Summary
Para el análisis mecánico profundizado de la síntesis sincitial respiratoria del ARN del virus (RSV), divulgamos un protocolo de utilizar la fosfoproteína de la chaperona (p) para el coexpression de la nucleoproteína ARN-libre (N0)para el montaje in vitro subsecuente de las nucleocápsides virus-específicas (NCs).
Abstract
El uso de una plantilla de ARN auténtica es fundamental para avanzar en el conocimiento fundamental de la síntesis de ARN viral que puede guiar tanto el descubrimiento mecanicista como el desarrollo de ensayos en virología. La plantilla del ARN de los virus nonsegmented del ARN del negativo-sentido (NNS), tales como el virus sincitial respiratorio (RSV), no es una molécula del ARN solamente sino algo un complejo encapsidated de la ribonucleoprotein de la nucleoproteína (N). A pesar de la importancia de la plantilla auténtica del ARN, la generación y el montaje de tal complejo del ribonucleoprotein siguen siendo sofisticados y requieren la aclaración profundizada. El principal desafío es que el RSV N sobreexpresado se une no específicamente a los ARN celulares para formar partículas aleatorias similares a nucleocáps (NCLPs). Aquí, establecimos un protocolo para obtener N libre de ARN (N0)primero co-expresando N con una fosfoproteína chaperona (P), luego ensamblando N0 con oligos de ARN con la secuencia de ARN específica del RSV para obtener nucleocápsides específicas del virus (NCs). Este protocolo muestra cómo superar la dificultad en la preparación de este complejo viral tradicionalmente desafiando del ribonucleoprotein.
Introduction
Los virus de ARN de sentido negativo no segmentado (NNS) incluyen muchos patógenos humanos significativos, como la rabia, el ébola y el virus sincitial respiratorio (RSV)1,2. El RSV es la principal causa de enfermedades respiratorias como la bronquiolitis y la neumonía en niños pequeños y adultos mayores en todo el mundo3. Actualmente, no hay vacunas efectivas o terapias antivirales disponibles para prevenir o tratar el RSV4. Como parte del ciclo de vida, el genoma del RSV sirve como la plantilla para la replicación por la ARN polimerasa dependiente del ARN del RSV para producir un antigenoma, que a su vez actúa como la plantilla para generar un genoma de progenie. Tanto el genoma como el antigenoma RNAs son totalmente encapsidados por la nucleoproteína (N) para formar las nucleocápsides (NCs)3. Debido a que los CN sirven como plantillas tanto para la replicación como para la transcripción por la ARSV polimerasa, el ensamblaje adecuado de NC es crucial para que la polimerasa obtenga acceso a las plantillas para la síntesis de ARN5. Curiosamente, basándose en los análisis estructurales de las polimerasas virales NNS, se presume que varias proteínas N se disocian transitoriamente de las NCs para permitir el acceso de la polimerasa y reenlazarse al ARN después de la síntesis de ARN6,7,8,9,10,11,12.
Actualmente, el ensayo de polimerización de ARN del RSV se ha establecido utilizando la polimerasa purificada del RSV en plantillas cortas de ARN desnudo13,14. Sin embargo, las actividades de la RSV polimerasa no alcanzan el óptimo, como se observa en los productos no procesivos y abortivos generados por la RSV polimerasa cuando se utilizan plantillas de ARN desnudo. La carencia del NC con el ARN virus-específico es una barrera primaria para la comprensión mecanicista adicional de la síntesis del ARN de RSV. Por lo tanto, el uso de una plantilla de ARN auténtica se convierte en una necesidad crítica para avanzar en el conocimiento fundamental de la síntesis de ARN del RSV. Las estructuras conocidas de las partículas similares a nucleocáps (NCLPs) del RSV y otros virus de ARN del NNS revelan que los ARN en los NCLPs son ARN celulares aleatorios o ARN genómicos virales promedio15,16,17,18,19. Juntos, el principal obstáculo es que N se une no específicamente a los RNAs celulares para formar NCLPs cuando N se sobreexpresa en las células huésped.
Para superar este obstáculo, establecimos un protocolo para obtener primero RNA-libre (N0)y ensamblar N0 con ARN genómico viral auténtico en NCLPs20. El principio de este protocolo es obtener una gran cantidad de N libre de ARN recombinante (N0)coexpresando N con una chaperona, el dominio N-terminal de la fosfoproteína del VSR (PNTD). El N0P purificado podría ser estimulado y ensamblado en NCLPs mediante la adición de oligos de ARN específicos del RSV, y durante el proceso de ensamblaje, la chaperona PNTD se desplaza tras la adición de oligos de ARN.
Aquí, detallamos un protocolo para la generación y el montaje de RSV ARN-específico NCs. En este protocolo, se describe la clonación molecular, la preparación de proteínas, el ensamblaje in vitro y la validación del ensamblaje complejo. Destacamos la estrategia de clonación para generar construcciones bi-cistrónicas para la coexpresión de proteínas para la clonación molecular. Para la preparación de proteínas, se describen los procedimientos de cultivo celular, extracción de proteínas, y la purificación del complejo proteico. A continuación, discutimos el método para el montaje in vitro de los NCs específicos de ARN del RSV. Finalmente, utilizamos la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y la microscopía electrónica de manchas negativas (EM) para caracterizar y visualizar los NCLPs ensamblados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Clonación molecular
NOTA: La clonación independiente de ligasa (LIC) se utilizó para hacer un plásmido de construcción de coexpresión bi-cistrónica del VSR. LIC es un método desarrollado a principios de la década de 1990, que utiliza la actividad 3'-5' Exo de la ADN polimerasa T4 para crear voladizos con complementariedad entre el vector y el inserto de ADN21,22. Las construcciones se realizaron utilizando el VECTOR 2BT-10 de ADN, que consiste en una etiqueta 10x His en el N-terminal del Open Reading Frame (ORF)(Figura 1).
- Realizar la linealización de vectores LIC utilizando la digestión SSPI.
- Combine 10 μL de tampón SSPI 10X, 4 μL de enzima SSPI a una concentración de 5 U/μL, el volumen equivalente de 5 μg de ADN de minipreparación vectorial y ddH estérilde 2O a 100 μL.
- Incubar el digesto durante 3 horas a 37 °C.
- Ejecute el resumen en un gel de agarosa al 1.0% para la extracción de ADN vectorial.
- Utilice un kit de extracción de gel para realizar la extracción y purificación. Suspenda el volumen final de ADN vectorial en 30 μL de ddH2O y guárdelo a -20 °C.
- Prepare los insertos de ADN para N1-391 y P1-126 utilizando el cebador delantero N1-391, el cebador inverso N1-391, el cebador inverso P1-126 y el cebador inverso P1-126 (Tabla 1).
NOTA: Hay suficiente superposición con el vector linealizado para asegurar una temperatura de fusión de entre 55 °C y 60 °C. Para el cebador inverso, hay suficiente superposición con la hebra complementaria inversa del vector linealizado por la misma razón.- Realizar la amplificación por PCR del inserto de ADN utilizando las condiciones de la Tabla 2 y la Tabla 3.
- Extraiga el inserto de ADN amplificado. Ejecute los productos de PCR del paso anterior en un gel de agarosa al 1.0%, luego extraiga y purifique las bandas mediante extracción de gel. Suspender el volumen final de ADN extraído en 15 μL de ddH2O.
- T4 ADN polimerasa tratamiento del vector y el inserto de ADN (Tabla 4).
NOTA: El tratamiento debe realizarse por separado para el ADN vectorial y el ADN inserto.- Incubar la mezcla durante 40 minutos a temperatura ambiente. Luego, inactivar térmicamente la polimerasa a 75 °C durante 20 minutos. Guarde la mezcla de reacción a -20 °C.
- Recocido el vector LIC y el vector de inserción.
- Establecer un control negativo con 2 μL de ADN vectorial LIC y 2 μL de ddHestéril 2O.
- Combine 2 μL de ADN de inserción y 2 μL de ADN vectorial LIC de las reacciones anteriores de la ADN polimerasa T4 en un tubo de 0,2 mL.
- Realice la reacción de recocido a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Apaje la reacción con 1,3 μL de EDTA a una concentración de 25 mM.
- Transformar la reacción en 100 μL de células competentes de E. coli Top10 y platearlas en una placa de selección de ampicilina23,24.
- Identificar las construcciones positivas.
- Prepare la solución de miniprep del plásmido. Esto se puede hacer a través de la recolección de colonias y la inoculación en medios LB. Por lo general, 3 colonias son suficientes.
- Incubar la mezcla durante la noche a 37 °C.
- Centrifugar la mezcla a 4.560 x g durante 10 minutos y desechar el sobrenadante.
- Resuspend los pellets en 250 μL de tampón P1 y prepare minipreps de plásmido usando un kit de miniprep de espín.
- Realice un análisis de digestión del producto miniprep usando AseI u otras enzimas de restricción.
- Cargue las muestras en gel de agarosa al 0,8% y ejecute el plásmido digerido. Analice el gel bajo una lámpara UV.
- Utilice un servicio de secuenciación para validar la secuencia del producto positivo.
- Obtenga el inserto de ADN de coexpresión.
- Realizar PCR para obtener N1-391 y P1-126 utilizando como plantillas los 2BT-10 N1-391 y 2BT-10 P1-126 previamente construidos.
- Realizar la1ª PCR para obtener N1-391 a partir de la construcción 2BT-10 N1-391 utilizando las condiciones de PCR de la Tabla 2 y tabla 3 con la N1-391 Imprimación directa y la Imprimación inversa 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGCAATGCGGCGGCG
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - Realizar la2ª PCR para obtener P1-126 de la construcción 2BT-10 P1-126 utilizando el cebador Forward: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́y el cebador inverso P1-126 (utilice las condiciones de PCR de la Tabla 2 y la Tabla 3). - Finalmente, realizar pcr superposición en los productos mixtos de las 2 reacciones de PCR anteriores para fusionarN1-391 y P1-126. Utilice el cebador delantero N1-391 y el cebador inverso P1-126. Utilice las condiciones de PCR de la Tabla 5 y la Tabla 6.
- Unir el vector y el inserto de ADN.
- Trate el producto de PCR superposición con ADN polimerasa T4 siguiendo el protocolo del paso 1.3.
- Recocido del vector LIC y producto de PCR siguiendo el protocolo del paso 1.4.
- Identifique las construcciones positivas que siguen el protocolo en el paso 1.5.
2. Expresión y purificación de proteínas
NOTA: Utilice E. coli para la construcción bi-cistrónica de la coexpresión de N y P. Cultivo de las células a 37 °C, pero llevar a cabo la expresión a una temperatura reducida (16 °C) durante la noche. Purificar los complejos proteicos a través de una combinación de columna de cobalto, intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 2).
- Utilice la cepa E. coli BL21(DE3) para la producción de proteínas. Cultivar cultivos celulares de 4 L a 37 °C en medio LB (Caldo de Luria) hasta que OD600 alcance 0.6.
- Baje la temperatura a 16 °C. Una hora más adelante, induzca la expresión con 0.5 milímetros de isopropilo 1 thio--D-galactopyranoside (IPTG) durante la noche.
- Centrifugar las células a 4.104 x g durante 25 min y luego desechar el sobrenadante.
- Resuspend los pellets celulares en 200 mL de tampón de lisis A (50 mM de fosfato sódico, pH 7,4, 500 mM de NaCl, 5 mM de imidazol, 10% de glicerol y 0,2% de NP40). Utilice 50 mL de tampón de lisis para resuspend los pellets celulares de 1 L de cultivo celular.
- Lyse las células por sonicación durante 15 min, 3 segundos en, y 3 segundos de descuento. Luego centrífuga las células a 37.888 x g durante 40 min.
NOTA: El protocolo se puede pausar congelando las células antes de la sonicación en un congelador de -80 °C. - Cargue el sobrenadante en una columna de gravedad de cobalto (diámetro x longitud: 2,5 cm x 10 cm) con ~ 10 mL de perlas preequilibradas con volúmenes de 5-10 columnas (CV) de tampón de lisis.
- Lave la columna con 5 CV de tampón B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10% de glicerol y 5 mM de imidazol) y 5 CV de tampón C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM de NaCl, glicerol al 10% y 5 mM de imidazol).
- Elute la proteína de las cuentas usando 2 CV del almacenador intermediario D (50 milímetros Tris-HCl pH 7.4, NaCl de 500 milímetros, y imidazole de 250 milímetros).
- Diluir la proteína elutida 5x con tampón QA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5% Glicerol) para la columna Q.
- Lave los 5 mL de la columna Q con tampón de control de calidad para equilibrar la columna, luego cargue la muestra diluida en la columna Q usando la bomba peristáltica (por ejemplo, Rabbit).
- Cargue la columna Q en la máquina de HPLC junto con el búfer de control de calidad y el búfer QB (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% glicerol). Configure el caudal como 1 mL/min.
- Ejecute el programa de "lavado de la bomba" para lavar la máquina con búfer QB seguido de búfer de control de calidad (1-2 CV / cada uno). Establezca el flujo del sistema en 3 mL/min.
- Establezca el UV1 en 280 nm y el UV2 en 260 nm. Utilice una placa de 96 pozos profundos para recoger las fracciones.
- Proteínas elute utilizando un gradiente escalonado de agente de elución (QB Buffer) aplicando 3-4 CV de cada concentración, aumentando el porcentaje en un 5% cada vez a partir de 0% QB. El complejo de proteína N0P saldrá al 15% de QB Buffer.
- Una vez que toda la proteína esté eluted, lave la columna con 100% QB Buffer (2 CV).
- Aislar la proteína por filtración en gel Superdex 200 Aumentar 10/300 GL columna (diámetro x longitud: 1,0 cm x 30 cm) y equilibrar con tampón E (20 mM HEPES pH 7,4 y 200 mM NaCl).
- Analice las fracciones que contienen proteínas mediante SDS-PAGE.
3. Ensamblaje in vitro del NC específico del virus
NOTA: El ensamblaje in vitro del NC específico del RSV (N: ARN) se realizó mediante la incubación del complejo N0P preparado con oligos de ARN. A continuación, se utilizó la cromatografía SEC para separar el complejo de ensamblaje del N0P y el exceso de ARN(Figura 2).
- Mezclar e incubar el complejo purificado N0P con RNA oligo con la relación molecular de 1:1,5 a temperatura ambiente durante 1 hora, generalmente 1 mL de la proteína N0P con una concentración de 1 mg/mL es suficiente para el siguiente paso. Configure la muestra de control, que solo contiene la misma cantidad de proteína N0P.
- Pre-equilibrar la filtración de gel Superdex 200 Aumentar 10/300 GL columna con el tampón E (20 mM HEPES, pH 7.4, 200 mM NaCl).
- Centrifugue la muestra con 21.130 x g durante 15 min, elimine cualquier precipitación y cargue el sobrenadante en la columna SEC.
- Compare las imágenes de cromatografía SEC de la muestra de ensamblaje de N: ARN y la muestra de control de N0P, combine la relación A260/ A280 para identificar qué picos son el N-ARN ensamblado, N0P y ARN libre.
- Recoja las fracciones máximas, ejecute el gel SDS-PAGE o haga cuadrículas.
- Para el complejo de N-ARN de ensamblaje, recoja todas las fracciones del pico de N-ARN, realice la extracción de ARN y ejecute el gel Urea-PAGE para verificar la longitud de ARN específico, que es la misma que se mezcla e incuba en el primer paso.
4. Hacer rejillas de manchas negativas
NOTA: La microscopía electrónica de mancha negativa (EM) es un método en el que las moléculas se adsorben a una película de carbono y luego se incrustan en una capa de átomos de metales pesados. La mancha negativa EM produce un alto contraste de imagen, lo que facilita la vista y la alineación computacional de las partículas. Otra ventaja es que la adsorción de las partículas a una película de carbono suele inducir a las moléculas a adherirse a la rejilla con pocas orientaciones preferidas. Cuando las moléculas están en una orientación similar, es fácil separarlas en clases estructuralmente distintas. La tinción negativa EM es, por lo tanto, la técnica adecuada para guiar la preparación delamuestra25,26 (Figura 3).
- Microondas o calentar 5 mL de ddH2O en un vaso de precipitados de vidrio pequeño utilizando un calentador de tungsteno hasta que esté hirviendo.
- Pesar 37.5 mg de formiato de uranilo y añadir a 5 mL de ddH calentado2O para hacer una solución de tinción de formiato de uranilo al 0.75%. Revuelva debajo de un casto cubierto de papel de aluminio para protegerlo de la luz.
- Añadir 4 μL de NaOH de 10 M a la solución de tinción y continuar agitando durante 15 min, protegido de la luz.
- Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 mm en un tubo de ensayo.
- Utilice la descarga de resplandor para hacer que las rejillas EM continuas recubiertas de carbono sean hidrofílicas27.
NOTA: Las rejillas se colocan dentro de una cámara conectada a una fuente de alimentación. Cuando se aplica alto voltaje, el gas dentro de la cámara ioniza, y los iones cargados negativamente se depositan en las rejillas de carbono para hacerlos hidrófilos. - Cortar y doblar una tira de parafilm. Pipetear 2 gotas de 40 μL del tampón en un lado de la parapelícula, y pipetear otras 2 gotas de 40 μL de solución de tinción al otro lado.
- Para hacer las rejillas de carbono EM, aplique 3 μL de muestra de proteína durante 1 minuto.
- Borrar las rejillas contra un papel secante.
NOTA: Las rejillas se lavan 2 veces con tampón, y 1x con la solución de tinción de formiato de uranilo al 0.75% borrada después de cada paso. - Mantenga la superficie de la rejilla en la segunda gota de 0.75% solución de tinción de formiato de uranilo durante 30 segundos.
- Limpie la rejilla contra un papel secante para eliminar el exceso de solución de manchas y permitir que la rejilla se seque al aire.
- Almacene las cuadrículas en el cuadro de cuadrícula antes de la creación de imágenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Purificación de la proteína N0P libre de ARN
Con este protocolo, se puede obtener un complejo heterodmérico soluble A gran escala RSV N0P. La longitud completa de la parte terminal N y N de las proteínas P se co-expresó con 10X His-Tag en la proteína N en E. coli. N0P fue purificado usando una columna del cobalto, un intercambio iónico, y una cromatografía de la exclusión del tamaño. N0P contiene tanto el terminal N de longitud completa como el N terminal P pero no contiene ARN celular basado en la absorbancia UV A260/A280 de relación20 (Figura 4).
Ensamblaje de N-ARN y comprobación de manchas negativas
A continuación, demostramos que el purificado N0P podría ser estimulado y ensamblado en nuciloplasmid-como partículas (NCLPs) mediante la incubación con oligos de ARN específicos. Los NCLPs se ensamblaron incubando el N0P con oligos de ARN con la proporción de 1:1.5 a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se ejecutan a través de la columna de filtración de gel. Cuando se forma el complejo N:ARN, muestra tres picos: el1º pico es N:ARN, el2º pico es N0P, y el3º pico es exceso de ARN libre. La fracción más alta del pico N:RNA crea las rejillas de manchas negativas para verificar con EM20 (Figura 5).
Figura 1. La ilustración de las construcciones del plásmido. un. La construcción de la RSV N1-391; B. La construcción del RSV P1-126; C. El constructo bi-cistrónico para la coexpresión de N1-391 y P1-126. El primer gen RSV N1-391,el segundo gen RSV P1-126,el gen resistente a los antibióticos (AmpR), y los promotores se destacan en cajas amarillas, cian, rosadas y naranjas, respectivamente. En resumen, los insertos génicos del RSV N1-391 y del RSV P1-126 se construyen por separado y se ensamblan. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2. El diagrama de flujo de la purificación del complejo proteico N1-391P1-126. Describe la inoculación y los crecimientos a gran escala del cultivo celular de E. coli y la cosecha de la célula por centrifugación. Seguidas por lisis celular, las muestras de proteínas son purificadas por la cromatografía de afinidad (es decir, columna de Co2+), cromatografía de intercambio iónico (es decir, columna Q) y cromatografía de exclusión de tamaño de filtración de gel (SEC). Las muestras de proteínas se analizan más a fondo mediante el gel SDS-PAGE. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3. Preparación de rejillas negativas del EM de la mancha para la proyección de imagen. A. El resplandor descarga las rejillas. B. Se muestra el procedimiento para las rejillas de tinción negativas. Las pinzas se utilizan para recoger una rejilla, seguida de la aplicación de la muestra de proteína durante 1 minuto. Las rejillas están borradas con papel secante. La rejilla se lava dos veces con tampón y dos veces con la solución de tinción de formiato de uranilo al 0,75%. Las rejillas se mantienen en la segunda gota de solución de tinción durante 30 segundos. Las rejillas se borran después de cada lavado y se secan al aire después de la borrada final. C. Las cuadrículas se almacenan en el cuadro de cuadrícula para obtener imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4. Resultados representativos de la copurificación del complejo N1-391P1-126. un. El perfil SEC de N1-391P1-126. B. El perfil SEC del conjunto N1-391P1-126 con ARN. C. El gel SDS-PAGE muestra la proteína N sólo para el complejo N-ARN y las bandas para las proteínas N y P del complejo N1-391P1-126. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5. Imágenes representativas de N-ARN. A y B son imágenes representativas de tinción negativa EM de N-ARN del picoN-1-391-ARNen la Figura 4. Los complejos N-ARN se tiñen utilizando el procedimiento descrito en la Figura 3. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| Imprimaciones | |||
| N1-391 Adelante | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 Reverso | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3' | ||
| P1-126 Adelante | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Reverso | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3' | ||
Tabla 1. Secuencias de cebadores.
| Amplificación por PCR del inserto de ADN | |
| 15 μL | 10x Tampón de reacción de la polimerasa Pfu |
| 3 μL | Cebador delantero (concentración de 100 μM) |
| 3 μL | Cebador inverso (concentración de 100 μM) |
| 15 μL | Mezcla dNTP a una concentración de 2,5 mM |
| 6 μL | El ADN plásmido contiene el gen de N o P (100ng/ μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polimerasa a 2,5U/μL |
| Volumen a llenar a 150 μL | DdH estéril2O |
Tabla 2. Amplificación por PCR de reactivos de inserción de ADN.
| Amplificación por PCR del inserto de ADN | |||
| paso | Hora | temperatura | Ciclos |
| desnaturalización | 4 min. | 95 ºC | 1 |
| desnaturalización | 45 seg. | 95 ºC | 30 |
| recocido | 30 seg. | 62 ºC | |
| Extensión* | 90 seg. | 72 ºC | |
| extensión | 10 min. | 72 ºC | 1 |
| sostener | ∞ | 4 ºC | 1 |
| La mezcla de 150 μL se puede ejecutar en tres reacciones de PCR separadas (3 x 50μL). | |||
| *Para la ADN polimerasa Pfu, 1 kb/min es la velocidad recomendada para la fase de extensión. Aquí, tanto las longitudes del gen N1-391 como las del gen P1-126 son inferiores a 1,5 Kb. | |||
| Por lo tanto, se utilizaron 90 segundos para el paso de extensión. | |||
Tabla 3. Amplificación por PCR del programa de termociclismo de inserción de ADN.
| Tratamiento de la ADN polimerasa T4 | |
| 10 x búfer | 2 μL |
| Vector/INSERTO DE ADN (vector de 0,1 pmol o inserto de 0,2 pmol) | 5 μL |
| dNTP* a 25 mM | 2 μL |
| TDT a 100 mM | 1 μL |
| ADN polimerasa T4 (LIC calificado) | 0,4 μL (1,25 U) |
| DdH estéril2O | 9.6 μL |
| *dGTP se utilizó para el vector, y dCTP se utilizó para el INSERTO de ADN. | |
Tabla 4. Tratamiento de la ADN polimerasa T4.
| Superposición PCR | |
| 15 μL | 10 X Tampón de reacción de la polimerasa Pfu |
| 3 μL | Cebador delantero (100 μM) |
| 3 μL | Cebador inverso (100 μM) |
| 15 μL | Mezcla dNTP (2,5 mM) |
| 3 μL | ADN de1ª ronda de PCR que contiene el gen N1-391 (100 ng/μL) |
| 3 μL | ADN de1ª ronda de PCR que contiene el gen P1-126 (100 ng/μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polimerasa (2,5 U/μL) |
| Volumen a llenar a 150 μL | DdH estéril2O |
Tabla 5. Superposición de reactivos de PCR.
| Superposición PCR | |||
| paso | Hora | temperatura | Ciclos |
| desnaturalización | 4 min. | °C 95 | 1 |
| desnaturalización | 45 seg. | °C 95 | 30 |
| recocido | 30 seg. | °C 62 | |
| Extensión* | 2 min. | °C 72 | |
| extensión | 10 min. | °C 72 | 1 |
| sostener | ∞ | °C 4 | 1 |
| La mezcla de 150 μL se puede ejecutar en tres reacciones de PCR separadas (3 x 50 μL). | |||
| *Para la ADN polimerasa Pfu, 1 kb/min es la velocidad recomendada para la fase de extensión. Aquí, la longitud total del gen N1-391 y P1-126 es inferior a 2,0 Kb. Así, 2 minutos fueron utilizados para el paso de la extensión. | |||
Tabla 6. Programa de termociclado por PCR superpuesta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las estructuras conocidas de partículas similares a nucleópsides (NCLP) de los virus de ARN de sentido negativo no segmentado (NNS) muestran que los NCLPs ensamblados son el complejo N con ARN celulares del huésped cuando se sobreexpresan en sistemas de expresión bacterianos o eucariotas15,16,17,18,19. Estudios anteriores han intentado obtener el ARN libre de N con una variedad de métodos, tales como la digestión de la ARNasa A, el lavado de sal alta, o el ajuste de diferentes tampones de pH para eliminar los ARN celulares inespecíficos28,29. Sin embargo, ninguno de los métodos anteriores se puede utilizar correctamente para el ensamblaje de los NIC específicos de virus. Para obtener el RSV N libre de ARN, también probamos una combinación de métodos, incluyendo la digestión de la ARNasa A, lavado con alto contenido de sal (1,5M NaCl), ajustando el pH tampón de pH 5,0 a pH 9,0, desnaturalización de proteínas y renaturalización. Después de muchos ensayos fallidos, todavía no podíamos conseguir N ARN-libre con los métodos antedichos. Discutiremos brevemente los intentos y las posibles razones.
Un método para obtener N libre de ARN es digerir el ARN celular del huésped en NCLPs ensamblados con ARNasa A. En VSV, la incubación del NCLP purificado con la ARNasa A a una concentración final de 1mg/ml a 37 °C durante 1 h eliminó completamente el ARN del NC28. El N oligomérico vacío purificado entonces fue incubado con poly-A (250-nt o más de largo) en un ratio molar de 1:5 en presencia de inhibidores de RNase. Análisis del ARN aislado de N reconstituido: poly-A demostró que el ARN era aproximadamente 90 nt de longitud. Esto sugirió que el ARN fuera de la nucleoproteína es susceptible a la digestión inespecífica por la ARNasa contaminada A del paso anterior. La estrategia de digestión de la ARNasa A para eliminar el ARN no tuvo éxito cuando se aplicó al RSV. Esto puede deberse a dos razones. En primer lugar, la ARNasa A contaminada digiere el ARN específico del RSV, que posteriormente se incubará y ensamblará con N. En segundo lugar, la eficiencia de la digestión de la ARNasa A es mucho menor en el RSV. Esto se debe a que los RNA se ensamblan de manera diferente en diferentes virus NNS. Las estructuras cristalinas conocidas de N:RNA muestran que el ARN se une fuera del NC en VSV, pero dentro del NC en RSV30,31. La configuración del ARN que ata hacia adentro del NC puede llevar a la eficacia baja para que el RNase A acceda y digiera.
Otro método para obtener N libre de ARN es hacer los truncamientos que cortan tanto el motivo N-terminal (N-brazo) como el motivo C-terminal (C-brazo) de N. Sin embargo, este N libre de ARN truncado no se puede utilizar para ensamblar con el ARN en un NC estable porque el N-brazo de N se dobla en sus subunidades vecinas interactuando con el dominio del C-terminal (CTD) de la subunidad precedente N. El brazo C extendido se coloca en el CTD de la siguiente subunidad N31.
Un método adicional para obtener N libre de ARN es preparar N mutante. Por ejemplo, el resultado obtenido por Galloux et al. mostró que el complejo N0P libre de ARN del RSV podía obtenerse mediante la coexpresión de un mutante doble N K170A/R185A con el N-terminal de P en bacterias32. Sin embargo, tiene dos problemas potenciales para otras caracterizaciones estructurales. Un problema es la baja estabilidad de este complejo mutante a altas concentraciones. El otro problema es que el complejo mutante perdió la capacidad de unión de ARN, que no se puede utilizar en el siguiente paso de montaje.
A pesar de los tremendos desafíos, hemos establecido y optimizado el protocolo para obtener NCs específicos del virus utilizando la coexpresión de N con una chaperona P. Recientemente, otro método exitoso es hacer una construcción de fusión quimérica que codifica para P1-50-TEV-N1-405-8xHispara MeV33,34. N0P se puede obtener después de la escisión de la proteasa tev. La pureza de N0P depende de la eficiencia de las hendiduras de TEV, que cortan la fusión quimérica entre la proteína N y P.
En lugar de utilizar el método de fusión quimérica, diseñamos una construcción de coexpresión bi-cistrónica. Específicamente, las construcciones de coexpresión del complejo N0P han sido diseñadas y diseñadas en dos marcos de lectura abiertos, que comprenden la longitud completa de N (1-391) con una his-tag de 10x en N-terminal en el primer ORF, y los péptidos N-terminales (1-126) de P en el segundo ORF20. Brevemente, el procedimiento general de la purificación de N0P es purificar N0P y N-ARN marcados con His de muestras de lisis celular con perlas de cobalto, eliminar el ARN inespecífico y el complejo N: ARN celular con columna Q, y obtener un complejo N0P puro con la columna SEC. En el paso SEC, la relación de A260/A280 se puede monitorear y verificar dos veces con la extracción de ARN de las fracciones de pico N0P.
Colectivamente, en este protocolo, los pasos más críticos son la estrategia para diseñar la construcción de la coexpresión del complejo N0P y el uso de una columna de afinidad en serie e intercambio iónico para separar el complejo N0P libre de ARN de los otros complejos de ARN N-celulares. La eficiencia de la estrategia de coexpresión para obtener el complejo N0P es relativamente baja; alrededor del 50% de la proteína N sigue siendo complejo de ARN N-celular. El protocolo también se puede aplicar para obtener N0P libre de ARN y el ensamblaje con ARN específico con N para obtener el complejo N:RNA de otros virus NNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los programas de investigación en el laboratorio Liang en Emory son apoyados por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Estados Unidos (NIGMS), los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de premio R01GM130950 y el Fondo de Investigación inicial de la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory. El autor reconoce a los miembros del laboratorio de Liang por su apoyo útil y su discusión crítica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
