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Medicine

Imaging perfusione Doppler laser nell'hindlimb del mouse

Published: April 18, 2021 doi: 10.3791/62012
Automatic Translation
1,2, 2
1Division of Vascular Surgery, University of Washington, 2VA Puget Sound Health Care System

Summary

Qui presentiamo un protocollo che dimostra la tecnica e i controlli necessari per l'imaging perfusione Laser Doppler per misurare il flusso sanguigno nell'arto posteriore del topo.

Abstract

Il recupero del flusso sanguigno è una misura critica del risultato dopo ischemia hindlimb sperimentale o ischemia-riperfusione. L'imaging perfusione Laser Doppler (LDPI) è un metodo comune, non invasivo e ripetibile per valutare il recupero del flusso sanguigno. La tecnica calcola il flusso sanguigno complessivo nel tessuto campionato dallo spostamento doppler della frequenza causato quando un laser colpisce i globuli rossi in movimento. Le misurazioni sono espresse in unità di perfusione arbitrarie, quindi il controfilettale non intervenuto sulla gamba viene solitamente utilizzato per aiutare a controllare le misurazioni. La profondità di misura è dell'intervallo di 0,3-1 mm; per l'ischemia dell'arto posteriore, ciò significa che viene valutata la perfusione dermica. La perfusione dermica dipende da diversi fattori, in particolare la temperatura cutanea e l'agente anestetico, che devono essere attentamente controllati per ottenere letture affidabili. Inoltre, la pigmentazione dei capelli e della pelle può alterare la capacità del laser di raggiungere o penetrare nel derma. In questo articolo viene illustrata la tecnica dell'LDPI nell'hindlimb del mouse.

Introduction

L'ulcerazione cutanea con una guarigione inadeguata delle ferite è una delle principali cause di amputazioni nei pazienti umani1. Un'adeguata guarigione delle ferite richiede livelli di perfusione arteriosa più elevati di quelli necessari per mantenere intatta la pelle, che è compromessa nei pazienti con malattia arteriosa periferica2,3,4. Molte altre condizioni reumatologiche e diabete possono anche portare a microcircolo cutaneo disturbato e inadeguato per guarire leferite 5,6. Molti pazienti diabetici hanno una concomitante malattia arteriosa periferica, mettendoli a rischio particolarmente elevato di amputazione. L'imaging perfusione Laser Doppler (LDPI) viene utilizzato in situazioni cliniche per valutare il microcircolo cutaneo, nonché in situazioni di ricerca per valutare il flusso sanguigno e il recupero del flusso sanguigno dopo ischemia hindlimb sperimentale, ischemia-riperfusione e lembi microchirurgici7.

Il sistema LDPI proietta un raggio laser a bassa potenza che viene deviato da uno specchio di scansione per muoversi su una regione di interesse. Questo differisce dalla fluidmetria Laser Doppler, che fornisce una misurazione perfusione per la piccola area del tessuto a diretto contatto con la sonda diflussometria 8. Quando il raggio laser interagisce con il sangue in movimento nella microvascolarizzazione, subisce uno spostamento di frequenza Doppler, che viene fotodetratto dallo scanner e convertito in unità di perfusione arbitrarie. Poiché l'LDPI è una tecnica leggera, è limitata in termini di profondità di penetrazione a 0,3-1 mm, il che significa che per la maggior parte la perfusione dermica vienevalutata 7. Il flusso dermico può essere alterato dalla temperatura della pelle e dal sistema nervoso simpatico, che può essere influenzato da vari agenti anestetici9. Le misurazioni dal laser ottico sono influenzate anche dalle condizioni di illuminazione ambientale, dalla pigmentazione della pelle e possono essere bloccate sovrascriendo pelliccia o capelli7.

LDPI è la tecnica di ricerca più comunemente utilizzata per monitorare il recupero della perfusione dopo l'ischemia perché non invasiva, non richiede la somministrazione del contrasto e ha tempi di scansione rapidi che consentono la raccolta dei dati su più animali. Questo lo rende ideale per aiutare a determinare se i trattamenti mirati all'arteriogenesi terapeutica o all'angiogenesi sono efficaci nei piccoli modelli animali. Il recupero del flusso sanguigno dopo l'ischemia dell'arto posteriore misurato dall'LDPI è ben correlato con lo sviluppo collaterale dell'arteria se valutato con altri mezzi come la fusione di Microfil o la micro-TC10,11. L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare la valutazione della perfusione dell'ostacolo utilizzando l'LDPI.

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Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Washington.

1. Preparazione dello scanner

  1. Regolare l'altezza dello scanner in modo che la distanza dal soggetto scansionato sia di circa 30 cm.
  2. Accendere l'imager e avviare il software associato.
  3. Aprire il programma di misurazione. Se il software comunica correttamente con lo scanner, verrà visualizzato l'avviso di accendemento del laser a infrarossi.
  4. Calibrare la macchina con gli standard forniti dal produttore (non mostrati nel video e dipenderanno dal modello specifico di macchina utilizzata).
  5. Regolare le impostazioni dello scanner in modo che siano appropriate per il materiale di sfondo e la configurazione dell'illuminazione nella stanza.
    1. Impostare i livelli di guadagno DC FLUX e CONC, in base alle istruzioni del produttore (non visualizzate nel video).
    2. Impostate la soglia di sfondo puntando il raggio laser verso il materiale di sfondo nero e premete Auto BK Set.

2. Preparazione della pre-scansione del mouse

  1. Impostare la camera di induzione dell'isoflurane con un'adeguata scavenging del gas di scarico.
    NOTA: Posizionare la camera di induzione su un tampone riscaldante aiuterà a prevenire la perdita di temperatura del mouse durante l'induzione dell'anestesia.
  2. Accendere la coperta omeotermica, che viene posizionata nell'area di scansione sotto una superficie non riflettente (in questo caso un tessuto neoprene nero). Impostare la coperta omeotermica per mantenere una temperatura corporea di 37 °C.
  3. Posizionare la sonda di temperatura per la coperta omeotermica e il lubrificante in modo che siano pronti per l'inserimento.
  4. Posizionare la maschera di anestesia e il sistema di scavenging nell'area di scansione.
  5. Anestetizzare il mouse con un vaporizzatore di isoflurane. Impostare la velocità dell'ossigeno su 1 L/min di flusso e regolare l'isoflurane al 4% per l'induzione dell'anestesia. Accendere il flusso alla camera di induzione dell'anestesia e la frequenza di respirazione del mouse rallenterà. Un'anestesia adeguata si ottiene quando il topo perde il riflesso di destro.
  6. Trasferire il mouse su una maschera anestetica/cono del naso con spazzino di gas di scarico collegato e regolare l'isoflurane all'1,5%.
    NOTA: Questo livello di anestesia è generalmente adeguato per mantenere il topo relativamente fermo durante la scansione, ma non è destinato a fornire livelli chirurgici di anestesia, quindi la profondità dell'anestesia non viene controllata. La modifica del livello di isoflurane causa cambiamenti nel battito cardiaco, nella respirazione e nella perfusione dermica, quindi una percentuale costante dovrebbe essere utilizzata durante qualsiasi esperimento del corso di tempo e per tutte le materie sperimentali. Possono essere utilizzate anche tecniche anestetiche alternative come l'iniezione IP di chetamina xiazina, ma la stessa tecnica anestetica dovrebbe essere utilizzata durante qualsiasi studio del corso in qualsiasi momento poiché diversi anestetici influenzano la perfusione dermica in modo diverso.
  7. (Facoltativo a seconda dell'area di scansione) Se la regione di interesse prevista da scansionare è coperta da pelliccia, utilizzare un piccolo trimmer elettrico o crema depilatoria per rimuovere i capelli dalla regione di interesse.
    NOTA: La crema depilatoria deve essere completamente rimossa e la pelle del mouse asciugata prima della scansione.
  8. Posizionare il mouse nell'appropriata posizione di scansione sulla superficie nera non riflettente che copre la coperta omeotermica, confermando che entrambi gli arti posteriori rimangono sulla fonte di calore durante l'equilibrazione e la scansione (Figura 1).
    NOTA: È importante mantenere entrambi i piedi sulla coperta omeotermica per evitare variazioni regionali di temperatura.
  9. Inserire la sonda di temperatura rettale lubrificata associata alla coperta omeotermica.
  10. Equilibrare la temperatura del mouse alla temperatura di scansione desiderata (37 °C); circa 5-10 minuti.
  11. Selezionare Configurazione scanner, a cui è possibile accedere dal menu in alto o dall'icona di configurazione dello scanner. Regolate l'area di scansione modificando le coordinate X-Y per adattarsi alla regione di interesse. La velocità di scansione dipenderà dalla risoluzione della scansione. Una risoluzione più elevata comporterà tempi di scansione più lunghi. Per la scansione ripetuta incentrata sulla perfusione globale, anziché su una risoluzione più elevata incentrata sulla perfusione anatomica, è adeguata una velocità di scansione di 4 ms/pixel.
    NOTA: Una risoluzione più elevata e una scansione singola dovrebbero essere prese in considerazione se il ricercatore sta tentando di studiare direttamente la circolazione collaterale in via di sviluppo (meglio immagine nella coscia ventrale e nel polpaccio dove è più vicina alla pelle). La scansione ripetuta a una risoluzione/velocità inferiore (ad esempio, 4 ms/pixel) è adeguata quando si valuta la perfusione globale all'organo finale del footpad del mouse. Il software mostrato nel video carica automaticamente il modello utilizzato in precedenza per l'area di scansione, la velocità e la risoluzione al riavvio oppure può essere recuperato da un file memorizzato se vengono utilizzate diverse regioni di interesse per vari esperimenti.
  12. Se si eseguono scansioni ripetute, selezionare la scheda Ripeti e Scansione linea. Il numero di scansioni può essere modificato (in questo caso 3 scansioni) e l'intervallo di ripetizione. Il tempo minimo per l'intervallo di ripetizione sarebbe il tempo di scansione stimato, che viene visualizzato nell'area disattivata a destra della casella determinata dall'area di scansione e dalla risoluzione di scansione. L'aggiunta di alcuni secondi consente all'utente di mettere in pausa e potenzialmente riposizionare il mouse, se necessario, tra le scansioni.

3. Scansione

  1. Selezionare la scheda Analisi immagine e selezionare il pulsante Segna. Il laser si muoverà per delineare l'area di scansione. Regolare la posizione del mouse in modo che la destinazione da scansionare si trova all'interno dell'area contrassegnata.
    NOTA: Per la scansione del pedante o del piede e del polpaccio, il posizionamento incline con gli arti posteriori estesi fornisce una regione di interesse più coerente rispetto al posizionamento supino. L'arteria femorale e l'arteria safenosa e i collaterali sono molto vicini alla superficie ventrale della coscia e del polpaccio, quindi il posizionamento supina è preferito se si utilizzano queste regioni di interesse.
  2. Iniziare la misurazione ripetuta selezionando l'icona Ripeti scansione e premere il pulsante Riproduci per avviare la scansione.
  3. Verificare la distanza di scansione nella finestra popup e fare clic su OK per iniziare la scansione.
  4. Monitorare il mouse durante la scansione per il movimento del mouse; se il mouse si muove in modo sufficiente che le zampe posteriori non si trovano più nell'area di scansione nel mezzo di una scansione, riavviare la scansione. Piccole variazioni nella posizione della penna posteriore del mouse possono essere ospitate nel software di analisi.
  5. Monitorare la temperatura del mouse durante il processo di scansione in quanto può fluttuare anche con l'uso della coperta omeotermica. Se c'è troppa variazione nella temperatura del mouse, ciò può comportare variazioni significative tra le scansioni. Generalmente, un intervallo di temperatura di 36,8-37,2 °C si tradurrà in dati accettabili.
  6. Salvare l'analisi acquisita nella finestra Salva con nome con un nome di file che include l'identificatore del mouse e il punto di tempo per facilitare l'analisi dei dati. Immettere i dettagli del mouse e del punto di tempo, se lo si desidera, nella finestra dei dettagli dell'oggetto.
  7. Spegnere l'isoflurane e rimuovere la sonda di temperatura rettale.
  8. Disinfettare la sonda a temperatura rettale con il 70% di etanolo in modo che sia pronta per l'uso nel mouse successivo.
  9. Lasciare che il mouse si riprenda dall'anestesia al punto in cui mostra un riflesso di destro lanciandosi dalla posizione supina alla posizione prona prima di restituirlo alla gabbia.
    NOTA: Il recupero può essere effettuato su una coperta riscaldante per isoflurane poiché il recupero è molto rapido o in una gabbia di recupero riscaldata per ketamina / xiloazina.

4. Acquisizione di dati LDPI (Figura 3)

  1. Aprire il programma software di revisione dell'imaging.
  2. Passare al menu file, aprire e individuare il file salvato.
  3. Selezionare l'icona ROI dalla barra degli strumenti.
  4. Selezionare il pulsante Aggiungi poligono.
  5. Tracciare l'area di interesse (ROI) per l'ostacolo del controllo utilizzando il mouse. La traccia poligonale non deve essere esatta in quanto lo sfondo grigio non verrà incluso nelle medie calcolate.
  6. Ripetere i passaggi 4.3-4.5 per l'arto posteriore chirurgico.
  7. Scegliere l'icona Statistiche per aprire la finestra Risultati statistiche ROM immagine (PU).
  8. Esportare i risultati per Poligono 1 (ostacolo di controllo) e Poligono 2 (ostacolo chirurgico) in un foglio di lavoro di raccolta dati tramite copia/incolla.

5. Analisi

  1. Acquisire i dati come rapporto chirurgico/controllo per ogni scansione.
  2. Utilizzare l'intervento/controllo medio per tutte e tre le scansioni per il punto dati per quel particolare mouse in quel punto di tempo. A causa della variabilità biologica nella risposta all'ischemia dell'arto posteriore, in generale sono necessari 8-10 topi per timepoint per ottenere risultati riproducibili con ~ 10% di errore standard.
    NOTA: Prima di consentire al mouse di riprendersi dall'anestesia, vale la pena eseguire una rapida analisi delle scansioni ripetute per verificare se i dati sono troppo variabili (ad esempio, più di 100-150 unità di perfusione diverse tra le scansioni 1-3). Variazioni elevate tra scansioni ripetute suggeriscono che il mouse non è stato completamente equilibrato durante la scansione (Figura 2) e una scansione ripetuta può essere eseguita senza perdere un punto dati, che si verificherebbe se le immagini non vengono analizzate fino a una data successiva. La modifica della tavolozza dei colori per ottimizzare l'intervallo dinamico di valori di flusso visualizzati potrebbe essere necessaria per visualizzare meglio la variazione della scansione (Figura 2).

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Representative Results

Il successo dell'LDPI dovrebbe comportare scansioni coerenti ripetute, con non più di 100-150 variazioni dell'unità di perfusione (corrispondenti a circa il 10% della perfusione media abituale per il pedano del mouse) tra le tre scansioni(Figura 2). Come illustrato nella figura 2, le scansioni ripetute aiutano a determinare che il mouse è stato opportunamente equilibrato in modo che il rapporto ischemico/controllo rifletta al meglio il flusso sanguigno sottostante rispetto alla variazione della perfusione dermica causata dalla variazione di temperatura. L'utilizzo di singole scansioni per i punti dati aumenterà la variabilità portando alla necessità di mouse più sperimentali. Se usato per l'ischemia dell'arto posteriore, l'arto posteriore chirurgico avrebbe dovuto diminuire la perfusione globale rispetto all'arto posteriore di controllo. I risultati sono espressi come un rapporto tra perfusione chirurgica dell'arto posteriore/perfusione dell'arto posteriore di controllo. Poiché i topi inizialmente vasodilati e sviluppano la loro rete collaterale intrinseca nel tempo, il recupero del flusso sanguigno da parte dell'LDPI dovrebbe essere visto durante un corso di tempo postoperatorio (Figura 4). Il grado di recupero dipende dallo sforzo del mouse e dalla gravità del modello di ischemia dell'arto posteriore.

Figure 1
Figura 1. Posizionamento del mouse per l'imaging laser doppler perfusione dei pedana ventrale. Il mouse anestetizzato con cono nasale isoflurane (A) è posto in posizione soggetta a arti posteriori estesi per consentire la scansione dei pedoni ventrali. La sonda di temperatura rettale (P) per coperta omeotermica è in posizione per mantenere una temperatura corporea costante durante la scansione. Il pad della coperta omeotermico si trova sotto il materiale neoprene non riflettente utilizzato per fornire lo sfondo per la scansione. Il laser che indica il centro della regione di scansione è visibile accanto alla coda del mouse. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Dimostrazione della variazione di scansione dal cambiamento della temperatura del mouse meglio visto con la regolazione della tavolozza dei colori. (A) Scansioni ripetute Laser Doppler con variazioni significative causate dalla variazione della temperatura interna del mouse durante le scansioni ripetute, che è visibile in base alle unità di perfusione tradotte a colori sulle scansioni di flusso ripetute. (B) La modifica dell'intervallo dinamico sulla tavolozza dei colori (mostrata a sinistra della finestra di scansione) da 0 a 1000 in A a 0-1500 (freccia rossa) in B rende la variazione più ovvia. (C) Le statistiche che mostrano i valori medi di perfusione per la regione di interesse (cerchiata in rosso) per l'arto posteriore di controllo (poligono 1 in nero sull'immagine rfx in A e B)varia da 655 per la scansione 1st a 791 sulla scansione 3rd e la perfusione media per la regione di l'interesse per l'arto posteriore ischemico (Poligono 2 in rosso sull'immagine rfx in A e B)ha mostrato una minore variazione (da 361 a 400), portando a differenze significative nel rapporto ischemico/controllo tra le scansioni ripetute (0,60, 0,53, e 0,46). (D) Finestra per modificare l'intervallo dinamico della tavolozza dei colori nel software di misurazione (pannello sinistro) e nel software di revisione delle immagini (pannello destro). Le frecce rosse mostrano dove aumentare o diminuire l'intervallo superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Acquisizione dati per l'imaging perfusione Doppler laser con scansioni ripetute. (A) Barra degli strumenti superiore con 1. Icona Aggiungi ROI. 2. Icona Aggiungi poligono. 3. Icona dettagli soggetto (accessi finestra pop-up in B). 4. Icona Statistiche (viene visualizzata la finestra di accesso in C). (B) Finestra dei dettagli dell'oggetto. (C) Finestra statistica che mostra i valori medi di perfusione (cerchiati in rosso) per ogni ROI. (D) Scansione ripetuta con ROI poligonale tracciato intorno al controllo posteriore (nero) e posteriore ischemico (rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Esperimento del corso di tempo con i dati LDPI. Topi knockout P27 (topi CDKN1b-/- di 3-5 mesi su sfondo C57Bl/6) dopo legatura dell'arteria femorale con (n=6) e senza (n=10) trattamento orale con doxiciclina rispetto ai topi femmine di tipo selvatico C57Bl/6 abbinati all'età con (n=11) e senza (n=9) trattamento orale con doxiciclina (dati inediti dell'autore). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Una tecnica coerente è fondamentale per ottenere risultati affidabili con LDPI. Lo stesso anestetico, le impostazioni di temperatura, la posizione del mouse e l'area di interesse devono essere utilizzati durante l'intero corso del tempo. Diversi agenti anestetici si tradurranno in valori di perfusione più o menoelevati 9. L'anestesia isoflurana è conveniente a causa della sua rapida insorgenza ed emergenza, nonché della sicurezza generale. Una percentuale costante di isoflurane deve essere utilizzata come profondità di anestesia con questo agente vasodilatatorio può alterare la perfusione cutanea. Se la regione di interesse include la pelliccia, allora lo stesso metodo di depilazione dovrebbe essere usato ogni volta, poiché i topi chimicamente depilati avranno valori di perfusione più elevati rispetto ai topi la cui pelliccia è stata rimossa con tosaerbaelettriche 7. La temperatura del topo ha un grande effetto sull'imaging perfusione, con topi a 36 °C con valori di perfusione significativamente inferiori rispetto ai topi a 38 °C7,12. L'ostacolo ischemico può anche reagire in modo diverso alla variazione di temperatura regionale rispetto all'ostacolo di controllo (Figura 2). In questo protocollo, una coperta omeotermica viene utilizzata per mantenere la temperatura del mouse durante la scansione, che fornisce un controllo della temperatura più coerente durante il processo di scansione rispetto alla pre-equilibbrazione del mouse su una piastra riscaldante a 37 °C per cinque minuti e quindi la scansione su una superficie non riscaldata come mostrato da Niiyama etal.

Se solo i pedana vengono scelti come regione di interesse, il posizionamento incline è preferito a causa della riproducibilità nella regione di interesse scansionata. Il vantaggio di questo approccio è che studia l'area più lontano dal cuore e l'area clinicamente più rilevante corrispondente a dove le ulcere ischemiche del piede sono comuni. I footpad sono senza peli, quindi il ritaglio o la depilazione non sono necessari, semplificando la preparazione e il tempo per la misurazione. Inoltre, i topi non bianchi possono avere macchie di pigmentazione nella pelle del vitello o della coscia, che possono interferire con la misurazione LDPI. Se la regione di interesse scelta include il polpaccio e la coscia, è preferibile il posizionamento supina perché l'arteria femorale e safenosa corre lungo la superficie ventrale dell'arto posteriore e può essere imageizzata utilizzando LDPI7. Dalla posizione supina, l'imaging coerente del piede è difficile da catturare, poiché le superfici laterali e superiore possono essere variamente immagini.

La collateralizzazione e il recupero del flusso sanguigno dopo l'ischemia dell'arto posteriore dipendono da una serie di fattori diversi tra cui il modello di ischemia dell'arto posteriore, lo sforzo del topo, il sesso e l'età. Alcuni ceppi di topi come C57Bl/6 hanno robuste garanzie di base, con un calo meno drammatico della perfusione dopo l'induzione dell'ischemia posteriore acuta, mentre altri come BALB /c hanno scarse garanziecollaterali 14,15. I topi femmine hanno un recupero peggiore rispetto ai topi maschi. I topi più anziani hanno anche un recupero del flusso sanguigno peggiore rispetto ai topipiù giovani 16. Pertanto, i topi devono essere ceppi, età e sesso abbinati per trarre conclusioni affidabili sul recupero del flusso sanguigno utilizzando i dati LDPI. Anche con una corrispondenza rigorosa e utilizzando ceppi di topi inbred, c'è una certa variabilità biologica nella risposta del mouse all'ischemia dell'arto posteriore, quindi sono necessari numeri di topo adeguati (di solito 8-10 topi per punto di tempo) per dati validi. Inoltre, normalizzazione dell'LDPI non significa necessariamente ripristino dei normali livelli di flusso arterioso in quanto la misurazione viene eseguita in topi anestetizzati che non hanno alcuna domanda muscolare scheletrica. Infine, a causa dei limiti di profondità di penetrazione, non sono possibili studi anatomici dettagliati sulle vie collaterali che possono attraversare la muscolatura più profonda della coscia e del polpaccio con LDPI.

Diversi altri metodi sono stati utilizzati per valutare il recupero del flusso sanguigno, tra cui l'imaging a base di perfusione della pelle come l'imaging a macchie laser17,18,19 o strutture più profonde come ultrasuoni potenziati dal contrasto del muscolo scheletrico20,RISONANZAMAGNETICA 21e (13)N-ammoniaca PET22. Sono utilizzate anche l'imaging anatomico di vasi collaterali come micro-CT10,OCT23e ultrasuoni potenziati dal contrasto con microscopia intravitale24. A causa del tempo di scansione rapido, della relativa facilità di acquisizione e analisi dei dati e della necessità di contrasto endovenoso, l'LDPI è il metodo predominante utilizzato dalla maggior parte dei gruppi in letteratura. I punti deboli includono che la tecnica misura le velocità del flusso sanguigno e fornisce dati in unità di perfusione arbitrarie piuttosto che misurare la perfusione assoluta del tessuto, la profondità di scansione è relativamente superficiale e fornisce dettagli anatomici relativamente poveri.

LDPI è più comunemente usato per valutare il recupero dopo vari modelli di ischemia hindlimb7. È stato anche utilizzato nella ricerca ischemia-riperfusione sia nell'artoposteriore 25 che negli organi splancnici più profondi o nel midollospinale 26,27,28. La valutazione delle strutture profonde richiede tuttavia la scansione dell'esposizione chirurgica della struttura, rendendo più difficili le misurazioni ripetute a causa delle cicatrici. Un'ulteriore applicazione è la valutazione della riperfusione del lembo dopo lamicrochirurgia 29.

In conclusione, l'LDPI è un metodo efficace, facilmente eseguibile e ripetibile per misurare la perfusione dermica posteriore come riflesso della perfusione arteriosa complessiva. È necessaria una tecnica coerente quando si utilizza LDPI per ottenere dati affidabili.

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Disclosures

Il dottor Tang non ha conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato svolto con l'utilizzo di strutture e risorse presso il VA Puget Sound Health Care Center. Il lavoro è quello dell'autore e non riflette necessariamente la posizione o la politica del Dipartimento degli Affari dei Veterani o del governo degli Stati Uniti. Il Dott. Tang è attualmente finanziato tramite l'AV (Merit 5 I01 BX004975-02).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black nonreflective material Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister A.M. Bickford Inc 80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe Harvard Apparatus Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine Drager Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber VetEquip 941444 2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager Moor Instruments MoorLDI2-IR Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone Multiple manufacturers
Nair Nair
Oxygen tank Multiple manufacturers
Surgilube Multiple distributors

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References

  1. Varma, P., Stineman, M. G., Dillingham, T. R. Epidemiology of limb loss. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (1), 1-8 (2014).
  2. Farber, A. Chronic Limb-Threatening Ischemia. New England Journal of Medicine. 379 (2), 171-180 (2018).
  3. Abularrage, C. J., et al. Evaluation of the microcirculation in vascular disease. Journal of Vascular Surgery. 42 (3), 574-581 (2005).
  4. Houben, A., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  5. Mahe, G., Humeau-Heurtier, A., Durand, S., Leftheriotis, G., Abraham, P. Assessment of skin microvascular function and dysfunction with laser speckle contrast imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 5 (1), 155-163 (2012).
  6. Murray, A. K., Herrick, A. L., King, T. A. Laser Doppler imaging: a developing technique for application in the rheumatic diseases. Rheumatology (Oxford). 43 (10), 1210-1218 (2004).
  7. Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser Doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors (Basel). 13 (1), 500-515 (2012).
  8. Sonmez, T. T., et al. A novel laser-Doppler flowmetry assisted murine model of acute hindlimb ischemia-reperfusion for free flap research. PLoS One. 8 (6), 66498 (2013).
  9. Gargiulo, S., et al. Effects of some anesthetic agents on skin microcirculation evaluated by laser Doppler perfusion imaging in mice. BMC Veterinary Research. 9, 255 (2013).
  10. Ankri-Eliahoo, G., Weitz, K., Cox, T. C., Tang, G. L. p27(kip1) Knockout enhances collateralization in response to hindlimb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (5), 1351-1359 (2016).
  11. McEnaney, R. M., Shukla, A., Madigan, M. C., Sachdev, U., Tzeng, E. P2Y2 nucleotide receptor mediates arteriogenesis in a murine model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (1), 216-225 (2016).
  12. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
  13. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
  14. Chalothorn, D., Faber, J. E. Strain-dependent variation in collateral circulatory function in mouse hindlimb. Physiological Genomics. 42 (3), 469-479 (2010).
  15. Helisch, A., et al. Impact of mouse strain differences in innate hindlimb collateral vasculature. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (3), 520-526 (2006).
  16. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (8), 1748-1756 (2011).
  17. Forrester, K. R., Stewart, C., Tulip, J., Leonard, C., Bray, R. C. Comparison of laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: measurement in human skin and rabbit articular tissue. Medical & Biological Engineering & Computing. 40 (6), 687-697 (2002).
  18. Briers, J. D. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging. Physiological Measurement. 22 (4), 35-66 (2001).
  19. Heeman, W., Steenbergen, W., van Dam, G., Boerma, E. C. Clinical applications of laser speckle contrast imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 24 (8), 1-11 (2019).
  20. Nguyen, T., Davidson, B. P. Contrast Enhanced Ultrasound Perfusion Imaging in Skeletal Muscle. Journal of Cardiovascular Imaging. 27 (3), 163-177 (2019).
  21. Zaccagnini, G., et al. Magnetic Resonance Imaging Allows the Evaluation of Tissue Damage and Regeneration in a Mouse Model of Critical Limb Ischemia. PLoS One. 10 (11), 0142111 (2015).
  22. Penuelas, I., et al. PET as a measurement of hindlimb perfusion in a mouse model of peripheral artery occlusive disease. Journal of Nuclear Medicine. 48 (13), 1216-1223 (2007).
  23. Jia, Y., Qin, J., Zhi, Z., Wang, R. K. Ultrahigh sensitive optical microangiography reveals depth-resolved microcirculation and its longitudinal response to prolonged ischemic event within skeletal muscles in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (8), 086004 (2011).
  24. Turaihi, A. H., et al. Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion. Journal of Visualized Experiments. (121), e54912 (2017).
  25. Liu, C., et al. Enhanced autophagy alleviates injury during hindlimb ischemia/reperfusion in mice. Experimental and Therapeutic Medicine. 18 (3), 1669-1676 (2019).
  26. Liu, D. L., Svanberg, K., Wang, I., Andersson-Engels, S., Svanberg, S. Laser Doppler perfusion imaging: new technique for determination of perfusion and reperfusion of splanchnic organs and tumor tissue. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (4), 473-479 (1997).
  27. Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat. Journal of Visualized Experiments. (135), e56243 (2018).
  28. Zhang, D., Li, S., Wang, S., Ma, H. An evaluation of the effect of a gastric ischemia-reperfusion model with laser Doppler blood perfusion imaging. Lasers in Medical Science. 21 (4), 224-228 (2006).
  29. Fitzal, F., et al. Circulatory changes after prolonged ischemia in the epigastric flap. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (7), 535-543 (2001).

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Medicina Numero 170 Laser Doppler Perfusion Imaging Laser Doppler flowmetry Mice Hindlimb Ischemia Ischemia Reperfusion Arteriogenesi
Imaging perfusione Doppler laser nell'hindlimb del mouse
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Tang, G. L., Kim, K. J. Laser… More

Tang, G. L., Kim, K. J. Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb. J. Vis. Exp. (170), e62012, doi:10.3791/62012 (2021).

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