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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Fabricação de plataformas magnéticas para organização em escala de micron de neurônios interligados

Published: July 14, 2021 doi: 10.3791/62013
Automatic Translation
1,4, 2,4, 2,4, 1,4, 2,4, 2,4, 3,4, 2,4, 1,4
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Summary

Este trabalho apresenta uma abordagem de baixo para cima para a engenharia de forças magnéticas locais para o controle da organização neuronal. Células semelhantes a neurônios carregadas com nanopartículas magnéticas (MNPs) são banhadas no topo e controladas por uma plataforma micro-padronizada com magnetização perpendicular. Também são descritas caracterização magnética, captação celular MNP, viabilidade celular e análise estatística.

Abstract

A capacidade de direcionar neurônios para redes neurais organizadas tem grandes implicações para medicina regenerativa, engenharia de tecidos e bio-interligação. Muitos estudos têm como objetivo direcionar neurônios usando pistas químicas e topográficas. No entanto, os relatos de controle organizacional em escala de micron sobre grandes áreas são escassos. Aqui, um método eficaz foi descrito para colocar neurônios em locais predefinidos e orientar o crescimento neuronal com resolução em escala de micron, usando plataformas magnéticas incorporadas com elementos magnéticos micro-padronizados. Foi demonstrado que carregar neurônios com nanopartículas magnéticas (MNPs) os converte em unidades magnéticas sensíveis que podem ser influenciadas por gradientes magnéticos. Após essa abordagem, uma plataforma magnética única foi fabricada na qual as células PC12, um modelo comum semelhante a neurônios, foram banhadas e carregadas com nanopartículas superparammagnéticas. Filmes finos de multicamadas ferromagnéticas (FM) com magnetização perpendicular estável foram depositados para fornecer forças de atração eficazes em direção aos padrões magnéticos. Estas células PC12 carregadas de MNP, banhadas e diferenciadas no topo das plataformas magnéticas, foram preferencialmente ligadas aos padrões magnéticos, e o crescimento de neurita estava bem alinhado com a forma de padrão, formando redes orientadas. São apresentados métodos quantitativos de caracterização das propriedades magnéticas, captação de MNP celular, viabilidade celular e análise estatística dos resultados. Essa abordagem permite o controle da formação da rede neural e melhora a interface neurônio-eletrodo através da manipulação de forças magnéticas, que pode ser uma ferramenta eficaz para estudos in vitro de redes e pode oferecer novas direções terapêuticas biointerfacing.

Introduction

A micropatters de neurônios tem grande potencial para a regeneração tecidual1,2,3,4,5 e o desenvolvimento de dispositivos neuroeletráticos6,7,8. No entanto, o posicionamento em escala de micron de neurônios em alta resolução espacial, como nos tecidos biológicos, representa um desafio significativo. A formação de estruturas pré-escaladas nesta escala requer a orientação dos processos de células nervosas controlando localmente a soma motilidade e o crescimento axonal. Estudos anteriores sugeriram o uso de pistas químicas e físicas9,10,11,12 para orientar o crescimento neuronal. Aqui, uma nova abordagem se concentra no controle do posicionamento celular por gradientes de campo magnético13,14,15,16,17, transformando células carregadas com MNPs em unidades sensíveis ao magnético, que podem ser remotamente manipuladas.

Kunze et al., que caracterizaram a força necessária para induzir respostas celulares usando células magnéticas carregadas de chip e MNP, provaram que o alongamento axonal precoce pode ser desencadeado pela tensão mecânica dentro das células18. Tay et al. confirmaram que substratos micro-fabricados com gradientes de campo magnético aprimorados permitem a estimulação sem fio de circuitos neurais dosados com MNPs usando corantes indicadores de cálcio19. Além disso, Tseng et al. coalesced nanopartículas dentro das células, resultando em forças localizadas mediadas por nanopartículas que se aproximavam da tensão celular20. Isso levou à fabricação de padrões definidos de substratos micromagnéticos que ajudaram a estudar a resposta celular às forças mecânicas. A tensão celular decorrente da aplicação de forças localizadas mediadas por nanopartículas foi alcançada por nanopartículas de coalizão dentro das células20. Um sistema híbrido complementar de óxido de metal (CMOS) microfluidic foi desenvolvido por Lee et al. que incorporaram uma matriz de micro-eletroímãs no chip CMOS para controlar o movimento de células individuais marcadas com contas magnéticas21.

Alon et al. usaram almofadas magnéticas em microescala, pré-programadas como "pontos quentes" magnéticos para localizar células22. Atividade específica também poderia ser estimulada dentro de células usando matrizes magnéticas micro-padronizadas para localização de nanopartículas em locais subcelulares específicos23. A absorção de MNP celular foi demonstrada com sucesso nos neurônios primários de sanguessuga, rato e rato24,25,26. Aqui, isso foi demonstrado em uma linha celular de feocromocitoma pc12 rato, que foi relatado anteriormente para mostrar alta absorção de MNPs27. Nos últimos anos, houve diversas aplicações médicas de MNPs, incluindo entrega de medicamentos e termoterapia em tratamentos oncológicos28,29,30,31. Especificamente, os estudos tratam da aplicação de MNPs e redes de neurônios32,33,34,35. No entanto, a organização magnética de neurônios usando MNPs em um nível de célula única merece uma investigação mais aprofundada.

Neste trabalho, uma abordagem de baixo para cima foi descrita para projetar forças magnéticas locais através de plataformas pré-projetadas para controlar o arranjo neuronal. A fabricação de padrões em escala de micron de multicamadas FM foi apresentada. Esta estrutura multicamadas FM única cria magnetização perpendicular estável que resulta em forças de atração eficazes em direção a todos os padrões magnéticos. Via incubação, os MNPs foram carregados em células PC12, transformando-as em unidades sensíveis magnéticas. As células carregadas de MNP, banhadas e diferenciadas no topo das plataformas magnéticas, eram preferencialmente ligadas aos padrões magnéticos, e o crescimento de neurita estava bem alinhado com a forma de padrão, formando redes orientadas. Vários métodos foram descritos para caracterizar as propriedades magnéticas das multicamadas FM e dos MNPs, e técnicas de captação de MNP celular e ensaios de viabilidade celular também foram apresentadas. Além disso, parâmetros morfométricos de crescimento neuronal e análise estatística dos resultados são detalhados.

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Protocol

NOTA: Realize todas as reações biológicas em um armário de biossegurança.

1. Fabricação de plataformas magnéticas

  1. litografia
    1. Corte os slides de vidro em 2 x 2 cm2 usando uma caneta escribra. Limpe as lâminas de vidro em acetona e, em seguida, isopropanol por 5 min cada em um banho de ultra-sônicação. Seque com nitrogênio de pureza ultra-alta (UHP).
    2. Cubra o vidro com fotoresistia usando revestimento de spin a 6.000 rpm por 60 s, para atingir 1,5 μm de espessura, e asse a 100 °C por 60 s. Exponha a amostra a uma fonte de luz, usando um comprimento de onda apropriado para fotoresist, com um padrão desejado, usando uma máscara ou litografia sem máscara.
    3. Desenvolver para 40 s em um desenvolvedor, diluído em água destilada (DW) de acordo com as instruções do fabricante; lavar em DW para 45 s, e secar com gás nitrogênio UHP. Inspecione o padrão sob um microscópio óptico.
  2. Depoimento de Sputter
    1. Insira a amostra na câmara principal do sistema de deposição e aguarde a pressão base (~5 × 10-8 Torr). Abra o fluxo de gás; definir o fluxo de argônio para sputtering padrão (28 sccm [cm cúbico padrão por min) aqui. Aclaça os alvos do sputter e, em seguida, coloque a pressão do sputter para 3 mTorr.
    2. Aumente a potência em cada alvo até que a taxa desejada seja alcançada.
      NOTA: Taxa de PD: 0,62 A/s = 1,0 nm em 16 s; Co80Fe20 Taxa: 0,32 A/s, 0,2 nm em 6,25 s.
    3. Ligue a rotação. Deposite a multicamadas FM, alternando entre as metas Co80Fe20 e Pd, abrindo e fechando as persianas alvo, respectivamente. Deposite 14 bicamadas de Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm), e finalize com uma camada adicional de tampa de Pd de 2 nm.
    4. Decolagem: Mergulhe a amostra em acetona por 30 minutos e enxágue com isopropanol. Em seguida, seque com nitrogênio UHP, e mantenha a amostra em um ambiente limpo e seco até usar.

2. Caracterização do dispositivo magnético através de medições de transporte

  1. Use um substrato Si ou lâmina de vidro com uma barra magnética em forma cruzada de 100 μm de largura, depositada com multicamadas FM (ver 1C inset). Conecte a amostra ao suporte usando fita dupla face.
  2. Usando um conectador de arame, ligue 4 fios à amostra, um em cada perna do eletrodo cruzado. Defina o porta-amostras e a amostra dentro do sistema de medição de transporte com um campo magnético para que o campo magnético seja perpendicular à amostra. Realizar medições em temperatura ambiente.
  3. Realizar a medição da tensão transversal (VT)do dispositivo; seguir as marcas na Figura 1C (inset): aplicar uma corrente de 1 mA entre os contatos 1 e 3; medir o VT entre os contatos 2 e 4; em seguida, aplique uma corrente entre 2 e 4 e meça a tensão entre 1 e 3. Por fim, calcule a diferença entre as tensões das medições e divida por 2 para obter VT. Use um sistema de comutação para alterar automaticamente entre as duas configurações de medição.
  4. Varrer o campo magnético entre 0,4 T e -0,4 T em passos de 5 mT e medir o VT em função do campo. Plote a resistência transversal (VT/I) vs. o campo magnético para determinar o sinal de Hall anômeo, que é proporcional à magnetização perpendicular no filme.

3. Caracterização de MNPs e multicamadas magnéticas por medições de magnetometria

  1. Medição magnetométrica para multicamadas FM
    1. Deposite a multicamadas FM no substrato Si (ver seção 1.2). Corte a amostra em 6 quadrados de tamanho de 4 x 4 mm2. Empilhe as amostras uma em cima da outra e organize-as na cápsula perpendicular à direção do campo magnético (ver 1D inset da Figura 1D).
    2. Insira a cápsula no magnetômetro e meça a magnetização à temperatura ambiente. Varrer o campo magnético entre -0,4 T e 0,4 T.
    3. Calcule o volume total do material magnético, considerando a espessura da camada magnética, o tamanho das amostras e o número de substratos. Divida a magnetização pelo volume total do material magnético.
    4. Plote a magnetização (por volume de unidade) versus o campo magnético. Subtrair o fundo diamagnético do substrato a partir da resposta de campo magnético elevado e extrapolar a magnetização de saturação da FM do gráfico.
  2. Medição magnetométrica para MNPs
    1. Insira uma massa designada de MNPs em uma cápsula de polímero sintético. Considere um volume maior se medir pequenos valores de saturação de magnetização.
    2. Se os MNPs forem suspensos em um solvente, seque os MNPs deixando a cápsula aberta durante a noite. Insira a cápsula no magnetômetro e meça a magnetização à temperatura ambiente. Varrer o campo magnético entre -0,2 T e 0,2 T.
    3. Calcule a massa total dos MNPs multiplicando o volume designado pela concentração de partículas. Normalize os resultados para 1 g.
    4. Plote a magnetização normalizada (por grama) versus o campo magnético. Extrapolar a saturação de magnetização dos MNPs do gráfico.

4. Protocolo de revestimento de colágeno

  1. Revestimento de pratos plásticos
    1. Prepare 0,01 M HCl adicionando 490 μL de HCl a 500 mL de água autoclavada dupla destilada (DDW).
      NOTA: Realize esta etapa apenas na coifa química.
    2. Colágeno diluído tipo 1 (solução da cauda de rato) 1:60-1:80 em 0,01 M HCl para obter a concentração final de trabalho de 50 μg/mL. Coloque 1,5 mL da solução diluída em um prato de cultura de 35 mm. Deixe o prato no capô por 1h, coberto.
    3. Remova a solução e lave 3x em salina estéril tamponada com fosfato (PBS). O prato está pronto para semeadura celular.
  2. Lâminas de vidro de revestimento
    1. Diluir o colágeno tipo 1 (solução da cauda de rato) 1:50 em 30% v/v de etanol. Para revestir um prato de 35 mm, adicione 20 μL de colágeno a 1 mL de 30% de etanol.
    2. Cubra o prato com a solução, e espere até que toda a solução evaporar, deixando o prato descoberto por algumas horas. Lave 3x em 1x PBS estéril; o slide de vidro está pronto para semeadura celular.

5. Captação e viabilidade de MNP celular

  1. Captação de MNP celular
    1. Prepare o meio básico de crescimento para a cultura celular PC12 adicionando 10% de soro de cavalo (SH), 5% de soro bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina e 0,2% de anfotericina ao meio do Roswell Park Medical Institute (RPMI) e filtro usando um filtro de nin nin alumínio de 0,22 μm.
    2. Adicione 1% de soro de cavalo (HS), 1% L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina e 0,2% de anfotericina ao meio RPMI para preparar o meio de diferenciação do PC12 e filtro usando um filtro de ninfa de 0,22 μm.
    3. Cultivar células em um frasco de cultura não tratada com 10 mL de meio básico de crescimento; adicionar 10 mL de meio de crescimento básico ao frasco a cada 2-3 dias, e subcultura as células após 8 dias.
    4. Para captação celular, centrifugar a suspensão celular em um tubo de centrífuga por 8 min a 200 × g e temperatura ambiente, e descartar o sobrenante.
    5. Resuspense as células em 3 mL de meio de crescimento básico fresco. Novamente, centrifugar a suspensão celular por 5 min a 200 × g e temperatura ambiente, e descartar o supernasce. Resuspense as células em 3 mL de meio de diferenciação fresco.
    6. Aspire as células 10x usando uma seringa e uma agulha para quebrar aglomerados celulares. Conte as células usando um hemótmetro, e sementes 106 células em um prato regular não revestido de 35 mm.
    7. Adicione ao prato o volume calculado de suspensão MNP e volume de meio de diferenciação para alcançar a concentração MNP desejada e o volume total. Misturar as células, MNPs e meio de diferenciação; incubar o prato em uma incubadora umidificada de CO2 de 5% a 37 °C por 24 h.
    8. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 200 × g à temperatura ambiente, e descartar o sobrenatante. Resuspend as células em 1 mL de meio de diferenciação fresco, e conte as células usando um hemótmetro.
  2. Diferenciação celular carregada por MNP
    1. Executar o protocolo de captação (seção 5.1). Semente 8 × 10 células carregadas de4 MNP em um prato revestido de colágeno de 35 mm na presença de meio de diferenciação (ver protocolo de revestimento de colágeno na seção 4.1). Após 24 h, adicione 1:100 novo fator de crescimento beta-nervo murine (β-NGF) (concentração final 50 ng/mL).
    2. Renove o meio de diferenciação e adicione murine fresco β-NGF a cada 2 dias. Imagem das células a cada 2 dias usando microscopia óptica. Após a formação da rede (6-8 dias para células PC12), imagem as células usando microscopia confocal, e observe a fluorescência das partículas.
  3. Ensaio de viabilidade para células carregadas de MNP: 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) teste de viabilidade celular.
    1. Prepare o meio básico de crescimento de acordo com a etapa 5.1.1. Cultivar as células PC12 com MNPs em diferentes concentrações (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL em meio de crescimento básico) e também sem MNPs para o controle em triplicado em uma placa plana de 96 poços (volume total de 100 μL/well). Incubar as células por 24 h em um CO2de 5%, incubadora umidificada a 37 °C.
    2. Prepare poços em branco contendo meio sem células para correção de fundo. Descongele a solução de reagente XTT e a solução dereação contendo sulfato de metila) em um banho de 37 °C imediatamente antes do uso. Gire suavemente até obter soluções claras.
    3. Para uma placa de 96 poços, misture 0,1 mL de solução de ativação com 5 mL de reagente XTT. Adicione 50 μL da solução de reação a cada poço, agite ligeiramente a placa para uma distribuição uniforme do corante nos poços e, em seguida, incubar a placa em uma incubadora por 5h.
    4. Meça a absorvância da amostra contra os poços em branco usando um leitor de ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) a um comprimento de onda de 450 nm. Meça a absorvância de referência usando um comprimento de onda de 630 nm e subtraia-a da medição de 450 nm.
    5. Como uma leve absorvância espontânea ocorre no meio de cultura incubado com o reagente XTT a 450 nm, subtrair a absorção média dos poços em branco dos outros poços. Subtrair valores de sinal de amostras paralelas de MNPs nas mesmas concentrações testadas que as amostras de células.
  4. Ensaio de viabilidade para células carregadas de MNP: teste de viabilidade celular baseado em resazurina
    1. Prepare o meio de crescimento básico de acordo com a etapa 5.1.1. Cultivar as células PC12 com MNPs em diferentes concentrações (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL em meio de crescimento básico) e sem MNPs como controle em triplicado em uma placa plana de 96 poços por 24 horas. Incubar as células por 24 h em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C. Prepare poços em branco contendo meio sem células.
    2. Lave as células com 1x PBS. Adicione o reagente à base de resazurina (10% c/v) ao médio e incubar por 2h em uma incubadora de 37 °C.
    3. Coloque 150 alíquotas de μL das amostras no leitor ELISA e meça a absorvância em um comprimento de onda de excitação de 560 nm e comprimento de onda de emissão de 590 nm. Subtrair os valores de sinal das amostras paralelas de MNPs nas mesmas concentrações testadas que as amostras de células.

6. Caracterização da concentração de MNP dentro das células usando plasma acoplado indutivamente (ICP)

  1. Prepare o meio de crescimento básico de acordo com a etapa 5.1.1. Cultivar as células PC12 com MNPs em diferentes concentrações (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL em meio de crescimento básico) e sem MNPs como controle em triplicado em uma placa plana de 96 poços (volume total de 100 μL/well). Incubar em 5% de CO2, incubadora umidificada a 37 °C por 24 h.
  2. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga (de cada poço separadamente), células centrífugas a 200 × g por 5 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenante. Resuspend as células em 1 mL de meio de diferenciação fresco, e conte as células usando um hemótmetro.
  3. Lise as células por tratamento com 100 μL de ácido nítrico de 70% para cada poço separadamente por pelo menos 15 minutos. Adicione 5 mL de DDW às células líssedas e filtre as soluções.
  4. Meça a concentração de ferro usando ICP e use a contagem celular para registrar concentração fe por célula.

7. Diferenciação celular e crescimento em plataforma magnética

  1. Limpe o substrato padronizado com 70% v/v/ etanol e coloque o substrato em um prato de cultura de 35 mm no capô. Coloque um grande ímã (~1500 Oe) abaixo do substrato padronizado por 1 min e remova o ímã movendo primeiro o prato para cima e para longe do ímã, e depois tire o ímã do capô. Ligue a luz ultravioleta por 15 minutos.
  2. Cubra o substrato com colágeno tipo 1 de acordo com a seção 4.2. Suspenda as células após a captação de MNP celular (seção 5.1), semente 105 células em um prato de cultura de 35 mm e adicione 2 mL de meio de diferenciação. Incubar a cultura em 5% de CO2,incubadora umidificada a 37 °C.
  3. Após 24 h, adicione 1:100 murine fresco β-NGF (concentração final de 50 ng/mL). Renove o meio de diferenciação e adicione murine fresco β-NGF a cada 2 dias. Imagem das células a cada 2 dias usando microscopia leve, e após a formação da rede, realiza imunossagens nas células (seção 8.1).

8. Coloração celular carregada por MNP

  1. Imunostaining tubulin
    1. Prepare 4% de solução paraformaldeída (PFA) misturando 10 mL de solução PFA de 16% c/v, 4 mL de PBS 10x e 26 mL de DDW. Prepare 50 mL de 1% PBT adicionando 500 μL de um surfactante não iônico a 50 mL de 1x PBS. Prepare 50 mL de 0,5% PBT misturando 25 mL de 1% PBT com 25 mL de 1x PBS. Prepare a solução de bloqueio misturando 1% de albumina de soro bovino e 1% de soro de burro normal em 0,25% PBT.
      NOTA: Use PFA somente dentro da capa química.
    2. Remova o meio supernante das células. Fixar as células carregadas de MNP em 4% pfa por 15 minutos à temperatura ambiente dentro de um capô químico. Lave as células carregadas de MNP 3x em 1x PBS, 5 min cada lavagem, dentro de uma capa química.
    3. Permeabilize as células carregadas de MNP com 0,5% de PBT por 10 min. Incubar as células carregadas de MNP primeiro na solução de bloqueio por 45 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, com anticorpo anti-α-tubulin de coelho na solução de bloqueio durante a noite a 4 °C. Lave as células carregadas de MNP 3x em 1x PBS, 5 min cada lavagem.
    4. Incubar as células carregadas de MNP com anticorpo anti-coelho de burro conjugado Cy2 por 45 minutos na escuridão e à temperatura ambiente. Lave as células carregadas de MNP 3x em 1x PBS, 5 min cada lavagem.
    5. Realize imagens confocal. Para tubulina, use um comprimento de onda de excitação de 492 nm e um comprimento de onda de emissão de 510 nm. Para os MNPs (rhodamina), use um comprimento de onda de excitação de 578 nm e um comprimento de onda de emissão de 613 nm.
  2. Coloração nuclear com 4′,6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI)
    1. Lave as células carregadas de MNP 3x em 1x PBS, 5 min cada lavagem. Remova o excesso de líquido ao redor da amostra, adicione 1 gota (~50 μL) de meio de montagem contendo DAPI para cobrir uma área de 22 mm x 22 mm, e incubar por 5 minutos na escuridão e à temperatura ambiente.
    2. Lave as células carregadas de MNP 3x em 1x PBS, 5 min cada lavagem. Realize imagens confocal. Para DAPI, use um comprimento de onda de excitação de 358 nm e um comprimento de onda de emissão de 461 nm. Para os MNPs (rhodamina), use um comprimento de onda de excitação de 578 nm e um comprimento de onda de emissão de 613 nm.

9. Medições e análises estatísticas

  1. Análise morfométrica da diferenciação celular carregada de MNP
    1. Para medir o número de intersecções a várias distâncias do corpo celular, adquira imagens de fase de células cultivadas até 3 dias após o tratamento com NGF.
      NOTA: Se feitas mais tarde, as células podem desenvolver redes, impedindo medições de resolução unicelular.
      1. Abra as imagens no programa de processamento de imagens, ImageJ, e use o plug-in NeuronJ, que permite um rastreamento de neurite semiautomático e medição de comprimento36. Usando o plug-in do rastreador neurite, rastreie os neurites e converta os dados em imagens binárias. Defina o centro da soma.
      2. Realize a análise de Sholl, disponível no plug-in NeuronJ. Defina o raio máximo. Repita o experimento três vezes. Analise mais de 100 células em cada experimento.
  2. Análise de localização celular
    1. Para determinar a porcentagem de células localizadas na área magnética após 3 dias de incubação, adquira imagens microscópicas confocal de células com e sem absorção de MNP. Use a coloração DAPI (seção 8.2).
    2. Conte manualmente as células no topo ou parcialmente em cima do padrão (células de toque) e das células que não são. Repita para três experimentos. Analise mais de 400 células com MNP e sem absorção.
    3. Calcule a proporção relativa das células que estão no topo dos padrões magnéticos do número total de células, com e sem MNPs. Além disso, calcule a porcentagem da área efetiva do padrão magnético adicionando o diâmetro do corpo celular à largura do padrão para determinar a probabilidade aleatória de as células pousarem em um padrão magnético.
    4. Realize uma única amostra Z-teste para analisar se a distribuição celular é resultado de pouso de células isotrópicas, ou se há um viés preferido para o padrão magnético.
  3. Análise de direcionalidade de crescimento
    1. Para quantificar o efeito sobre a direcionalidade do crescimento do neurite, adquira imagens microscópicas confocal das células com e sem tratamento MNP após 8 dias de incubação. Realizar imuno-coloração (seção 8.1).
    2. Usando o software ImageJ, meça o ângulo entre o neurite celular e as listras magnéticas em ambas as condições.
      NOTA: Analise apenas os neurites originários das somas localizadas nas listras magnéticas.
    3. Plote a distribuição dos ângulos dos neurites em relação à direção das listras (Δφ). Realize um teste qui-quadrado da distribuição de Δφ para demonstrar que a distribuição não é normal ou uniforme.

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Representative Results

Plataformas magnéticas com diferentes formas geométricas foram fabricadas(Figura 1A). Os padrões magnéticos foram depositados por sputtering: 14 multicamadas de Co80Fe20 e Pd, 0,2 nm e 1 nm, respectivamente. A microscopia eletrônica revelou a altura total dos padrões magnéticos a ~18 nm(Figura 1B). Esta deposição multicamada FM única cria uma plataforma estável com anisotropia de magnetização perpendicular (PMA) em relação ao plano substrato que permite a atração das células carregadas de MNP em direção a todo o padrão magnético e não apenas às bordas22,37. Os parâmetros da estrutura multicamadas FM foram caracterizados por medições de magneto-transporte para as quais foi fabricado um dispositivo em forma cruzada de multicamadas FM(conjunto da Figura 1C), e a magnetização perpendicular ao substrato foi medida através do efeito anômal do salão (AHE)38, onde a resistência AHE é proporcional à magnetização perpendicular. A medição do campo magnético AHE mostrou um loop de histerese indicativo de ferromagnets PMA(Figura 1C). A magnetização remanescente das multicamadas FM (momento magnético em campo zero) foi idêntica à saturação de magnetização (MS)em campos altos. Além disso, o campo coercitivo das multicamadas FM era ~500 Oe, atingindo saturação a 1.200 Oe, o que possibilitou a fácil magnetização do dispositivo e garantiu estabilidade contra a influência de campos magnéticos não intencionais. O valor MS das multicamadas foi medido utilizando-se um magnetômetro (Figura 1D),conforme descrito na seção 3.1. O MS foi de 270 emu/cm3,o que é igual às medições anteriores de estruturas semelhantes.

Óxido de ferro fluorescente (γ-Fe2O3) Os MNPs foram preparados de acordo com uma publicação anterior39. Os MNPs foram sintetizados pela nucleação, incluindo a conjugação covalente de seis camadas de filmes finos de óxido de ferro para isothiocianato de rhodamina e revestimento com albumina de soro humano. O tamanho do diâmetro seco dos MNPs foi de ~15 nm com potencial zeta de -45, de acordo com a medição microscópica eletrônica de transmissão. As medidas magnetométricas dos MNPs (Figura 2A) mostram que a curva de magnetização não tinha histerese, indicando comportamento superparamagnetic dos MNPs, um campo de baixa saturação de 500 Oe, e MS relativamente alto de 22 emu/g. Para controlar a localização celular usando padrões magnéticos, as células PC12 foram incubadas em média misturadas com MNPs fluorescentes de óxido de ferro por 24 horas, transformando-as em unidades magnéticas. A concentração de MNP no meio pode ser variada; foram 0,25 mg/mL nos experimentos de revestimento. As imagens microscópicas confocal foram tiradas após a coloração do DAPI (Figura 2B). Os MNPs foram internalizados na soma das células PC12, mas não nos núcleos, o que foi refletido pela sombra escura no centro. Os resultados mostram que não houve florescência vermelha nos núcleos, o que indica que os MNPs não foram internalizados nos núcleos ou se ligaram à superfície externa das células. Utilizando medições de ICP, foi possível quantificar as quantidades de MNPs internalizados nas células PC12. A concentração de ferro dentro das células aumentou com o aumento da concentração de MNP no meio(Figura 2C).

A viabilidade das células PC12 carregadas de MNP para diferentes concentrações de MNPs foi avaliada utilizando ensaios baseados em XTT e resazurina. A Figura 3A mostra as células PC12 após o tratamento MNP, crescendo e diferenciando em cima de um prato de plástico revestido de colágeno. Para examinar o impacto dos MNPs internalizados na diferenciação, foi realizada a medição morfológica de Sholl. Não foi observada diferença significativa na morfologia celular entre as células carregadas de MNP e as células de controle(t-test, p > 0,05, n = 3) (Figura 3B). A atividade metabólica das células PC12 foi medida utilizando ensaios baseados em XTT e resazurina após a incubação celular com diferentes concentrações de MNP. Os resultados foram normalizados para a medição de controle de células PC12 sem MNPs. Essas concentrações de MNPs não apresentaram citotoxicidade significativa em relação às células, evidentes nafalta de diferenças significativas na viabilidade celular para qualquer uma das preparações ( t-test, p > 0,05, n = 3) (Figura 3C,D). Os efeitos dos MNPs no revestimento e desenvolvimento celular foram determinados comparando células carregadas de MNP a células não carregadas, banhadas e cultivadas em substratos magnéticos idênticos. As células foram semeadas e deixadas para aderir ao substrato. A cada 2 dias, as células eram tratadas com meio fresco e NGF conforme descrito na seção 7. A Figura 4 mostra células PC12 com e sem tratamento MNP, crescendo e diferenciando em um substrato magnético com listras largas de 20 μm e espaçamento de 100 μm. Após 3 dias de crescimento, as células foram imunossu detidas, manchadas de DAPI e imagens foram tiradas.

As células magnetizadas foram encontradas para se conectar aos padrões magnéticos e crescer galhos de acordo com os padrões, enquanto as células sem tratamento MNP cresceram sem afinidade com os dispositivos magnéticos(Figura 4A, B). A Figura 4C apresenta o posicionamento das células e a formação da rede em um substrato com geometria hexagonal de um comprimento lateral de 200 μm e largura de linha de 50 μm. As células foram imagens após 6 dias. As células magnetizadas estavam localizadas no padrão magnético, com afinidade semelhante aos substratos listrados. O posicionamento celular foi quantificado pela contagem dos corpos celulares localizados nos padrões magnéticos ou ligados a eles. A proporção relativa de células foi calculada a partir da população celular total. Isso foi feito para células com e sem tratamento MNP. A área efetiva da resposta magnética foi calculada adicionando o diâmetro das células (~10 μm para células PC12) a ambas as bordas do padrão magnético. Para os padrões de listras magnéticas, a proporção de área magnética efetiva foi de 33%, o que correspondia à probabilidade das células pousarem aleatoriamente nas listras magnéticas. Os resultados mostraram que 75% dos corpos celulares carregados de MNP estavam em contato com as listras magnéticas, enquanto apenas 35% das células não magnetizadas estavam localizadas nas listras (em concordância estatística com uma distribuição imparcial) (Figura 4D). A análise estatística indicou que a medida não foi derivada do pouso arbitrário celular (teste de uma amostra z,p < 10-6, n = 430).

Em contraste, a análise estatística dos hexágonos magnéticos revelou que 92% da soma das células carregadas de MNP estavam ligadas aos padrões magnéticos, em comparação com 38% para células sem tratamento MNP(Figura 4E). A proporção de área efetiva dos hexágonos foi de 32% do substrato. A análise estatística para os hexágonos também indicou que a medida não foi derivada do pouso arbitrário celular (teste de uma amostra z,p < 10-6, n = 370). Os resultados revelaram uma clara preferência das células carregadas de MNP para o padrão magnético, enquanto as células sem MNPs aderiram aleatoriamente a todo o substrato. Além do efeito de posicionamento celular, essas plataformas magnéticas também foram encontradas para controlar a direcionalidade dos neurites em crescimento. A Figura 5A mostra células carregadas de MNP com neurites, alinhando-se de acordo com a orientação das listras. Em contraste, a medição de controle de células sem MNPs mostrou crescimento de neurita em toda a plataforma, independentemente dos padrões magnéticos.

Para avaliar o efeito magnético na direcionalidade do crescimento neuronal, o ângulo entre os neurites e as listras magnéticas foi medido. Os dados revelaram que 80% dos neurites de células carregadas de MNP apresentaram correlação com a orientação das listras magnéticas, dentro de Δφ < 15° em relação à direção das listras. No entanto, apenas 32% dos neurites de células sem MNPs se desenvolveram nessa faixa. As células sem tratamento MNP não apresentaram correlação com as listras magnéticas e cresceram de acordo com uma distribuição de ângulo uniforme(Figura 5B). A análise estatística da distribuição de Δφ revelou que não era normal ou uniforme (teste qui-quadrado, p < 0,001). O efeito da geometria hexagonal no crescimento de neurita também foi demonstrado. A Figura 5C mostra imagens de fluorescência do desenvolvimento da rede neural de células PC12 magnetizadas e não magnetizadas em cima de um padrão magnético de hexágonos e grandes círculos entre as bordas. O comprimento lateral do hexágono era de 200 μm e a largura das linhas era de 10 μm; o diâmetro do círculo era de 30 μm. As somas celulares mostraram alta afinidade com os círculos e desenvolveram uma rede neural bem orientada ao longo dos contornos hexagonais. Uma imagem de zoom demonstra células ligadas a um círculo magnético e neurites crescendo ao longo desses contornos(Figura 5D).

Figure 1
Figura 1: Caracterização dos dispositivos magnéticos. (A) Imagens microscópicas ópticas de dispositivos magnéticos com várias formas geométricas. Barra de escala = 200 μm. (B) Imagem microscópica eletrônica de varredura de Co80Fe20/Pd multicamadas e um esquema das multicamadas. A altura total dos padrões magnéticos é de 18 nm. Barra de escala = 100 nm. (C) Medição do efeito Hall anômal do dispositivo magnético mostrando os campos magnéticos coercitivos e remanescentes do conjunto FM. Inset: imagem do dispositivo com eletrodos marcados. (D) A magnetometria do dispositivo multicamadas mostra o valor de saturação de magnetização calculado por volume. Este valor foi modificado a partir de Marcus et al.37. Abreviaturas: AHE = Efeito Salão Anômparado; FM = ferromagnético; B = campo magnético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Captação celular PC12 de MNPs. (A) Medição magnetométrica de MNPs à temperatura ambiente. (B) Imagem de microscopia confocal da absorção de MNP por células PC12. Núcleos manchados com DAPI; MNPs rotulados com rhodamina entram nas células. Barra de escala = 10 μm (C) Medição iCP dos MNPs de óxido de ferro internalizado (pg) por células PC12 após 24 h de incubação com várias concentrações de MNP. Este valor foi modificado a partir de Marcus et al.37. Abreviaturas: MNPs = nanopartículas magnéticas; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole; ICP = plasma acoplado indutivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Viabilidade celular PC12 carregada por MNP. (A) Imagens microscópicas confocal de células PC12 diferenciadas incubadas com MNPs. Setas mostram neurites diferenciados com Barras de Escala de MNPs internalizadas = 50 nm. (B) Análise de sholl do crescimento de neurite das células PC12 após 3 dias de diferenciação. (C) Ensaio de viabilidade XTT de células PC12 tratadas com concentrações crescentes de MNPs após 24 h de incubação. As medidas são normalizadas para controle. (D) Ensaio de viabilidade baseado em resazurina de células PC12 tratadas com concentrações crescentes de MNPs após 24 h de incubação. As medidas são normalizadas para controle. Não há significância estatística em ambas as análises. Este valor foi modificado a partir de Marcus et al.37. Abreviaturas: MNPs = nanopartículas magnéticas; XTT = 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Localização celular em cima de dispositivos magnéticos. (A) Imagens fluorescentes de células PC12 carregadas com MNPs crescendo nas listras magnéticas: (i) rotulagem de α-tubulina, (ii) coloração DAPI e (iii) imagem mesclada. Barra de escala = 100 μm. (B) Imagens fluorescentes de células PC12 sem tratamento MNP, crescendo em cima das listras magnéticas como em (A). (C) Imagens de fluorescência de células PC12, com e sem MNPs, no padrão magnético hexagonal. Barra de escala = 200 μm. (D) Percentual de corpos celulares, com e sem MNPs, localizados nas listras magnéticas. As barras de erro representam desvio padrão. A linha pontilhada representa a probabilidade de as células pousarem nas listras magnéticas. (E) Percentual de corpos celulares, com e sem MNPs, localizados nos hexágonos magnéticos. As barras de erro representam desvio padrão. A linha pontilhada representa a probabilidade de as células pousarem nos padrões magnéticos para uma distribuição aleatória. Não há significância estatística em ambas as análises. Este valor foi modificado a partir de Marcus et al.37. Abreviaturas: MNPs = nanopartículas magnéticas; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Direcionalidade da rede neuronal. (A) Imagens microscópicas confocal de células PC12 rotuladas α-tubulina com tratamento MNP (esquerda) e sem tratamento MNP (direita), crescendo em cima de listras magnéticas. As listras estão marcadas. (B) Os histogramas polares apresentam o efeito de direcionalidade neurita nas células PC12 (esquerda) com tratamento MNP e (à direita) sem tratamento MNP. O desvio do ângulo de orientação é definido como a diferença no ângulo entre os neurites e a orientação da faixa magnética (caixas de 15°). (C) Imagens de fluorescência de células PC12 cultivadas em cima de um padrão hexagonal magnético, (esquerda) com tratamento MNP e (direita) sem tratamento MNP. Barra de escala = 200 μm. (D) Imagem zoom-in de uma célula magnetizada desenvolvendo neurites de acordo com o padrão magnético. Barra de escala = 30 μm. Este valor foi modificado a partir de Marcus et al.37. Abreviação: MNPs = nanopartículas magnéticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os resultados representativos demonstram a eficácia da metodologia apresentada para controlar e organizar a formação da rede neuronal na escala de míccros. As células PC12 carregadas por MNP permaneceram viáveis e foram transformadas em unidades sensíveis magnéticas que foram atraídas pelas forças magnéticas dos eletrodos FM para locais específicos. Isso é melhor demonstrado na Figura 5C,onde as células preferencialmente aderiram aos vértices maiores dos hexágonos e não às linhas finas. Além disso, a ramificação das células também se desenvolveu favoravelmente seguindo os padrões magnéticos. Todos os experimentos de controle demonstraram inequivocamente que as forças magnéticas direcionaram a localização dos corpos celulares e os crescimentos. Embora tenha sido demonstrado que as pistas topográficas podem ser usadas para direcionar o crescimento de neurite40,41, este não é o caso aqui, pois as células sem MNPs não mostraram resposta à forma do padrão.

Uma abordagem de baixo para cima foi empregada para projetar as forças magnéticas locais, utilizando fotolítico padrão e depoimentos sputtering que estão disponíveis em muitas instalações de pesquisa, facilitando a adoção dessas técnicas por muitos pesquisadores. A abordagem de baixo para cima permite a liberdade no desenho de padrões e formas complexas de acordo com as necessidades dos pesquisadores, com resolução em escala de micron para áreas de comprimento de centímetros. Embora os resultados tenham sido demonstrados em lâminas de vidro, em princípio, é possível preparar os dispositivos em cima de outros materiais biocompatíveis adequados para aplicações terapêuticas in vivo, como matrizes de eletrodos flexíveis para gravação neuronal e estimulação42,43.

Essas plataformas pma únicas, alcançadas pela deposição multicamadas, produzem um forte campo magnético ao longo de todo o padrão magnético e não apenas nas bordas, como observado anteriormente22. Além disso, as FMs foram projetadas com uma grande saturação de magnetização remanescente, ou seja, mesmo quando o campo magnético externo é removido, os eletrodos permanecem totalmente magnetizados e continuam atraindo as células sem a necessidade de um ímã externo. No entanto, uma força magnética externa pode ajudar na magnetização total dos MNPs nas células, aumentando assim a força de atração e eficiência durante o revestimento. Uma consideração importante no projeto FM foi o número de repetições. Enquanto mais repetição aumentará o momento magnético total, o que é favorável, adicionar muitas camadas também aumentará a mistura de camadas, causando PMA menos estável e, finalmente, resultará em uma magnetização em avião44,45 eixo fácil e atração para diferentes bordas dos eletrodos22,37. Portanto, é necessário otimizar o número FM e a composição das multicamadas para garantir PMA estável com campos magnéticos máximos.

Os MNPs apresentados nos resultados representativos mostraram quase nenhuma toxicidade em relação às células PC12 nas concentrações testadas, nem afetaram o comportamento celular, apesar de serem capazes de entrar nas células e ter um momento magnético relativamente alto. A força de atração em uma célula depende do número de MNPs na célula e da magnetização de cada MNP. O ideal é que ambos sejam altos; no entanto, pode haver uma troca entre os dois. Com alguns MNPs comerciais, a viabilidade celular era boa, mas o momento magnético era muito fraco. Para outras partículas fabricadas em laboratório, o momento magnético era alto, mas os MNPs tendiam a agregar e a viabilidade celular era baixa. Assim, é importante testar a viabilidade celular e caracterizar sua magnetização ao escolher MNPs. Os MNPs usados aqui também são fluorescentes, o que facilita o rastreamento de sua localização nas células. Os resultados mostram neurites se desenvolvendo de acordo com a forma do padrão magnético, e a fluorescência indica a presença de MNPs ao longo dos neurites.

O mecanismo de internalização dos MNPs em células foi previamente investigado46. A absorção celular de MNPs ocorre por meio de endocitose de acordo com seu tamanho, forma e química superficial. Estudos anteriores examinaram a absorção de diferentes tipos de MNPs em neurônios24; a absorção celular de MNPs revestidos foi melhor do que a absorção celular de MNPs não revestidos. Como mostrado na Figura 3A,B, Os MNPs foram internalizados no citoplasma, mas permaneceram fora dos núcleos e foram transferidos para os neurídeos durante seu desenvolvimento. Além disso, os MNPs conjugados ao NGF que ativaram a via de sinalização NGF também foram internalizados em células via endocitose47,48.

Para concluir, este artigo apresenta uma caixa de ferramentas eficaz de manipulação magnética para pesquisas que requerem organização de elementos biológicos. O uso de forças magnéticas permite o posicionamento das células, direcionando o crescimento de neurite. Este método permite o design de plataformas com formas geométricas complexas. As forças da atração magnética podem ser projetadas para manipular a formação da rede neural remotamente alterando a paisagem da força magnética ao longo do tempo. Toda essa metodologia pode ser facilmente estendida para controlar outros fatores ou produtos químicos que podem ser acoplados aos MNPs e levá-los a pontos de interesse pré-assinados, todos com resolução em escala de micron.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo Ministério da Ciência & Tecnologia, Israel, e pela Fundação israelense de Ciência (569/16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Fabricação de plataformas magnéticas para organização em escala de micron de neurônios interligados
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Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., … More

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

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