Summary
Para uma análise mecanicista aprofundada da síntese de RNA do vírus sincicial respiratório (RSV), relatamos um protocolo de utilização da fosfoproteína acompanhante (P) para coexpressão da nucleoproteína livre de RNA (N0) para posterior montagem in vitro dos nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs).
Abstract
O uso de um modelo de RNA autêntico é fundamental para avançar no conhecimento fundamental da síntese de RNA viral que pode guiar tanto a descoberta mecanicista quanto o desenvolvimento de ensaios em virologia. O modelo de RNA de vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS), como o vírus sincicial respiratório (RSV), não é apenas uma molécula de RNA, mas sim um complexo de ribonucleoproteína encapsidada por nucleoproteína. Apesar da importância do autêntico modelo de RNA, a geração e montagem de tal complexo ribonucleoproteína permanecem sofisticadas e requerem elucidação aprofundada. O principal desafio é que o RSV N superexpresso liga-se não especificamente às RNAs celulares para formar partículas aleatórias semelhantes a nucleocapsídeos (NCLPs). Aqui, estabelecemos um protocolo para obter N (N0)livre de RNA primeiro, co-expressando N com uma fosfoproteína acompanhante (P), depois montando n0 com oligos de RNA com a sequência de RNA específica do RSV para obter nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs). Este protocolo mostra como superar a dificuldade na preparação desse complexo tradicionalmente desafiador de ribonucleoproteína viral.
Introduction
Os vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) incluem muitos patógenos humanos significativos, como raiva, Ebola e vírus sincicial respiratório (RSV)1,2. O RSV é a principal causa de doenças respiratórias, como bronquiolite e pneumonia em crianças pequenas e idosos em todo o mundo3. Atualmente, não há vacinas efetivas ou terapias antivirais disponíveis para prevenir ou tratar o RSV4. Como parte do ciclo de vida, o genoma RSV serve como modelo para replicação pela polimerase RNA dependente do RSV RNA para produzir um antígeno, que por sua vez atua como modelo para gerar um genoma descendente. Tanto o genoma quanto o antígeno RNAs são inteiramente encapsidados pela nucleoproteína (N) para formar os nucleocapsídeos (NCs)3. Como os NCs servem como modelos para replicação e transcrição pela polimerase RSV, o conjunto NC adequado é crucial para que a polimerase tenha acesso aos modelos para síntese de RNA5. Curiosamente, com base nas análises estruturais das polmerases virais NNS, hipótese-se que várias proteínas N se dissociam transitoriamente das NCs para permitir o acesso da polimerase e rebinadas ao RNA após a síntese do RNA6,7,8,9,10,11,12.
Atualmente, o ensaio de polimerização RSV RNA foi estabelecido utilizando polimerase RSV purificada em modelos de RNA nus curtos13,14. No entanto, as atividades da polimerase RSV não alcançam o ideal, como observado nos produtos não processivos e abortivos gerados pela polimerase RSV ao usar modelos de RNA nus. A falta de NC com RNA específico do vírus é uma barreira primária para a compreensão mecanicista da síntese do RSV RNA. Portanto, o uso de um modelo de RNA autêntico torna-se uma necessidade crítica para avançar no conhecimento fundamental da síntese de RNA RSV. As estruturas conhecidas das partículas semelhantes a nucleocapsídeos (NCLPs) do RSV e de outros vírus NNS RNA revelam que os RNAs nos NCLPs são RNAs celulares aleatórios ou RNAs genômicas viraismédias 15,16,17,18,19. Juntos, o principal obstáculo é que N liga não especificamente aos RNAs celulares para formar NCLPs quando n é superexpresso nas células host.
Para superar esse obstáculo, estabelecemos um protocolo para obter o RNA sem RNA (N0) primeiro e montar o N0 com RNA genômico viral autêntico em NCLPs20. O princípio deste protocolo é obter uma grande quantidade de N (N) recombinante livre de RNA (N0)co-expressando N com um acompanhante, o domínio n-terminal de fosfoproteína RSV (PNTD). O N0P purificado poderia ser estimulado e montado em NCLPs adicionando oligos RNA específicos do RSV, e durante o processo de montagem, o acompanhante PNTD é deslocado após a adição de oligos RNA.
Aqui, detalhamos um protocolo para a geração e montagem de NCs específicos do RSV RNA. Neste protocolo, descrevemos a clonagem molecular, preparação de proteínas, montagem in vitro e validação da montagem complexa. Destacamos a estratégia de clonagem para gerar construções bi-cistrônicas para coexpressão de proteínas para clonagem molecular. Para a preparação de proteínas, descrevemos os procedimentos da cultura celular, extração de proteínas e a purificação do complexo proteico. Em seguida, discutimos o método de montagem in vitro dos NCs específicos do RSV RNA. Finalmente, usamos cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e microscopia eletrônica de manchas negativas (EM) para caracterizar e visualizar os NCLPs montados.
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Protocol
1. Clonagem molecular
NOTA: A Clonagem Independente de Ligase (LIC) foi usada para fazer um plasmídeo de coexpressão bi-cistronic RSV. LIC é um método desenvolvido no início da década de 1990, que utiliza a atividade Exo 3'-5' da polimerase de DNA T4 para criar saliências com complementaridade entre o vetor e a inserção de DNA21,22. As construções foram feitas utilizando-se o DNA vetorial 2BT-10, que consiste em uma etiqueta de 10x no terminal N do Quadro de Leitura Aberto (ORF) (Figura 1).
- Realize a linearização dos vetores LIC usando digestão SSPI.
- Combine 10 μL de tampão SSPI 10X, 4 μL de enzima SSPI a uma concentração de 5 U/μL, o volume equivalente de 5 μg de DNA miniprep vetorial e ddH2O a 100 μL.
- Incubar o digestor por 3 horas a 37 °C.
- Execute o digestão em um gel de 1,0% de agarose para a extração de DNA vetorial.
- Use um kit de extração de gel para realizar extração e purificação. Suspenda o volume final de DNA vetorial em 30 μL de ddH2O e armazene-o a -20 °C.
- Prepare as pastilhas de DNA para n1-391 e P1-126 usando o Primer N1-391 Forward, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer e P1-126 Reverse Primer(Tabela 1).
NOTA: Há sobreposição suficiente com o vetor linearizado para garantir uma temperatura de fusão entre 55 °C e 60 °C. Para o primer reverso, há sobreposição suficiente com a vertente complementar reversa do vetor linearizado pelo mesmo motivo.- Realize a amplificação pcr da inserção de DNA utilizando as condições na Tabela 2 e Tabela 3.
- Extrair a inserção de DNA amplificada. Execute os produtos PCR da etapa anterior em um gel de 1,0% de agarose, em seguida, extraia e purifica as bandas por extração de gel. Suspenda o volume final de DNA extraído em 15 μL de ddH2O.
- Tratamento de polimerase de DNA T4 do vetor e inserir DNA(Tabela 4).
NOTA: O tratamento deve ser realizado separadamente para o DNA vetorial e o DNA da inserção.- Incubar a mistura por 40 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, inativar a polimerase a 75 °C por 20 minutos. Armazene a mistura de reação a -20 °C.
- Anneal o vetor LIC e o vetor de inserção.
- Configure um controle negativo com 2 μL de DNA vetorial LIC e 2 μL de ddH2O estéril.
- Combine 2 μL de DNA de inserção e 2 μL de DNA vetorial LIC das reações anteriores de polimerase de DNA T4 em um tubo de 0,2 mL.
- Realize a reação de ressarcial à temperatura ambiente por 10 minutos.
- Sacie a reação com 1,3 μL de EDTA a uma concentração de 25 mM.
- Transforme a reação em 100 μL de células competentes E. coli Top10 e emplaque-as em uma placa de seleção de ampicillin23,24.
- Identifique as construções positivas.
- Prepare a solução de miniprep plasmida. Isso pode ser feito através da colheita e inoculação de colônias em mídia LB. Normalmente, 3 colônias são suficientes.
- Incubar a mistura durante a noite a 37 °C.
- Centrifugar a mistura a 4.560 x g por 10 minutos e descartar o supernaspeso.
- Resuspenque as pelotas em 250 μL de tampão P1 e prepare minipreps plasmídeos usando um kit de miniprep spin.
- Realize uma análise de digestão do produto miniprep usando AseI ou outras enzimas de restrição.
- Carregue amostras em gel de 0,8% de agarose e execute o plasmídeo digerido. Analise o gel sob uma lâmpada UV.
- Use um serviço de sequenciamento para validar a sequência do produto positivo.
- Obtenha a inserção de DNA de coexpressão.
- Execute o PCR para obter n1-391 e P1-126 usando os modelos 2BT-10 N1-391 e 2BT-10 P1-126.
- Execute o 1st PCR para obter n1-391 da construção 2BT-10 N1-391 usando as condições pcr na Tabela 2 e Tabela 3 com o primer N1-391 Forward e Reverse Primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGGCAATGCGGCGGCGG
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - Execute o2º PCR para obter P1-126 da construção 2BT-10 P1-126 usando o primer Forward: 5'-CCGCCGCATTGCAGCCAGCCAATCTTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́ e o primer reverso P1-126 (use as condições pcr na Tabela 2 e Tabela 3). - Finalmente, execute a sobreposição de PCR nos produtos mistos das 2 reações pcr anteriores para mesclar n1-391 e P1-126. Use o primer N1-391 Forward e o primer P1-126 Reverse. Use as condições de PCR na Tabela 5 e Tabela 6.
- Junte-se ao vetor e à inserção de DNA.
- Trate o produto PCR sobreposto com polimerase de DNA T4 seguindo o protocolo na etapa 1.3.
- Anneal o vetor LIC e produto PCR seguindo o protocolo na etapa 1.4.
- Identifique os construtos positivos seguindo o protocolo na etapa 1.5.
2. Expressão e purificação de proteínas
NOTA: Use E. coli para a construção bi-cistrônica da coexpressão tanto da cultura N quanto da P. Cultura as células a 37 °C, mas realize a expressão a uma temperatura reduzida (16 °C) durante a noite. Purificar os complexos proteicos através de uma combinação de coluna de cobalto, troca de íons e cromatografia de exclusão de tamanho(Figura 2).
- Use a cepa E. coli BL21(DE3) para produção de proteínas. Cresça 4 culturas celulares L a 37 °C em lb (Caldo de Luria) médio até OD600 chegar a 0,6.
- Abaixe a temperatura para 16 °C. Uma hora depois, induza a expressão com isopropílico de 0,5 mM 1-thio--D-galactopyranoside (IPTG) durante a noite.
- Centrifugar as células a 4.104 x g por 25 min e depois descartar o supernascedor.
- Resuspend as pelotas de célula em 200 mL de tampão de lise A (50 mM de fosfato de sódio, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol, 10% glicerol e 0,2% NP40). Use 50 mL de tampão de lise para resuspensar as pelotas celulares a partir de 1 L de cultura celular.
- Lyse as células por sônica por 15 minutos, 3 segundos e 3 segundos de distância. Em seguida, células centrífugas a 37.888 x g por 40 min.
NOTA: O protocolo pode ser pausado congelando as células antes da sônica em um congelador de -80 °C. - Carregue o supernante em uma coluna de gravidade de cobalto (diâmetro x comprimento: 2,5 cm x 10 cm) com ~10mL de contas pré-equilibradas com volumes de coluna de 5-10 (CV) de tampão de lise.
- Lave a coluna com 5 CV de buffer B (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 10% glicerol e 5 mM imidazol) e 5 CV de tampão C (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 10% glicerol e 5 mM imidazol).
- Elute a proteína das contas usando 2 CV de tampão D (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, e 250 mM imidazole).
- Diluir a proteína elucida 5x com tampão de QA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% Glicerol) para a coluna Q.
- Lave os 5 mL da coluna Q com tampão de QA para equilibrar a coluna e, em seguida, carregue a amostra diluída na coluna Q usando a bomba peristáltica (por exemplo, Coelho).
- Carregue a coluna Q na máquina HPLC juntamente com buffer QA e buffer QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1,5 M NaCl, 5% glicerol). Configure a vazão em 1 mL/min.
- Execute o programa de "lavagem da bomba" para lavar a máquina com buffer QB seguido de buffer QA (1-2 CVs/cada). Defina o fluxo do sistema para 3 mL/min.
- Defina o UV1 para 280 nm e UV2 para 260 nm. Use uma placa de poço de 96 polegadas para coletar as frações.
- Proteínas elutos usando um gradiente stepwise do agente de elução (QB Buffer) aplicando 3-4 CV de cada concentração, aumentando a porcentagem em 5% cada vez começando em 0% de QB. O complexo de proteínas N0P sairá com 15% de QB Buffer.
- Uma vez que toda a proteína é eluvada, lave a coluna com 100% QB Buffer (2 CV).
- Isole a proteína por filtragem de gel Superdex 200 Aumente coluna 10/300 GL (diâmetro x comprimento: 1,0 cm x 30 cm) e equilibre com tampão E (20 mM HEPES pH 7,4 e 200 mM NaCl).
- Analise frações contendo proteínas por SDS-PAGE.
3. Montagem in vitro do NC específico do vírus
NOTA: A montagem in vitro do NC específico do RSV (N:RNA) foi realizada incubando o complexo N0P preparado com oligos de RNA. Em seguida, a cromatografia SEC foi utilizada para separar o complexo de montagem do N0P e o excesso de RNA(Figura 2).
- Misture e incuba o complexo N0P purificado com oligo de RNA com a razão molecular de 1:1.5 à temperatura ambiente por 1 hora, geralmente 1 mL da proteína N0P com uma concentração de 1 mg/mL é suficiente para o próximo passo. Configure a amostra de controle, que contém apenas a mesma quantidade de proteína N0P.
- Pré-equilibre a filtragem de gel Superdex 200 Aumente coluna 10/300 GL com o buffer E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl).
- Centrifugar a amostra com 21.130 x g por 15 minutos, remover qualquer precipitação e carregar o supernasal para a coluna SEC.
- Compare as imagens de cromatografia SEC da amostra de montagem N:RNA e da amostra de controle N0P, combine a razão A260/A280 para identificar quais picos são o N-RNA montado, N0P e RNA gratuito.
- Colete as frações de pico, execute o gel SDS-PAGE ou faça grades.
- Para o complexo de montagem N-RNA, colete todas as frações do pico N-RNA, faça a extração de RNA e execute o gel Urea-PAGE para verificar novamente o comprimento do RNA específico, que é o mesmo que misto e incubado na primeira etapa.
4. Fazer grades de manchas negativas
NOTA: A microscopia eletrônica de manchas negativas (EM) é um método no qual as moléculas são adsorvidas a uma película de carbono e, em seguida, incorporadas em uma camada de átomos de metais pesados. A mancha negativa EM produz um alto contraste de imagem, facilitando a visão e alinhe computacionalmente as partículas. Outra vantagem é que a adsorção das partículas a um filme de carbono geralmente induz as moléculas a aderir à rede com poucas orientações preferidas. Quando as moléculas estão em uma orientação semelhante, é fácil separá-las em classes estruturalmente distintas. A mancha negativa EM é, portanto, a técnica adequada para orientar a preparação da amostra25,26 ( Figura3).
- Micro-ondas ou calor 5 mL de ddH2O em um pequeno copo de vidro usando um aquecedor de tungstênio até que esteja fervendo.
- Pese 37,5 mg de formatação de uranyl e adicione a 5 mL de ddH2O aquecido para fazer uma solução de coloração forma 0,75% de uranyl. Mexa sob um béquer coberto de papel alumínio para proteger da luz.
- Adicione 4 μL de 10 M NaOH à solução de coloração e continue mexendo por 15 minutos, protegido da luz.
- Filtre a solução através de um filtro de 0,22 mm em um tubo de ensaio.
- Use a descarga de brilho para tornar as redes EM contínuas revestidas de carbono hidrofílicas27.
NOTA: As grades são colocadas dentro de uma câmara conectada a uma fonte de alimentação. Quando a alta tensão é aplicada, o gás dentro da câmara ioniza, e os íons carregados negativamente depositam nas redes de carbono para torná-los hidrofílicos. - Corte e dobre uma tira de parafilm. Pipet 2 gotas de 40 μL do buffer de um lado do parafilme, e pipet outras 2 gotas de 40 μL de solução de coloração para o outro lado.
- Para fazer as redes de carbono EM, aplique 3 μL de amostra de proteína por 1 minuto.
- Borrida as grades contra um papel manchado.
NOTA: As grades são lavadas 2x com tampão, e 1x com a solução de coloração de formação de 0,75% de uranyl apagada após cada etapa. - Segure a superfície da rede na segunda queda de 0,75% de solução de coloração de formação de urano por 30 segundos.
- Borrique a grade contra um papel manchador para remover a solução de excesso de manchas e permitir que a rede seque ao ar.
- Armazene as grades da caixa da grade antes de fotografar.
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Representative Results
Purificação da proteína N0P livre de RNA
Com este protocolo, um complexo solúvel solúvel RSV N0P pode ser obtido em larga escala. A extensão total da parte terminal N e N das proteínas P foi co-expressa com 10X His-Tag na proteína N em E. coli. N0P foi purificado usando uma coluna de cobalto, troca de íons e cromatografia de exclusão de tamanho. O N0P contém o terminal N e N de comprimento completo P, mas não continha RNA celular baseado na absorção UV A260/A280 razão20 (Figura 4).
Montagem do N-RNA e verificação com mancha negativa
Em seguida, demonstramos que o N0P purificado poderia ser estimulado e montado em partículas semelhantes a Nuceloplasmid (NCLPs) incubando com oligos RNA específicos. Os NCLPs foram montados incubando o N0P com oligos de RNA com a razão de 1:1.5 em temperatura ambiente por 1 hora e, em seguida, executar através da coluna de filtragem de gel. Quando o complexo N:RNA se forma, ele mostra três picos: opico 1 é N:RNA, o pico2 é N0P, e opico 3 é RNA livre em excesso. A fração mais alta do pico N:RNA cria as grades de manchas negativas para verificação com EM20 (Figura 5).
Figura 1. A ilustração das construções plasmid. um. A construção do RSV N1-391; B. A construção do RSV P1-126; C. A construção bi-cistronic para a coexpressão de N1-391 e P1-126. O primeiro gene RSV N1-391, o segundo gene RSV P1-126,o gene resistente a antibióticos (AmpR), e os promotores são destacados em caixas amarelas, ciano, rosa e laranja, respectivamente. Em resumo, as pastilhas genéticas do RSV N1-391 e do RSV P1-126 são construídas separadamente e montadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. O fluxograma da purificação do complexo proteico N1-391P1-126. Ele descreve a inoculação e os crescimentos em larga escala da cultura celular E. coli e a colheita da célula por centrifugação. Seguidas pela lise celular, as amostras de proteína são purificadas pela cromatografia de afinidade (ou seja, coluna Co2+), cromatografia de troca de íons (ou seja, coluna Q) e cromatografia de tamanho de filtragem de gel (SEC). As amostras de proteínas são ainda mais analisadas pelo gel SDS-PAGE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Preparação de grades EM de coloração negativa para imagens. A. Glow descarrega as grades. B. O procedimento para grades de coloração negativas é mostrado. As pinças são usadas para pegar uma grade, seguida pela aplicação da amostra de proteína por 1 minuto. As grades estão manchadas com papel manchado. A rede é lavada duas vezes com tampão e duas vezes com a solução de coloração de formação de 0,75% deuranyl. As grades são mantidas na segunda queda da solução de coloração por 30 segundos. As grades são borradas após cada lavagem e ar seco após a mancha final. C. As grades são armazenadas na caixa de grade para imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Resultados representativos da copurificação do complexo N1-391P1-126. um. O perfil SEC de N1-391P1-126. B. O perfil SEC da montagem N1-391P1-126 com RNA. C. O gel SDS-PAGE mostra a proteína N apenas para o complexo N-RNA e as bandas para proteínas N e P do complexo N1-391P1-126. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Imagens representativas do N-RNA. A e B são imagens representativas de manchas negativas EM de N-RNA do pico N1-391-RNA na Figura 4. Os complexos N-RNA estão manchados usando o procedimento descrito na Figura 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Primers | |||
| N1-391 Para a frente | 5'-TACTTCCAATCCAATCAATCAATCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 Reverso | 5'-TTATCCACTTCCAATTTATTACAGTTCCACGTTGTTGTCCTTGG-3' | ||
| P1-126 Para a frente | 5'-TACTTCCAATCCAATCAATGGAAAAAGTTCGCCCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Reverso | 5'-TTATCCACTTCCAATTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3' | ||
Mesa 1. Sequências de primer.
| Amplificação pcr da inserção de DNA | |
| 15 μL | 10x Tampão de reação de polimerase Pfu |
| 3 μL | Primer para a frente (concentração de 100 μM) |
| 3 μL | Primer reverso (concentração de 100 μM) |
| 15 μL | dNTP mix a 2,5 mM de concentração |
| 6 μL | O DNA plasmídeo contém o gene de N ou P (100ng/ μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polimerase a 2.5U/μL |
| Volume para encher a 150 μL | DdH2O estéril |
Mesa 2. Amplificação PCR de reagentes de inserção de DNA.
| Amplicação PCR da inserção de DNA | |||
| passo | Hora | temperatura | Ciclos |
| desnaturação | 4 min. | 95 ºC | 1 |
| desnaturação | 45 segundos. | 95 ºC | 30 |
| recozimento | 30 segundos. | 62 ºC | |
| Extensão* | 90 segundos. | 72 ºC | |
| extensão | 10 min. | 72 ºC | 1 |
| segurar | ∞ | 4 ºC | 1 |
| A mistura de 150 μL pode ser executada em três reações PCR separadas (3 x 50μL). | |||
| *Para a polimerase de DNA Pfu, 1 kb/min é a velocidade recomendada para a fase de extensão. Aqui, ambos os comprimentos do gene N1-391 ou do gene P1-126 são menores que 1,5 Kb. | |||
| Assim, foram utilizados 90 segundos para a etapa de extensão. | |||
Mesa 3. Amplificação PCR do programa termocicl de inserção de DNA.
| Tratamento de polimerase de DNA T4 | |
| 10 x Buffer | 2 μL |
| DNA vetor/inserção (vetor de 0,1 pmol ou 0,2 pmol) | 5 μL |
| dNTP* a 25 mM | 2 μL |
| DTT a 100 mM | 1 μL |
| Polimerase de DNA T4 (qualificada LIC) | 0,4 μL (1,25 U) |
| DdH2O estéril | 9,6 μL |
| *dGTP foi utilizado para o vetor, e dCTP foi usado para o DNA de inserção. | |
Mesa 4. Tratamento de polimerase de DNA T4.
| Sobrepor PCR | |
| 15 μL | 10 X tampão de reação de polimerase Pfu |
| 3 μL | Primer para a frente (100 μM) |
| 3 μL | Primer reverso (100 μM) |
| 15 μL | dNTP Mix (2,5 mM) |
| 3 μL | DNA de 1st round PCR que contêm o gene N1-391 (100 ng/μL ) |
| 3 μL | DNA de 1st round PCR que contêm o gene P1-126 (100 ng/μL ) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Polimerase pfu (2.5 U/μL) |
| Volume para encher a 150 μL | DdH2O estéril |
Mesa 5. Sobrepor reagentes PCR.
| Sobrepor PCR | |||
| passo | Hora | temperatura | Ciclos |
| desnaturação | 4 min. | 95 °C | 1 |
| desnaturação | 45 segundos. | 95 °C | 30 |
| recozimento | 30 segundos. | 62 °C | |
| Extensão* | Dois minutos. | 72 °C | |
| extensão | 10 min. | 72 °C | 1 |
| segurar | ∞ | 4 °C | 1 |
| A mistura de 150 μL pode ser executada em três reações PCR separadas (3 x 50 μL). | |||
| *Para a polimerase de DNA Pfu, 1 kb/min é a velocidade recomendada para a fase de extensão. Aqui, o comprimento total do gene N1-391 e P1-126 é menor que 2,0 Kb. Assim, foram utilizados 2 minutos para a etapa de extensão. | |||
Mesa 6. Sobreponha o programa de termociclismo PCR.
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Discussion
As conhecidas estruturas de partículas nucleocárides (NCLP) dos vírus RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) mostram que os NCLPs montados são o complexo N com RNAs celulares hospedeiros quando superexpressos em sistemas de expressão bacteriana ou eucariótica15,16,17,18,19. Estudos anteriores tentaram obter o RNA free N com uma variedade de métodos, como a digestão RNase A, lavagem de sal alto ou ajuste diferentes tampões de pH para remover as RNAs celulares não específicas28,29. No entanto, nenhum dos métodos acima pode ser usado com sucesso para a montagem dos NCs específicos do vírus. Para obter o RSV N sem RNA, também tentamos uma combinação de métodos, incluindo digestão RNase A, lavagem de sal alto (1,5M NaCl), ajustando o pH tampão do pH 5.0 para pH 9.0, desnaturação de proteínas e renaturação. Depois de muitos testes fracassados, ainda não conseguimos obter N livre de RNA com os métodos acima. Discutiremos brevemente as tentativas e possíveis razões.
Um método para obter N sem RNA é digerir RNA celular hospedeiro em NCLPs montados com RNase A. Em VSV, a incubação do NCLP purificado com RNase A em uma concentração final de 1mg/ml a 37 °C por 1 h RNA completamente removido do NC28. Oligomerico vazio purificado N foi então incubado com poli-A (250-nt ou mais) em uma razão molar de 1:5 na presença de inibidores de RNase. A análise do RNA isolado da N:poly-A reconstituída mostrou que o RNA tinha aproximadamente 90 nt de comprimento. Isso sugere que o RNA fora da nucleoproteína é suscetível à digestão inespecífica pelo RNase A contaminado da etapa anterior. A estratégia de digestão RNase A para remover o RNA não foi bem sucedida quando aplicada ao RSV. Isso pode ser devido a duas razões. Primeiro, o RNase A contaminado digerirá o RNA específico do RSV, que será posteriormente incubado e montado com N. Em segundo lugar, a eficiência da digestão RNase A é muito menor em RSV. Isso ocorre porque as RNAs se reúnem de forma diferente em diferentes vírus NNS. As estruturas cristalinas conhecidas de N:RNA mostram que o RNA se liga fora do NC em VSV, mas dentro do NC em RSV30,31. A configuração de RNA de ligação para dentro do NC pode levar a baixa eficiência para o RNase A acessar e digerir.
Outro método para obter N sem RNA é fazer as truncações que cortam tanto o motivo do terminal N (N-arm) quanto o motivo do terminal C (braço C) de N. No entanto, este N truncado sem RNA não pode ser usado para montar com RNA em um NC estável porque o braço N de N é dobrado em suas subunidades vizinhas interagindo com o domínio do terminal C (CTD) da subunidade N precedente. O braço C estendido está posicionado no CTD da próxima subunidade N31.
Um método adicional para obter N sem RNA é preparar o mutante N. Por exemplo, o resultado obtido por Galloux et al. mostrou que o rsv RNA livre n0P complexo poderia ser obtido por coexpressão de um mutante K170A/R185A duplo N com o N-terminus de P na bactéria32. No entanto, tem duas questões potenciais para outras caracterizações estruturais. Uma questão é a baixa estabilidade deste complexo mutante em altas concentrações. A outra questão é que o complexo mutante perdeu a capacidade de ligação do RNA, que não pode ser usada na próxima etapa de montagem.
Apesar dos tremendos desafios, estabelecemos e otimizamos o protocolo para obter NCs específicos do vírus usando a coexpressão de N com um P. Recentemente, outro método de sucesso é fazer uma codificação de construção de fusão quimrica para P1-50-TEV-N1-405-8xHis para MeV33,34. N0P pode ser obtido após o decote protease TEV. A pureza de N0P depende da eficiência dos decotes TEV, que cortam a fusão quimrica entre a proteína N e P.
Em vez de usar o método de fusão quimrica, projetamos uma construção de co-expressão bi-cistronic. Especificamente, as construções de coexpressão do complexo N0P foram projetadas e projetadas em dois quadros de leitura aberto, compreendendo o comprimento completo de N (1-391) com uma tag His de 10x no terminal N no primeiro ORF, e os peptídeos n-terminal (1-126) de P no segundo ORF20. Resumidamente, o procedimento global da purificação N0P é purificar N0P e N-RNA de amostras de lise celular com contas de cobalto, remover o complexo de RNA e N:cellular RNA inespecífico com coluna Q, e obter um complexo N0P puro com a coluna SEC. Na etapa sec, a razão de A260/A280 pode ser monitorada e verificada duplamente com extração de RNA a partir das frações de pico N0P.
Coletivamente, neste protocolo, os passos mais críticos são a estratégia para projetar a construção da coexpressão do complexo N0P e usar uma série de afinidade e coluna de troca de íons para separar o complexo N 0 P livrede RNAdos outros complexos de RNA N-cellular. A eficiência da estratégia de coexpressão para obter complexo N0P é relativamente baixa; cerca de 50% n proteína ainda é complexo N-cellular RNA. O protocolo também pode ser aplicado para obter RNA livre N0P e montagem com RNA específico com N para obter complexo N:RNA de outros vírus NNS.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os programas de pesquisa no laboratório de Liang em Emory são apoiados pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos EUA (NIGMS), Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o número de premiação R01GM130950 e o Research Start-Up Fund da Emory University School of Medicine. O autor reconhece os membros do laboratório Liang por apoio útil e discussão crítica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
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