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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Fabbricazione di piattaforme magnetiche per l'organizzazione su scala micron di neuroni interconnessi

Published: July 14, 2021 doi: 10.3791/62013
Automatic Translation
1,4, 2,4, 2,4, 1,4, 2,4, 2,4, 3,4, 2,4, 1,4
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Summary

Questo lavoro presenta un approccio dal basso verso l'alto all'ingegneria delle forze magnetiche locali per il controllo dell'organizzazione neuronale. Le cellule simili a neuroni cariche di nanoparticelle magnetiche (MNP) sono placcate in cima e controllate da una piattaforma micro-modellata con magnetizzazione perpendicolare. Sono descritti anche la caratterizzazione magnetica, l'assorbimento cellulare MNP, la vitalità cellulare e l'analisi statistica.

Abstract

La capacità di indirizzare i neuroni verso reti neurali organizzate ha grandi implicazioni per la medicina rigenerativa, l'ingegneria tissutale e il bio-interfacciamento. Molti studi hanno mirato a dirigere i neuroni usando segnali chimici e topografici. Tuttavia, le segnalazioni di controllo organizzativo su scala micron su vaste aree sono scarse. Qui, è stato descritto un metodo efficace per posizionare i neuroni in siti preimpostati e guidare la crescita neuronale con risoluzione su scala micron, utilizzando piattaforme magnetiche incorporate con elementi magnetici micro-modellati. È stato dimostrato che il caricamento di neuroni con nanoparticelle magnetiche (MNP) li converte in unità magnetiche sensibili che possono essere influenzate da gradienti magnetici. Seguendo questo approccio, è stata fabbricata una piattaforma magnetica unica su cui le cellule PC12, un modello comune simile a un neurone, sono state placcate e caricate con nanoparticelle superparamagnetiche. Sottili pellicole di multistrati ferromagnetici (FM) con magnetizzazione perpendicolare stabile sono state depositate per fornire forze di attrazione efficaci verso i modelli magnetici. Queste celle PC12 cariche di MNP, placcate e differenziate in cima alle piattaforme magnetiche, erano direttamente attaccate ai modelli magnetici, e la crescita della neurite era ben allineata con la forma del modello, formando reti orientate. Vengono presentati metodi di caratterizzazione quantitativa delle proprietà magnetiche, assorbimento MNP cellulare, vitalità cellulare e analisi statistica dei risultati. Questo approccio consente il controllo della formazione di reti neurali e migliora l'interfaccia neurone-elettrodo attraverso la manipolazione delle forze magnetiche, che può essere uno strumento efficace per gli studi in vitro sulle reti e può offrire nuove direzioni terapeutiche di biointerfazione.

Introduction

La micropatterning dei neuroni ha un grande potenziale per larigenerazione tissutale 1,2,3,4,5 e lo sviluppo di dispositivi neuro-elettronici6,7,8. Tuttavia, il posizionamento in scala micron dei neuroni ad alta risoluzione spaziale, come nei tessuti biologici, rappresenta una sfida significativa. La formazione di strutture predesignate su questa scala richiede la guida dei processi cellulari nervosi controllando localmente la motilità del soma e la crescita asonale. Studi precedenti hanno suggerito l'uso di segnali chimici e fisici9,10,11,12 per guidare la crescita neuronale. Qui, un nuovo approccio si concentra sul controllo del posizionamento cellulare in base ai gradienti dicampo magnetico 13,14,15,16,17, trasformando le celle cariche di MNP in unità sensibili al magnetico, che possono essere manipolate a distanza.

Kunze et al., che ha caratterizzato la forza necessaria per indurre le risposte cellulari usando cellule a chip magnetico e cariche di MNP, ha dimostrato che l'allungamento assionale precoce può essere innescato dalla tensione meccanica all'interno dellecelle 18. ha confermato che i substrati micro-fabbricati con gradienti di campo magnetico migliorati consentono la stimolazione wireless dei circuiti neurali dosati con MNP utilizzando coloranti indicatori calcio19. Inoltre, le nanoparticelle unite all'interno delle cellule, con conseguente forza localizzata mediata da nanoparticelle che si avvicinavano alla tensione cellulare20. Ciò ha portato alla fabbricazione di modelli definiti di substrati micromagnetici che hanno contribuito a studiare la risposta cellulare alle forze meccaniche. La tensione cellulare derivante dall'applicazione di forze localizzate mediate da nanoparticelle è stata raggiunta coalescenza di nanoparticelle all'interno dellecellule 20. Un sistema ibrido complementare di semiconduttori di ossido metallico (CMOS) -microfluidico è stato sviluppato da Lee et al.

ha utilizzato cuscinetti magnetici su microbila scala, pre-programmati come "punti caldi" magnetici per localizzare le celle22. Un'attività specifica potrebbe anche essere stimolata all'interno delle cellule utilizzando array magnetici micro-modellati per localizzare nanoparticelle in specifiche posizioni subcellulari23. L'assorbimento dell'MNP cellulare è stato dimostrato con successo nei neuroni primari di sanguisughe, ratti e topi24,25,26. Qui, questo è stato dimostrato su una linea cellulare feocromocitoma PC12 ratto, che è stato precedentemente segnalato per mostrare un elevato assorbimento di MNPs27. Negli ultimi anni, ci sono state varie applicazioni mediche di MNPs, tra cui la somministrazione di farmaci e la termoterapia nei trattamenti contro ilcancro 28,29,30,31. Nello specifico, gli studi riguardano l'applicazione di MNP e retineuronali 32,33,34,35. Tuttavia, l'organizzazione magnetica dei neuroni che utilizzano MNP a livello di una singola cellula merita ulteriori indagini.

In questo lavoro, è stato descritto un approccio dal basso verso l'alto per progettare forze magnetiche locali attraverso piattaforme predesignate per il controllo della disposizione neuronale. È stata presentata la fabbricazione di modelli su scala micron di multistrati FM. Questa struttura multistrato FM unica crea una magnetizzazione perpendicolare stabile che si traduce in forze di attrazione efficaci verso tutti i modelli magnetici. Attraverso l'incubazione, i MNP sono stati caricati in celle PC12, trasformandoli in unità sensibili magnetiche. Le celle cariche di MNP, placcate e differenziate in cima alle piattaforme magnetiche, erano preferenzialmente attaccate ai modelli magnetici, e la crescita della neurite era ben allineata con la forma del modello, formando reti orientate. Sono stati descritti diversi metodi per caratterizzare le proprietà magnetiche dei multistrati FM e degli MNP, e sono state presentate anche tecniche per l'assorbimento dell'MNP cellulare e i test di vitalità cellulare. Inoltre, i parametri morfometrici della crescita neuronale e l'analisi statistica dei risultati sono dettagliati.

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Protocol

NOTA: Eseguire tutte le reazioni biologiche in un armadio di biosicurezza.

1. Fabbricazione di piattaforme magnetiche

  1. litografia
    1. Tagliare vetri scivola in 2 x 2 cm2 usando una penna scriber. Pulire i vetrini in acetone e quindi isopropanolo per 5 minuti ciascuno in un bagno di ultra-sonicazione. Asciugare con azoto ad altissima purezza (UHP).
    2. Rivestire il vetro con fotoresist utilizzando lo spin-coating a 6.000 giri/min per 60 s, per raggiungere uno spessore di 1,5 μm, e cuocere a 100 °C per 60 s. Esporre il campione a una sorgente luminosa, utilizzando una lunghezza d'onda appropriata per il fotoresist, con un modello desiderato, utilizzando una fotomaschera o una litografia senza maschera.
    3. Sviluppare per 40 s in uno sviluppatore, diluito in acqua distillata (DW) secondo le istruzioni del produttore; lavare in DW per 45 s e asciugare con gas azoto UHP. Ispezionare il modello al microscopio ottico.
  2. Deposizione di Sputter
    1. Inserire il campione nella camera principale del sistema di deposizione e attendere la pressione di base (~5 × 10-8 Torr). Aprire il flusso di gas; impostare il flusso argon per lo sputtering standard (28 sccm [cm cubico standard per min) nel presente documento. Accendere i bersagli dello sputter, quindi impostare la pressione dello sputter su 3 mTorr.
    2. Aumentare la potenza su ogni bersaglio fino a raggiungere la velocità desiderata.
      NOTA: Pd Tasso: 0,62 A/s = 1,0 nm in 16 s; Co80Fe20 Tasso: 0,32 A/s, 0,2 nm in 6,25 s.
    3. Attivare la rotazione. Depositare il multistrato FM, alternando gli obiettivi Co80Fe20 e Pd, aprendo e chiudendo rispettivamente le persiane target. Depositare 14 bistrati di Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm) e terminare con un ulteriore livello di tappatura Pd a 2 nm.
    4. Decollo: immergere il campione in acetone per 30 minuti e risciacquare con isopropanolo. Quindi, asciugare con azoto UHP e conservare il campione in un ambiente pulito e asciutto fino all'uso.

2. Caratterizzazione del dispositivo magnetico tramite misurazioni del trasporto

  1. Utilizzare un substrato Si o uno scivolo di vetro con una barra magnetica a forma di croce di 100 μm di larghezza, depositata con multistrati FM (vedere figura 1C inset). Collegare il campione al supporto utilizzando nastro a doppia parte.
  2. Utilizzando un legatore di fili, legare 4 fili al campione, uno su ogni gamba dell'elettrodo incrociato. Impostare il portacampioni e il campione all'interno del sistema di misurazione del trasporto con un campo magnetico in modo che il campo magnetico sia perpendicolare al campione. Eseguire misurazioni a temperatura ambiente.
  3. Eseguire la misurazione della tensione trasversale (VT)del dispositivo; seguire le indicazioni della figura 1C (interno): applicare una corrente di 1 mA tra i contatti 1 e 3; misurare il VT tra i contatti 2 e 4; quindi, applicare una corrente compresa tra 2 e 4 e misurare la tensione tra 1 e 3. Infine, calcolare la differenza tra le tensioni sia delle misurazioni che dividere per 2 per ottenere VT. Utilizzare un sistema di commutazione per passare automaticamente tra le due configurazioni di misurazione.
  4. Spazzare il campo magnetico tra 0,4 T e -0,4 T in gradini di 5 mT e misurare il VT in funzione del campo. Tracciare la resistenza trasversale (VT/I) rispetto al campo magnetico per determinare il segnale anomalo di Hall, che è proporzionale alla magnetizzazione perpendicolare nella pellicola.

3. Caratterizzazione di MNP e multistrati magnetici mediante misurazioni della magnetometria

  1. Misurazione magnetometrica per multistrati FM
    1. Depositare il multistrato FM sul substrato Si (vedere sezione 1.2). Tagliare il campione in 6 quadrati di dimensioni 4 x 4 mm2. Impilare i campioni uno sopra l'altro e disporli nella capsula perpendicolarmente alla direzione del campo magnetico (vedere figura 1D inset).
    2. Inserire la capsula nel magnetometro e misurare la magnetizzazione a temperatura ambiente. Spazzare il campo magnetico tra -0,4 T e 0,4 T.
    3. Calcolare il volume totale del materiale magnetico, considerando lo spessore dello strato magnetico, la dimensione dei campioni e il numero di substrati. Dividere la magnetizzazione per il volume totale del materiale magnetico.
    4. Tracciare la magnetizzazione (per unità di volume) rispetto al campo magnetico. Sottrarre lo sfondo diamagnetico del substrato dall'elevata risposta del campo magnetico ed estrapolare la magnetizzazione di saturazione dell'FM dal grafico.
  2. Misurazione magnetometrica per MNP
    1. Inserire una massa designata di MNP in una capsula polimerica sintetica. Si consideri un volume maggiore se si misurano piccoli valori di saturazione di magnetizzazione.
    2. Se gli MNP sono sospesi in un solvente, asciugare i MNPs lasciando la capsula aperta durante la notte. Inserire la capsula nel magnetometro e misurare la magnetizzazione a temperatura ambiente. Spazzare il campo magnetico tra -0,2 T e 0,2 T.
    3. Calcolare la massa totale degli MNP moltiplicando il volume designato per la concentrazione di particelle. Normalizzare i risultati a 1 g.
    4. Tracciare la magnetizzazione normalizzata (per grammo) rispetto al campo magnetico. Estrapolare la saturazione di magnetizzazione degli MNP dal grafico.

4. Protocollo di rivestimento del collagene

  1. Rivestimento di stoviglie in plastica
    1. Preparare 0,01 M HCl aggiungendo 490 μL di HCl a 500 mL di acqua autoclavata a doppia distillazione (DDW).
      NOTA: Eseguire questo passaggio solo nella cappa chimica.
    2. Diluire il collagene di tipo 1 (soluzione dalla coda del ratto) 1:60-1:80 in 0,01 M HCl per ottenere la concentrazione di lavoro finale di 50 μg/mL. Posizionare 1,5 mL della soluzione diluita in un piatto da coltura da 35 mm. Lasciare il piatto nel cappuccio per 1 h, coperto.
    3. Rimuovere la soluzione e lavare 3 volte in soluzione salina sterile tamponata con fosfato 1x (PBS). Il piatto è pronto per la semina cellulare.
  2. Rivestimento vetrini
    1. Diluire il collagene di tipo 1 (soluzione dalla coda del ratto) 1:50 in 30% v/v etanolo. Per rivestire un piatto da 35 mm, aggiungere 20 μL di collagene a 1 mL di 30% di etanolo.
    2. Coprire il piatto con la soluzione e attendere che tutta la soluzione evapori, lasciando il piatto scoperto per alcune ore. Lavare 3 volte in 1x PBS sterile; lo scivolo di vetro è pronto per la semina cellulare.

5. Assorbimento e vitalità dell'MNP cellulare

  1. Assorbimento cellulare MNP
    1. Preparare il mezzo di crescita di base per la coltura cellulare PC12 aggiungendo il 10% di siero di cavallo (HS), il 5% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di L-glutammina, l'1% di penicillina / streptomicina e lo 0,2% di anbrotericina al mezzo Roswell Park Medical Institute (RPMI) e il filtro utilizzando un filtro in nylon da 0,22 μm.
    2. Aggiungere l'1% di siero di cavallo (HS), l'1% di L-glutammina, l'1% di penicillina/streptomicina e lo 0,2% di anbrotericina al mezzo RPMI per preparare il mezzo di differenziazione PC12 e filtrare utilizzando un filtro in nylon da 0,22 μm.
    3. Coltivare cellule in un pallone da coltura non trattato con 10 ml di mezzo di crescita di base; aggiungere 10 ml di mezzo di crescita di base al pallone ogni 2-3 giorni e sotto-coltura le cellule dopo 8 giorni.
    4. Per l'assorbimento cellulare, centrifugare la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga per 8 minuti a 200 × g e temperatura ambiente e scartare il supernatante.
    5. Rimosi le cellule in 3 mL di nuovo mezzo di crescita di base. Ancora una volta, centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 200 × g e temperatura ambiente e scartare il supernatante. Rimosi le cellule in 3 mL di mezzo di differenziazione fresco.
    6. Aspirare le cellule 10 volte usando una siringa e un ago per rompere i grappoli cellulari. Contare le cellule usando un emocitometro e seminare 106 cellule in un piatto normale non rivestito da 35 mm.
    7. Aggiungere al piatto il volume calcolato della sospensione MNP e il volume del mezzo di differenziazione per ottenere la concentrazione MNP desiderata e il volume totale. Mescolare le celle, gli MNP e il mezzo di differenziazione; incubare il piatto in un incubatore umidificato di CO2 al 5% a 37 °C per 24 ore.
    8. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 200 × g a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Rimescolare le cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione fresco e contare le cellule usando un emocitometro.
  2. Differenziazione delle celle caricate da MNP
    1. Eseguire il protocollo di assorbimento (sezione 5.1). Seed 8 × 104 cellule cariche di MNP su un piatto rivestito di collagene di 35 mm in presenza di mezzo di differenziazione (vedi protocollo di rivestimento del collagene nella sezione 4.1). Dopo 24 ore, aggiungere 1:100 fattore di crescita fresco murino beta-nervosa (β-NGF) (concentrazione finale 50 ng/mL).
    2. Rinnovare il mezzo di differenziazione e aggiungere murine β-NGF ogni 2 giorni. Immagini le cellule ogni 2 giorni usando la microscopia ottica. Dopo la formazione della rete (6-8 giorni per le cellule PC12), immaginiamo le cellule usando la microscopia confocale e osservano la fluorescenza delle particelle.
  3. Saggio di vitalità per le cellule cariche di MNP: test di vitalità cellulare 2,3-bis-(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT).
    1. Preparare il mezzo di crescita di base secondo la fase 5.1.1. Coltivare le cellule PC12 con MNP a diverse concentrazioni (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL nel mezzo di crescita di base) e anche senza MNP per il controllo del tripliceto in una piastra piatta da 96 pomp po ' (volume totale di 100 μL / pozzo). Incubare le cellule per 24 ore in un 5% di CO2,incubatore umidificato a 37 °C.
    2. Preparare pozzi vuoti contenenti supporto senza celle per la correzione dello sfondo. Scongelare la soluzione reagente XTT e la soluzione di reazione contenenteN-metile dibenzopirrazina metile solfato) in un bagno di 37 °C immediatamente prima dell'uso. Ruotare delicatamente fino a ottenere soluzioni chiare.
    3. Per una piastra da 96 po' , mescolare 0,1 mL di soluzione di attivazione con 5 mL di reagente XTT. Aggiungere 50 μL della soluzione di reazione ad ogni pozzo, scuotere leggermente la piastra per una distribuzione uniforme del colorante nei pozzi, quindi incubare la piastra in un'incubatrice per 5 ore.
    4. Misurare l'assorbanza del campione rispetto ai pozzi vuoti utilizzando un lettore elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ad una lunghezza d'onda di 450 nm. Misurare l'assorbanza di riferimento utilizzando una lunghezza d'onda di 630 nm e sottrarla dalla misurazione di 450 nm.
    5. Poiché una leggera assorbanza spontanea si verifica nel mezzo di coltura incubato con il reagente XTT a 450 nm, sottrarre l'assorbanza media dei pozzi vuoti da quella degli altri pozzi. Sottrarre i valori del segnale da campioni paralleli di MNP alle stesse concentrazioni testate dei campioni di cellule.
  4. Test di vitalità per celle caricate con MNP: test di vitalità cellulare basato sulla resazurina
    1. Preparare il mezzo di crescita di base secondo il passaggio 5.1.1. Coltivare le cellule PC12 con MNP a diverse concentrazioni (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL nel mezzo di crescita di base) e senza MNP come controllo in triplice copia in una piastra piatta da 96 po'per 24 ore. Incubare le cellule per 24 ore in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C. Preparare pozzi vuoti contenenti mezzo senza celle.
    2. Lavare le celle con 1x PBS. Aggiungere il reagente a base di resazurina (10% w/v) al mezzo e incubare per 2 ore in un incubatore a 37 °C.
    3. Posizionare 150 μL di aliquote dei campioni nel lettore ELISA e misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 560 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm. Sottrarre i valori del segnale dai campioni paralleli di MNP alle stesse concentrazioni testate dei campioni di cellule.

6. Caratterizzazione della concentrazione di MNP all'interno delle cellule utilizzando plasma accoppiato induttivamente (PIC)

  1. Preparare il mezzo di crescita di base secondo il passaggio 5.1.1. Coltivare le cellule PC12 con MNP a diverse concentrazioni (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL nel mezzo di crescita di base) e senza MNP come controllo in triplice copia in una piastra piatta da 96 po '(volume totale di 100 μL /pozzo). Incubare in un 5% di CO2,incubatore umidificato a 37 °C per 24 ore.
  2. Trasferire la sospensione in un tubo di centrifuga (da ogni pozzo separatamente), centrifugare le celle a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Rimescolare le cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione fresco e contare le cellule usando un emocitometro.
  3. Lenire le cellule per trattamento con 100 μL di acido nitrico al 70% per ogni pozzo separatamente per almeno 15 minuti. Aggiungere 5 mL di DDW alle celle lysed e filtrare le soluzioni.
  4. Misurare la concentrazione di ferro utilizzando ICP e utilizzare il conteggio delle cellule per registrare la concentrazione di Fe per cella.

7. Differenziazione cellulare e crescita su piattaforma magnetica

  1. Pulire il substrato modellato con 70% v/v/ etanolo e posizionare il substrato in un piatto di coltura da 35 mm nel cappuccio. Posizionare un grande magnete (~1500 Oe) sotto il substrato modellato per 1 minuto e rimuovere il magnete spostando prima il piatto su e lontano dal magnete, quindi estraere il magnete dal cappuccio. Accendere la luce ultravioletta per 15 minuti.
  2. Rivestire il substrato con collagene di tipo 1 secondo la sezione 4.2. Sospendere le cellule dopo l'assorbimento cellulare di MNP (sezione 5.1), seminare 105 cellule in un piatto di coltura da 35 mm e aggiungere 2 mL di mezzo di differenziazione. Incubare la coltura in un 5% di CO2,incubatore umidificato a 37 °C.
  3. Dopo 24 ore, aggiungere 1:100 murine fresco β-NGF (concentrazione finale di 50 ng/mL). Rinnovare il mezzo di differenziazione e aggiungere murine β-NGF ogni 2 giorni. Immagini le cellule ogni 2 giorni utilizzando la microscopia ottica e, dopo la formazione della rete, esegui l'immunostaining sulle cellule (sezione 8.1).

8. Colorazione delle celle caricata da MNP

  1. Immunostaining di tubulina
    1. Preparare la soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% mescolando 10 mL di soluzione PFA 16% con 16%, 4 mL di PBS 10x e 26 mL di DDW. Preparare 50 mL di 1% di PBT aggiungendo 500 μL di un tensioattiva non ionico a 50 mL di 1x PBS. Preparare 50 mL di 0,5% di PBT mescolando 25 mL di 1% di PBT con 25 mL di 1x PBS. Preparare la soluzione di blocco mescolando l'1% di albumina di siero bovino e l'1% di siero d'asino normale nello 0,25% di PBT.
      NOTA: Utilizzare PFA solo all'interno della cappa chimica.
    2. Rimuovere il supporto supernatante dalle celle. Fissare le celle caricate con MNP in PFA al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente all'interno di una cappa chimica. Lavare le celle caricate con MNP 3 volte in 1x PBS, 5 min ciascuna lavaggio, all'interno di una cappa chimica.
    3. Permeabilizzare le celle cariche di MNP con 0,5% di PBT per 10 minuti. Incubare le cellule cariche di MNP prima in soluzione di blocco per 45 minuti a temperatura ambiente e poi con anticorpo anti- α-tubulina di coniglio in soluzione di blocco durante la notte a 4 °C. Lavare le celle caricate con MNP 3 volte in 1 PBS, 5 min ciascuna di lavaggio.
    4. Incubare le cellule cariche di MNP con anticorpi secondari anti-coniglio dell'asino coniugato Cy2 per 45 minuti nell'oscurità e a temperatura ambiente. Lavare le celle caricate con MNP 3 volte in 1 PBS, 5 min ciascuna lavaggio.
    5. Eseguire l'imaging confocale. Per la tubulina, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 492 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 510 nm. Per gli MNP (rodiammina), utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 578 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 613 nm.
  2. Colorazione nucleare con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)
    1. Lavare le celle caricate con MNP 3 volte in 1 PBS, 5 min ciascuna lavaggio. Rimuovere il liquido in eccesso intorno al campione, aggiungere 1 goccia (~50 μL) di mezzo di montaggio contenente DAPI per coprire un'area di 22 mm x 22 mm e incubare per 5 minuti nell'oscurità e a temperatura ambiente.
    2. Lavare le celle caricate con MNP 3 volte in 1 PBS, 5 min ciascuna lavaggio. Eseguire l'imaging confocale. Per DAPI, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 358 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 461 nm. Per gli MNP (rodiammina), utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 578 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 613 nm.

9. Misure e analisi statistiche

  1. Analisi morfometrica della differenziazione cellulare caricata da MNP
    1. Per misurare il numero di intersezioni a varie distanze dal corpo cellulare, acquisire immagini di fase di cellule coltivate fino a 3 giorni dopo il trattamento con NGF.
      NOTA: Se fatte in seguito, le celle possono sviluppare reti, impedendo misurazioni della risoluzione a cella singola.
      1. Aprire le immagini nel programma di elaborazione delle immagini ImageJ e utilizzare il plug-in NeuronJ, che consente un tracciamento semiautomatico della neurite e la misurazione dellalunghezza 36. Utilizzando il plug-in tracciante neurite, tracciate le neurite e convertite i dati in immagini binarie. Definire il centro del soma.
      2. Eseguire l'analisi sholl, disponibile nel plug-in NeuronJ. Definite il raggio massimo. Ripeti l'esperimento tre volte. Analizza più di 100 cellule in ogni esperimento.
  2. Analisi della localizzazione cellulare
    1. Per determinare la percentuale di cellule localizzate sull'area magnetica dopo 3 giorni di incubazione, acquisire immagini microscopiche confocali di cellule con e senza assorbimento MNP. Utilizzare la colorazione DAPI (sezione 8.2).
    2. Contare manualmente le celle in cima o parzialmente in cima al modello (toccando le celle) e le celle che non lo sono. Ripetere per tre esperimenti. Analizzare più di 400 celle con MNP e senza assorbimento.
    3. Calcolare la proporzione relativa delle celle che si trovano in cima ai modelli magnetici dal numero totale di celle, con e senza MNP. Inoltre, calcolare la percentuale dell'area effettiva del modello magnetico aggiungendo il diametro del corpo cellulare alla larghezza del modello per determinare la probabilità casuale che le cellule affioro su un modello magnetico.
    4. Eseguire un singolo test Zcampione per analizzare se la distribuzione cellulare è il risultato dell'atterraggio di cellule isotrope, o se c'è una distorsione preferita al modello magnetico.
  3. Analisi della direzionalità della crescita
    1. Per quantificare l'effetto sulla direzionalità della crescita della neurite, acquisire immagini microscopiche confocali delle cellule con e senza trattamento MNP dopo 8 giorni di incubazione. Eseguire la colorazione immuno (sezione 8.1).
    2. Utilizzando il software ImageJ, misurare l'angolo tra la neurite cellulare e le strisce magnetiche in entrambe le condizioni.
      NOTA: Analizza solo i neuriti che provengono da soma situati sulle strisce magnetiche.
    3. Tracciare la distribuzione degli angoli dei neuriti rispetto alla direzione delle strisce (Δθ). Eseguire un test chi quadrato della distribuzione di Δθ per dimostrare che la distribuzione non è normale o uniforme.

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Representative Results

Sono state fabbricate piattaforme magnetiche con diverse forme geometriche(Figura 1A). I modelli magnetici sono stati depositati sputtering: 14 multistrati di Co80Fe20 e Pd, rispettivamente 0,2 nm e 1 nm. La microscopia elettronica ha rivelato che l'altezza totale dei modelli magnetici è di ~18 nm (Figura 1B). Questa esclusiva deposizione multistrato FM crea una piattaforma stabile con anisotropia di magnetizzazione perpendicolare (PMA) rispetto al piano del substrato che consente l'attrazione delle celle cariche di MNP verso l'intero modello magnetico e non soloverso i bordi 22,37. I parametri della struttura multistrato FM sono stati caratterizzati da misurazioni magneto-trasporto per le quali è stato fabbricato un dispositivo a forma di croce di multistrati FM(figura 1C), e la magnetizzazione perpendicolare al substrato è stata misurata attraverso l'effetto sala anomala (AHE)38, dove la resistenza AHE è proporzionale alla magnetizzazione perpendicolare. La misurazione AHE vs campo magnetico ha mostrato un circuito di isteresi indicativo dei ferromagneti PMA (Figura 1C). La magnetizzazione residuare dei multistrati FM (momento magnetico a campo zero) era identica alla saturazione della magnetizzazione (MS)nei campi alti. Inoltre, il campo coercitivo dei multistrati FM era ~ 500 Oe, raggiungendo la saturazione a 1.200 Oe, il che permise una facile magnetizzazione del dispositivo e assicurò la stabilità contro l'influenza di campi magnetici involontari. Il valore MS dei multistrati è stato misurato utilizzando un magnetometro (Figura 1D), come descritto nella sezione 3.1. La MS era di 270 emu/cm3,che è alla pari con le precedenti misurazioni di strutture simili.

Secondo una precedente pubblicazione39,gli MNP diossido di ferrofluorescente (γ-Fe 2 O3)sono stati preparati. I MNP sono stati sintetizzati per nucleazione, inclusa la coniugazione covalente di pellicole sottili a sei strati di ossido di ferro all'isotiocianato di rodiomina e al rivestimento con albumina sierica umana. La dimensione del diametro secco degli MNP era di ~15 nm con potenziale zeta di -45, secondo la misurazione microscopica dell'elettrone di trasmissione. Le misurazioni magnetometriche degli MNP (Figura 2A) mostrano che la curva di magnetizzazione non aveva isteresi, indicando un comportamento superparamagnetico degli MNP, un campo di bassa saturazione di 500 Oe e M S relativamentealto di 22 emu/g. Per controllare la localizzazione cellulare utilizzando schemi magnetici, le celle PC12 sono state incubate in mezzo mescolate con MNP fluorescenti ad ossido di ferro per 24 ore, trasformandole in unità magnetiche. La concentrazione di MNP nel mezzo può essere variata; era di 0,25 mg/mL negli esperimenti di placcatura. Immagini microscopiche confocali sono state scattate dopo la colorazione DAPI (Figura 2B). Gli MNP sono stati interiorizzati nel soma delle cellule PC12, ma non nei nuclei, che è stato riflesso dall'ombra scura al centro. I risultati mostrano che non c'era alcuna florescence rossa nei nuclei, il che indica che i MNP non erano interiorizzati nei nuclei o si erano attaccati alla superficie esterna delle cellule. Utilizzando le misurazioni pic, è stato possibile quantificare le quantità di MNP internalizzate nelle celle PC12. La concentrazione di ferro all'interno delle cellule è aumentata con l'aumento della concentrazione di MNP nel mezzo(Figura 2C).

La vitalità delle cellule PC12 caricate da MNP per diverse concentrazioni di MNP è stata valutata utilizzando saggi basati su XTT e resazurina. La figura 3A mostra le cellule PC12 dopo il trattamento MNP, crescendo e differenziando in cima a un piatto di plastica rivestito di collagene. Per esaminare l'impatto dei MNP internalizzati sulla differenziazione, è stata eseguita la misurazione morfologica sholl. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella morfologia cellulare tra le cellule cariche di MNP e le cellule dicontrollo (t-test, p > 0,05, n = 3) (Figura 3B). L'attività metabolica delle cellule PC12 è stata misurata utilizzando saggi a base di XTT e resazurina dopo l'incubazione cellulare con diverse concentrazioni di MNP. I risultati sono stati normalizzati alla misurazione del controllo delle celle PC12 senza MNP. Queste concentrazioni di MNP non hanno mostrato una citotossicità significativa nei confronti delle cellule, evidente nella mancanza di differenze significative nella vitalità cellulare di nessuno dei preparati(t-test, p > 0,05, n = 3)(figura 3C,D). Gli effetti degli MNP sulla placcatura e sullo sviluppo delle cellule sono stati determinati confrontando le cellule caricate con MNP con celle non caricate, placcate e coltivate su substrati magnetici identici. Le cellule sono state seminate e lasciate aderire al substrato. Ogni 2 giorni, le cellule venivano trattate con mezzo fresco e NGF come descritto nella sezione 7. La figura 4 mostra le cellule PC12 con e senza trattamento MNP, in crescita e differenzianti su un substrato magnetico con strisce larghe 20 μm e spaziatura di 100 μm. Dopo 3 giorni di crescita, le cellule sono state immunostained, macchiate di DAPI e sono state scattate immagini.

Le cellule magnetizzate sono state trovate per attaccarsi ai modelli magnetici e far crescere i rami in base ai modelli, mentre le cellule senza trattamento MNP sono cresciute senza affinità con i dispositivi magnetici(Figura 4A,B). La figura 4C presenta il posizionamento delle cellule e la formazione della rete su un substrato con geometria esagonale di una lunghezza laterale di 200 μm e larghezza della linea di 50 μm. Le celle sono state immagini dopo 6 giorni. Le cellule magnetizzate erano localizzate sul modello magnetico, con affinità simile ai substrati a strisce. Il posizionamento cellulare è stato quantificato contando i corpi cellulari situati sui modelli magnetici o attaccati ad essi. La proporzione relativa di cellule è stata calcolata sulla base della popolazione cellulare totale. Questo è stato fatto per le cellule con e senza trattamento MNP. L'area effettiva della risposta magnetica è stata calcolata aggiungendo il diametro delle cellule (~10 μm per le celle PC12) ad entrambi i bordi del modello magnetico. Per i modelli di banda magnetica, il rapporto di area magnetica effettiva era del 33%, che corrispondeva alla probabilità che le cellule atterrasse casualmente sulle strisce magnetiche. I risultati hanno mostrato che il 75% dei corpi cellulari carichi di MNP erano in contatto con le strisce magnetiche, mentre solo il 35% delle cellule non magnetizzate si trovava sulle strisce (in accordo statistico con una distribuzione imparziale)(figura 4D). L'analisi statistica ha indicato che la misurazione non è stata derivata dall'atterraggio arbitrario di cellule (test za un campione, p < 10-6, n = 430).

Al contrario, l'analisi statistica degli esagoni magnetici ha rivelato che il 92% del soma delle cellule cariche di MNP era attaccato ai modelli magnetici, rispetto al 38% per le cellule senza trattamento MNP (Figura 4E). Il rapporto di area effettiva degli esagoni era del 32% del substrato. L'analisi statistica per gli esagoni ha anche indicato che la misurazione non è stata derivata dal pianerottolo cellulare arbitrario (test z a uncampione, p < 10-6, n = 370). I risultati hanno rivelato una chiara preferenza delle celle cariche di MNP per il modello magnetico, mentre le cellule senza MNP hanno aderito casualmente all'intero substrato. Oltre all'effetto di posizionamento cellulare, queste piattaforme magnetiche controllano anche la direzionalità dei neuriti in crescita. La figura 5A mostra le celle cariche di MNP con neuriti, allineandosi in base all'orientamento delle strisce. Al contrario, la misurazione del controllo delle cellule senza MNP ha mostrato una crescita di neurite attraverso la piattaforma indipendentemente dai modelli magnetici.

Per valutare l'effetto magnetico sulla direzionalità della crescita neuronale, è stato misurato l'angolo tra i neuriti e le strisce magnetiche. I dati hanno rivelato che l'80% dei neuriti delle cellule cariche di MNP mostrava correlazione con l'orientamento delle strisce magnetiche, entro Δθ < 15° rispetto alla direzione delle strisce. Tuttavia, solo il 32% dei neuriti di cellule senza MNP si è sviluppato in quell'intervallo. Le cellule senza trattamento MNP non hanno mostrato alcuna correlazione con le strisce magnetiche e sono cresciute secondo una distribuzione uniforme dell'angolo(figura 5B). L'analisi statistica della distribuzione di Δθ ha rivelato che non era normale o uniforme (test chi quadrato, p < 0,001). È stato dimostrato anche l'effetto della geometria esagonale sulla crescita della neurite. La figura 5C mostra immagini a fluorescenza dello sviluppo di reti neurali di cellule PC12 magnetizzate e non magnetizzate in cima a un modello magnetico di esagoni e grandi cerchi tra i bordi. La lunghezza laterale dell'esagono era di 200 μm e la larghezza delle linee era di 10 μm; il diametro del cerchio era di 30 μm. I somi cellulari mostravano un'alta affinità per i cerchi e sviluppavano una rete neurale ben orientata lungo i contorni esagonali. Un'immagine zoom-in mostra le celle attaccate a un cerchio magnetico e i neuriti che crescono lungo tali contorni (Figura 5D).

Figure 1
Figura 1: Caratterizzazione dei dispositivi magnetici. (A) Immagini microscopiche ottiche di dispositivi magnetici con varie forme geometriche. Barra di scala = 200 μm. (B) Scansione dell'immagine microscopica elettronica di Co80Fe20/Pd multistrato e schema dei multistrati. L'altezza totale dei modelli magnetici è di 18 nm. Barra di scala = 100 nm. (C) Misurazione dell'effetto Hall anomalo del dispositivo magnetico che mostra i campi magnetici coercitivi e remnant dell'FM. (D) La magnetometria del dispositivo multistrato mostra il valore di saturazione della magnetizzazione calcolato per volume. Questa cifra è stata modificata da Marco etal. Abbreviazioni: AHE = Effetto Sala anomala; FM = ferromagnetico; B = campo magnetico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Assorbimento cellulare PC12 dei MNP. (A) Misurazione magnetometrica dei MNP a temperatura ambiente. (B) Immagine di microscopia confocale dell'assorbimento MNP da parte delle celle PC12. Nuclei macchiati di DAPI; Gli MNP etichettati con rodiammina entrano nelle cellule. Barra di scala = 10 μm (C) Misurazione IPCA dell'ossido di ferro interiorizzato MNP (pg) da parte delle cellule PC12 dopo 24 ore di incubazione con diverse concentrazioni di MNP. Questa cifra è stata modificata da Marco etal. Abbreviazioni: MNPs = nanoparticelle magnetiche; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; PIC = plasma accoppiato induttivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Vitalità cellulare PC12 caricata da MNP. (A) Immagini microscopiche confocali di cellule PC12 differenziate incubate con MNP. (B) Analisi sholl della crescita della neurite delle cellule PC12 dopo 3 giorni di differenziazione. (C) Saggio di vitalità XTT delle cellule PC12 trattate con concentrazioni crescenti di MNP dopo 24 ore di incubazione. Le misure sono normalizzate per il controllo. (D) Saggio di vitalità a base di resazurina delle cellule PC12 trattate con concentrazioni crescenti di MNP dopo 24 ore di incubazione. Le misure sono normalizzate per il controllo. Non vi è alcuna significatività statistica in entrambe le analisi. Questa cifra è stata modificata da Marco etal. Abbreviazioni: MNPs = nanoparticelle magnetiche; XTT = 2,3-bis-(2-metossi-4-nitro-5-solfofenil)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Localizzazione cellulare in cima a dispositivi magnetici. (A) Immagini fluorescenti di celle PC12 cariche di MNP che crescono sulle strisce magnetiche: (i) etichettatura α-tubulina, (ii) colorazione DAPI e (iii) immagine unita. Barra di scala = 100 μm. (B) Immagini fluorescenti di cellule PC12 senza trattamento MNP, che crescono sopra le strisce magnetiche come in (A). (C) Immagini a fluorescenza di celle PC12, con e senza MNP, sul modello magnetico esagonale. Barra di scala = 200 μm. (D) Percentuale di corpi cellulari, con e senza MNP, situati sulle strisce magnetiche. Le barre di errore rappresentano una deviazione standard. La linea tratteggiata rappresenta la probabilità che le cellule arovano sulle strisce magnetiche. (E) Percentuale di corpi cellulari, con e senza MNP, situati sugli esagoni magnetici. Le barre di errore rappresentano una deviazione standard. La linea tratteggiata rappresenta la probabilità che le cellule arovano sui modelli magnetici per una distribuzione casuale. Non vi è alcuna significatività statistica in entrambe le analisi. Questa cifra è stata modificata da Marco etal. Abbreviazioni: MNPs = nanoparticelle magnetiche; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Direzionalità della rete neuronale. (A) Immagini microscopiche confocali di cellule PC12 etichettate α-tubulina con trattamento MNP (a sinistra) e senza trattamento MNP (a destra), in crescita in cima a strisce magnetiche. Le strisce sono contrassegnate. (B) Gli istogrammi polari presentano l'effetto direzionalità della neurite sulle cellule PC12 (a sinistra) con trattamento MNP e (a destra) senza trattamento MNP. La deviazione dell'angolo di orientamento è definita come la differenza nell'angolo tra i neuriti e l'orientamento della banda magnetica (bidoni a 15°). (C) Immagini a fluorescenza di cellule PC12 coltivate in cima a un modello esagonale magnetico, (a sinistra) con trattamento MNP e (a destra) senza trattamento MNP. Barra di scala = 200 μm. (D) Immagine zoom-in di una cella magnetizzata che sviluppa neuriti secondo il modello magnetico. Barra di scala = 30 μm. Questa cifra è stata modificata da Marco etal. Abbreviazione: MNPs = nanoparticelle magnetiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I risultati rappresentativi dimostrano l'efficacia della metodologia presentata per il controllo e l'organizzazione della formazione della rete neuronale su scala micron. Le celle PC12 caricate da MNP rimasero vitali e furono trasformate in unità sensibili magnetiche che furono attratte dalle forze magnetiche dagli elettrodi FM a siti specifici. Ciò è dimostrato al meglio nella figura 5C, dove le cellule hanno aderito preferenzialmente ai vertici più grandi degli esagoni e non alle linee sottili. Inoltre, la ramificazione delle cellule si sviluppò favorevolmente seguendo i modelli magnetici. Tutti gli esperimenti di controllo dimostrano inequivocabilmente che le forze magnetiche hanno diretto la localizzazione dei corpi cellulari e delle crescita. Sebbene sia stato dimostrato che i segnali topografici possono essere utilizzati per dirigere la crescita della neurite40,41, questo non è il caso qui, poiché le celle senza MNP non hanno mostrato alcuna risposta alla forma del modello.

Un approccio dal basso verso l'alto è stato impiegato per progettare le forze magnetiche locali, utilizzando la fotolitografia standard e le deposizioni sputtering disponibili in molte strutture di ricerca, facilitando l'adozione di queste tecniche da parte di molti ricercatori. L'approccio bottom-up consente la libertà nella progettazione di modelli e forme complessi in base alle esigenze dei ricercatori, con risoluzione su scala micron per le aree di lunghezza dei centimetri. Sebbene i risultati siano stati dimostrati su vetrini, in linea di principio, è possibile preparare i dispositivi in cima ad altri materiali biocompatibili adatti ad applicazioni terapeutiche in vivo come array di elettrodi flessibili per la registrazione e lastimolazione neuronale 42,43.

Queste piattaforme PMA uniche, raggiunte dalla deposizione multistrato, producono un forte campo magnetico lungo l'intero modello magnetico e non solo sui bordi, come osservatoin precedenza 22. Inoltre, gli FMs sono stati progettati con una grande saturazione di magnetizzazione residua, cioè, anche quando il campo magnetico esterno viene rimosso, gli elettrodi rimangono completamente magnetizzati e continuano ad attrarre le cellule senza la necessità di un magnete esterno. Tuttavia, una forza magnetica esterna può aiutare a magnetizzare completamente gli MNP nelle cellule, aumentando così la forza di attrazione ed efficienza durante la placcatura. Una considerazione importante nel design FM era il numero di ripetizioni. Mentre una maggiore ripetizione aumenterà il momento magnetico totale, il che è favorevole, l'aggiunta di molti strati aumenterà anche l'intermixing dello strato, causando PMA meno stabile e infine si tradurrà in una magnetizzazione in piano44,45 asse facile e attrazione a diversi bordi degli elettrodi22,37. Pertanto, è necessario ottimizzare il numero FM e la composizione dei multistrati per garantire PMA stabile con campi magnetici massimi.

I MNP presentati nei risultati rappresentativi non hanno mostrato quasi alcuna tossicità verso le cellule PC12 alle concentrazioni testate, né hanno influenzato il comportamento cellulare, nonostante siano stati in grado di entrare nelle cellule e abbiano un momento magnetico relativamente alto. La forza di attrazione su una cellula dipende dal numero di MNP nella cellula e dalla magnetizzazione di ogni MNP. Idealmente, entrambi dovrebbero essere alti; tuttavia, potrebbe esserci un compromesso tra i due. Con alcuni parlamentari commerciali, la vitalità cellulare era buona, ma il momento magnetico era troppo debole. Per altre particelle fabbricate in laboratorio, il momento magnetico era alto, ma gli MNP tendevano ad aggregarsi e la vitalità cellulare era bassa. Pertanto, è importante testare la vitalità delle cellule e caratterizzarne la magnetizzazione quando si scelgono gli MNP. Anche gli MNP utilizzati qui sono fluorescenti, il che rende facile tracciare la loro posizione nelle celle. I risultati mostrano neuriti che si sviluppano in base alla forma del modello magnetico, e la fluorescenza indica la presenza di MNP lungo i neuriti.

Il meccanismo di internalizzazione dei MNP nelle celle è stato precedentemente studiato46. L'assorbimento cellulare dei MNP avviene tramite endocitosi in base alle loro dimensioni, forma e chimica delle superfici. Studi precedenti hanno esaminato l'assorbimento di diversi tipi di MNP nei neuroni24; l'assorbimento cellulare dei parlamentari rivestiti era migliore dell'assorbimento cellulare dei parlamentari non rivestiti. Come mostrato nella figura 3A, B, gli MNP sono stati interiorizzati nel citoplasma, ma sono rimasti al di fuori dei nuclei e sono stati trasferiti ai neuriti durante il loro sviluppo. Inoltre, i MNP coniugati con NGF che attivavano la via di segnalazione NGF sono stati internalizzati anche nelle cellule tramite endocitosi47,48.

Per concludere, questo documento presenta un efficace strumento di manipolazione magnetica per la ricerca che richiede l'organizzazione di elementi biologici. L'uso di forze magnetiche consente il posizionamento delle cellule, dirigendo la crescita della neurite. Questo metodo consente la progettazione di piattaforme con forme geometriche complesse. Le forze dell'attrazione magnetica possono essere progettate per manipolare la formazione della rete neurale da remoto cambiando il panorama della forza magnetica nel tempo. L'intera metodologia può essere facilmente estesa per controllare altri fattori o sostanze chimiche che possono essere accoppiati ai MNP e portarli in punti di interesse predesignati, il tutto con risoluzione su scala micron.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta dal Ministero della Scienza & Tecnologia, Israele, e dalla Israeli Science Foundation (569/16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

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References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

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Bioingegneria Numero 173 nanoparticelle magnetiche anisotropia di magnetizzazione perpendicolare (PMA) somministrazione di farmaci magnetici mirati manipolazione di cellule magnetiche coltura neurale ingegneria neurale bio-interfacciamento fotolitografia multistrato magnetico
Fabbricazione di piattaforme magnetiche per l'organizzazione su scala micron di neuroni interconnessi
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Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

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