Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا يوضح التقنية والضوابط اللازمة لتصوير التشوه بالليزر Doppler لقياس تدفق الدم في الجزء الخلفي من الماوس.
Abstract
انتعاش تدفق الدم هو مقياس النتيجة الحاسمة بعد نقص التروية الخلفية التجريبية أو نقص التروية. الليزر دوبلر التصوير التشوه (LDPI) هو شائع، غير باضع، طريقة متكررة لتقييم استعادة تدفق الدم. تقوم هذه التقنية بحساب تدفق الدم بشكل عام في الأنسجة التي تم أخذ عينات منها من تحول دوبلر في التردد الذي يحدث عندما يضرب الليزر خلايا الدم الحمراء المتحركة. يتم التعبير عن القياسات في وحدات التشويش التعسفي ، لذلك عادة ما يتم استخدام عدم التدخل في الساق للمساعدة في التحكم في القياسات. عمق القياس في نطاق 0.3-1 مم؛ لإقفارية الأطراف الخلفية ، وهذا يعني أن يتم تقييم التشوه الجلدي. يعتمد التشوه الجلدي على عدة عوامل - أهمها درجة حرارة الجلد وعامل التخدير ، والتي يجب التحكم فيها بعناية لتؤدي إلى قراءات موثوقة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يغير تصبغ الشعر والجلد قدرة الليزر على الوصول إلى الأدمة أو اختراقها. توضح هذه المقالة تقنية LDPI في الجانب الخلفي الماوس.
Introduction
تقرح الجلد مع عدم كفاية التئام الجروح هو السبب الرئيسي لعمليات البتر في المرضى الإنسان1. يتطلب التئام الجروح الكافي مستويات أعلى من التشوه الشرياني مما هو مطلوب للحفاظ على الجلد السليم ، والذي يتعرض للخطر في المرضى الذين يعانون من مرض الشريان المحيطي2،3،4. العديد من الحالات الروماتويدية الأخرى ومرض السكري يمكن أن يؤدي أيضا إلى اضطراب وعدم كفاية دوران الأوعية الدقيقة الجلد لتضميد الجروح5،6. يعاني العديد من مرضى السكري من مرض الشريان المحيطي المصاحب، مما يعرضهم لخطر كبير بشكل خاص للبتر. الليزر دوبلر تصوير التخثر (LDPI) يستخدم في الحالات السريرية لتقييم دوران الأوعية الدقيقة الجلد، وكذلك في حالات البحوث لتقييم تدفق الدم وانتعاش تدفق الدم بعد نقص التروية الخلفية التجريبية، نقص التروية- reperfusion، واللوحات الجراحية الدقيقة7.
يعرض نظام LDPI شعاع ليزر منخفض الطاقة ينحرف بواسطة مرآة المسح الضوئي للتحرك فوق منطقة الاهتمام. وهذا يختلف عن قياس التدفق ليزر دوبلر، الذي يوفر قياس التغلغل لمنطقة صغيرة من الأنسجة في اتصال مباشر مع مسبار قياس التدفق8. عندما يتفاعل شعاع الليزر مع الدم المتحرك في الأوعية الدقيقة ، فإنه يخضع لتحول تردد دوبلر ، والذي يتم مسحه ضوئيا بواسطة الماسح الضوئي وتحويله إلى وحدات تغلغل تعسفية. لأن LDPI هو تقنية خفيفة ، فهي محدودة من حيث عمق الاختراق إلى 0.3-1 مم ، مما يعني أنه بالنسبة للجزء الأكبر يتم تقييم التشويش الجلدي7. يمكن تغيير تدفق الجلد عن طريق درجة حرارة الجلد والجهاز العصبي المتعاطف ، والتي قد تتأثر بعوامل مخدرة مختلفة9. تتأثر القياسات من الليزر البصري أيضا بظروف الإضاءة المحيطة وتصبغ الجلد ، ويمكن حظرها عن طريق الفراء أو الشعرالزائد 7.
LDPI هي تقنية البحث الأكثر استخداما لمراقبة التعافي من التشوه بعد نقص التروية لأنها غير باضعة ، ولا تتطلب إدارة التباين ، ولها أوقات مسح سريعة تسمح بجمع البيانات عن متعددة. وهذا يجعل من المثالي للمساعدة في تحديد ما إذا كانت العلاجات التي تهدف إلى تكوين الشرايين العلاجية أو تولد الأوعية فعالة في النماذج الحيوانية الصغيرة. انتعاش تدفق الدم بعد نقص التروية الخلفية كما تقاس LDPI يرتبط بشكل جيد مع تطور الشريان الجانبية عند تقييمها بوسائل أخرى مثل الصب Microfil أو الصغرى CT10،11. والهدف من هذا البروتوكول هو إظهار تقييم التغلغل في الأطراف الخلفية باستخدام LDPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكول وافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة واشنطن.
1. إعداد الماسح الضوئي
- اضبط ارتفاع الماسح الضوئي بحيث تكون المسافة إلى الهدف الممسوح ضوئيا حوالي 30 سم.
- قم بتشغيل الصور ثم قم بتشغيل البرنامج المقترن.
- افتح برنامج القياس. إذا كان البرنامج يتصل بالماسح الضوئي بشكل صحيح، فسيظهر تشغيل التحذير بالليزر بالأشعة تحت الحمراء.
- معايرة الجهاز مع المعايير المقدمة من الشركة المصنعة (غير مبين في الفيديو، وسوف تعتمد على نموذج معين من الجهاز المستخدمة).
- ضبط إعدادات الماسح الضوئي لتكون مناسبة للمواد الخلفية وإعداد الإضاءة في الغرفة.
- قم بتعيين مستويات الكسب DC FLUX و CONC، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (غير الموضحة في الفيديو).
- تعيين عتبة الخلفية عن طريق الإشارة إلى شعاع الليزر في مادة خلفية سوداء، واضغط على مجموعة BK التلقائي.
2. الماوس قبل إعداد المسح الضوئي
- إعداد غرفة التعريفي isoflurane مع الزبال المناسب للغاز النفايات.
ملاحظة: وضع غرفة التعريفي على لوحة الاحترار سوف تساعد على منع فقدان درجة حرارة الماوس أثناء تحريض التخدير. - بدوره على بطانية المنزلية، والتي يتم وضعها في منطقة المسح الضوئي تحت سطح غير انعكاسي (في هذه الحالة نسيج النيوبرين الأسود). تعيين بطانية المنزلية للحفاظ على درجة حرارة الجسم من 37 درجة مئوية.
- ضع مسبار درجة الحرارة للبطانية المنزلية ومواد التشحيم حتى تكون جاهزة للإدراج.
- ضع قناع التخدير ونظام المسح في منطقة المسح الضوئي.
- تخدير الماوس مع المبخر isoflurane. تعيين معدل الأكسجين إلى 1 لتر / دقيقة من التدفق وضبط isoflurane إلى 4٪ لتحريض التخدير. بدوره على تدفق إلى غرفة تحريض التخدير، ومعدل التنفس الماوس سوف تبطئ. يتم تحقيق التخدير الكافي عندما يفقد الماوس منعكسه الصحيح.
- نقل الماوس إلى قناع مخدر / مخروط الأنف مع زبال غاز النفايات المرفقة وضبط isoflurane إلى 1.5٪.
ملاحظة: هذا المستوى من التخدير هو عموما كافية للحفاظ على الماوس الكذب لا يزال نسبيا أثناء المسح الضوئي، ولكن ليس المقصود لتوفير مستويات جراحية من التخدير، لذلك لا يتم فحص عمق التخدير. تغيير مستوى isoflurane يسبب تغييرات في ضربات القلب، والتنفس، وتشويش الجلد، لذلك ينبغي استخدام نسبة متسقة في جميع أنحاء أي تجربة دورة زمنية وجميع المواضيع التجريبية. يمكن أيضا استخدام تقنيات مخدرة بديلة مثل حقن IP للكيتامين xylazine ، ولكن يجب استخدام نفس تقنية التخدير طوال أي دراسة دورة زمنية حيث تؤثر التخديرات المختلفة على التشوه الجلدي بشكل مختلف. - (اختياري اعتمادا على منطقة المسح) إذا كانت المنطقة المخطط لها التي سيتم مسحها ضوئيا مغطاة بالفرو، فاستخدم أداة تشذيب كهربائية صغيرة أو كريم إزالة الشعر من منطقة الاهتمام.
ملاحظة: يجب إزالة كريم إزالة الشعر تماما، وجلد الماوس المجففة قبل المسح الضوئي. - ضع الماوس في موضع المسح المناسب على السطح الأسود غير الحراري الذي يغطي بطانية المنازل ، مما يؤكد أن كلا من المصابيح الخلفية لا تزال على مصدر الحرارة في جميع أنحاء التوازن والمسح الضوئي(الشكل 1).
ملاحظة: من المهم الحفاظ على كلا القدمين على بطانية المنازل لمنع الاختلاف الإقليمي في درجة الحرارة. - أدخل مسبار درجة حرارة المستقيم التشحيمي المرتبط بالبطانية المنزلية.
- توازن درجة حرارة الماوس لدرجة حرارة المسح المطلوبة (37 °C) ؛ حوالي 5-10 دقائق.
- حدد إعداد الماسح الضوئي، والذي يمكن الوصول إليه من القائمة العلوية أو من رمز إعداد الماسح الضوئي. اضبط منطقة المسح الضوئي عن طريق تغيير إحداثيات X-Y لاستيعاب منطقة الاهتمام. تعتمد سرعة المسح الضوئي على دقة المسح الضوئي. ستؤدي الدقة العالية إلى أوقات مسح أطول. لتكرار المسح الضوئي مع التركيز على التشوه العالمي ، بدلا من دقة أعلى مع التركيز على التشوه التشريحي ، تكون سرعة المسح الضوئي 4 مللي ثانية / بكسل كافية.
ملاحظة: يجب النظر في دقة أعلى ومسح واحد إذا كان الباحث يحاول دراسة الدورة الدموية الجانبية النامية مباشرة (أفضل صورة في الفخذ البطني والعجل حيث يكون أقرب إلى الجلد). الفحص المتكرر بدقة/سرعة أقل (على سبيل المثال، 4 مللي ثانية/بكسل) يكون كافيا عند تقييم التشوه العالمي للجهاز النهائي لبادية قدم الماوس. يقوم البرنامج المعروض في الفيديو بتحميل القالب المستخدم سابقا لمنطقة المسح الضوئي وسرعته ودقة الوضوح تلقائيا عند إعادة تشغيله، أو يمكن استرداده من ملف مخزن إذا تم استخدام مناطق اهتمام مختلفة لإجراء تجارب مختلفة. - في حالة إجراء عمليات مسح متكررة، حدد علامة التبويب تكرار ومسح الخط. يمكن تغيير عدد عمليات المسح الضوئي (في هذه الحالة 3 مسح) وكذلك الفاصل الزمني المتكرر. يكون الحد الأدنى من الوقت للفاصل الزمني المتكرر هو وقت المسح المقدر، والذي يظهر في منطقة الرمادية على يمين المربع المحددة بمنطقة المسح الضوئي ودقة المسح الضوئي. إضافة بضع ثوان يسمح للمستخدم لوقفة وربما إعادة الماوس إذا لزم الأمر بين عمليات المسح الضوئي.
3. المسح الضوئي
- حدد علامة التبويب مسح الصور وحدد الزر علامة. سوف يتحرك الليزر لتحديد منطقة المسح الضوئي. اضبط موضع الماوس بحيث يكون الهدف الذي سيتم مسحه ضوئيا ضمن المنطقة المحددة.
ملاحظة: بالنسبة اللوحة القدم أو لوحة القدم ومسح العجل، عرضة لتحديد المواقع مع الأطراف الخلفية الموسعة يوفر منطقة أكثر اتساقا من الفائدة من تحديد المواقع سوبين. الشريان الفخذي والشريان الصابني والضمانات قريبة جدا من السطح البطني للفخذ والعجل ، لذلك يفضل تحديد المواقع ضعيف إذا كان استخدام هذه المناطق ذات الأهمية. - ابدأ القياس المتكرر بتحديد رمز تكرار المسح الضوئي واضغط على زر التشغيل لبدء المسح الضوئي.
- تأكد من مسافة المسح في النافذة المنبثقة وانقر فوق موافق لبدء المسح الضوئي.
- مراقبة الماوس أثناء المسح الضوئي لحركة الماوس؛ إذا تحرك الماوس بما فيه الكفاية بحيث لم تعد في منطقة المسح الضوئي في منتصف المسح الضوئي، قم بإعادة تشغيل الفحص. يمكن استيعاب الاختلافات الصغيرة في موضع الماوس الخلفي في برنامج التحليل.
- مراقبة درجة حرارة الماوس أثناء عملية المسح الضوئي لأنها قد تتقلب حتى مع استخدام بطانية المنزلية. إذا كان هناك اختلاف كبير في درجة حرارة الماوس، فقد يؤدي ذلك إلى تباين كبير بين عمليات المسح الضوئي. عموما، فإن نطاق درجة الحرارة من 36.8-37.2 درجة مئوية يؤدي إلى بيانات مقبولة.
- حفظ المسح الضوئي الملتقط ضمن إطار حفظ باسم ملف يتضمن معرف الماوس و timepoint لتحليل البيانات أسهل. أدخل تفاصيل الماوس والنقطة الزمنية إذا رغبت في ذلك في إطار تفاصيل الموضوع.
- إيقاف isoflurane وإزالة مسبار درجة حرارة المستقيم.
- تطهير مسبار درجة حرارة المستقيم مع الإيثانول 70٪ بحيث تكون جاهزة للاستخدام في الماوس التالي.
- السماح للفأر للتعافي من التخدير إلى النقطة التي يعرض رد فعل الحق عن طريق التقليب من موقف سوبين إلى موقف عرضة قبل إعادته إلى القفص.
ملاحظة: يمكن أن يتم الانتعاش إما على بطانية الاحترار لisoflurane منذ الانتعاش سريع جدا أو في قفص الانتعاش الدافئة للكيتامين / xylazine.
4. التقاط بيانات LDPI (الشكل 3)
- افتح برنامج مراجعة التصوير.
- انتقل إلى قائمة الملفات، وافتح، وحدد موقع الملف المحفوظ.
- حدد رمز ROI من شريط الأدوات.
- حدد الزر إضافة مضلع.
- تتبع منطقة الفائدة (ROI) لعنصر التحكم الخلفي باستخدام الماوس. تتبع المضلع ليس من الضروري أن يكون دقيقا كما لن يتم تضمين الخلفية الرمادية في المتوسطات المحسوبة.
- كرر الخطوات 4.3-4.5 للأطراف الخلفية الجراحية.
- اختر رمز الإحصائيات لفتح إطار نتائج إحصائيات ROIs للصورة (PU).
- تصدير نتائج المضلع 1 (التحكم في الخلفية) والمضلع 2 (hindlimb الجراحية) إلى ورقة عمل جمع البيانات عن طريق نسخ / لصق.
5. تحليل
- التقط البيانات كنسبة جراحية/تحكم لكل فحص.
- استخدام متوسط الجراحية / التحكم لجميع عمليات المسح الضوئي الثلاثة لنقطة البيانات لهذا الماوس خاصة في تلك النقطة الزمنية. بسبب التغير البيولوجي في الاستجابة لنقص التروية في الإدراك المتأخر ، بشكل عام ، هناك حاجة إلى فئران 8-10 لكل نقطة زمنية لتحقيق نتائج قابلة للاستنساخ مع خطأ قياسي بنسبة 10٪ تقريبا.
ملاحظة: قبل السماح للفأرة بالتعافي من التخدير، من المفيد إجراء تحليل سريع للفحوصات المتكررة للتحقق مما إذا كانت البيانات متغيرة جدا (على سبيل المثال، أكثر من 100-150 وحدة تغلغل مختلفة بين المسح الضوئي 1-3). يشير التباين العالي بين عمليات المسح المتكررة إلى أن الماوس لم يكن متساويا تماما أثناء الفحص(الشكل 2)، ويمكن إجراء فحص متكرر دون فقدان نقطة بيانات ، وهو ما سيحدث إذا لم يتم تحليل الصور حتى تاريخ لاحق. قد يكون تغيير لوحة الألوان لتحسين النطاق الديناميكي لقيم التدفق المعروض ضروريا لعرض تباين المسح الضوئي بشكل أفضل (الشكل 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وينبغي أن يؤدي نجاح LDPI في عمليات مسح التدابير المتكررة متسقة، مع ما لا يزيد عن 100-150 الاختلاف وحدة التغلغل (المقابلة لحوالي 10٪ من متوسط الانحراف المعتاد اللوحة قدم الماوس) بين المسح الضوئي الثلاثة(الشكل 2). كما هو موضح في الشكل 2، تكرار المسح يساعد على تحديد أن الماوس قد تم equilibrated بشكل مناسب بحيث نسبة نقص التروية / التحكم يعكس أفضل تدفق الدم الكامنة بدلا من الاختلاف في انحراف الجلد الناجمة عن الاختلاف في درجة الحرارة. استخدام مسح واحد لنقاط البيانات سيزيد من التباين مما يؤدي إلى الحاجة إلى المزيد من الفئران التجريبية. عند استخدامها لاقفاز التروية الخلفية ، كان ينبغي أن يكون العسر الجراحي قد انخفض التغلغل العالمي بالمقارنة مع الادراك الخلفي للسيطرة. يتم التعبير عن النتائج كنسبة من التغلغل الجراحي في الأطراف الخلفية / التحكم في التشوه الخلفي. كما الفئران في البداية vasodilate وتطوير شبكتها الجانبية الجوهرية مع مرور الوقت، ينبغي أن ينظر إلى استعادة تدفق الدم من قبل LDPI على مدى دورة زمنية بعد العملية الجراحية(الشكل 4). درجة الانتعاش يعتمد على سلالة الماوس وشدة نموذج نقص التروية الخلفية.
الشكل 1. وضع الماوس لتصوير الليزر دوبلر التشويش من لوحات القدم البطنية. يتم وضع الماوس تخدير باستخدام مخروط الأنف isoflurane (A) في موقف عرضة مع hindlimbs الموسعة للسماح بمسح لوحات القدم البطنية. يتوفر مسبار درجة حرارة المستقيم (P) للبطانية المنزلية للحفاظ على درجة حرارة الجسم المتسقة أثناء الفحص. وسادة بطانية المنزلية تحت المواد النيوبرين غير الكهربائية المستخدمة لتوفير خلفية للمسح الضوئي. الليزر يشير إلى منتصف منطقة المسح الضوئي مرئيا بجوار ذيل الماوس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مظاهرة من الاختلاف المسح الضوئي من تغير درجة حرارة الماوس ينظر بشكل أفضل مع تعديل لوحة الألوان. (أ)الليزر دوبلر بمسح المتكررة مع اختلاف كبير الناجمة عن تباين درجة الحرارة الأساسية الماوس خلال عمليات المسح المتكررة، والتي هي مرئية على أساس وحدات التغلغل ترجمت إلى اللون على مسح تدفق المتكررة. (ب)تغيير النطاق الديناميكي على لوح الألوان (يظهر على يسار نافذة المسح الضوئي) من 0-1000 في A إلى 0-1500 (السهم الأحمر) في B يجعل الاختلاف أكثر وضوحا. (C) الإحصاءات التي تبين متوسط قيم التغلغل لمنطقة الاهتمام (محاطة بالأحمر) للتحكم في الأطراف الخلفية (المضلع 1 باللون الأسود على صورة rfx في A و B) يتراوح بين 655 لمسح 1st إلى 791 على المسحالضوئي الثالث ومتوسط التشوه ل المنطقة التي تهم الخلفية الإقفارية (المضلع 2 باللون الأحمر على صورة rfx في A و B) أظهرت تباينا أقل (361 إلى 400) ، مما أدى إلى اختلافات كبيرة في نسبة الإقفارية / التحكم بين المسح المتكرر (0.60 ، 0.53 ، و 0.46). (D) نافذة لتغيير النطاق الديناميكي للوحة الألوان في برنامج القياس (اللوحة اليسرى) وبرامج مراجعة الصور (اللوحة اليمنى). تظهر الأسهم الحمراء مكان زيادة النطاق العلوي أو تقليله. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التقاط البيانات لتصوير تغلغل دوبلر بالليزر مع عمليات المسح المتكررة. (أ) شريط الأدوات العلوي مع 1. إضافة رمز عائد الاستثمار. 2. إضافة رمز المضلع. 3. رمز تفاصيل الموضوع (الوصول إلى النافذة المنبثقة في B). 4. أيقونة الإحصاءات (الوصول إلى النافذة المنبثقة في C). (ب) نافذة تفاصيل الموضوع. (ج)نافذة الإحصاءات التي تبين متوسط قيم التغلغل (محاطة بدائرة باللون الأحمر) لكل عائد استثمار. (D) المسح المتكرر مع العائد على الاستثمار المضلع تتبع حول التحكم hindpaw (أسود) و hindpaw الإقفاري (أحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تجربة الدورة الزمنية مع بيانات LDPI. P27 الفئران بالضربة القاضية (3-5 أشهر من العمر أنثى CDKN1b-/- الفئران على خلفية C57Bl/6) بعد ربط الشريان الفخذي مع (ن = 6) ودون (ن = 10) علاج دوكسيسيكلين عن طريق الفم بالمقارنة مع العمر مطابقة للإناث البرية C57Bl/6 الفئران مع (ن = 11) ودون (ن = 9) علاج دوكسيسيكلين عن طريق الفم (بيانات غير منشورة من المؤلف). تمثل أشرطة الخطأ خطأ قياسي في المتوسط (SEM). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية متناسقة أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج موثوق بها مع LDPI. يجب استخدام نفس التخدير وإعدادات درجة الحرارة وموقع الماوس ومنطقة الاهتمام طوال الدورة الزمنية بأكملها. عوامل مخدرة مختلفة سوف يؤدي إلى قيم التغلغل أعلى أو أقل9. التخدير Isoflurane مريحة بسبب ظهورها السريع والظهور، فضلا عن السلامة الشاملة. وينبغي استخدام نسبة مئوية متسقة من isoflurane كعمق التخدير مع هذا العامل الوعائي قد يغير تغلغل الجلد. إذا كانت المنطقة ذات الاهتمام تشمل الفراء ، فيجب استخدام نفس طريقة إزالة الشعر في كل مرة ، حيث سيكون لدى الفئران التي تم نزعها كيميائيا قيم تغلغل أعلى من الفئران التي تمت إزالة فرائها بمقصات كهربائية7. درجة حرارة الماوس له تأثير كبير على التصوير التشوه، مع الفئران في 36 درجة مئوية وجود قيم التشوه أقل بكثير من الفئران في 38 درجة مئوية7،12. قد يكون رد الفعل الخلفي الإقفاري أيضا مختلفا عن التغير في درجة الحرارة الإقليمية من الأطراف الخلفية للتحكم(الشكل 2). في هذا البروتوكول، يتم استخدام بطانية منزلية للحفاظ على درجة حرارة الماوس أثناء المسح الضوئي، والتي توفر تحكما أكثر اتساقا في درجة الحرارة أثناء عملية المسح الضوئي من إعادة توازن الماوس على لوحة احترار 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم المسح الضوئي على سطح غير دافئ كما هو مبين من قبل Niiyama وآخرون.
إذا تم اختيار لوحات الأقدام فقط كمنطقة الاهتمام ، يفضل تحديد المواقع المعرضة بسبب القابلية للتكرار في المنطقة الممسوحة ضوئيا ذات الاهتمام. ميزة هذا النهج هو أنه يدرس المنطقة الأبعد عن القلب ، والمنطقة الأكثر ملاءمة سريريا المقابلة حيث قرحة القدم الإقفارية شائعة. لوحات القدم هي بلا شعر، لذلك لقطة أو إزالة الشعر ليست ضرورية، وتبسيط التحضير والوقت للقياس. أيضا، الفئران غير البيضاء قد يكون بقع من تصبغ في جلد العجل أو الفخذ، والتي يمكن أن تتداخل مع قياس LDPI. إذا كانت المنطقة المختارة من الفائدة تشمل العجل والفخذ، ثم يفضل تحديد المواقع سوبين لأن الشريان الفخذي والسابهين تشغيل على طول السطح البطني من الأطراف الخلفية ويمكن تصويرها باستخدام LDPI7. من موضع السطانة ، يصعب التقاط تصوير ثابت للقدم ، حيث قد يتم تصوير الأسطح الجانبية والعاعلة بشكل متنوع.
يعتمد الضمان واستعادة تدفق الدم بعد نقص التروية في الأطراف الخلفية على عدد من العوامل المختلفة بما في ذلك نموذج نقص التروية في الأطراف الخلفية وسلالة الماوس والجنس والعمر. سلالات معينة من الفئران مثل C57Bl/6 لديها ضمانات خط الأساس قوية، مع انخفاض أقل دراماتيكية في التشوه بعد تحريض نقص التروية الحادة الخلفية، في حين أن البعض الآخر مثل BALB / ج لديها ضمانات الفقراء14،15. الفئران الإناث لديها انتعاش أسوأ من الفئران الذكور. الفئران الأكبر سنا لديها أيضا أسوأ انتعاش تدفق الدم من الفئران الأصغر سنا16. لذلك، الفئران تحتاج إلى أن تكون سلالة، والعمر، والجنس مطابقة لاستنتاجات موثوق بها يمكن استخلاصها فيما يتعلق باستعادة تدفق الدم باستخدام بيانات LDPI. حتى مع مطابقة صارمة واستخدام سلالات أصيلة من الفئران، وهناك كمية معينة من التباين البيولوجي للاستجابة الماوس إلى نقص التروية hindlimb، لذلك مطلوب أرقام الماوس كافية (عادة 8-10 الفئران لكل نقطة زمنية) للحصول على بيانات صالحة. وعلاوة على ذلك، فإن تطبيع LDPI لا يعني بالضرورة استعادة المستويات الطبيعية لتدفق الشرايين حيث يتم القياس في الفئران المخدرة التي ليس لديها أي طلب على عضلات الهيكل العظمي. وأخيرا ، بسبب القيود في عمق الاختراق ، والدراسات التشريحية التفصيلية للمسارات الجانبية التي قد تمر عبر العضلات أعمق من الفخذ والعجل ليست ممكنة مع LDPI.
وقد استخدمت عدة طرق أخرى لتقييم استعادة تدفق الدم بما في ذلك التصوير القائم على التغلغل في الجلد مثل التصوير بقع الليزر17،18،19 أو هياكل أعمق مثل الموجات فوق الصوتية المعززة على النقيض من العضلات الهيكلية20، التصوير بالرنين المغناطيسي21، و (13) N-ammonia PET22. وتستخدم أيضا التصوير التشريحي القائم على السفن الجانبية مثل الأشعة المقطعية الدقيقة10،أكتوبر 23، والموجات فوق الصوتية المعززة على النقيض من ذلك مع المجهر داخل الجسم24. بسبب وقت المسح السريع ، والسهولة النسبية لالتقاط البيانات وتحليلها ، وتجنب الحاجة إلى التباين الوريدي ، فإن LDPI هي الطريقة السائدة التي تستخدمها معظم المجموعات في الأدب. وتشمل نقاط الضعف أن هذه التقنية تقيس سرعات تدفق الدم وتوفر بيانات في وحدات التشوه التعسفي بدلا من قياس التشوه المطلق للأنسجة، وعمق المسح ضحل نسبيا، ويوفر تفاصيل تشريحية ضعيفة نسبيا.
يستخدم LDPI الأكثر شيوعا لتقييم الانتعاش بعد نماذج نقص التروية الخلفية المختلفة7. وقد استخدمت أيضا في البحوث الإقفارية reperfusion سواء في الأطراف الخلفية25 وكذلك في أجهزة أكثر عمقا splanchnic أو الحبل الشوكي26,27,28. ومع ذلك، يتطلب تقييم الهياكل العميقة فحص التعرض الجراحي للهيكل، مما يجعل القياسات المتكررة أكثر صعوبة بسبب الندبات. وهناك تطبيق آخر هو تقييم إعادة التروية رفرف بعد الجراحة المجهرية29.
في الختام ، LDPI هو وسيلة فعالة وسهلة الأداء وقابلة للتكرار لقياس التشوه الجلدي الخلفي كانعكاس للتشويش الشرياني العام. تقنية متناسقة مطلوب عند استخدام LDPI للحصول على بيانات موثوق بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الدكتور تانغ ليس لديه تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
وقد تم تنفيذ هذا العمل باستخدام المرافق والموارد في مركز الرعاية الصحية VA Puget Sound. والعمل هو عمل المؤلف ولا يعكس بالضرورة موقف أو سياسة وزارة شؤون المحاربين القدماء أو حكومة الولايات المتحدة. يتم تمويل الدكتور تانغ حاليا عن طريق VA (الجدارة 5 I01 BX004975-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black nonreflective material | Fabric store, black neoprene recommended by company | ||
| F/air cannister | A.M. Bickford Inc | 80120 | |
| Homeothermic blanket with rigid metal probe | Harvard Apparatus | Also comes with flexible probe, but this is less durable | |
| Isoflurane Anesthesia machine | Drager | Multiple manufacturers | |
| Isoflurane induction chamber | VetEquip | 941444 | 2 L chamber |
| Moor laser Doppler perfusion imager | Moor Instruments | MoorLDI2-IR | Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR) |
| Mouse Anesthesia nose cone | Multiple manufacturers | ||
| Nair | Nair | ||
| Oxygen tank | Multiple manufacturers | ||
| Surgilube | Multiple distributors |
References
- Varma, P., Stineman, M. G., Dillingham, T. R. Epidemiology of limb loss. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (1), 1-8 (2014).
- Farber, A. Chronic Limb-Threatening Ischemia. New England Journal of Medicine. 379 (2), 171-180 (2018).
- Abularrage, C. J., et al. Evaluation of the microcirculation in vascular disease. Journal of Vascular Surgery. 42 (3), 574-581 (2005).
- Houben, A., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Mahe, G., Humeau-Heurtier, A., Durand, S., Leftheriotis, G., Abraham, P. Assessment of skin microvascular function and dysfunction with laser speckle contrast imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 5 (1), 155-163 (2012).
- Murray, A. K., Herrick, A. L., King, T. A. Laser Doppler imaging: a developing technique for application in the rheumatic diseases. Rheumatology (Oxford). 43 (10), 1210-1218 (2004).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser Doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors (Basel). 13 (1), 500-515 (2012).
- Sonmez, T. T., et al. A novel laser-Doppler flowmetry assisted murine model of acute hindlimb ischemia-reperfusion for free flap research. PLoS One. 8 (6), 66498 (2013).
- Gargiulo, S., et al. Effects of some anesthetic agents on skin microcirculation evaluated by laser Doppler perfusion imaging in mice. BMC Veterinary Research. 9, 255 (2013).
- Ankri-Eliahoo, G., Weitz, K., Cox, T. C., Tang, G. L. p27(kip1) Knockout enhances collateralization in response to hindlimb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (5), 1351-1359 (2016).
- McEnaney, R. M., Shukla, A., Madigan, M. C., Sachdev, U., Tzeng, E. P2Y2 nucleotide receptor mediates arteriogenesis in a murine model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (1), 216-225 (2016).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Chalothorn, D., Faber, J. E. Strain-dependent variation in collateral circulatory function in mouse hindlimb. Physiological Genomics. 42 (3), 469-479 (2010).
- Helisch, A., et al. Impact of mouse strain differences in innate hindlimb collateral vasculature. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (3), 520-526 (2006).
- Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (8), 1748-1756 (2011).
- Forrester, K. R., Stewart, C., Tulip, J., Leonard, C., Bray, R. C. Comparison of laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: measurement in human skin and rabbit articular tissue. Medical & Biological Engineering & Computing. 40 (6), 687-697 (2002).
- Briers, J. D. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging. Physiological Measurement. 22 (4), 35-66 (2001).
- Heeman, W., Steenbergen, W., van Dam, G., Boerma, E. C. Clinical applications of laser speckle contrast imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 24 (8), 1-11 (2019).
- Nguyen, T., Davidson, B. P. Contrast Enhanced Ultrasound Perfusion Imaging in Skeletal Muscle. Journal of Cardiovascular Imaging. 27 (3), 163-177 (2019).
- Zaccagnini, G., et al. Magnetic Resonance Imaging Allows the Evaluation of Tissue Damage and Regeneration in a Mouse Model of Critical Limb Ischemia. PLoS One. 10 (11), 0142111 (2015).
- Penuelas, I., et al. PET as a measurement of hindlimb perfusion in a mouse model of peripheral artery occlusive disease. Journal of Nuclear Medicine. 48 (13), 1216-1223 (2007).
- Jia, Y., Qin, J., Zhi, Z., Wang, R. K. Ultrahigh sensitive optical microangiography reveals depth-resolved microcirculation and its longitudinal response to prolonged ischemic event within skeletal muscles in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (8), 086004 (2011).
- Turaihi, A. H., et al. Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion. Journal of Visualized Experiments. (121), e54912 (2017).
- Liu, C., et al. Enhanced autophagy alleviates injury during hindlimb ischemia/reperfusion in mice. Experimental and Therapeutic Medicine. 18 (3), 1669-1676 (2019).
- Liu, D. L., Svanberg, K., Wang, I., Andersson-Engels, S., Svanberg, S. Laser Doppler perfusion imaging: new technique for determination of perfusion and reperfusion of splanchnic organs and tumor tissue. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (4), 473-479 (1997).
- Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat. Journal of Visualized Experiments. (135), e56243 (2018).
- Zhang, D., Li, S., Wang, S., Ma, H. An evaluation of the effect of a gastric ischemia-reperfusion model with laser Doppler blood perfusion imaging. Lasers in Medical Science. 21 (4), 224-228 (2006).
- Fitzal, F., et al. Circulatory changes after prolonged ischemia in the epigastric flap. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (7), 535-543 (2001).
