Summary
ここでは、マウス後肢の血流を測定するためのレーザードップラー灌流イメージングの技術と必要な制御を実証するプロトコルを提示する。
Abstract
血流回復は、実験的な後肢虚血または虚血再灌流後の重要な結果測定である。レーザードップラー灌流イメージング(LDPI)は、血流回復を評価するための一般的な、非侵襲的で反復可能な方法です。この技術は、レーザーが赤血球を動かすときに引き起こされる周波数のドップラーシフトからサンプリングされた組織の全体的な血流を計算する。測定は任意の灌流単位で表現されるため、脚に対して非介入された対側は、通常、測定を制御するために使用されます。測定深さは0.3-1 mmの範囲にある。後肢虚血に対して、これは真皮灌流が評価されることを意味する。皮膚灌流は、いくつかの要因に依存します - 最も重要な皮膚温度と麻酔薬は、信頼性の高い測定値を得るために慎重に制御する必要があります。さらに、毛髪や皮膚の色素沈着は、真皮に到達するか浸透するレーザーの能力を変更することができます。この資料では、マウスの後肢における LDPI の手法について説明します。
Introduction
不十分な創傷治癒を伴う皮膚潰瘍は、ヒト患者1における切断の主な原因である。十分な創傷治癒は、末梢動脈疾患2、3、4の患者において損なわれる無傷の皮膚を維持するために必要とされるより高いレベルの動脈灌流を必要とする。他のいくつかのリウマチの状態と糖尿病はまた、傷5、6を癒すために皮膚の微小循環を妨げ、不十分に導く可能性がある。多くの糖尿病患者は、付随する末梢動脈疾患を有し、切断のリスクが特に高い。レーザードップラー灌流イメージング(LDPI)は、臨床的な状況で皮膚の微小循環を評価するために用いられ、また、実験的後肢虚血、虚血再灌流、及び微小外科的フラップ7後の血流および血流回復を評価する研究状況において用いられる。
LDPIシステムは、関心のある領域の上を移動するためにスキャンミラーによって偏向される低電力レーザービームを投影します。これは、レーザドップラーフローメトリーとは異なり、フローメトリープローブ8と直接接触する組織の小領域に対する灌流測定を提供する。レーザービームがマイクロバスキュアチュア内の移動血液と相互作用すると、ドップラー周波数シフトが発生し、スキャナによって光検出され、任意の灌流ユニットに変換されます。LDPIは光ベースの技術であるため、浸透深度の点で0.3〜1mmに制限され、大部分の真皮灌流は7と評価される。皮膚の温度や交感神経系によって皮膚の血流が変化し、これは様々な麻酔薬9によって影響を受ける可能性がある。光学レーザーからの測定はまた、周囲の照明条件、皮膚色素沈着の影響を受け、毛皮または毛髪7を上に横にすることによってブロックすることができる。
LDPIは、非侵襲的であり、コントラスト投与を必要とせず、複数の動物のデータ収集を可能にする迅速なスキャン時間を有するため、虚血後の灌流回復を監視するための最も一般的に使用される研究技術である。これは、治療の動脈新生や血管新生を目的とした治療法が小さな動物モデルに有効であるかどうかを判断するのに理想的です。LDPIによって測定された後の後肢虚血後の血流回復は、マイクロフィル鋳造またはマイクロCT10、11などの他の手段によって評価された場合の副動脈の発達とよく相関する。このプロトコルの目的は、LDPIを用いた後肢灌流の評価を実証することです。
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Protocol
動物実験は、ワシントン大学の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。
1. スキャナーの準備
- スキャン対象までの距離が約 30 cm になるように、スキャナーの高さを調整します。
- イメージャーの電源を入れ、関連するソフトウェアを起動します。
- 測定プログラムを開きます。ソフトウェアがスキャナと正しく通信している場合は、赤外線レーザーの電源がオンの警告が表示されます。
- メーカーが提供する標準で機械を較正します(ビデオには表示されず、使用されているマシンの特定のモデルに依存します)。
- 室内の背景素材と照明設定に適したスキャナー設定を調整します。
- 製造元の指示に従ってゲインレベル DC FLUX と CONCを設定します(ビデオには表示されません)。
- 黒の背景素材にレーザー光を向けて背景のしきい値を設定し 、Auto BK Setを押します。
2. マウスの事前スキャン準備
- 廃棄物ガスの適切な清掃でイソフルラン誘導室を設置します。
注:誘導室を加温パッドに置くと、麻酔誘導時のマウス温度低下を防ぐことができます。 - 非反射面の下のスキャン領域に置かれたホーム温気ブランケット(この場合は黒いネオプレン生地)をオンにします。37 °Cの体温を維持するために、家庭の吸熱毛布をセットします。
- 家庭用の毛布と潤滑剤の温度プローブを、挿入の準備ができているように置きます。
- 麻酔マスクと清掃システムをスキャンエリアに設置します。
- イオブルラン気化器でマウスを麻酔します。酸素率を1 L/minの流量に設定し、麻酔誘導のためにイオブルランを4%に調整します。麻酔誘導室への流れをオンにすると、マウスの呼吸速度が遅くなります。マウスが右反射を失うと、適切な麻酔が得られます。
- マウスを取り付けた廃ガススカベンジャーを使用して麻酔マスク/ノーズコーンに移し、イソフルランを1.5%に調整します。
注:この麻酔レベルは、一般的にスキャン中にマウスを比較的静かに保つために十分ですが、麻酔の外科的レベルを提供することを意図していませんので、麻酔の深さはチェックされません。イソフルランレベルを変更すると、心拍、呼吸、真皮灌流の変化が生じ、時間経過実験全体およびすべての実験対象に対して一貫した割合を使用する必要があります。ケタミンキシラジンのIP注入などの代替麻酔技術も使用できますが、異なる麻酔薬が異なる皮膚灌流に影響を与えるのと同じ麻酔技術をコース研究を通して使用する必要があります。 - (スキャンエリアによりオプション)スキャン対象とする計画領域が毛皮で覆われている場合は、小さな電気トリマーまたは脱毛クリームを使用して、対象領域から髪を取り除きます。
注:脱毛クリームは完全に除去し、マウスの皮膚はスキャン前に乾燥する必要があります。 - ホーム温帯ブランケットを覆う黒色の非反射面にマウスを適切なスキャン位置に置き、両方の後肢が平衡およびスキャンを通じて熱源に残っていることを確認する(図1)。
注:温度の地域的な変動を防ぐために、家庭の吸熱毛布の上に両足を維持することが重要です。 - ホームソアミックブランケットに関連付けられた潤滑直腸温度プローブを挿入します。
- マウス温度を所望の走査温度(37°C)に平衡化します。約5〜10分。
- 上部メニューまたは スキャナ設定アイコンからアクセスできる [スキャナのセットアップ] を選択します。対象領域に合わせて X-Y 座標を変更して、スキャン領域を調整します。スキャン速度は、スキャンの解像度に依存します。解像度が高いほど、スキャン時間が長くなります。解剖灌流に焦点を当てた高解像度とは対照的に、グローバル灌流に焦点を当てた反復スキャンでは、4 ms/pixelのスキャン速度が十分です。
注:研究者が開発中の副循環(皮膚に近い腹側の大腿とふくらはぎで最もよく画像化されている)を直接研究しようとしている場合は、より高い解像度と単一スキャンを考慮する必要があります。マウスフットパッドのエンドオルガンへのグローバルな灌流を評価する場合、低解像度/速度(例えば4 ms/pixel)での反復スキャンは十分です。ビデオに示されているソフトウェアは、再起動時にスキャン領域、速度、解像度のために以前に使用したテンプレートを自動的にロードするか、さまざまな対象領域がさまざまな実験に使用されている場合は保存されたファイルから取得することができます。 - 繰り返しスキャンを実行する場合は、[ 繰り返しおよびライン スキャン ] タブを選択します。スキャンの数は、繰り返し間隔と同様に変更することができます(この場合は3スキャン)。繰り返し間隔の最小時間は、スキャン領域とスキャン解像度によって決定されるボックスの右側のグレー表示領域に表示される、推定スキャン時間になります。数秒を追加すると、ユーザーはスキャンの間に必要に応じてマウスを一時停止し、マウスの位置を変更できます。
3. スキャン
- [イメージ スキャン] タブを選択し、[マーク] ボタンを選択します。レーザーはスキャン領域の輪郭に移動します。スキャン対象のターゲットがマークされた領域内になるように、マウスの位置を調整します。
注: フットパッドまたはフットパッドおよびふくらはぎのスキャンでは、後肢を拡張して位置を決めやすい場合は、supine の位置よりも一貫した関心領域を提供します。大腿動脈と伏在動脈および副巻は、大腿部とふくらはぎの腹側表面に非常に近いので、これらの対象領域を使用する場合は、スピーヌ位置が好ましい。 - 繰り返しスキャンアイコンを選択して測定を繰り返し開始し、再生ボタンを押してスキャンを開始します。
- ポップアップ ウィンドウでスキャン距離を確認し、[OK] をクリックしてスキャンを開始します。
- マウスの動きのスキャン中にマウスを監視します。スキャンの途中で、マウスが十分に移動して、スキャン領域にヒンドポーが存在しない場合は、スキャンを再開します。マウスのヒンドポー位置の小さな変化は、解析ソフトウェアに対応することができます。
- ホーム温気ブランケットを使用しても変動する可能性があるため、スキャンプロセス中にマウス温度を監視します。マウス温度にばらつきが多すぎる場合、スキャンの間に大きな変動が生じる可能性があります。一般的に、36.8~37.2 °Cの温度範囲は許容可能なデータとなります。
- キャプチャしたスキャンを [名前を付けて保存] ウィンドウの下に、マウス ID とタイムポイントを含むファイル名を付けて保存し、データ分析を容易にします。必要に応じて、マウスとタイムポイントの詳細を[件名の詳細]ウィンドウに入力します。
- イオフイオフ、直腸温度プローブを取り外します。
- 直腸温度プローブを70%エタノールで消毒して、次のマウスで使用できます。
- マウスが麻酔から右反射を表示する時点まで回復できるように、ケージに戻す前に、直面する位置に、直面する可能性のある位置に反転させます。
注:回復は非常に迅速であるか、ケタミン/キシラジンのための暖かい回復ケージで、イゾフルランのための温暖化毛布のいずれかで行うことができます。
4. LDPI データのキャプチャ (図 3)
- イメージングレビューソフトウェアプログラムを開きます。
- ファイル メニューに移動し、開いて保存したファイルを見つけます。
- ツールバーから ROI アイコンを選択します。
- [ ポリゴンの追加] ボタンを選択します。
- マウスを使用して、コントロールの後肢の対象領域 (ROI) をトレースします。ポリゴン トレースは、計算された平均に灰色の背景が含まれないため、正確である必要はありません。
- 手術後肢についてステップ4.3~4.5を繰り返します。
- [統計情報] アイコンを選択して、[イメージ ROI 統計結果 (PU)]ウィンドウを開きます。
- ポリゴン 1 (後肢コントロール) とポリゴン 2 (外科的後肢) の結果をコピー/貼り付けを使用してデータ収集ワークシートにエクスポートします。
5. 分析
- 各スキャンの外科/制御比率としてデータをキャプチャします。
- その時点での特定のマウスのデータポイントの 3 つのスキャンすべてに平均された外科/制御を使用します。後肢虚血に対する応答の生物学的変動のために、一般に8〜10匹のマウスが〜10%標準誤差で再現可能な結果を達成するために、時間的に必要とされる。
注:マウスが麻酔から回復できるようにする前に、繰り返しスキャンの迅速な分析を実行して、データが可変すぎるかどうかを確認する価値があります(例えば、スキャン1-3の間で100〜150以上の灌流ユニットが異なります)。繰り返しスキャンの間に大きな変動は、マウスがスキャン中に完全に平衡化されないことを示唆しています (図 2)、データポイントを失うことなく繰り返しスキャンを実行できます。表示されるフラックス値のダイナミックレンジを最適化するためにカラーパレットを変更する方が、表示スキャンのバリエーションを改善するために必要な場合があります(図2)。
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Representative Results
成功したLDPIは、3つのスキャン間で100〜150個以下の灌流ユニット変動(マウスフットパッドの通常の平均灌流の約10%に相当する)を持つ、一貫した反復測定スキャンをもたらすはずです(図2)。図2に示すように、反復スキャンは、マウスが適切に平衡化されていることを判断し、虚血/制御比が温度変動によって引き起こされる真皮灌流の変動とは対照的に、基礎となる血流を最もよく反映するようにするのに役立ちます。データポイントに対して単一のスキャンを使用すると、より実験的なマウスの必要性につながる変動性が高まります。後肢虚血に使用する場合、外科的後肢は、コントロール後肢と比較して世界的な灌流を減少させたはずである。結果は、外科的後肢灌流/制御後肢灌流の比率として表される。マウスが最初に血管化し、時間の経過とともに彼らの本質的な担保ネットワークを開発するにつれて、LDPIによる血流回復は術後の時間経過にわたって見られるべきです(図4)。回復の程度は、マウス株および後肢虚血モデルの重症度に依存する。
図 1.腹側フットパッドのレーザードップラー灌流イメージングのためのマウスポジショニング。 イオブルラン鼻コーン(A)を使用した麻酔マウスは、腹側フットパッドのスキャンを可能にするために後肢を拡張して、起こりやすい位置に置かれる。ホーム熱ブランケット用直腸温度プローブ(P)は、スキャン中に一貫した体温を維持するために設置されています。家庭性ブランケットパッドは、スキャンの背景を提供するために使用される非反射ネオプレン材料の下にあります。スキャン領域の中央を示すレーザーがマウスの尾の横に表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.カラーパレット調整で見たマウス温度変化からのスキャン変動のデモンストレーション。(A)レーザードップラーは、繰り返し走査中にマウスコア温度変動によって引き起こされる有意な変動を伴うスキャンを繰り返し、繰り返し流束スキャンで色に変換された灌流ユニットに基づいて表示される。(B) カラーパレットのダイナミックレンジ(スキャンウィンドウの左側に表示)をAの0~1000からBの0-1500(赤い矢印)に変更すると、バリエーションがより明白になります。(C) コントロール後肢の対象領域の平均灌流値(赤で囲まれた)を示す統計(AとBのrfx画像では黒のポリゴン1)の範囲は、第1スキャンの655から3回目のスキャンでは791まで及ぶ 虚血性後肢の対象領域(AおよびBのrfx画像の赤のポリゴン2)は、より少ない変動(361〜400)を示し、繰り返しスキャンの間の虚血/制御比の有意な差(0.60、0.53、 0.46)。(D)測定ソフトウェア(左パネル)と画像レビューソフトウェア(右パネル)のカラーパレットのダイナミックレンジを変更するウィンドウ。赤い矢印は、範囲の上限を増減する場所を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.繰り返しスキャンを行うレーザードップラー灌流イメージング用のデータキャプチャ。 (A) トップツールバー(1)ROI アイコンを追加します。2. ポリゴンの追加アイコン。3. 件名の詳細アイコン (Bのウィンドウポップアップにアクセスします)。4. 統計アイコン (Cのウィンドウポップアップにアクセスします)。(B) 件名の詳細ウィンドウ(C) 各 ROI の平均灌流値(赤で囲まれた)を示す統計ウィンドウ。(D) 制御ヒンドポー(黒)と虚血性ヒンドポー(赤)の周囲にトレースされたポリゴンROIを使用した繰り返しスキャン。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.LDPI データを使用した時間コースの実験。 P27ノックアウトマウス(3〜5ヶ月の生き生きとした女性CDKN1b-/- C57Bl/6バックグラウンドのマウス)を伴う大腿動脈結紮(n=6)および(n=10)経口ドキシサイクリン治療なし(n=11)および(n=9)経口ドキシサイクシン(n=9)経口ドキシクリン(非公表)を有する(n=9)経口ドキシクリンを有する(n=9)経口ドキシクリンを投与した場合誤差範囲は、平均値 (SEM) の標準誤差を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
LDPI を使用して信頼できる結果を得るには、一貫した手法が不可欠です。同じ麻酔薬、温度設定、マウス位置、関心領域は、全期間を通して使用する必要があります。異なる麻酔薬は、より高いまたは低い灌流値9をもたらす。イオブルラン麻酔は、その急速な発症と出現だけでなく、全体的な安全性のために便利です。イソフルランの一貫した割合は、この血管拡張剤が皮膚灌流を変える可能性のある麻酔の深さとして使用されるべきである。対象領域に毛皮が含まれる場合、化学的に脱毛したマウスは、ファーを電気バリカン7で除去したマウスよりも高い灌流値を有するので、毎回同じ脱毛方法を使用すべきである。マウスの温度は、36°Cのマウスが38°C7、12でマウスよりも有意に低い灌流値を有する、灌流イメージングに大きな影響を及ぼす。虚血性後肢はまた、コントロール後肢とは異なる地域温度変化に対して異なる反応をする可能性がある(図2)。このプロトコルでは、スキャン中にマウスの温度を維持するために家庭性毛布を使用し、スキャンプロセス中にマウスを5分間事前に平衡化し、その後、新井山らが示すように、非温かい表面でスキャンするよりも、より一貫した温度制御を提供します。
フットパッドのみを対象領域として選択した場合、スキャン対象領域での再現性のために、ポジショニングが好ましい。このアプローチの利点は、心臓から最も遠い領域を研究し、虚血性足潰瘍が一般的である場所に対応する最も臨床的に関連する領域を研究することです。フットパッドはヘアレスなので、クリッピングや脱毛は不要で、測定の準備と時間が簡素化されます。また、非白色マウスは、ふくらはぎまたは太ももの皮膚に色素沈着のパッチを有し、LDPI測定を妨げる可能性がある。選択した対象領域にふくらはぎと太ももが含まれる場合、後肢の腹側表面に沿って大腿動脈および伏在動脈が走り、LDPI7を用いて画像化することができるため、その後、スピン位置が好ましい。この上端位置から、足の一貫した撮像は捕捉が困難であり、側面および上面が可変的に画像化されてもよい。
後肢虚血後の副表添えおよび血流回復は、後肢虚血モデル、マウス株、性別、および年齢を含む多くの異なる要因に依存する。C57Bl/6のようなマウスの特定の株は、急性後肢虚血の誘導後の灌流の劇的な低下が少ないのに対し、BALB/cのような他の株は貧しい担保14、15を有する堅牢なベースラインの担保を有する。雌マウスは雄マウスよりも回復が悪い。古いマウスはまた、若いマウス16よりも悪い血流回復を有する。したがって、マウスは、LDPIデータを用いた血流回復に関する信頼できる結論を導くために、緊張、年齢、性別を一致させる必要があります。厳密なマッチングを行い、マウスの近交系株を使用しても、後肢虚血に対するマウスの反応に一定量の生物学的変動があるため、有効なデータには適切なマウス数(通常は時点あたり8〜10匹)が必要です。さらに、LDPIの正常化は、骨格筋の需要を有しない麻酔マウスで測定が行われるため、必ずしも正常レベルの動脈流動の回復を意味するわけではない。最後に、浸透の深さの限界のために、大腿部と子牛のより深い筋肉を通って走るかもしれない副内因経路の詳細な解剖学的研究はLDPIでは不可能である。
レーザースペックルイメージング17、18、19、骨格筋のコントラスト強化超音波などの深部構造などの皮膚の灌流ベースのイメージングを含む血流回復を評価するためにいくつかの他の方法が使用されている、MRI21、および(13)N-アンモニアPET22。また、マイクロCT10、OCT23などの副次血管の解剖学的イメージング、および生体内顕微鏡24によるコントラスト強化超音波も使用される。高速スキャン時間、データのキャプチャと分析の相対的な容易さ、および静脈内コントラストの必要性の回避のために、LDPIは、文献のほとんどのグループで使用される主要な方法です。弱点は、この技術が血流速度を測定し、絶対組織灌流を測定するのではなく、任意の灌流ユニットでデータを提供し、スキャン深度は比較的浅く、比較的貧弱な解剖学的詳細を提供することが含まれる。
LDPIは、様々な後肢虚血モデル7の後の回復を評価するために最も一般的に使用される。また、後肢25、より深い虚血器官または脊髄26、27、28の両方で虚血再灌流研究にも使用されている。しかし、深部構造の評価には、スキャンする構造の外科的暴露が必要であり、瘢痕化のために繰り返し測定することがより困難になる。さらなる適用は、マイクロサージャリー29後のフラップ再灌流の評価である。
結論として、LDPIは、全体的な動脈灌流の反射として後肢真皮灌流を測定するための効果的で、容易に行われ、反復可能な方法である。LDPI を使用して信頼性の高いデータを取得する場合は、一貫した手法が必要です。
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Disclosures
唐博士は開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
VAピューゲ・サウンド・ヘルスケア・センターでは、施設・資源を活用して行った作業です。この作品は著者のものであり、退役軍人省または米国政府の立場や方針を必ずしも反映しているわけではありません。唐博士は現在、VA(Merit 5 I01 BX004975-02)を通じて資金提供を受けています。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Black nonreflective material | Fabric store, black neoprene recommended by company | ||
F/air cannister | A.M. Bickford Inc | 80120 | |
Homeothermic blanket with rigid metal probe | Harvard Apparatus | Also comes with flexible probe, but this is less durable | |
Isoflurane Anesthesia machine | Drager | Multiple manufacturers | |
Isoflurane induction chamber | VetEquip | 941444 | 2 L chamber |
Moor laser Doppler perfusion imager | Moor Instruments | MoorLDI2-IR | Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR) |
Mouse Anesthesia nose cone | Multiple manufacturers | ||
Nair | Nair | ||
Oxygen tank | Multiple manufacturers | ||
Surgilube | Multiple distributors |
References
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