनए टेम्पलेट का उपयोग आरएसवी आरएनए संश्लेषण के मौलिक ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता बन जाती है। आरएसवी और अन्य एनएनएस आरएनए वायरस से न्यूक्लियोकैप्सिड जैसे कणों (एनसीएलआरपी) की ज्ञात संरचनाओं से पता चलता है कि एनसीएलपीएस में आरएनए या तो यादृच्छिक सेलुलर आरएनए या औसत वायरल जीनोमिक आरएनए15,16,17,18, 19हैं। एक साथ, मुख्य बाधा यह है कि एन मेजबान कोशिकाओं में एन अतिव्यक्त होने पर एनसीएलपी बनाने के लिए गैर-विशेष रूप से सेलुलर आरएनए को बांधता है।

इस बाधा को दूर करने के लिए, हमने आरएनए-फ्री (एन0)को पहले प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया और एन0 को एनसीएलपीएस20में प्रामाणिक वायरल जीनोमिक आरएनए के साथ इकट्ठा किया। इस प्रोटोकॉल का सिद्धांत आरएसवी फॉस्फोप्रोटीन (पीएनटीडी)के एन-टर्मिनल डोमेन, एक चैपरोन के साथ एन-एक्सप्रेसिंग द्वारा बड़ी मात्रा में पुनर्संयोजन आरएनए-मुक्त एन (एन0)प्राप्त करना है। शुद्ध एन0पी को आरएसवी-विशिष्ट आरएनए ओलिगोस जोड़कर एनसीएलपीएस में उत्तेजित और इकट्ठा किया जा सकता है, और विधानसभा प्रक्रिया के दौरान, चैपरवन पीएनटीडी को आरएनए ओलिगोस के अलावा विस्थापित किया जाता है।

यहां, हम आरएसवी आरएनए-विशिष्ट एनसी की पीढ़ी और असेंबली के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम आणविक क्लोनिंग, प्रोटीन तैयार करने, इन विट्रो असेंबली और जटिल असेंबली के सत्यापन का वर्णन करते हैं। हम आणविक क्लोनिंग के लिए प्रोटीन सहएक्सप्रेशन के लिए द्वि-सिस्ट्रोनिक संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए क्लोनिंग रणनीति को उजागर करते हैं। प्रोटीन तैयार करने के लिए, हम सेल संस्कृति, प्रोटीन निष्कर्षण, और प्रोटीन परिसर की शुद्धि की प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। फिर हम आरएसवी आरएनए-विशिष्ट एनसी की इन विट्रो असेंबली के लिए विधि पर चर्चा करते हैं। अंत में, हम इकट्ठे एनसीएलपी की विशेषता और कल्पना करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) और नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) का उपयोग करते हैं।

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Protocol

1. आणविक क्लोनिंग

नोट: लिगासे इंडिपेंडेंट क्लोनिंग (एलआईसी) का उपयोग आरएसवी द्वि-सिस्ट्रोनिक सहएक्सपीशन निर्माण प्लाज्मिड बनाने के लिए किया गया था। एलआईसी 1990 के दशक की शुरुआत में विकसित एक विधि है, जो वेक्टर और डीएनए डालने21, 22के बीच पूरकता के साथ ओवरहैंग बनाने के लिए T4 डीएनए पॉलीमरेज की 3'-5 ' एक्सो गतिविधि का उपयोग करती है। निर्माण 2BT-10 वेक्टर डीएनए का उपयोग करके किए गए थे, जिसमें ओपन रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ)(चित्रा 1)के एन-टर्मिनल पर 10x उनका टैग होता है।

  1. एसएसपीआई पाचन का उपयोग करके एलआईसी वैक्टर का रैखीकरण करें।
    1. SSPI 10X बफर के 10 माइक्रोन, 5 यू/μL की एकाग्रता पर SSPI एंजाइम के 4 μL, वेक्टर मिनीप्रप डीएनए के 5 माइक्रोन की बराबर मात्रा, और बाँझ ddH2O से १०० μL गठबंधन ।
    2. डाइजेस्ट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे तक इनक्यूबेट करें।
    3. वेक्टर डीएनए की निकासी के लिए 1.0% एगर उठे जेल पर डाइजेस्ट चलाएं।
    4. निष्कर्षण और शुद्धिकरण करने के लिए एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करें। डीडीएच2ओ के 30 माइक्रोन में वेक्टर डीएनए की अंतिम मात्रा को निलंबित करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एन1-391 और पी1-126 के लिए डीएनए आवेषण तैयार एन1-391 फॉरवर्ड प्राइमर, एन1-391 रिवर्स प्राइमर, पी1-126 फॉरवर्ड प्राइमर, और पी1-126 रिवर्स प्राइमर(तालिका 1)का उपयोग करते हुए।
    नोट: 55 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री सेल्सियस के बीच के पिघलने के तापमान को सुनिश्चित करने के लिए रैखिक वेक्टर के साथ पर्याप्त ओवरलैप है। रिवर्स प्राइमर के लिए, एक ही कारण के लिए रैखिक वेक्टर के रिवर्स पूरक कतरा के साथ पर्याप्त ओवरलैप है।
    1. तालिका 2 और तालिका 3में स्थितियों का उपयोग कर डीएनए डालने की पीसीआर प्रवर्धन करें।
    2. प्रवर्धित डीएनए डालने को निकालें। 1.0% एगर उठे जेल पर पिछले चरण से पीसीआर उत्पादों को चलाएं, फिर जेल निष्कर्षण द्वारा बैंड निकालें और शुद्ध करें। निकाले गए डीएनए की अंतिम मात्रा को डीएच2ओ के 15 माइक्रोन में निलंबित करें।
  3. टी 4 डीएनए पॉलीमरेज वेक्टर का उपचार और डीएनए डालें(तालिका 4)।
    नोट: उपचार वेक्टर डीएनए और सम्मिलित डीएनए के लिए अलग से किया जाना चाहिए ।
    1. कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें। इसके बाद 20 मिनट तक 75 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीमरेज को हीट-इनएक्टिवेट करें। प्रतिक्रिया मिश्रण को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एनील एलआईसी वेक्टर और डालने वेक्टर।
    1. एलआईसी वेक्टर डीएनए के 2 माइक्रोन और बाँझ डीडीएच 2 ओ के 2 माइक्रोन के साथ एक नकारात्मक नियंत्रणस्थापितकरें।
    2. 0.2 मिली ट्यूब में पिछले टी 4 डीएनए पॉलीमरेज प्रतिक्रियाओं से डीएनए डालें और एलआईसी वेक्टर डीएनए के 2 माइक्रोन को मिलाएं।
    3. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एनीलिंग प्रतिक्रिया करें।
    4. 25 mM की एकाग्रता पर EDTA के 1.3 माइक्रोन के साथ प्रतिक्रिया को बुझाें।
    5. प्रतिक्रिया को ई कोलाई टॉप10 सक्षम कोशिकाओं के 100 माइक्रोन में बदल दें और उन्हें एम्पीसिलिन चयन प्लेट23,24पर प्लेट करें।
  5. सकारात्मक निर्माणों की पहचान करें।
    1. प्लाज्मिड मिनीप्रेप समाधान तैयार करें। यह एलबी मीडिया में कॉलोनी पिकिंग और टीका के माध्यम से किया जा सकता है। आमतौर पर 3 कॉलोनियां पर्याप्त होती हैं।
    2. मिश्रण को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. 10 मिनट के लिए 4,560 x ग्राम पर मिश्रण को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्याग दें।
    4. P1 बफर के 250 μL में छर्रों को फिर से खर्च करें और स्पिन मिनीप्रिप किट का उपयोग करके प्लाज्मिड मिनीप्रिप तैयार करें।
    5. AseI या अन्य प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करके मिनीप्रेप उत्पाद का पाचन विश्लेषण करें।
    6. 0.8% एगर उठे जेल पर नमूने लोड करें और पचा हुआ प्लाज्मिड चलाएं। एक यूवी लैंप के नीचे जेल का विश्लेषण करें।
    7. सकारात्मक उत्पाद के अनुक्रम को मान्य करने के लिए अनुक्रमण सेवा का उपयोग करें।
  6. सहएक्सप्रेसियन डीएनए डालें प्राप्त करें।
    1. टेम्पलेट्स के रूप में पहले से निर्मित2BT-10 N1-391 और 2BT-10 पी 1-126 का उपयोग करके एन1-391 और पी1-126 प्राप्त करने के लिए पीसीआर प्रदर्शन करें।
    2. 2बीटी-10 एन1-391 से एन 1-391 प्राप्त करने के लिए1 पीसीआर प्रदर्शन करें टेबल 2 और टेबल 3 में पीसीआर शर्तों का उपयोग करके एन1-391 फॉरवर्ड प्राइमर और रिवर्स प्राइमर 5'-GTGAAGATCCTGGGATGCAATGGGGGGGG
      सीजीसीसीसीसीजीजीजीजीटीसीसीजीसीसीसीसीजीसीसी-3'।
    3. 2बीटी-10 पी1-126 से पी 1-126 प्राप्त करने के लिए2 पीसीआर फॉरवर्ड प्राइमर का उपयोग करके निर्माण करें: 5'-CCGCCGCATCATTGCATCAGGATGATCTTCACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3' और पी1-126 रिवर्स प्राइमर (तालिका 2 और तालिका 3में पीसीआर शर्तों का उपयोग करें) ।
    4. अंत में, एन1-391 और पी 1-126 को मर्ज करनेके लिए पिछले 2 पीसीआर प्रतिक्रियाओं के मिश्रित उत्पादों पर ओवरलैप पीसीआर करें। एन1-391 फॉरवर्ड प्राइमर और पी1-126 रिवर्स प्राइमर का इस्तेमाल करें। टेबल 5 और टेबल 6में पीसीआर की स्थिति का उपयोग करें ।
  7. वेक्टर और डीएनए डालने में शामिल हों।
    1. चरण 1.3 में प्रोटोकॉल का पालन करते हुए टी 4 डीएनए पॉलीमरेज के साथ ओवरलैप पीसीआर उत्पाद का इलाज करें।
    2. स्टेप 1.4 में प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एलआईसी वेक्टर और पीसीआर उत्पाद एनील।
    3. चरण 1.5 में प्रोटोकॉल का पालन करने वाले सकारात्मक निर्माणों की पहचान करें।

2. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि

नोट: एन और पी दोनों के सह-अभिव्यक्ति के द्वि-सिस्ट्रोनिक निर्माण के लिए ई कोलाई का उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को संस्कृति, लेकिन रात भर कम तापमान (16 डिग्री सेल्सियस) पर अभिव्यक्ति को पूरा करें। प्रोटीन परिसरों को कोबाल्ट कॉलम, आयन एक्सचेंज और आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी(चित्रा 2) केसंयोजन के माध्यम से शुद्ध करें।

  1. प्रोटीन उत्पादन के लिए ई. कोलाई BL21 (DE3) तनाव का उपयोग करें। एलबी (लुरिया शोरबा) माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 एल सेल संस्कृतियों को बढ़ाएं जब तक कि ओडी600 0.6 तक न पहुंच जाए।
  2. तापमान को 16 डिग्री सेल्सियस तक कम करें। एक घंटे बाद, 0.5 m isopropyl 1-thio-D-galactopyranoside (IPTG) रातोंरात के साथ अभिव्यक्ति को प्रेरित करें।
  3. 25 मिनट के लिए 4,104 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और फिर सुपरनेट को त्यागें।
  4. लाइसिस बफर ए (50 एमएम सोडियम फॉस्फेट, पीएच 7.4, 500 एमएमएल एनएसीएल, 5 एमएम इमिडाजोल, 10% ग्लिसरोल, और 0.2% एनपी40) के 200 मिलील में सेल छर्रों को फिर से रीसुस्पेंड करें। सेल कल्चर के 1 एल से सेल छर्रों को रीसुस्पेंड करने के लिए लाइसिस बफर के 50 एमएल का इस्तेमाल करें।
  5. 15 मिनट, 3 सेकंड पर, और 3 सेकंड बंद के लिए सोनीशन द्वारा कोशिकाओं को Lyse । फिर 40 मिनट के लिए 37,888 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाएं।
    नोट: प्रोटोकॉल एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में सोनीशन से पहले कोशिकाओं को फ्रीज करके रोका जा सकता है।
  6. सुपरनेट को कोबाल्ट गुरुत्वाकर्षण कॉलम (व्यास एक्स लंबाई: 2.5 सेमी x 10 सेमी) में लोड करें, जिसमें ~ 10mL मोतियों के 5-10 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) के साथ लाइसिस बफर के बराबर हो जाते हैं।
  7. बफर बी के 5 सीवी (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.4, 1 एम एनएसीएल, 10% ग्लाइसरोल, और 5 एमएम इमिडाजोल) और बफर सी के 5 सीवी (50 एमएम ट्राइज-एचसीएल पीएच 7.4, 500 mM NaCl, 10% ग्लाइकरोल, और 5 mzomida imle) के साथ कॉलम धो लें।
  8. बफर डी (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.4, 500 एमएमएम एनएसीएल, और 250 mm इमिडाजोल) के 2 सीवी का उपयोग करके मोतियों से प्रोटीन को एल्यूट करें।
  9. क्यू कॉलम के लिए क्यूए बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 5% ग्लिसरोल) के साथ एल्यूटेड प्रोटीन 5x को पतला करें।
  10. कॉलम को बराबर करने के लिए क्यू बफर के साथ क्यू कॉलम के 5 एमएल को धोएं, फिर पेरिस्टाल्टिक पंप (जैसे, खरगोश) का उपयोग करके क्यू कॉलम में पतला नमूना लोड करें।
  11. क्यू कॉलम को क्यू कॉलम को क्यू बफर और क्यूबी बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच7.4, 1.5 एम एनएसीएल, 5% ग्लिसरोल) के साथ एचपीएलसी मशीन में लोड करें। प्रवाह दर को 1 एमएल/न्यूनतम के रूप में स्थापित करें ।
  12. क्यूए बफर (1-2 सीवी/ सिस्टम प्रवाह को 3 एमएल/मिनट तक सेट करें।
  13. यूवी1 को 280 एनएम और यूवी2 को 260 एनएम सेट करें। अंशों को इकट्ठा करने के लिए 96 गहरी अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें।
  14. एल्यूट प्रोटीन एल्यूशन एजेंट (QB बफर) के एक स्टेपवाइज ढाल का उपयोग करके प्रत्येक एकाग्रता के 3-4 सीवी को लागू करते हैं, हर बार 0% QB से शुरू होने वाले प्रतिशत में 5% की वृद्धि करते हैं। एन0पी प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 15% क्यूबी बफर पर बाहर आएगा ।
  15. एक बार जब सभी प्रोटीन को eluted कर दिया जाता है, तो कॉलम को 100% QB बफर (2 सीवी) के साथ धो लें।
  16. जेल फिल्ट्रेशन सुपरडेक्स 200 द्वारा प्रोटीन को अलग करें 10/300 जीएल कॉलम (व्यास एक्स लंबाई: 1.0 सेमी x 30 सेमी) और बफर ई (20 एमएम एचईपीईएस पीएच 7.4 और 200 एमएम एनएसीएल) के साथ संतुलन बढ़ाएं।
  17. एसडीएस-पेज द्वारा प्रोटीन युक्त अंशों का विश्लेषण करें।

3. वायरस विशिष्ट नेकां के इन विट्रो विधानसभा

नोट: आरएसवी-विशिष्ट नेकां (एन:आरएनए) की इन विट्रो असेंबली आरएनए ओलिगोस के साथ तैयार एन0पी कॉम्प्लेक्स को इनक्यूबेटिंग करके किया गया था। फिर, एसईसी क्रोमेटोग्राफी का उपयोग एन0पी और अतिरिक्त आरएनए(चित्रा 2)से असेंबली कॉम्प्लेक्स को अलग करने के लिए किया गया था।

  1. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 1:1.5 के आणविक अनुपात के साथ आरएनए ओलिगो के साथ शुद्ध एन0पी परिसर को मिलाएं और इनक्यूबेट करें, आमतौर पर प्रोटीन एन 0 पी का1मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के साथ 1 मिलीलीटर का 1 एमएल अगले चरण के लिए पर्याप्त है । नियंत्रण नमूना है, जो केवल एन0पी प्रोटीन की एक ही राशि शामिल सेट करें ।
  2. प्री-समतुल्य जेल फिल्ट्रेशन सुपरडेक्स 200 बढ़ाएं बफर ई (20 एमएम एचईपीई, पीएच 7.4, 200 एमएमएम एनएसीएल) के साथ 10/300 जीएल कॉलम बढ़ाएं।
  3. 15 मिनट के लिए 21,130 x ग्राम के साथ नमूना अपकेंद्रित्र करें, किसी भी वर्षा को हटा दें और एसईसी कॉलम में सुपरनैंट लोड करें।
  4. एन: आरएनए असेंबली नमूना और एन0पी नियंत्रण नमूने की एसईसी क्रोमेटोग्राफी छवियों की तुलना करें, यह पहचानने के लिए260/ए280 अनुपात को जोड़ें कि कौन सी चोटियां इकट्ठे एन-आरएनए, एन0पी और मुफ्त आरएनए हैं।
  5. चोटी के अंशों को इकट्ठा करें, एसडीएस-पेज जेल चलाएं, या ग्रिड बनाएं।
  6. असेंबली एन-आरएनए परिसर के लिए, एन-आरएनए पीक के सभी अंशों को इकट्ठा करें, आरएनए निष्कर्षण करें और विशिष्ट आरएनए की लंबाई को डबल-चेक करने के लिए यूरिया-पेज जेल चलाएं, जो पहले चरण में मिश्रित और इनक्यूबेटेड के समान है।

4. नकारात्मक दाग ग्रिड बनाना

नोट: नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) एक ऐसी विधि है जिसमें अणुओं को कार्बन फिल्म में सोख दिया जाता है और फिर भारी धातु परमाणुओं की एक परत में एम्बेडेड किया जाता है। नकारात्मक दाग EM एक उच्च छवि विपरीत पैदा करता है, जिससे कणों को देखना और गणना करना आसान हो जाता है। एक और लाभ यह है कि एक कार्बन फिल्म के लिए कणों के सोखने आमतौर पर कुछ पसंदीदा झुकाव के साथ ग्रिड का पालन करने के लिए अणुओं लाती है । जब अणु समान अभिविन्यास में होते हैं, तो उन्हें संरचनात्मक रूप से अलग वर्गों में अलग करना आसान होता है। नकारात्मक दाग EM इस प्रकार नमूना तैयारी25, 26 (चित्रा 3)का मार्गदर्शन करने के लिए उपयुक्त तकनीक है ।

  1. माइक्रोवेव या एक छोटे सेगिलास बीकर में एक छोटे से गिलास बीकर में 5 एमएल गर्मी जब तक यह उबलते है ।
  2. 37.5 मिलीग्राम यूरेरियल फोरमेट का वजन करें और 0.75% यूरेरियल फोरमेट धुंधला समाधान बनाने के लिए गर्म डीडीएच2ओ के 5 एमएल में जोड़ें। प्रकाश से बचाने के लिए एक एल्यूमीनियम पन्नी कवर बीकर के नीचे हिलाओ।
  3. धुंधला समाधान करने के लिए 10 एम NaOH के 4 μL जोड़ें और प्रकाश से संरक्षित 15 मिनट के लिए हलचल जारी है ।
  4. एक टेस्ट ट्यूब में 0.22 मिमी फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
  5. सतत कार्बन-कोटेड ईएम ग्रिड हाइड्रोफिलिक27बनाने के लिए ग्लो डिस्चार्ज का उपयोग करें।
    नोट: ग्रिड एक बिजली की आपूर्ति से जुड़े एक कक्ष के अंदर रखा जाता है । जब उच्च वोल्टेज लागू किया जाता है, तो कक्ष के भीतर गैस आयनित हो जाती है, और उन्हें हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए कार्बन ग्रिड पर नकारात्मक रूप से चार्ज आयन जमा करते हैं।
  6. एक पैराफिल्म स्ट्रिप को काटें और मोड़ें। पैराफिल्म के एक तरफ बफर के 40 माइक्रोन की 2 बूंदें, और दूसरी तरफ धुंधला समाधान के 40 माइक्रोन की एक और 2 बूंदें पिपेट करें।
  7. ईएम कार्बन ग्रिड बनाने के लिए, 1 मिनट के लिए प्रोटीन नमूना के 3 माइक्रोन लागू करें।
  8. एक दाग कागज के खिलाफ ग्रिड दाग।
    नोट: ग्रिड बफर के साथ 2x धोया जाता है, और 0.75% यूरेरियल फोरमेट धुंधला समाधान के साथ 1x प्रत्येक चरण के बाद दाग।
  9. 30 सेकंड के लिए 0.75% यूरेरियल फोरमेट धुंधला समाधान की दूसरी बूंद में ग्रिड की सतह पकड़ो।
  10. अतिरिक्त दाग समाधान को हटाने और ग्रिड को हवा-शुष्क करने की अनुमति देने के लिए एक ब्लॉटिंग पेपर के खिलाफ ग्रिड को दाग दें।
  11. इमेजिंग से पहले ग्रिड बॉक्स में ग्रिड स्टोर करें।

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Representative Results

आरएनए-मुक्त एन0पी प्रोटीन का शुद्धिकरण
इस प्रोटोकॉल के साथ, बड़े पैमाने पर घुलनशील विषमता आरएसवी एन0पी परिसर प्राप्त किया जा सकता है। पी प्रोटीन के एन और एन टर्मिनल भाग की पूरी लंबाई ई. कोलाईमें एन प्रोटीन पर 10X अपने टैग के साथ सह व्यक्त किया गया । एन0पी को कोबाल्ट कॉलम, आयन एक्सचेंज और आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। एन0पी में पूर्ण लंबाई एन और एन टर्मिनल पी दोनों शामिल हैं, लेकिन यूवी अवशोषण ए260 /ए 280अनुपात20 (चित्रा 4)के आधार पर सेलुलर आरएनए शामिल नहीं थे।

एन-आरएनए की विधानसभा और नकारात्मक दाग के साथ जांच
तब हमने यह दर्शाया कि शुद्ध एन0पी को विशिष्ट आरएनए ओलिगोस के साथ इनक्यूबेटिंग करके Nuceloplasmid जैसे कणों (एनसीएलआरपी) में उत्तेजित और इकट्ठा किया जा सकता है। एनसीएलपीएस को आरएनए ओलिगोस के साथ एन0पी को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 1:1.5 के अनुपात के साथ इनक्यूबेटिंग करके इकट्ठा किया गया था और फिर जेल निस्पंदन कॉलम के माध्यम से चलाया गया था। जब एन: आरएनए परिसर रूपों, यह तीन चोटियों से पता चलता है: 1चोटी एन: आरएनए है, 2चोटी एन0पी है, और3 चोटी अतिरिक्त मुक्त आरएनए है । एन: आरएनए पीक का उच्चतम अंश ईएम20 (चित्रा 5)के साथ जांच के लिए नकारात्मक दाग ग्रिड बनाता है।

Figure 1
चित्रा 1. प्लाज्मिड निर्माणों का उदाहरण। एक। आरएसवी एन1-391का निर्माण; बी। आरएसवी पी1-126का निर्माण; C. एन1-391 और पी 1-126 के सह-प्रसार के लिएद्वि-सिस्ट्रोनिकनिर्माण। पहला जीन आरएसवी एन1-391,दूसरा जीन आरएसवी पी1-126,एंटीबायोटिक प्रतिरोधी जीन (AmpR), और प्रमोटरों को क्रमशः पीले, सियान, गुलाबी और नारंगी बक्से में हाइलाइट किया जाता है। संक्षेप में, आरएसवी एन1-391 और आरएसवी पी1-126 के जीन आवेषण अलग से बनाए जाते हैं और इकट्ठे होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। प्रोटीन कॉम्प्लेक्स एन1-391 पी 1-126के शुद्धिकरण का प्रवाहचार्ट । इसमें ई कोलाई सेल कल्चर के टीका और बड़े पैमाने पर ग्रो-अप को रेखांकित किया गया है और सेंट्रलाइजेशन द्वारा सेल की कटाई की गई है । सेल लाइसिस के बाद प्रोटीन के नमूनों को एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी (यानी सीओ 2 + कॉलम), आयन-एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी (यानी क्यू कॉलम) और जेल फिल्ट्रेशन साइज अपवर्जन (एसईसी) क्रोमेटोग्राफी से शुद्ध किया जाता है । प्रोटीन के नमूनों को आगे एसडीएस-पेज जेल द्वारा विश्लेषण किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। इमेजिंग के लिए नकारात्मक दाग ईएम ग्रिड की तैयारी। ए ग्लो ग्रिडों का निर्वहन करता है। बी। नकारात्मक धुंधला ग्रिड के लिए प्रक्रिया दिखाई जाती है। चिमटी का उपयोग ग्रिड लेने के लिए किया जाता है, जिसके बाद प्रोटीन का नमूना 1 मिनट के लिए लगाया जाता है। ग्रिड ब्लॉटिंग पेपर के साथ दागदार हैं। ग्रिड को बफर के साथ दो बार और दो बार 0.75% यूरेनिल फोरमेट धुंधला समाधान के साथ धोया जाता है। ग्रिड 30 सेकंड के लिए दूसरे धुंधला समाधान ड्रॉप में आयोजित कर रहे हैं । अंतिम ब्लॉटिंग के बाद प्रत्येक धोने और हवा में सूखने के बाद ग्रिडों को दागदार किया जाता है। C. ग्रिड इमेजिंग के लिए ग्रिड बॉक्स में संग्रहीत किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4. एन1-391 पी 1-126परिसर के सहपरिफिकेशनके प्रतिनिधि परिणाम। एक। एन1-391पी1-126के एसईसी प्रोफाइल । बी। आरएनए के साथ विधानसभा एन1-391पी1-126 के एसईसी प्रोफाइल । C. एसडीएस-पेज जेल केवल एन-आरएनए कॉम्प्लेक्स के लिए एन प्रोटीन और एन1-391 पी 1-126कॉम्प्लेक्स के एन और पी प्रोटीन दोनों के लिए बैंड दिखाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। एन-आरएनए की प्रतिनिधि छवियां। ए और बी एन-391-आरएनए पीक इन फिगर 4 सेएन-आरएनएकी प्रतिनिधि नकारात्मक दाग ईएम छवियांहैं। एन-आरएनए परिसरों को चित्र 3में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके दाग दिया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्राइमरों
एन1-391 आगे 5'-TACTTCCAATCAATGCCCCCTGCAAAGGAAG-3'
एन1-391 रिवर्स 5'-TTATCCACTTCATGTTATTACAGCCACGTCTCTTTTTTTTGG-3'
पी1-126 आगे 5'-TACTTCCAATCAATATGAAGTTCCCCCCGAG-3 '
पी1-126 रिवर्स 5'-TTATCCACTTCATTTATTTTTTTTTTTTTGATTTTAGTAGTAGC-3'

तालिका 1. प्राइमर दृश्यों।

डीएनए डालने की पीसीआर प्रवर्धन
15 माइक्रोन 10x फू पॉलीमरेज रिएक्शन बफर
3 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर (100 माइक्रोन एकाग्रता)
3 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर (100 माइक्रोन एकाग्रता)
15 माइक्रोन 2.5 mm एकाग्रता पर डीएनटीपी मिश्रण
6 माइक्रोन प्लाज्मिड डीएनए में एन या पी (100ng/μL) का जीन होता है
7 माइक्रोन डीएमएसओ
3 माइक्रोन 2.5U/μL पर Pfu बहुलक
वॉल्यूम 150 माइक्रोन को भरने के लिए बाँझ डीडीएच2ओ

तालिका 2. डीएनए डालने के रिएजेंट्स की पीसीआर प्रवर्धन।

डीएनए डालने की पीसीआर एम्प्लिकेशन
क़दम समय तापमान चक्र
डेनैचेशन 4 मिनट। 95 डिग्री सेल्सियस 1
डेनैचेशन 45 सेकंड। 95 डिग्री सेल्सियस 30
एनीलिंग 30 सेकंड। 62 डिग्री सेल्सियस
एक्सटेंशन* 90 सेकंड। 72 डिग्री सेल्सियस
विस्तार 10 मिनट। 72 डिग्री सेल्सियस 1
पकड ∞ 4 डिग्री 1
150 माइक्रोल मिश्रण तीन अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं (3 x 50μL) में चलाया जा सकता है।
* Pfu डीएनए बहुलक के लिए, 1 kb/min विस्तार चरण के लिए अनुशंसित गति है । यहां एन1-391 जीन या पी1-126 जीन की दोनों लम्हियां 15 केबी से कम हैं।
इस प्रकार, विस्तार चरण के लिए 90 सेकंड का उपयोग किया गया था।

तालिका 3. डीएनए का पीसीआर प्रवर्धन थर्मोसाइक्लिंग प्रोग्राम डालें।

T4 डीएनए पॉलीमरेज उपचार
10 एक्स बफर 2 माइक्रोन
वेक्टर/डालें डीएनए (0.1 पीएमओएल वेक्टर या 0.2 पीएमओएल डालने) 5 माइक्रोन
25 एमएम पर डीएनटीपी * 2 माइक्रोन
100 एमएमएम पर डीटीटी 1 माइक्रोल
टी 4 डीएनए पॉलीमरेज (एलआईसी योग्य) 0.4 माइक्रोल (1.25 यू)
बाँझ डीडीएच2ओ 9.6 माइक्रोल
* dGTP वेक्टर के लिए इस्तेमाल किया गया था, और dCTP डालने डीएनए के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

तालिका 4. टी 4 डीएनए पॉलीमरेज उपचार।

ओवरलैप पीसीआर
15 माइक्रोन 10 एक्स फू पॉलीमरेज रिएक्शन बफर
3 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर (100 माइक्रोन)
3 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर (100 माइक्रोन)
15 माइक्रोन डीएनटीपी मिक्स (2.5 mM)
3 माइक्रोन 1सेंट राउंड पीसीआर से डीएनए जिसमें जीन एन1-391 (100 एनजी/माइक्रोन) होते हैं
3 माइक्रोन 1सेंट राउंड पीसीआर से डीएनए जिसमें जीन पी1-126 (100 एनजी/माइक्रोन) होते हैं
7 माइक्रोन डीएमएसओ
3 माइक्रोन Pfu बहुलक (2.5 U/μL)
वॉल्यूम 150 माइक्रोन को भरने के लिए बाँझ डीडीएच2ओ

तालिका 5. ओवरलैप पीसीआर रिएजेंट्स।

ओवरलैप पीसीआर
क़दम समय तापमान चक्र
डेनैचेशन 4 मिनट। 95 डिग्री सेल्सियस 1
डेनैचेशन 45 सेकंड। 95 डिग्री सेल्सियस 30
एनीलिंग 30 सेकंड। 62 डिग्री सेल्सियस
एक्सटेंशन* 2 मिनट। 72 डिग्री सेल्सियस
विस्तार 10 मिनट। 72 डिग्री सेल्सियस 1
पकड ∞ 4 डिग्री सेल्सियस 1
150 माइक्रोल मिश्रण तीन अलग पीसीआर प्रतिक्रियाओं (3 x 50 μL) में चलाया जा सकता है।
* Pfu डीएनए बहुलक के लिए, 1 kb/min विस्तार चरण के लिए अनुशंसित गति है । यहां जीन एन1-391 और पी1-126 की कुल लंबाई 20 केबी से कम है। इस प्रकार, विस्तार चरण के लिए 2 मिनट का उपयोग किया गया था।

तालिका 6. ओवरलैप पीसीआर थर्मोसाइक्लिंग प्रोग्राम।

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Discussion

गैर-संरक्षित नकारात्मक-भावना (एनएनएस) आरएनए वायरस की ज्ञात न्यूक्लियोकैप्सिड-जैसे कण (एनसीएलपी) संरचनाएं दर्शाती हैं कि इकट्ठे हुए एनसीएलपी मेजबान सेलुलर आरएनए के साथ जटिल एन हैं जब बैक्टीरियल या यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणालियोंमें अधिक अभिव्यक्ति की जाती है15,16,17,18,19। पिछले अध्ययनों ने आरएनए मुक्त एन को विभिन्न तरीकों से प्राप्त करने का प्रयास किया है, जैसे कि आरएनएई ए पाचन, उच्च नमक धोने, या गैर-विशिष्ट सेलुलर आरएनए28, 29को हटाने के लिए विभिन्न पीएच बफ़र्स को समायोजित करना। हालांकि, उपरोक्त तरीकों में से किसी को भी वायरस-विशिष्ट एनसी की असेंबली के लिए सफलतापूर्वक उपयोग नहीं किया जा सकता है। आरएनए-मुक्त आरएसवी एन प्राप्त करने के लिए, हमने आरएनएसई ए पाचन, उच्च नमक (1.5 M NaCl) धोने, पीएच 5.0 से पीएच 9.0, प्रोटीन डेनैचुरेशन और रेनैचुरेशन तक बफर पीएच को समायोजित करने सहित तरीकों का एक संयोजन करने की भी कोशिश की। कई असफल परीक्षणों के बाद, हम अभी भी उपरोक्त तरीकों के साथ आरएनए-मुक्त एन नहीं प्राप्त कर सके। हम संक्षेप में प्रयासों और संभावित कारणों पर चर्चा करेंगे ।

आरएनए-मुक्त एन प्राप्त करने के लिए एक विधि RNase ए के साथ इकट्ठे NCLPs में मेजबान सेलुलर आरएनए को पचाने के लिए है ।  वीएसवी में, 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता पर आरएनएएस ए के साथ शुद्ध एनसीएलपी की इनक्यूबेशन 1 घंटे के लिए पूरी तरह से एनसी28से आरएनए को हटा दिया गया । शुद्ध खाली ओलिगोमेरिक एन को तब आरएनएज़ अवरोधकों की उपस्थिति में 1:5 के मोलर अनुपात में पॉली-ए (250-एनटी या उससे अधिक) के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। पुनर्गठित एन से अलग आरएनए के विश्लेषण: पाली-ए से पता चला है कि आरएनए लंबाई में लगभग ९० nt था । यह सुझाव दिया है कि न्यूक्लियोप्रोटीन के बाहर आरएनए पिछले कदम से दूषित RNase A द्वारा गैर विशिष्ट पाचन के लिए अतिसंवेदनशील है । आरएसवी पर लागू होने पर आरएनए को हटाने के लिए आरएनएसई ए पाचन की रणनीति सफल नहीं रही । ऐसा दो कारणों से हो सकता है। सबसे पहले, दूषित RNase ए आरएसवी-विशिष्ट आरएनए को पचा लेगा, जिसे बाद में इनक्यूबेटेड किया जाएगा और एन के साथ इकट्ठा किया जाएगा । दूसरा, आरएसवी में आरएनएसई ए पाचन की दक्षता बहुत कम है। इसका कारण यह है कि आरएनए अलग-अलग एनएनएस वायरस में अलग-अलग इकट्ठा होते हैं। एन: आरएनए की ज्ञात क्रिस्टल संरचनाएं बताती हैं कि आरएनए वीएसवी में नेकां के बाहर बांधता है, लेकिन आरएसवी30, 31में नेकां के अंदर। नेकां के आरएनएई ए तक पहुंच और पचाने के लिए आरएनएई के लिए आरएनएईटी के लिए कम दक्षता का कारण बन सकता है।

आरएनए-फ्री एन प्राप्त करने के लिए एक और तरीका ट्रंकेशन बनाना है जो एन-टर्मिनल आकृति (एन-आर्म) और एन के सी-टर्मिनल आकृति (सी-आर्म) दोनों को काटता है। हालांकि, इस छोटा आरएनए मुक्त एन का उपयोग आरएनए के साथ एक स्थिर नेकां में इकट्ठा करने के लिए नहीं किया जा सकता है क्योंकि एन-आर्म को मिसाल एन सबयूनिट के सी-टर्मिनल डोमेन (सीटीडी) के साथ बातचीत करके अपने पड़ोसी सबयूनिट में जोड़ दिया जाता है। विस्तारित सी-आर्म अगले एन सबयूनिट31के सीटीडी में तैनात है ।

आरएनए-फ्री एन प्राप्त करने के लिए एक अतिरिक्त तरीका उत्परिवर्ती एन तैयार करना है। उदाहरण के लिए, गैलॉक्स एट अल द्वारा प्राप्त परिणाम से पता चला है कि आरएसवी आरएनए मुक्त एन0पी कॉम्प्लेक्स को बैक्टीरिया32में पी के एन-टर्मिनस के साथ K170A/R185A डबल एन म्यूटेंट के सहएक्सप्रेशन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, इसमें आगे संरचनात्मक लक्षणों के लिए दो संभावित मुद्दे हैं। एक मुद्दा उच्च सांद्रता पर इस उत्परिवर्ती परिसर की कम स्थिरता है । दूसरा मुद्दा यह है कि उत्परिवर्ती परिसर आरएनए बाध्यकारी क्षमता है, जो विधानसभा के अगले कदम में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता खो दिया है ।

जबरदस्त चुनौतियों के बावजूद, हमने एक चैपरवन पी के साथ एन के सह-प्रयोग का उपयोग करके वायरस-विशिष्ट एनसी प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना और अनुकूलित किया है हाल ही में, एक अन्य सफल विधिपी1-50-तेव-एन 1-405-8xHisके लिए एक चिमेरिक फ्यूजन निर्माण एन्कोडिंग बनानाहै। तेव प्रोटीज क्लीवेज के बाद एन0पी प्राप्त किया जा सकता है। एन0पी की शुद्धता टीईवी क्लीवेज की दक्षता पर निर्भर करती है, जो एन और पी प्रोटीन के बीच चिमेरिक फ्यूजन को काटती है।

चिमरिक फ्यूजन विधि का उपयोग करने के बजाय, हमने एक द्वि-सिस्ट्रोनिक सहएक्सप्रेसियन निर्माण तैयार किया। विशेष रूप से, एन0पी कॉम्प्लेक्स के सह-प्रसार निर्माण को दो खुले रीडिंग फ्रेम में डिजाइन और इंजीनियर किया गया है, जिसमें पहले ओआरएफ में एन-टर्मिनल में 10x उनका टैग और दूसरे ओआरएफ 20 में पी से एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स (1-126) के साथ एन(1-391)की पूरी लंबाई शामिल है। संक्षेप में, एन0पी शुद्धि की समग्र प्रक्रिया कोबाल्ट मोतियों के साथ सेलुलर लाइसिस नमूनों से अपने टैग एन0पी और एन-आरएनए को शुद्ध करना है, क्यू कॉलम के साथ गैर-विशिष्ट आरएनए और एन: सेलुलर आरएनए परिसर को हटा दें, और एसईसी कॉलम के साथ एक शुद्ध एन0पी परिसर प्राप्त करें। एसईसी चरण में, एन 0 पी पीक अंशों से आरएनए निष्कर्षण के साथ260/ए280 के अनुपात की निगरानी और दोहरी जांच की जा सकती है।

सामूहिक रूप से, इस प्रोटोकॉल में, एन0पी कॉम्प्लेक्स के सह-प्रयोग के निर्माण को डिजाइन करने और अन्य एन-सेलुलर आरएनए परिसरों से आरएनए मुक्त एन0पी परिसर को अलग करने के लिए एक श्रृंखला आत्मीयता और आयन-विनिमय कॉलम का उपयोग करने की रणनीति सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं। एन0पी कॉम्प्लेक्स प्राप्त करने के लिए सह-प्रसार रणनीति की दक्षता अपेक्षाकृत कम है; लगभग 50% एन प्रोटीन अभी भी एन-सेलुलर आरएनए कॉम्प्लेक्स है। प्रोटोकॉल भी आरएनए मुक्त एन0पी और एन के साथ विशिष्ट आरएनए के साथ विधानसभा प्राप्त करने के लिए एन: एनएनएस वायरस के आरएनए परिसर प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एमोरी में लियांग प्रयोगशाला में अनुसंधान कार्यक्रमों को अमेरिका के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान (एनआईजीएमएस), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा पुरस्कार संख्या R01GM130950 के तहत समर्थन दिया जाता है, और एमोरी यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में रिसर्च स्टार्ट-अप फंड । लेखक सहायक समर्थन और महत्वपूर्ण चर्चा के लिए लियांग प्रयोगशाला के सदस्यों को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose SIgma A9539-500G making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore UFC901024 concentrate the protein sample
Ampicillin sodium GOLD BIOTECHNOLOGY 5118.111317A antibiotic for cell culture
AseI NEB R0526S making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads Gold Bio H-310-500 For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater CORNING 6885-DB Heate the sample
dCTP Invitrogen 10217016 making construct using LIC method
dGTP Invitrogen 10218014 making construct using LIC method
Glycerol Sigma G5516-4L making solution
HEPES Sigma H3375-100G making solution
HiTrap Q HP Sigma GE29-0513-25 Protein purification
Imidazole Sigma I5513-100G making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) GOLD BIOTECHNOLOGY 1116.071717A induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes VWR 47730-598 for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor SpectraLab MSX-XL-2020 sonicator for lysing cell
Negative stain grids Electron Microscopy Sciences CF400-Cu-TH For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R eppendorf M1282-0000 Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385-1L making solution
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480L PCR
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 Purify DNA
SSPI-HF NEB R3132S making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL Sigma GE29-0915-96 Protein purification
T4 DNA polymerase Sigma 70099-3 making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge Fisher Scientific 36-101-0816 Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride Sigma T3253-250G making solution
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22451 making negative stain solution

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References

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