Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המדגים את הטכניקה ואת הפקדים הדרושים עבור הדמיית זלוף דופלר לייזר כדי למדוד את זרימת הדם בעכבר hindlimb.
Abstract
התאוששות זרימת הדם היא מדד תוצאה קריטי לאחר איסכמיה אחורית ניסיונית או איסכמיה-רפרופוזיה. הדמיית זלוף דופלר לייזר (LDPI) היא שיטה נפוצה, פולשנית, חוזרת להערכת התאוששות זרימת הדם. הטכניקה מחשבת את זרימת הדם הכוללת ברקמה שנדגמה משינוי דופלר בתדירות שנגרם כאשר לייזר פוגע בתאי דם אדומים נעים. המדידות באות לידי ביטוי ביחידות זלוף שרירותיות, כך שההתבטאות הנגדית שאינה מתערבת ברגל משמשת בדרך כלל כדי לסייע בשליטה על המדידות. עומק המדידה הוא בטווח של 0.3-1 מ"מ; עבור איסכמיה hindlimb, משמעות הדבר היא כי זלוף עורי מוערך. זלוף עורי תלוי במספר גורמים – והכי חשוב טמפרטורת העור וסוכן הרדמה, אשר חייב להיות נשלט בקפידה כדי לגרום קריאות אמינות. יתר על כן, פיגמנטציה שיער ועור יכול לשנות את היכולת של הלייזר להגיע או לחדור הדרמיס. מאמר זה מדגים את הטכניקה של LDPI בעכבר hindlimb.
Introduction
כיב העור עם ריפוי פצעים לקוי הוא הגורם המוביל של קטיעות בחולים אנושיים1. ריפוי פצעים נאות דורש רמות גבוהות יותר של זלוף עורקים מהנדרש כדי לשמור על עור שלם, אשר נפגע בחולים עם מחלת עורקים היקפית2,3,4. מספר מצבים ראומטולוגיים וסוכרת אחרים יכולים גם להוביל microcirculation העור מופרע ולא מספיק כדי לרפא פצעים5,6. חולי סוכרת רבים סובלים ממחלת עורקים היקפית בו זמנית, מה שמציב אותם בסיכון גבוה במיוחד לקטיעה. הדמיית זלוף דופלר לייזר (LDPI) משמש במצבים קליניים כדי להעריך את microcirculation העור, כמו גם במצבי מחקר כדי להעריך את זרימת הדם ואת זרימת הדם התאוששות לאחר איסכמיה hindlimb ניסיוני, איסכמיה-reperfusion, דש מיקרוכירורגי7.
מערכת LDPI מקרינה קרן לייזר בהספק נמוך המוסטת על-ידי מראה סריקה כדי לנוע מעל אזור מעניין. זה שונה מזרימה של דופלר לייזר, המספק מדידת זלוף עבור האזור הקטן של הרקמה במגע ישיר עם בדיקה flowmetry8. כאשר קרן הלייזר מקיימת אינטראקציה עם דם נע במיקרו-וסקולטורה, היא עוברת שינוי בתדר דופלר, אשר מובלט על ידי הסורק ומומר ליחידות זלוף שרירותיות. מכיוון ש- LDPI היא טכניקה מבוססת אור, היא מוגבלת מבחינת עומק החדירה ל- 0.3-1 מ"מ, כלומר לרוב זלוף עורי מוערך7. זרימה עורית יכולה להשתנות על ידי טמפרטורת העור ומערכת העצבים הסימפתטית, אשר עשוי להיות מושפע סוכני הרדמה שונים9. מדידות מהלייזר האופטי מושפעות גם מתנאי תאורת הסביבה, פיגמנטציה בעור, וניתן לחסום אותן על ידי פרווה או שיער7.
LDPI היא טכניקת המחקר הנפוצה ביותר לניטור התאוששות זלוף לאחר איסכמיה מכיוון שהיא לא פולשנית, אינה דורשת ניהול ניגודיות, ויש לה זמני סריקה מהירים המאפשרים איסוף נתונים על בעלי חיים מרובים. זה עושה את זה אידיאלי כדי לעזור לקבוע אם טיפולים שמטרתם arteriogenesis טיפולית או אנגיוגנזה יעילים מודלים בעלי חיים קטנים. התאוששות זרימת הדם לאחר איסכמיה hindlimb כפי שנמדד על ידי LDPI בקורלציה היטב עם פיתוח עורק בטחונות כאשר מוערך באמצעים אחרים כגון יציקת Microfil או מיקרו CT10,11. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את ההערכה של זלוף hindlimb באמצעות LDPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון.
1. הכנת סורק
- כוונן את גובה הסורק כך שהמרחק לנושא הסרוק יהיה כ- 30 ס"מ.
- הפעל את Imager ולהפעיל את התוכנה המשויכת.
- פתח את תוכנית המדידה. אם התוכנה מקיימת תקשורת נכונה עם הסורק, תופיע אזהרת הפעלת לייזר אינפרא-אדום.
- כייל את המכונה בתקנים שסופקו על-ידי היצרן (לא מוצג בסרטון ויהיה תלוי בדגם הספציפי של המכונה הנמצא בשימוש).
- כוונן את הגדרות הסורק כך שיתאימו לחומר הרקע ולהגדרת התאורה בחדר.
- הגדר את רמות הרווח DC FLUX ו- CONC, לפי הוראות היצרן (לא מוצג בסרטון).
- הגדר את סף הרקע על-ידי הצבעה על קרן הלייזר בחומר הרקע השחור והקש על ערכת BK אוטומטית.
2. הכנת סריקה מראש של העכבר
- הקם את תא האינדוקציה isoflurane עם ניקוי מתאים של גז הפסולת.
הערה: הנחת תא האינדוקציה על משטח חימום תסייע במניעת אובדן טמפרטורת העכבר במהלך אינדוקציה להרדמה. - הפעל את השמיכה ההומאותרמית, הממוקמת באזור הסריקה מתחת למשטח לא רפלקטיבי (במקרה זה בד ניאופרן שחור). הגדר את השמיכה homeothermic כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של 37 °C (69 °F).
- מקם את גשוש הטמפרטורה עבור השמיכה ההומיותרמית וחומר הסיכה כך שהם מוכנים להכנסה.
- מניחים את מסכת ההרדמה ומערכת הטיהור באזור הסריקה.
- המשך את העכבר עם מאדה isoflurane. הגדר את קצב החמצן ל 1 L / min של זרימה ולהתאים את isoflurane ל 4% עבור אינדוקציה הרדמה. הפעל את הזרימה לתא האינדוקציה של ההרדמה, וקצב הנשימה של העכבר יאט. הרדמה נאותה מושגת כאשר העכבר מאבד את הרפלקס הימני שלה.
- מעבירים את העכבר למסכת הרדמה/חרוט אף עם נבלות גז פסולת מחוברות ומתאימה את הישפולורן ל-1.5%.
הערה: רמת הרדמה זו היא בדרך כלל מספיק כדי לשמור על העכבר שוכב בשקט יחסית במהלך הסריקה, אבל לא נועד לספק רמות כירורגיות של הרדמה, ולכן עומק ההרדמה אינו נבדק. שינוי רמת איזופלורן גורם לשינויים בקצב הלב, הנשימה והזלוף העורי, ולכן יש להשתמש באחוז עקבי לאורך כל ניסוי קורס הזמן ולכל הנבדקים הניסיוניים. טכניקות הרדמה חלופיות כגון הזרקת IP של קטמין xylazine ניתן להשתמש גם, אבל אותה טכניקת הרדמה יש להשתמש לאורך כל המחקר כמובן זמן כמו הרדמה שונים משפיעים על זלוף עורי באופן שונה. - (אופציונלי בהתאם לאזור הסריקה) אם האזור המתוכנן של עניין להיסרק מכוסה על ידי פרווה, להשתמש גוזם חשמלי קטן או קרם depilatory כדי להסיר את השיער מאזור העניין.
הערה: יש להסיר לחלוטין את קרם הדפילטורי, ואת עור העכבר מיובש לפני הסריקה. - הנח את העכבר בתנוחת הסריקה המתאימה על המשטח השחור הלא רפטקטיבי המכסה את השמיכה הביתית, ותאשר ששני החלקים האחוריים נשארים על מקור החום לאורך שיווי המשקל והסריקה (איור 1).
הערה: חשוב לשמור על שתי הרגליים על השמיכה homeothermic כדי למנוע וריאציה אזורית בטמפרטורה. - הכנס את בדיקת הטמפרטורה רקטלית משומנת הקשורים השמיכה הומאותרמית.
- השווה את טמפרטורת העכבר לטמפרטורת הסריקה הרצויה (37 °C (67 °F); בערך 5-10 דקות.
- בחר הגדרת סורק, שאליה ניתן לגשת מהתפריט העליון או מסמל הגדרת הסורק. התאם את אזור הסריקה על-ידי שינוי קואורדינטות X-Y כך שיתאימו לאזור העניין. מהירות הסריקה תהיה תלויה ברזולוציית הסריקה. רזולוציה גבוהה יותר תגרום לזמנים ארוכים יותר של סריקה. לסריקה חוזרת המתמקדת בזלוף גלובלי, בניגוד לרזולוציה גבוהה יותר המתמקדת בזלוף אנטומי, מהירות סריקה של 4 אלפיות השנייה/פיקסל מתאימה.
הערה: יש לשקול רזולוציה גבוהה יותר וסריקה אחת אם החוקר מנסה לחקור ישירות את זרימת הערבות המתפתחת (התמונה הטובה ביותר בירך הגחון ובעגל שם הוא קרוב יותר לעור). סריקה חוזרת ונשנית ברזולוציה/מהירות נמוכה יותר (למשל, 4 אלפיות השנייה/פיקסל) מספיקה בעת הערכת זלוף גלובלי לאיבר הקצה של משטח הרגל של העכבר. התוכנה המוצגת בסרטון טוענת באופן אוטומטי את התבנית ששימשה בעבר לסריקת אזור, מהירות ורזולוציה בעת הפעלה מחדש, או שניתן לאחזר אותה מקובץ מאוחסן אם אזורים שונים של עניין משמשים לניסויים שונים. - בשעת ביצוע סריקות חוזרות, בחרו בכרטיסיה 'חזור' ו'סריקת קו'. ניתן לשנות את מספר הסריקות (במקרה זה 3 סריקות) כמו גם את מרווח הזמן לחזרה. הזמן המינימלי עבור מרווח הזמן לחזרה יהיה זמן הסריקה המשוער, המוצג באזור האפור שמימין לתיבה הנקבע על-ידי אזור הסריקה ורזולוציית הסריקה. הוספת מספר שניות מאפשרת למשתמש להשהות את העכבר ולמקם אותו מחדש במידת הצורך בין הסריקות.
3. סריקה
- בחרו בכרטיסייה 'סריקת תמונות' ובחרו בלחצן 'סמן'. הלייזר יעבור כדי להתוות את אזור הסריקה. התאם את מיקום העכבר כך שהיעד לסריקה נמצא בתוך האזור המסומן.
הערה: עבור פנקס רגליים או משטח רגל וסריקת עגל, מיקום נוטה עם hindlimbs המורחבת מספק אזור עקבי יותר של עניין מאשר מיקום סופי. עורק הירך ועורק saphenous ו בטחונות קרובים מאוד לפני השטח הגחוניים של הירך והעגל, ולכן מיקום סופי הוא המועדף אם משתמשים באזורים אלה של עניין. - התחל מדידה חוזרת על-ידי בחירה בסמל סריקה חוזרת ולחץ על לחצן 'הפעל' כדי ליזום את הסריקה.
- אשר את מרחק הסריקה בחלון המוקפץ ולחץ על אישור כדי להתחיל בסריקה.
- נטר את העכבר במהלך הסריקה לאיתור תנועת עכבר; אם העכבר זז מספיק כדי שהעכבות האחוריות לא יהיו עוד באזור הסריקה באמצע סריקה, הפעל מחדש את הסריקה. וריאציות קטנות בעמדת העכבר האחורי ניתן לאכלס בתוכנת הניתוח.
- לפקח על טמפרטורת העכבר במהלך תהליך הסריקה כפי שהוא עשוי להשתנות אפילו עם השימוש בשמיכה הומאותרמית. אם יש שונות רבה מדי בטמפרטורת העכבר, הדבר עלול לגרום לשינוי משמעותי בין הסריקות. בדרך כלל, טווח טמפרטורות של 36.8-37.2 מעלות צלזיוס יגרום לנתונים מקובלים.
- שמור את הסריקה שנלכדה תחת החלון שמירה בשם עם שם קובץ הכולל מזהה עכבר ונקודת זמן לניתוח נתונים קל יותר. הזן פרטי עכבר ונקודת זמן אם תרצה בחלון פרטי הנושא.
- כבה את isoflurane ולהסיר את גשוש הטמפרטורה רקטלית.
- לחטא את הבדיקה טמפרטורת רקטלית עם 70% אתנול כך שהוא מוכן לשימוש בעכבר הבא.
- אפשר לעכבר להתאושש מהרדמה עד לנקודה שבה הוא מציג רפלקס ימני על ידי היפוך מהמיקום supine למצב נוטה לפני החזרתו לכלוב.
הערה: התאוששות יכולה להתבצע גם על שמיכת התחממות עבור isoflurane מאז ההתאוששות היא מהירה מאוד או בכלוב התאוששות מחומם קטמין / xylazine.
4. לכידת נתוני LDPI (איור 3)
- פתח את תוכנת סקירת ההדמיה.
- עבור לתפריט הקובץ, פתח ואתר את הקובץ שנשמר.
- בחר בסמל ההחזר על ההשקעה בסרגל הכלים.
- בחרו בלחצן 'הוסף מצולע'.
- עקוב אחר אזור העניין (ROI) עבור ה- hindlimb של הפקד באמצעות העכבר. מעקב מצולע אינו חייב להיות מדויק מכיוון שהרקע האפור לא ייכלל בממוצעים המחושבים.
- חזור על שלבים 4.3-4.5 עבור hindlimb כירורגי.
- בחר בסמל סטטיסטיקה כדי לפתוח את החלון תוצאות סטטיסטיקה של ROIs תמונה (PU).
- יצא את התוצאות עבור מצולע 1 (בקרה hindlimb) ומצולע 2 (hindlimb כירורגי) לגליון עבודה איסוף נתונים באמצעות העתקה /הדבקה.
5. ניתוח
- לכוד את הנתונים כיחס כירורגי/בקרה עבור כל סריקה.
- השתמש בניתוח/בקרה בממוצע עבור כל שלוש הסריקות לאיתור נקודת הנתונים עבור עכבר מסוים זה בנקודת זמן זו. בגלל השונות הביולוגית בתגובה לאיסמיה hindlimb, באופן כללי 8-10 עכברים נדרשים בכל נקודת זמן כדי להשיג תוצאות לשחזור עם ~ 10% שגיאת תקן.
הערה: לפני מתן אפשרות לעכבר להתאושש מהרדמה, כדאי לבצע ניתוח מהיר של הסריקות החוזרות ונשנות כדי לבדוק אם הנתונים משתנים מדי (למשל, יותר מ-100-150 יחידות זלוף שונות בין סריקות 1-3). שונות גבוהה בין סריקות חוזרות מצביעה על כך שהעכבר לא שוווה לחלוטין במהלך הסריקה (איור 2), וניתן לבצע סריקה חוזרת מבלי לאבד נקודת נתונים, שתתרחש אם התמונות לא ינותח עד למועד מאוחר יותר. ייתכן שיהיה צורך לשנות את לוח הצבעים כדי למטב את הטווח הדינמי של ערכי השטף המוצגים כדי להציג טוב יותר וריאציית סריקה (איור 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LDPI מוצלח אמור לגרום לסריקות חוזרות ונשנות עקביות, עם וריאציה של יחידת זלוף של לא יותר מ- 100-150 (המתאימה לכ- 10% מהזלוף הממוצע הרגיל עבור משטח הרגל של העכבר) בין שלוש הסריקות (איור 2). כפי שמודגם באיור 2, סריקות חוזרות מסייעות לקבוע שהעכבר שוווה כראוי כך שיחס איסכמי/בקרה משקף בצורה הטובה ביותר את זרימת הדם הבסיסית לעומת שונות בזלוף עורי הנגרמת על ידי שינוי טמפרטורה. שימוש בסריקות בודדות עבור נקודות נתונים יגדיל את השונות שתוביל לצורך בעכברים ניסיוניים יותר. כאשר נעשה שימוש עבור איסכמיה hindlimb, hindlimb כירורגית צריך ירידה זלוף גלובלי בהשוואה לפקד hindlimb. התוצאות באות לידי ביטוי כיחס של זלוף אחורי כירורגי / שליטה זלוף hindlimb. כאשר עכברים בתחילה vasodilate ולפתח רשת בטחונות מהותית שלהם לאורך זמן, התאוששות זרימת הדם על ידי LDPI צריך להיראות על פני קורס זמן לאחר הניתוח (איור 4). מידת ההחלמה תלויה במתח העכבר ובחומרתו של מודל איסכמיה hindlimb.
איור 1. מיקום עכבר להדמיית זלוף דופלר בלייזר של משטחי הרגליים הגחוניים. עכבר מורדם באמצעות חרוט האף isoflurane (A) ממוקם במצב נוטה עם hindlimbs המורחבת כדי לאפשר סריקה של משטחי הרגליים הגחוני. בדיקת טמפרטורה רקטלית (P) עבור שמיכה הומאותרמית היא במקום כדי לשמור על טמפרטורת גוף עקבית במהלך הסריקה. כרית השמיכה ההומאותרמית נמצאת מתחת לחומר הניאופרן הלא רפלקטיבי המשמש לאספקת רקע לסריקה. לייזר המציין את אמצע אזור הסריקה נראה ליד זנב העכבר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. הדגמה של וריאציית סריקה מטמפרטורת העכבר משתנה טוב יותר עם התאמת לוח צבעים. (A)לייזר דופלר חזר על סריקות עם וריאציה משמעותית הנגרמת על ידי וריאציה טמפרטורת הליבה של העכבר במהלך הסריקות החוזרות ונשנות, אשר גלוי על סמך יחידות זלוף מתורגם צבע על סריקות שטף חוזרות ונשנות. (B)שינוי הטווח הדינמי בלוח הצבעים (המוצג משמאל לחלון הסריקה) מ- 0-1000 ב- A ל- 0-1500 (חץ אדום) ב- B הופך את הווריאציה לבולטת יותר. (C) סטטיסטיקה המציגה ערכי זלוף ממוצעים עבור אזור העניין (מוקף בעיגול באדום) עבור ה- hindlimb של הפקד (מצולע 1 בשחור בתמונת rfx ב- A ו- B)נע בין 655 עבורהסריקה ברחוב 1 ל- 791 בסריקההשלישית וזלוף ממוצע עבור אזור עניין עבור hindlimb איסכמי (מצולע 2 באדום על התמונה rfx ב- A ו- B) הראה פחות וריאציה (361 כדי 400), המוביל הבדלים משמעותיים ביחס איסכמי / שליטה בין הסריקות החוזרות ונשנות (0.60, 0.53, ו-0.46). (D) חלון לשינוי הטווח הדינמי של לוח הצבעים בתוכנת המדידה (לוח שמאלי) ובתוכנות סקירת תמונה (לוח ימין). חצים אדומים מראים היכן להגדיל או להקטין את הטווח העליון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. לכידת נתונים להדמיית זלוף דופלר בלייזר עם סריקות חוזרות ונשנות. (A) סרגל כלים עליון עם 1. סמל 'הוסף החזר על ההשקעה'. 2. הוסף סמל מצולע. 3. סמל פרטי נושא (ניגש לחלון מוקפץ ב- B). 4. סמל סטטיסטיקה (ניגש לחלון מוקפץ ב- C). (ב)חלון פרטי נושא. (C) חלון סטטיסטיקה המציג את ערכי הזלוף הממוצעים (מוקפים בעיגול באדום) עבור כל החזר על ההשקעה. (D)סריקה חוזרת ונשנית עם החזר על ההשקעה במצולע במעקב סביב השליטה hindpaw (שחור) ו hindpaw איסכמי (אדום). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. ניסוי קורס זמן עם נתוני LDPI. עכברי נוקאאוט P27 (3-5 חודשים נקבה CDKN1b-/- עכברים על רקע C57Bl/6) לאחר קשירה עורק הירך עם (n = 6) ובלי (n = 10) אוראלי טיפול דוקסיציקלין בהשוואה לסוג פראי נשי תואם גיל C57Bl/6 עכברים עם (n = 11) ובלי (n = 9) טיפול דוקסיציקלין אוראלי (נתונים שלא פורסמו מהמחבר). קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של הממוצע (SEM). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקה עקבית היא קריטית להשגת תוצאות אמינות עם LDPI. יש להשתמש באותם הרדמה, הגדרות טמפרטורה, מיקום העכבר ואזור העניין לאורך כל קורס הזמן. חומרי הרדמה שונים יגרמו לערכי זלוף גבוהים או נמוכים יותר9. הרדמה Isoflurane נוח בגלל הופעתה המהירה, כמו גם בטיחות כללית. אחוז עקבי של isoflurane יש להשתמש כעומק של הרדמה עם סוכן vasodilatory זה עשוי לשנות את זלוף העור. אם אזור העניין כולל פרווה, אז אותה שיטה של הסרת שיער יש להשתמש בכל פעם, כמו עכברים depilated כימית יהיו ערכי זלוף גבוהים יותר מאשר עכברים שפרוותם הוסרה עם קוצץ חשמלי7. טמפרטורת העכבר יש השפעה גדולה על הדמיה זלוף, עם עכברים ב 36 °C (60 °F) בעל ערכי זלוף נמוכים משמעותית מאשר עכברים ב 38 °C(7 °F),12. ההינדסימב האיסכמי עשוי גם להגיב באופן שונה לשינוי טמפרטורה אזורי מאשר השליטה האחורית (איור 2). בפרוטוקול זה, שמיכה הומאותרמית משמשת לשמירה על טמפרטורת העכבר במהלך הסריקה, המספקת בקרת טמפרטורה עקבית יותר במהלך תהליך הסריקה מאשר שיוויון מראש של העכבר על צלחת חימום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ולאחר מכן סריקה על משטח לא מחומם כפי שמוצג על ידי Niiyama etal.
אם רק footpads נבחרים כאזור עניין, אז מיצוב נוטה הוא המועדף בגלל רבייה באזור סרוק של עניין. היתרון של גישה זו הוא שהיא חוקרת את האזור הרחוק ביותר מהלב, ואת האזור הרלוונטי ביותר מבחינה קלינית המתאים למקום שבו כיבים ברגל איסכמי נפוצים. משטחי הרגליים הם חסרי שיער, ולכן גזירה או depilation אין צורך, פישוט הכנה וזמן למדידה. כמו כן, עכברים שאינם לבנים עשויים להיות כתמים של פיגמנטציה בעור של העגל או הירך, אשר יכול להפריע מדידת LDPI. אם האזור הנבחר של עניין כולל את העגל והירך, אז מיקום סופי הוא המועדף כי עורק הירך saphenous לרוץ לאורך פני השטח הגחוניים של hindlimb והוא יכול להיות בתמונה באמצעות LDPI7. מן המיקום supine, הדמיה עקבית של כף הרגל קשה ללכוד, כמו הצד ואת המשטחים העליונים עשוי להיות בתמונה מגוונת.
בטחונות והתאוששות זרימת הדם לאחר איסכמיה hindlimb תלוי במספר גורמים שונים, כולל מודל איסכמיה hindlimb, זן העכבר, מין, וגיל. זנים מסוימים של עכברים כגון C57Bl/6 יש בטחונות בסיסיים חזקים, עם ירידה פחות דרמטית זלוף לאחר אינדוקציה של איסכמיה אחורית חריפה, ואילו אחרים כגון BALB / c יש בטחונות עניים14,15. לעכברים נקביים יש התאוששות גרועה יותר מעכברים זכרים. עכברים מבוגרים יש גם התאוששות זרימת דם גרוע יותר מאשר עכברים צעירים16. לכן, עכברים צריכים להיות מתח, גיל, ומין תואם מסקנות אמינות להסיק לגבי התאוששות זרימת הדם באמצעות נתוני LDPI. אפילו עם התאמה קפדנית ושימוש זנים מולדים של עכברים, יש כמות מסוימת של שונות ביולוגית לתגובת העכבר לאיזכמיה hindlimb, כך מספרי עכבר נאותים (בדרך כלל 8-10 עכברים לכל נקודת זמן) נדרשים עבור נתונים תקפים. יתר על כן, נורמליזציה של LDPI לא בהכרח אומר שיקום של רמות נורמליות של זרימת העורקים כמו המדידה נעשית בעכברים מורדמים שאין להם כל ביקוש לשרירי השלד. לבסוף, בגלל המגבלות בעומק החדירה, מחקרים אנטומיים מפורטים של מסלולים בטחונות שעשויים לרוץ דרך השרירים העמוקים יותר של הירך והעגל אינם אפשריים עם LDPI.
מספר שיטות אחרות שימשו כדי להעריך את התאוששות זרימת הדם כולל הדמיה מבוססת זלוף של העור כגון הדמיית כתמי לייזר17,18,19 או מבנים עמוקים יותר כגון אולטרסאונד משופר ניגודיות של שריר השלד20, MRI21, ו (13)N-אמוניה PET22. כמו כן נעשה שימוש בהדמיה מבוססת אנטומית של כלי בטחונות כגון מיקרו-CT10, OCT23, אולטרסאונד משופר ניגודיות עם מיקרוסקופיה תוך ורידית24. בשל זמן סריקה מהיר, קלות יחסית של לכידת נתונים וניתוח, והימנעות מהצורך בניגוד תוך ורידי, LDPI היא השיטה השלטת בה משתמשות רוב הקבוצות בספרות. החולשות כוללות כי הטכניקה מודדת את מהירויות זרימת הדם ומספקת נתונים ביחידות זלוף שרירותיות במקום למדוד זלוף רקמות מוחלט, עומק הסריקה רדוד יחסית, והוא מספק פרטים אנטומיים ירודים יחסית.
LDPI משמש בדרך כלל להערכת התאוששות לאחר דגמי איסכמיה אחוריים שונים7. זה שימש גם במחקר איסכמיה-reperfusion הן hindlimb25, כמו גם באיברים splanchnic עמוק יותר או חוט השדרה26,27,28. עם זאת, הערכה של מבנים עמוקים דורשת חשיפה כירורגית של המבנה לסריקה, מה שהופך מדידות חוזרות ונשנות לקשות יותר בגלל הצטלקות. יישום נוסף הוא הערכה של רפרופוזיה דש לאחר מיקרוכירורגיה29.
לסיכום, LDPI היא שיטה יעילה, מבוצעת בקלות וחוזרת על עצמה למדידת זלוף עורי אחורי כהשתקפות של זלוף העורקים הכולל. נדרשת טכניקה עקבית בעת שימוש ב- LDPI כדי להשיג נתונים אמינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לד"ר טאנג אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו בוצעה עם השימוש במתקנים ומשאבים במרכז הבריאות VA Puget Sound. העבודה היא של המחבר ואינה משקפת בהכרח את עמדת או המדיניות של המחלקה לענייני חיילים משוחררים או ממשלת ארצות הברית. ד"ר טאנג ממומן כיום באמצעות VA (הצטיינות 5 I01 BX004975-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black nonreflective material | Fabric store, black neoprene recommended by company | ||
| F/air cannister | A.M. Bickford Inc | 80120 | |
| Homeothermic blanket with rigid metal probe | Harvard Apparatus | Also comes with flexible probe, but this is less durable | |
| Isoflurane Anesthesia machine | Drager | Multiple manufacturers | |
| Isoflurane induction chamber | VetEquip | 941444 | 2 L chamber |
| Moor laser Doppler perfusion imager | Moor Instruments | MoorLDI2-IR | Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR) |
| Mouse Anesthesia nose cone | Multiple manufacturers | ||
| Nair | Nair | ||
| Oxygen tank | Multiple manufacturers | ||
| Surgilube | Multiple distributors |
References
- Varma, P., Stineman, M. G., Dillingham, T. R. Epidemiology of limb loss. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (1), 1-8 (2014).
- Farber, A. Chronic Limb-Threatening Ischemia. New England Journal of Medicine. 379 (2), 171-180 (2018).
- Abularrage, C. J., et al. Evaluation of the microcirculation in vascular disease. Journal of Vascular Surgery. 42 (3), 574-581 (2005).
- Houben, A., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Mahe, G., Humeau-Heurtier, A., Durand, S., Leftheriotis, G., Abraham, P. Assessment of skin microvascular function and dysfunction with laser speckle contrast imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 5 (1), 155-163 (2012).
- Murray, A. K., Herrick, A. L., King, T. A. Laser Doppler imaging: a developing technique for application in the rheumatic diseases. Rheumatology (Oxford). 43 (10), 1210-1218 (2004).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser Doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors (Basel). 13 (1), 500-515 (2012).
- Sonmez, T. T., et al. A novel laser-Doppler flowmetry assisted murine model of acute hindlimb ischemia-reperfusion for free flap research. PLoS One. 8 (6), 66498 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Effects of some anesthetic agents on skin microcirculation evaluated by laser Doppler perfusion imaging in mice. BMC Veterinary Research. 9, 255 (2013).
- Ankri-Eliahoo, G., Weitz, K., Cox, T. C., Tang, G. L. p27(kip1) Knockout enhances collateralization in response to hindlimb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (5), 1351-1359 (2016).
- McEnaney, R. M., Shukla, A., Madigan, M. C., Sachdev, U., Tzeng, E. P2Y2 nucleotide receptor mediates arteriogenesis in a murine model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (1), 216-225 (2016).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Chalothorn, D., Faber, J. E. Strain-dependent variation in collateral circulatory function in mouse hindlimb. Physiological Genomics. 42 (3), 469-479 (2010).
- Helisch, A., et al. Impact of mouse strain differences in innate hindlimb collateral vasculature. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (3), 520-526 (2006).
- Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (8), 1748-1756 (2011).
- Forrester, K. R., Stewart, C., Tulip, J., Leonard, C., Bray, R. C. Comparison of laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: measurement in human skin and rabbit articular tissue. Medical & Biological Engineering & Computing. 40 (6), 687-697 (2002).
- Briers, J. D. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging. Physiological Measurement. 22 (4), 35-66 (2001).
- Heeman, W., Steenbergen, W., van Dam, G., Boerma, E. C. Clinical applications of laser speckle contrast imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 24 (8), 1-11 (2019).
- Nguyen, T., Davidson, B. P. Contrast Enhanced Ultrasound Perfusion Imaging in Skeletal Muscle. Journal of Cardiovascular Imaging. 27 (3), 163-177 (2019).
- Zaccagnini, G., et al. Magnetic Resonance Imaging Allows the Evaluation of Tissue Damage and Regeneration in a Mouse Model of Critical Limb Ischemia. PLoS One. 10 (11), 0142111 (2015).
- Penuelas, I., et al. PET as a measurement of hindlimb perfusion in a mouse model of peripheral artery occlusive disease. Journal of Nuclear Medicine. 48 (13), 1216-1223 (2007).
- Jia, Y., Qin, J., Zhi, Z., Wang, R. K. Ultrahigh sensitive optical microangiography reveals depth-resolved microcirculation and its longitudinal response to prolonged ischemic event within skeletal muscles in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (8), 086004 (2011).
- Turaihi, A. H., et al. Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion. Journal of Visualized Experiments. (121), e54912 (2017).
- Liu, C., et al. Enhanced autophagy alleviates injury during hindlimb ischemia/reperfusion in mice. Experimental and Therapeutic Medicine. 18 (3), 1669-1676 (2019).
- Liu, D. L., Svanberg, K., Wang, I., Andersson-Engels, S., Svanberg, S. Laser Doppler perfusion imaging: new technique for determination of perfusion and reperfusion of splanchnic organs and tumor tissue. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (4), 473-479 (1997).
- Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat. Journal of Visualized Experiments. (135), e56243 (2018).
- Zhang, D., Li, S., Wang, S., Ma, H. An evaluation of the effect of a gastric ischemia-reperfusion model with laser Doppler blood perfusion imaging. Lasers in Medical Science. 21 (4), 224-228 (2006).
- Fitzal, F., et al. Circulatory changes after prolonged ischemia in the epigastric flap. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (7), 535-543 (2001).
