Summary
호흡기 싱크량 바이러스(RSV) RNA 합성의 심층 기계분석의 경우, 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)의 후속 체외 조립을 위해 RNA-프리 뉴클레오프로틴(N0)의 공동발현을 위해 샤페론 인포단(P)을 활용하는 프로토콜을 보고한다.
Abstract
본격적인 RNA 템플릿의 사용은 바이러스학의 기계성 발견과 분석 개발을 모두 안내 할 수있는 바이러스 RNA 합성의 기본 지식을 발전시키는 데 중요합니다. 호흡기 싱크로바이러스(RSV)와 같은 비분할 음성감각(NNS) RNA 바이러스의 RNA 템플릿은 RNA 분자만이 아니라 오히려 리보뉴클레오단백질 복합체를 캡슐화한 뉴클레오단백질(N)이다. 본격적인 RNA 템플릿의 중요성에도 불구하고, 이러한 리보뉴클레오단백질 복합체의 생성 및 조립은 정교하게 유지되고 심층적인 용해가 필요합니다. 주요 과제는 과발현된 RSV N이 임의의 뉴클레오캡시드 와 같은 입자(NCLPs)를 형성하기 위해 세포 RNA에 비특이적 결합한다는 것입니다. 여기서, 먼저 n을 샤페론 인포단(P)으로 공동 발현한 다음, RNA 올리고스와 함께N0을 조립하여 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)를 획득하는 프로토콜을 확립하였다. 이 프로토콜은 이 전통적으로 도전적인 바이러스성 리보뉴클레오단백질 복합체의 준비에 있는 어려움을 극복하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
비분할 음성 감각(NNS) RNA 바이러스는 광견병, 에볼라 및 호흡 싱크바이러스(RSV)1,2와같은 많은 중요한 인간 병원균을 포함한다. RSV는 전 세계3명의어린이와 노인의 기관지염 및 폐렴과 같은 호흡기 질환의 주요 원인입니다. 현재, RSV4를예방하거나 치료하기 위해 효과적인 백신이나 항바이러스 요법을 사용할 수 없다. 수명 주기의 일환으로, RSV 게놈은 RSV RNA 의존RNA 폴리머라제에 의한 복제를 위한 템플릿으로서 작용하여 항게놈을 생성하며, 이는 차례로 자손 게놈을 생성하는 템플릿으로서 작용한다. 게놈 및 항게놈 RNA는 뉴클레오캡시드(N)를 형성하기 위해 뉴클레오프로틴(N)에 의해 완전히 캡슐화되어3. NC는 RSV 폴리머라제에 의한 복제 및 전사 모두에 대한 템플릿역할을 하기 때문에, 적절한 NC 어셈블리는 중합체가 RNA 합성5에대한 템플릿에 접근하는 것이 중요하다. 흥미롭게도, NNS 바이러스 성 중합체의 구조적 분석에 기초하여, 몇몇 N 단백질이 RNA 합성 후 RNA에 중합효소의 접근을 허용하고 RNA에 재결합하기 위해여러 N 단백질이 과도하게 해리되고 RNA6,7,8,9,10,11,12가가설된다.
현재, RSV RNA 중합 분석은 짧은 알몸 RNA템플릿(13,14)에정제된 RSV 폴리머라제를 사용하여 확립되었다. 그러나, RSV 폴리머라제의 활동은 알몸 RNA 템플릿을 사용할 때 RSV 폴리머라제에 의해 생성된 비공정 및 중단 성 제품에서 관찰된 바와 같이 최적에 도달하지 못한다. 바이러스 특이적 RNA를 가진 NC의 부족은 RSV RNA 합성의 추가 기계론적인 이해를 위한 1 차적인 장벽입니다. 따라서, 본격적인 RNA 템플릿을 사용하는 것은 RSV RNA 합성의 근본적인 지식을 발전시키기 위하여 중요한 필요가 된다. RSV 및 기타 NNS RNA 바이러스로부터뉴클레오캡시드 유사 입자(NCLPs)의 공지된 구조는 NCLP내의 RNA가 임의의 세포 RNA 또는 평균 바이러스 게놈 RNA15,16,17,18,19임을드러낸다. 함께, 주요 장애물은 N이 호스트 세포에서 과발현될 때 N이 NCLP를 형성하기 위하여 세포 RNA에 비특이적 결합한다는 것입니다.
이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 먼저 RNA가없는 (N0)을얻고 NCLPs20에정통 바이러스 게놈 RNA와 N0을 조립하는 프로토콜을 설립했다. 이 프로토콜의 원리는 RSV 인포프로틴(PNTD)의N-단자 도메인인 샤페론과 N을 공동 발현함으로써 다량의 재조합 RNA-free N(N0)을획득하는 것이다. 정제된 N0P는 RSV 특이적 RNA 올리고를 첨가하여 NCLPs로 자극및 조립될 수 있으며, 조립 과정에서, 샤페론 PNTD는 RNA 올리고스의 첨가시 변위된다.
여기서는 RSV RNA 특이적 NC의 생성 및 조립을 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 분자 복제, 단백질 제제, 시험관 내 조립 및 복잡한 조립의 유효성검사를 설명합니다. 분자 복제를 위한 단백질 공동발현을 위한 바이-시스트로닉 구조를 생성하는 복제 전략을 강조합니다. 단백질 제제를 위해, 우리는 세포 배양, 단백질 추출 및 단백질 복합체의 정제의 절차를 설명합니다. 그런 다음 RSV RNA 특이적 종크의 체외 조립 방법을 논의합니다. 마지막으로, 당사는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 음수 얼룩 전자 현미경(EM)을 사용하여 조립된 NCLP의 특성화 및 시각화를 합니다.
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Protocol
1. 분자 복제
참고: 리가제 독립 복제(LIC)는 RSV 바이시스트로닉 공동발현 생성물 플라스미드를 만드는 데 사용되었습니다. LIC는 1990년대 초에 개발된 방법으로, T4 DNA 폴리머라제의 3'-5' 엑소 활성을 사용하여 벡터와 DNA인서트(21,22)사이의 상호 보완성을 가진 오버행을 생성한다. 구조는 오픈 리딩 프레임(ORF)(도 1)의 N 단말에서 10배 의 그의 태그로 구성된2BT-10벡터 DNA를 사용하여 만들어졌다.
- SSPI 소화를 사용하여 LIC 벡터의 선형화를 수행합니다.
- SSPI 10X 버퍼 10μL, SSPI 효소 4μL을 5 U/μL 의 농도로 결합하고, 벡터 미니렙 DNA의 5 μg, 멸균 ddH2O ~ 100 μL을 결합합니다.
- 37°C에서 3시간 동안 소화를 배양합니다.
- 벡터 DNA의 추출을 위해 1.0% 아가로즈 젤에서 다이제스트를 실행합니다.
- 겔 추출 키트를 사용하여 추출 및 정제를 수행합니다. ddH2O의 30 μL에서 벡터 DNA의 최종 부피를 일시 중단하고 -20 °C에 저장합니다.
- N1-391 포워드 프라이머, N1-391 리버스 프라이머, P 1-126 포워드 프라이머 및 P 1-126 역프라이머(표1)를사용하여 N1-391 및 P1-126에 대한 DNA 삽입을 준비한다.
참고: 55°C와 60°C 사이의 용융 온도를 보장하기 위해 선형화된 벡터와 충분한 중복이 있습니다. 역프라이머의 경우 동일한 이유로 선형화된 벡터의 역 보완 가닥과 충분한 중복이 있습니다.- 표 2 및 표 3의조건을 사용하여 DNA 삽입의 PCR 증폭을 수행한다.
- 증폭된 DNA 삽입물을 추출합니다. 1.0% 아가로즈 젤에서 이전 단계에서 PCR 제품을 실행한 다음 젤 추출하여 밴드를 추출하고 정화합니다. ddH2O의 15 μL에서 추출된 DNA의 최종 부피를 일시 중단합니다.
- 벡터의 T4 DNA 중합체 치료 및 삽입DNA(표 4).
참고: 벡터 DNA 및 삽입 DNA에 대해 별도로 치료수행해야 합니다.- 상온에서 40분 동안 혼합물을 배양합니다. 이어서, 20분 동안 75°C에서 중합효소를 열비활성화한다. 반응 혼합물을 -20°C에 보관합니다.
- LIC 벡터와 인서드 벡터를 음침합니다.
- LIC 벡터 DNA 2μL 및 멸균 ddH2O의 2 μL로 음수 제어를 설정합니다.
- 0.2mL 튜브에서 이전 T4 DNA 폴리머라제 반응으로부터 삽입 DNA 2μL및 LIC 벡터 DNA 2 μL을 결합합니다.
- 실온에서 10분 동안 어닐링 반응을 수행합니다.
- 25 mM의 농도에서 EDTA의 1.3 μL로 반응을 담금질.
- 대장균 Top10 유능한 세포의 100 μL로 반응을 변환하고 암피실린 선택플레이트(23,24)에판판한다.
- 양수 구문 식별합니다.
- 플라스미드 미니프레플 솔루션을 준비합니다. 이것은 LB 매체에 있는 식민지 따기 그리고 접종을 통해 행해질 수 있습니다. 보통, 3 식민지는 충분하다.
- 37°C에서 하룻밤 동안 혼합물을 배양한다.
- 10 분 동안 4,560 x g에서 혼합물을 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.
- P1 버퍼의 250 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드 미니프렙을 준비합니다.
- AseI 또는 기타 제한 효소를 사용하여 미니프준비 제품의 소화 분석을 수행한다.
- 0.8% 아가로즈 젤에 샘플을 적재하고 소화된 플라스미드를 실행합니다. UV 램프 아래에서 젤을 분석합니다.
- 시퀀싱 서비스를 사용하여 양수 제품의 시퀀스를 검증합니다.
- 공동 발현 DNA 삽입을 가져옵니다.
- PCR을 수행하여 이전에 제작된 2BT-10 N1-391 및 2BT-10 P1-1-126을 템플릿으로 사용하여 N1-391 및 P1-126을 획득한다.
- N1-1-391 포워드 프라이머와 역프라이머 5'GTGAAGATCCTGATGCGGGGGGGGGGGCG와 함께 표 2 및 표 3의 PCR 조건을 사용하여 2BT-10 N1-391 구조에서 N1-391을 획득하기 위해 1st PCR을 수행
CGCCGCGATCGCGGATCC-3'. - 2nd PCR을 수행하여 2BT-10 P1-126 구체에서 포워드 프라이머를 사용하여 P1-126을 획득합니다: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3'and P1-126 역 프라이머 (표 2 및 표 3에서PCR 조건을 사용). - 마지막으로, N1-391 및 P1-126을병합하기 위해 이전 2 PCR 반응의 혼합 제품에 PCR중복 PCR을 수행한다. N1-391 포워드 프라이머와 P1-126 역 프라이머를 사용합니다. 표 5 및 표 6에서PCR 조건을 사용합니다.
- 벡터와 DNA 삽입에 참여합니다.
- 1.3 단계에서 프로토콜에 따라 T4 DNA 폴리머라제와 겹치는 PCR 제품을 치료한다.
- 1.4 단계에서 프로토콜에 따라 LIC 벡터 및 PCR 제품을 음침합니다.
- 1.5 단계에서 프로토콜 에 이어 양수 구문들을 식별합니다.
2. 단백질 발현 및 정제
참고: 대장균을 사용하여 37°C에서 N 과 P. 배양 세포의 공동 발현을 모두 의한 이중 시스트로닉 구조에 사용하지만, 하룻밤 사이에 감소된 온도(16°C)에서 발현을 수행한다. 코발트 컬럼, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피(그림2)의조합을 통해 단백질 복합체를 정화한다.
- 단백질 생산을 위해 대장균 BL21(DE3) 균주를 사용하십시오. ODI600이 0.6에 도달할 때까지 LB(Luria Broth) 배지에서 37°C에서 4L 세포 배양을 성장시다.
- 온도를 16°C로 낮춥춥습니다. 한 시간 후, 0.5 mM 이소프로필 1-티오-D-갈라크토피라노사이드(IPTG)로 하룻밤 사이에 식을 유도한다.
- 25 분 동안 4,104 x g에서 세포를 원심 분리 한 다음 상체를 폐기하십시오.
- 리시스 완충제 A의 200mL에서 세포 펠릿을 재연하여 (50mMM 나트륨 인산염, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 10% 글리세롤 및 0.2% NP40). 50mL의 용해 버퍼를 사용하여 세포 배양의 1 L에서 세포 펠릿을 재보일시 합니다.
- 15분, 3초, 3초 쉬기 동안 초음파 처리로 셀을 lyse합니다. 그런 다음 원심 분리기 세포는 37,888 x g에서 40 분 동안.
참고: 프로토콜은 -80°C 냉동고에서 초음파 처리 전에 세포를 동결하여 일시 중지할 수 있습니다. - 상체를 코발트 중력 기둥(직경 x 길이: 2.5cm x 10cm)에 로드하고 - 10mL의 비드를 용해 버퍼의 5-10 컬럼 볼륨(CV)으로 미리 평가한다.
- 5 CV 버퍼 B(50m Tris-HCl pH 7.4, 1M NaCl, 10% 글리세롤, 5m mM imidazole)와 5 CV(50m Tris-HCl pH 7.4, 500mM MM NaCl, 10% 글리세롤, 5mm imidim)로 컬럼을 세척합니다.
- 완충D 2CV(50m Tris-HCl pH 7.4, 500mMM NaCl, 250mM imidazole)를 사용하여 구슬로부터 단백질을 엘테.
- Q 컬럼에 대해 QA 버퍼(50m Tris-HCl pH 8.0, 5% 글리세롤)로 동경의 단백질 5배희석을 희석시켰다.
- Q 컬럼5mL을 QA 버퍼로 세척하여 열을 양립한 다음 연동 펌프(예: 토끼)를 사용하여 희석된 샘플을 Q 컬럼에 로드합니다.
- Q 컬럼을 QA 버퍼 및 QB 버퍼(50m Tris-HCl pH7.4, 1.5M NaCl, 5% 글리세롤)와 함께 HPLC 기계에 로드합니다. 유량을 1mL/분으로 설정합니다.
- "펌프 워시" 프로그램을 실행하여 QB 버퍼로 기계를 세척하고 QA 버퍼(각각 1-2CV/각)를 세척합니다. 시스템 흐름을 3mL/분으로 설정합니다.
- UV1을 280nm로 설정하고 UV2를 260 nm로 설정합니다. 96 개의 깊은 우물 플레이트를 사용하여 분획을 수집합니다.
- 각 농도의 3-4 CV를 적용한 용출제(QB 버퍼)의 단계별 그라데이션을 사용하는 엘루트 단백질은 0% QB부터 매번 백분율을 5% 증가시다. N0P 단백질 복합체는 15% QB 버퍼로 나올 것입니다.
- 모든 단백질이 용출되면 컬럼을 100% QB 버퍼(2 CV)로 세척합니다.
- 젤 여과 Superdex 200 증가 10/300 GL 컬럼 (직경 x 길이: 1.0 cm x 30cm) 및 완충 E (20 m M HEPES pH 7.4 및 200 mM NaCl)와 평형.
- SDS-PAGE를 통해 단백질 함유 분수를 분석합니다.
3. 바이러스 별 NC의 시험관 내 조립
참고: RSV 특이적 NC(N:RNA)의 체외 조립은 RNA 올리고스를 통해 준비된 N0P 콤플렉스를 배양함으로써 수행되었다. 이어서, SEC 크로마토그래피는 N0P 및 과잉 RNA(도2)로부터어셈블리 콤플렉스를 분리하는 데 사용되었다.
- 1시간 동안 실온에서1:1.5의 분자비를 RNA 올리고와 혼합 및 배양하고, 보통 1 mg/mL의 농도를 가진 단백질 N0P의 1mL은 다음 단계에 충분하다. 동일한 양의 N0P 단백질만 포함하는 대조군 샘플을 설정합니다.
- 젤 여과 Superdex 200 버퍼 E (20m HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl)로 10/300 GL 컬럼을 미리 평형화합니다.
- 15분 동안 21,130 x g의 샘플을 원심분리하고 침전을 제거하고 SEC 열에 상류체를 로드합니다.
- N:RNA 어셈블리 샘플 및 N0P 대조군 샘플의 SEC 크로마토그래피 이미지를 비교하고, A260/A280 비율을 결합하여 조립된 N-RNA, N0P 및 무료 RNA의 피크를 식별합니다.
- 피크 분수를 수집하거나, SDS-PAGE 젤을 실행하거나, 그리드를 만듭니다.
- 조립 N-RNA 복합체의 경우, N-RNA 피크의 모든 분획을 수집하고, RNA 추출을 수행하여 요레아 페이지 겔을 실행하여 첫 번째 단계에서 혼합 및 배양과 동일한 특정 RNA의 길이를 다시 확인한다.
4. 부정적인 얼룩 그리드 만들기
참고: 음의 얼룩 전자 현미경 검사법(EM)은 분자가 탄소 필름에 흡착된 다음 중금속 원자층에 내장되는 방법입니다. 네거티브 스테인 EM은 높은 이미지 콘트라스트를 생성하여 입자를 쉽게 보고 계산적으로 정렬합니다. 또 다른 장점은 탄소 필름에 입자의 흡착은 일반적으로 몇 가지 바람직한 방향으로 그리드에 부착하는 분자를 유도한다는 것입니다. 분자가 유사한 방향으로 있을 때, 구조적으로 구별되는 병과로 분리하는 것은 쉽습니다. 따라서 음의 얼룩 EM은 시료준비(25,26)를 안내하는 적절한기술이다(도 3).
- 작은 유리 비커에 5mL의 ddH2O를 전자레인지 또는 가열하여 끓일 때까지 가열합니다.
- 37.5 mg의 우라젤 포메이트를 계량하고 가열 된 ddH2O5 mL에 추가하여 0.75 % uranyl formate 염색 용액을 만듭니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일 덮인 비커 아래에서 저어주세요.
- 염색 용액에 10M NaOH의 4 μL을 추가하고 빛으로부터 보호된 15분 동안 계속 저어줍니다.
- 0.22mm 필터를 통해 용액을 테스트 튜브로 필터링합니다.
- 연속 탄소 코팅 EM 그리드 를 만들기 위해 글로우 방전을 사용(27)
참고: 그리드는 전원 공급 장치에 연결된 챔버 내부에 배치됩니다. 고전압이 적용되면 챔버 내의 가스가 이온화되고, 음전하 이온이 탄소 그리드에 증착되어 친수성으로 만듭니다. - 파라필름 스트립을 자르고 접습니다. 파라필름 의 한쪽에 버퍼의 40 μL의 파이프 2 방울, 다른 쪽에 염색 용액의 40 μL의 또 다른 2 방울을 피펫.
- EM 탄소 그리드를 만들려면 단백질 샘플 3μL을 1분간 적용하십시오.
- 블로팅 용지에 그리드를 블롯합니다.
참고: 그리드는 버퍼로 2배, 각 단계마다 0.75% 우라일 포메이트 스테인링 용액으로 1배 세척됩니다. - 그리드 표면을 0.75% 우라일 포메이트 스테인딩 용액의 두 번째 낙하에서 30초 동안 유지합니다.
- 그리드를 블로팅 용지에 블롯하여 과도한 얼룩 용액을 제거하고 그리드가 공기 건조하도록 합니다.
- 이미징 하기 전에 그리드 상자에 그리드를 저장 합니다.
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Representative Results
RNA 가 없는 N0P 단백질의 정제
이 프로토콜을 사용하면 대규모 용해성 RSV N0P 복합체를 얻을 수 있습니다. P 단백질의 N 및 N 말단 부분의 전체 길이는 대장균에서N 단백질에 대한 10배 의 His-Tag로 공동 발현되었다. N0P는 코발트 컬럼, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. N0P는 전길이 N 및 N 단자 P를 모두 포함하지만 UV 흡광도 A260/A 280비20(도 4)에기초한 세포 RNA를 포함하지 않았다.
N-RNA의 조립 및 부정적인 얼룩으로 확인
그런 다음 정제된 N0P가 특정 RNA 올리고를 배양하여 Nuceloplasmid와 같은 입자(NCLPs)로 자극되고 조립될 수 있음을 입증했습니다. NCLP는 1시간 동안 실온에서 1:1.5의 비율로 RNA 올리고를 가진 N0P를 배양한 다음 겔 여과 열을 통해 실행함으로써 조립되었다. N:RNA 복합체가 형성되면,1st 피크는 N:RNA이고,2nd 피크는N0P이고,3rd 피크는 과잉 자유 RNA이다. N:RNA 피크의 가장 높은 분수는 EM20(그림 5)으로확인하기 위한 음의 얼룩 그리드를 생성한다.
그림 1. 플라스미드 구조의 그림. A. RSV N1-391의구조; B. RSV P1-126의구조; C. N1-391 및 P 1-126의공동 표현을 위한 바이-시스트로닉 구조. 제1 유전자 RSV N1-391,제2 유전자 RSV P1-126,항생제 내성 유전자(AmpR), 및 프로모터는 각각 노란색, 시안, 분홍색 및 주황색 상자로 강조된다. 요약하자면, RSV N1-391 및 RSV P1-126의 유전자 삽입은 별도로 구성되고 조립된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 단백질 복합체 N 1-391 P1-1-126의정화의 순서도. 그것은 대장균 세포 배양의 접종 및 대규모 성장을 설명하고 원심 분리에 의해 세포를 수확. 세포 용해에 이어, 단백질 샘플은 친화성 크로마토그래피(즉, Co2+ 컬럼), 이온 교환 크로마토그래피(즉, Q 컬럼), 겔 여과 크기 배제(SEC) 크로마토그래피에 의해 정제된다. 단백질 샘플은 SDS-PAGE 젤에 의해 더 분석된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 이미징을 위한 음의 얼룩 EM 그리드의 준비. A. 글로우가 그리드를 배출합니다. B. 음수 염색 그리드에 대한 절차가 표시됩니다. 핀셋은 그리드를 픽업하는 데 사용되며, 그 다음에 단백질 샘플을 1분 동안 적용합니다. 그리드는 얼룩이 있는 종이로 얼룩져 있습니다. 그리드는 버퍼로 두 번 세척되고 0.75% uranyl formate 염색 용액으로 두 번 세척됩니다. 그리드는 30초 동안 두 번째 염색 솔루션 드롭에서 개최됩니다. 그리드는 각 세척 후 블롯되고 최종 블로팅 후 공기 건조됩니다. C. 그리드는 이미징을 위해 그리드 상자에 저장됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. N1-391P1-126 단지의 공동화의 대표적인 결과. A. N1-391 P 1-126의SEC 프로필 . B. RNA를 가진 어셈블리 N1-391P1-1-126의 SEC 프로파일. C. SDS-PAGE 젤은 N-RNA 복합체 및 N1-391 P 1-1-126 복합체의 N 및 P 단백질 모두에 대한 밴드에 대해서만 N 단백질을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. N-RNA의 대표적인 이미지. A와 B는 도 4에서 N1-391-RNA피크로부터 N-RNA의 대표적인 네거티브 얼룩 EM 이미지이다. N-RNA 복합체는 도 3에기재된 절차를 사용하여 염색된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 뇌관 | |||
| N1-391 포워드 | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 역방향 | 5'-TTATCCACTTCCAATGTT타카그TTCCGTGTGTGT-3' | ||
| P1-126 포워드 | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAAGTTCGCCCGAG-3' | ||
| P1-126 역방향 | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTTGGGGTGTTGATTTCCTCGTAGT-CGTAGC-3' | ||
표 1. 프라이머 시퀀스.
| DNA 삽입의 PCR 증폭 | |
| 15 μL | 10x 푸 폴리머라제 반응 버퍼 |
| 3 μL | 포워드 프라이머(100 μM 농도) |
| 3 μL | 역프라이머(100 μM 농도) |
| 15 μL | dNTP 믹스 2.5 mM 농도 |
| 6 μL | 플라스미드 DNA는 N 또는 P의 유전자를 포함 (100ng / μL) |
| 7 μL | DMSO |
| 3 μL | 푸 폴리머라제 앳 2.5U/μL |
| 150 μL로 채우는 부피 | 멸균 ddH2O |
표 2. DNA 삽입 시약의 PCR 증폭.
| DNA 삽입의 PCR 증폭 | |||
| 걸음 | 시간 | 온도 | 사이클 |
| 변성 | 4분. | 95 ºC | 1 |
| 변성 | 45초. | 95 ºC | 30 |
| 어 닐 링 | 30초. | 62 ºC | |
| 확장* | 90초. | 72 ºC | |
| 확장 | 10분. | 72 ºC | 1 |
| 들다 | ∞ | 4 ºC | 1 |
| 150 μL 혼합물은 세 개의 별도의 PCR 반응(3 x 50μL)으로 실행할 수 있습니다. | |||
| *Pfu DNA 폴리머라제의 경우 1kb/min이 확장 단계에 권장되는 속도입니다. 여기서, N1-391 유전자 또는 P1-126 유전자의 길이는 모두 1.5 KB보다 짧다. | |||
| 따라서, 90초는 확장 단계에 사용되었다. | |||
표 3. DNA 삽입 열순환 프로그램의 PCR 증폭.
| T4 DNA 폴리머라제 치료 | |
| 10 x 버퍼 | 2 μL |
| 벡터/삽입 DNA(0.1 pmol 벡터 또는 0.2 pmol 삽입) | 5 μL |
| dNTP* 앳 25mM | 2 μL |
| 100mM에서 DTT | 1 μL |
| T4 DNA 폴리머라제 (LIC 인증) | 0.4 μL (1.25 U) |
| 멸균 ddH2O | 9.6 μL |
| *dGTP는 벡터에 사용되었고, dCTP는 삽입 DNA에 사용되었다. | |
표 4. T4 DNA 폴리머라제 치료.
| PCR 중복 | |
| 15 μL | 10 X 푸 폴리머라제 반응 버퍼 |
| 3 μL | 포워드 프라이머 (100 μM) |
| 3 μL | 역프라이머 (100 μM) |
| 15 μL | dNTP 믹스 (2.5 mM) |
| 3 μL | 유전자 N1-391 (100 ng/μL)을 포함하는 1st 원형 PCR로부터의 DNA |
| 3 μL | 유전자 P1-126 (100 ng/μL)을 포함하는 1st 원형 PCR에서 DNA |
| 7 μL | DMSO |
| 3 μL | 푸 폴리머라제 (2.5 U/μL) |
| 150 μL로 채우는 부피 | 멸균 ddH2O |
표 5. PCR 시약을 겹칩니다.
| PCR 중복 | |||
| 걸음 | 시간 | 온도 | 사이클 |
| 변성 | 4분. | 95°C | 1 |
| 변성 | 45초. | 95°C | 30 |
| 어 닐 링 | 30초. | 62 °C | |
| 확장* | 2분. | 72 °C | |
| 확장 | 10분. | 72 °C | 1 |
| 들다 | ∞ | 4°C | 1 |
| 150 μL 혼합물은 세 개의 별도의 PCR 반응(3 x 50 μL)으로 실행할 수 있습니다. | |||
| *Pfu DNA 폴리머라제의 경우 1kb/min이 확장 단계에 권장되는 속도입니다. 여기서, 유전자 N1-391 및 P1-126의 총 길이는 2.0 KB보다 짧다. 따라서, 2분 연장 단계에 사용되었다. | |||
표 6. PCR 열순환 프로그램을 겹칩니다.
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Discussion
비분할 음성 감지(NNS) RNA 바이러스의 공지된 뉴클레오캡시드 형 입자(NCLP) 구조는 조립된 NCLP가 세균성 또는 진핵발현시스템(15,16,17,18,19)에서과발현될 때 숙주 세포 RNA를 가진 복잡한 N임을 보여준다. 이전 연구는 RNase A 소화, 높은 염분 세척, 또는 비특이적 세포RNA(28,29)를제거하기 위해 상이한 pH 버퍼를 조정하는 등 다양한 방법으로 RNA 무료 N을 얻으려고 시도했다. 그러나, 상기 방법 중 어느 것도 바이러스 특이적 NC의 어셈블리에 성공적으로 사용될 수 없다. RNA 가 없는 RSV N을 얻기 위해, 우리는 또한 RNase A 소화, 높은 염(1.5M NaCl) 세척, pH 5.0에서 pH 9.0, 단백질 성모 및 레나처링을 포함하는 방법의 조합을 시도했습니다. 많은 실패한 예심 후에, 우리는 아직도 위의 방법으로 RNA 자유로운 N을 얻을 수 없었습니다. 우리는 시도와 잠재적 인 이유에 대해 간략하게 논의 할 것입니다.
RNA-free N을 얻는 한 가지 방법은 RNase A를 사용하여 조립된 NCLPs에서 숙주 세포 RNA를 소화하는 것이다. VSV에서, NC28로부터1h 완전 제거 RNA에 대한 37°C에서 37°C에서 1mg/ml의 최종 농도에서 RNase A를 가진 정제 된 NCLP의 인큐베이션. 정제된 빈 올리고메릭 N은 RNase 억제제의 존재시 1:5의 어금니 비율로 폴리-A(250-nt 이상)로 배양되었다. 재구성된 N:poly-A로부터 분리된 RNA의 분석은 RNA가 길이약 90nt이었다는 것을 보여주었다. 이것은 뉴클레오단백질 외부의 RNA가 이전 단계에서 오염된 RNase A에 의한 비특이적 소화에 취약하다는 것을 건의했다. RNA를 제거하는 RNase 소화의 전략은 RSV에 적용될 때 성공하지 못했습니다. 이는 두 가지 이유로 인한 것일 수 있습니다. 첫째, 오염된 RNase A는 RSV 특이적 RNA를 소화할 것이며, 이 RNA는 나중에 인큐베이션되고 N으로 조립될 것입니다. 둘째, RNase A 소화의 효율은 RSV에서 훨씬 낮습니다. 이는 RNA가 다른 NNS 바이러스에서 다르게 조립하기 때문입니다. N:RNA의 공지된 결정 구조는 RNA가 VSV에서 NC 의 외부에 결합하지만 RSV30,31에서NC 내부임을 보여준다. NC의 안쪽에 결합하는 RNA의 구성은 RNase A에 대한 낮은 효율로 이어질 수 있고 소화.
RNA 가 없는 N을 얻는 또 다른 방법은 N 단자 모티프(N-arm)와 N의 C-말단 모티프(C-arm)를 모두 절단하는 잘림착을 만드는 것이다. 그러나, 이러한 잘린 RNA-free N은 N의 N-arm이 선례 N 서브유닛의 C-말단 도메인(CTD)과 상호작용하여 인접한 하위 단위로 접히기 때문에 RNA를 안정된 NC로 조립하는 데 사용할 수 없다. 확장된 C-암은 다음 N서브유닛(31)의CTD에 배치된다.
RNA 가 없는 N을 얻는 추가 방법은 돌연변이 N을 준비하는 것입니다. 예를 들어, Galloux 등으로부터 얻은 결과는 RSV RNA 자유 N0P 복합체가 K170A/R185A 이중 N 돌연변이체의 공동 발현에 의해 얻어질 수 있음을 보여주었으며,박테리아(32)에서P의 N-종미와 함께 이중 N 돌연변이체를 얻을 수 있었다. 그러나, 그것은 추가 구조적 특성에 대 한 두 가지 잠재적인 문제가 있다. 한 가지 문제는 고농도에서이 돌연변이 단지의 낮은 안정성이다. 다른 문제는 돌연변이 복합체가 다음 조립 단계에서 사용할 수 없는 RNA 결합 능력을 상실했다는 것이다.
엄청난 도전에도 불구하고, 우리는 최근 chaperone P와 N의 공동 표현을 사용하여 바이러스 특정 N을 얻기 위해 프로토콜을 수립하고최적화했습니다. N0P는 TEV 프로테아제 분열 후 얻을 수 있다. N0P의 순도는 N과 P 단백질 사이의 키메라 융합을 절단 TEV 분열의 효율에 따라 달라집니다.
키메라 융합 방법을 사용하는 대신, 우리는 바이 시스트로닉 공동발성 구조를 설계했습니다. 구체적으로,N0P 콤플렉스의 코발현 구조는 제1 ORF의 N단말단에서 10배 의 His-tag를 갖는 N(1-391)의 전체 길이를 포함하는 두 개의 개방형 판독 프레임으로 설계 및 설계되었으며, 제2 ORF20에서P로부터 N단 펩티드(1-126)를 구성한다. 간단히, N0P 정제의 전반적인 절차는 코발트 구슬을 가진 세포 용해 견본에서 그의 태그된 N0P 및 N-RNA를 정제하고, Q 컬럼을 가진 비특이적인 RNA 및 N:cellular RNA 복합체를 제거하고, SEC 열로 순수한 N0P 복합체를 얻는 것입니다. SEC 단계에서, A260/A280의 비율은 N0P 피크 분획으로부터 RNA 추출을 통해 모니터링 및 이중 검사될 수 있다.
전체적으로, 본 프로토콜에서 가장 중요한 단계는N0P 콤플렉스의 공동발현의 시공을 설계하고, 다른 N세포 RNA 복합체로부터 RNA 자유 N0P 복합체를 분리하기 위해 시리즈 친화도 및 이온 교환 컬럼을 사용하는 전략이다. N0P 복합체를 얻기 위한 공동표현 전략의 효율은 상대적으로 낮습니다. 약 50% N 단백질은 여전히 N 세포 RNA 복합체입니다. 프로토콜은 또한 RNA 무료 N0P를 얻기 위한 적용될 수 있고 그밖 NNS 바이러스의 N:RNA 복합체를 얻기 위하여 N을 가진 특정 RNA를 가진 조립.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
에모리의 리앙 연구소의 연구 프로그램은 미국 국립 일반 의학 연구소(NIGMS), 국립 보건원(NIH)이 수상 번호 R01GM130950에 따라 지원되며, 에모리 대학 의과 대학의 연구 스타트업 기금이 지원됩니다. 저자는 도움이 지원과 비판적 토론을 위해 Liang 연구소의 구성원을 인정한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
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