Summary
这项工作提出了一个自下而上的方法,以工程的局部磁力控制神经元组织。装有磁性纳米粒子(MNPs)的神经元状细胞被镀在上面,由垂直磁化的微模式平台控制。还描述了磁定性、MNP细胞吸收、细胞生存能力和统计分析。
Abstract
将神经元引导到有组织的神经网络的能力对再生医学、组织工程和生物面具有重大影响。许多研究旨在利用化学和地形线索引导神经元。然而,关于大面积的微米规模组织控制的报告很少。在这里,描述了一种有效的方法,用于将神经元放置在预设位点,并利用嵌入微模式磁性元素的磁平台,以微米级分辨率引导神经元生长。已经证明,用磁性纳米粒子(MNPs)加载神经元可以将其转换成受磁梯度影响的敏感磁性单位。按照这种方法,制作了一个独特的磁性平台,在该平台上,PC12细胞,一个常见的神经元样模型,被镀层并装载了超参数纳米粒子。沉积了具有稳定垂直磁化的铁磁(FM)多层薄膜,为磁态模式提供有效的吸引力。这些MNP加载的PC12单元,镀层和分化在磁平台上,优先附着在磁性模式上,中性生长与图案形状完全一致,形成定向网络。介绍了磁性、蜂窝MNP吸收、细胞生存能力和结果统计分析的定量表征方法。这种方法能够控制神经网络的形成,并通过磁力的操纵改善神经元到电极的接口,它可以成为网络体外研究的有效工具,并可能提供新的治疗生物接触方向。
Introduction
神经元的微观模式对组织再生1、2、3、4、5和神经电子设备6、7、8的发展具有巨大的潜力。然而,与生物组织一样,微米比例定位神经元在高空间分辨率下构成重大挑战。在这种尺度上形成预先设计的结构需要通过局部控制索马活力和轴向外生长来指导神经细胞过程。先前的研究表明,使用化学和物理线索9,10,11,12来指导神经元生长。在这里,一种新的方法侧重于通过磁场梯度13、14、15、16、17控制细胞定位,将装有MNP的细胞转变为磁敏单元,可以远程操作。
Kunze等人用磁芯片和MNP加载的细胞来描述诱导细胞反应所需的力,他们证明早期轴向拉长可以通过细胞内部的机械张力触发。Tay等人证实,具有增强磁场梯度的微结构基板允许使用钙指示染料19对与MNPs一起使用的神经回路进行无线刺激。此外,曾等人将纳米粒子凝聚在细胞内,导致局部纳米粒子介质力接近细胞张力20。这导致了微磁基板的定义模式的制造,帮助研究细胞对机械力的反应。通过在细胞20内凝聚纳米粒子,实现了因应用局部纳米粒子介导力而产生的细胞张力。Lee等人开发了一种互补的金属氧化物半导体(CMOS)-微流体混合系统,他们在CMOS芯片中嵌入了一系列微电磁铁,以控制标有磁珠21的单个细胞的运动。
阿隆等人利用微尺度、预编程、磁垫作为磁性"热点"定位细胞22。也可以利用微模式磁阵列在细胞内刺激特定活动,使纳米粒子在特定的亚细胞位置23。细胞MNP的吸收已经成功地证明在水痘,大鼠和小鼠原神经元24,25,26。在这里,这已经证明在老鼠PC12 pheo色细胞细胞系,这之前有报道说,显示高吸收MNPs27。近年来,国会议员的医疗应用多种多方面,包括药物输送和治疗癌症治疗28、29、30、31。具体来说,研究涉及MNP和神经元网络32,33,34,35的应用。然而,在单细胞水平上使用MNP的神经元的磁组织值得进一步研究。
在这项工作中,描述了一种自下而上的方法,通过预先设计的平台设计本地磁力,用于控制神经元排列。介绍了调频多层机型微米尺度模式的制造。这种独特的调频多层结构创造了稳定的垂直磁化,从而对所有磁模式产生有效的吸引力。通过孵化,MNP 被加载到 PC12 单元中,将其转换为磁性敏感单元。在磁平台上镀层和分化的MNP加载单元优先附着在磁性模式上,中性生长与模式形状完全一致,形成定向网络。介绍了几种方法来描述调频多层和MNPs的磁性特性,并介绍了细胞MNP吸收和细胞生存性检测技术。此外,还详细介绍了神经元生长的形态参数和结果的统计分析。
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Protocol
注意:在生物安全柜中执行所有生物反应。
1. 磁平台制造
- 光刻
- 使用抄写笔将玻璃滑入 2 x 2 厘米2。 用丙酮清洁玻璃滑梯,然后在超声波浴缸中分别清洁 5 分钟。用超高纯度 (UHP) 氮干燥。
- 在 60s 的 60s 中使用旋转涂层,将玻璃涂上光层,达到 1.5μm 厚度,在 60 年代以 100 °C 烘烤。使用光面罩或无面膜光刻技术,使用合适的波长,使用所需的图案,将样品暴露在光源中。
- 开发人员在开发人员中开发 40s,根据制造商的说明在蒸馏水中稀释;在DW中清洗45s,用UHP氮气干燥。检查光学显微镜下的图案。
- 溅射沉积
- 将样品插入沉积系统的主腔室,等待基本压力(约5×10-8 托尔)。打开气体流:在此设置标准溅射的砷流(28 sccm [标准立方厘米/分钟)。点燃溅射目标,然后将溅射压力设置为 3 mTorr。
- 在达到预期速率之前,增加每个目标的功率。
注:Pd 速率:0.62 A/s = 16s 中的 1.0 nm;Co80Fe20 费率: 0.32 A/s, 0.2 nm 在 6.25 s. - 打开旋转。通过打开和关闭目标百叶窗,将调频多层机位分别存放在 Co80Fe20 和 Pd 目标之间交替。存入 14 个双层 Co80Fe20 (0.2 nm)/Pd (1.0 nm),最后再加 2 nm Pd 封顶层。
- 升空:将样品浸泡在丙酮中30分钟,然后用异丙丙酚冲洗。然后,用 UHP 氮干燥,并将样品保存在干净干燥的环境中,直到使用。
2. 通过运输测量对磁性装置进行定性
- 使用 Si 基板或玻璃滑梯,其横形磁条宽度为 100μm,存放有 FM 多层(见 图 1C 插图)。使用双面胶带将样品连接到支架上。
- 使用钢丝粘合器,将 4 根导线粘结到样品上,在交叉电极的每一段上粘合一根。将样品持有人和样品设置在传输测量系统内,并设置磁场,使磁场与样品垂直。在室温下进行测量。
- 对设备进行横向电压 (VT)测量:按照 图1C 中的标记(插图):在联系人1和3之间应用1 mA电流;测量联系人2和4之间的VT; 然后,在 2 到 4 之间施加电流,测量 1 到 3 之间的电压。最后,计算测量电压和除以 2 以获得 VT的电压之间的差值。使用切换系统在两个测量配置之间自动更改。
- 以 5 mT 的步骤扫描 0.4 T 到 -0.4 T 之间的磁场,并测量 VT 作为磁场的函数。绘制横向电阻 (VT/I)与磁场,以确定异常大厅信号,这与薄膜中的垂直磁化成正比。
3. 通过磁测量对 MNP 和磁多层进行特征测量
- FM 多层的磁度测量
- 将调频多层机位存放在 Si 基板上(见第 1.2 节)。将样品切成 6 个正方形,尺寸为 4 x 4 mm2。 将样品一个堆叠在另一个上面,并将其排列在垂直于磁场方向的胶囊中(见 图1D 插图)。
- 将胶囊插入磁力计,并在室温下测量磁化。在 -0.4 T 和 0.4 T 之间扫除磁场。
- 考虑磁层厚度、样品大小和基材数量,计算磁性材料的总体积。将磁化除以磁性材料的总体积。
- 绘制磁化(单位体积)与磁场。从高磁场响应中减去基板的磁性背景,从图形中推断调频的饱和磁化。
- MNP 的磁度测量
- 将指定质量的 MNP 插入合成聚合物胶囊中。如果测量小磁化饱和值,请考虑更大的体积。
- 如果 Mps 被悬挂在溶剂中, 通过让胶囊通宵开放来干燥 Mps 。将胶囊插入磁力计,并在室温下测量磁化。在 -0.2 T 和 0.2 T 之间扫除磁场。
- 通过将指定体积乘以粒子浓度来计算议员的总质量。将结果标准化为 1 g。
- 绘制规范化磁化(每克)与磁场。从图表中推断出 MP 的磁化饱和度。
4. 胶原蛋白涂层协议
- 涂层塑料菜肴
- 通过将 490 μL 的 HCl 添加到 500 mL 的高压双蒸馏水 (DDW) 中,准备 0.01 M HCl。
注意:仅在化学罩中执行此步骤。 - 稀释胶原蛋白1型(从大鼠尾巴溶液)1:60-1:80在0.01 M HCl获得50μg/mL的最终工作浓度。将稀释溶液的 1.5 mL 放在 35 mm 培养皿中。将盘子放在引擎盖上1小时,盖上盖子。
- 取出溶液,用无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗 3 次。这道菜已经准备好细胞播种了。
- 通过将 490 μL 的 HCl 添加到 500 mL 的高压双蒸馏水 (DDW) 中,准备 0.01 M HCl。
- 涂层玻璃滑梯
- 稀释胶原蛋白类型 1 (从大鼠尾巴溶液) 1:50 在 30% v/v 乙醇.对于涂层35毫米的菜,添加20μL胶原蛋白到1mL的30%乙醇。
- 用溶液盖住盘子,等到所有的溶液蒸发,让盘子露出几个小时。在无菌1倍PBS中清洗3次;玻璃滑梯已准备好进行细胞播种。
5. 细胞MNP吸收和生存能力
- 蜂窝 MNP 吸收
- 通过在罗斯韦尔公园医学研究所 (RPMI) 介质中加入 10% 马血清 (HS)、5% 胎儿牛血清 (FBS)、1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素和 0.2% 氨基霉素来为 PC12 细胞培养准备基本生长介质,并使用 0.22 μm 尼龙过滤器进行过滤。
- 将 1% 马血清 (HS)、 1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素和 0.2% 安非他明添加到 RPMI 介质中,以准备 PC12 分化介质,并使用 0.22μm 尼龙过滤器进行过滤。
- 在未经处理的培养瓶中生长细胞,具有 10 mL 的基本生长介质;每2-3天在烧瓶中加入10mL的基本生长介质,并在8天后对细胞进行子培养。
- 对于细胞吸收,离心机在离心管中悬架8分钟,在200× 克 和室温下,并丢弃超自然。
- 将细胞在3mL的新鲜基本生长介质中补充。再次,离心机在200× 克 和室温下将细胞悬架悬架5分钟,并丢弃超自然。将细胞重新注入3mL的新鲜分化介质中。
- 使用注射器和针头对细胞吸气10倍,以分解细胞群。使用血细胞计数数细胞,并在常规未涂层的 35 mm 盘中播种 106 个细胞。
- 在菜中加入 MNP 悬架的计算体积和分化介质的体积,以达到所需的 MNP 浓度和总体积。混合细胞、MNP 和分化介质;在 5% 的 CO2 加湿孵化器中孵化菜肴,在 37 °C 中 24 小时。
- 在室温下将细胞悬架在200× 克 时悬架5分钟,并丢弃超母体。将细胞重新注入1mL的新鲜分化介质中,并使用血细胞计数细胞。
- MNP 加载的细胞分化
- 执行吸收协议(第 5.1 节)。种子 8 × 104 MNP 加载细胞在 35 毫米,胶原蛋白类型 l 涂层盘在分化介质的存在(见胶原蛋白涂层协议在第 4.1 节)。24小时后,加入1:100新鲜穆林β-神经生长因子(β-NGF)(最终浓度50 ng/mL)。
- 更新分化介质,每 2 天添加一次新鲜的穆林β-NGF。使用光学显微镜每 2 天对细胞进行成像。网络形成后(PC12细胞6-8天),使用共焦显微镜对细胞进行成像,并观察粒子的荧光。
- MNP加载细胞的可生存性检测:2,3-比斯-(2-甲氧-4-硝基-5-磺胺)-2H-四环磷-5-碳化物(XTT)细胞生存能力测试。
- 按照步骤 5.1.1 编制基本增长介质。培养具有不同浓度的 MNP 的 PC12 细胞(0.1 毫克/mL、0.25 毫克/mL 和 0.5 毫克/mL 的基本生长介质),并且在平坦的 96 井板中也无需 MNP 用于三元控制(总体积为 100μL/井)。在 5% 的 CO 2 中孵化细胞24小时,在 37 °C 的加湿孵化器中孵化 24 小时。
- 准备含有无细胞介质的空白井,用于背景校正。在使用前立即在 37 °C 的浴缸中解冻 XTT 试剂溶液和含有 N-甲基二苯丙胺硫酸酯的反应溶液。轻轻旋转,直到获得清晰的解决方案。
- 对于一个 96 井板,将 0.1 mL 的激活解决方案与 5 mL XTT 试剂混合。向每口油井添加 50μL 的反应溶液,稍微摇动板,以均匀地分配油井中的染料,然后在孵化器中孵化板 5 小时。
- 使用酶相关免疫分析 (ELISA) 读卡器以 450 nm 的波长测量样品对空白油井的吸收度。使用 630 nm 的波长测量参考吸收度,并从 450 nm 测量中减去它。
- 当在450纳米处用XTT试剂孵育的培养介质中发生轻微的自发吸收时,从其他油井中减去空白油井的平均吸收量。从 MNP 的平行样本中减去信号值,其测试浓度与细胞样本相同。
- MNP 加载细胞的可行性检测:基于雷萨祖林的细胞生存能力测试
- 根据步骤 5.1.1 编制基本增长介质。培养具有不同浓度的 MNP 的 PC12 细胞(0.1 毫克/mL、0.25 毫克/mL 和 0.5 毫克/mL 的基本生长介质),并且没有 MNP 在 24 小时的平面 96 井板中控制三脚架。在 37 °C 的 5% CO2 孵化器中孵化细胞 24 小时。 准备含有无细胞介质的空白井。
- 用1倍PBS清洗细胞。将基于雷萨祖林的试剂(10%w/v)添加到介质中,并在37°C孵化器中孵化2小时。
- 将样品的 150μL 引用放在 ELISA 读卡器中,测量 560 nm 的激发波长和 590 nm 的发射波长的吸收。以与细胞样本相同的测试浓度从 MNP 的平行样本中减去信号值。
6. 使用感应耦合等离子体(ICP)对细胞内MNP浓度进行描述
- 根据步骤 5.1.1 编制基本增长介质。培养具有不同浓度的 MNP 的 PC12 细胞(0.1 毫克/mL、0.25 毫克/mL 和 0.5 毫克/mL 的基本生长介质),并且没有 MNP 在平坦的 96 井板中作为三元控制(总体积为 100 μL/井)。在 5% 的 CO2中孵化,在 37 °C 的加湿孵化器中孵化 24 小时。
- 将悬架转移到离心管(从每个井单独),离心机细胞在200× 克 在室温下5分钟,并丢弃超自然。将细胞重新注入1mL的新鲜分化介质中,并使用血细胞计数细胞。
- 通过用100微升70%硝酸分别到每口井中治疗,将细胞酶化至少15分钟。将 5 mL 的 DDW 添加到解冻的单元格中,并过滤解决方案。
- 使用 ICP 测量铁浓度,并使用细胞计数记录每个细胞的 Fe 浓度。
7. 磁平台上的细胞分化和生长
- 用 70% v/v/ 乙醇清洁图案基板,并将基板放在发动机罩中的 35 毫米培养皿中。将一块大磁铁(约 1500 Oe)放在图案基板下方 1 分钟,然后先将磁盘向上移动并远离磁铁,然后将磁铁从引擎盖中取出来,从而去除磁铁。打开紫外线15分钟。
- 根据第 4.2 节,将基板涂上胶原蛋白类型 1。细胞MNP吸收(第5.1节)后暂停细胞,在35毫米培养盘中播种105 个细胞,并添加2mL的分化介质。在 5% 的 CO2中孵化培养,在 37 °C 的加湿孵化器中孵化。
- 24小时后,加入1:100新鲜的穆林β-NGF(最终浓度为50 ng/mL)。更新分化介质,每 2 天添加一次新鲜的穆林β-NGF。每2天使用光显微镜对细胞进行一次成像,在网络形成后,对细胞进行免疫染色(第8.1节)。
8. MNP 加载的细胞染色
- 图布林免疫染色
- 通过混合 10 mL 的 16% w/v PFA 解决方案、4 mL 的 10 倍 PBS 和 26 mL 的 DDW 来准备 4% 的副甲醛 (PFA) 溶液。通过将非离子表面活性剂的 500 μL 添加到 1x PBS 的 50 mL 中,准备 50 mL 的 1% PBT。通过将 25 mL 的 1% PBT 与 1x PBS 的 25 mL 混合,准备 0.5% PBT 的 50 mL。通过在 0.25% PBT 中混合 1% 牛血清白蛋白和 1% 普通驴血清来准备阻塞解决方案。
注意:仅在化学罩内使用 PFA。 - 从细胞中取出超自然介质。在化学罩内室温下,将 MNP 加载的细胞固定在 4% PFA 中 15 分钟。在化学罩内用 1 倍 PBS 清洗 MNP 加载的电池 3 次,每次洗涤 5 分钟。
- 用 0.5% PBT 将 MNP 加载的电池渗透 10 分钟。首先在室温下将 MNP 加载的细胞孵化为阻塞溶液 45 分钟,然后在 4 °C 的阻塞溶液中用兔子抗α-图布林抗体。 在 1 倍 PBS 中清洗 MNP 加载的电池 3 倍,每次洗涤 5 分钟。
- 在黑暗和室温下用 Cy2 组合驴抗兔次抗体孵育 MNP 加载的细胞 45 分钟。用 1 倍 PBS 清洗 MNP 加载的电池 3 次,每次洗涤 5 分钟。
- 执行共焦成像。对于图布林,使用492 nm的激发波长和510 nm的发射波长。对于 MNP(罗达明),使用 578 nm 的激发波长和 613 nm 的发射波长。
- 通过混合 10 mL 的 16% w/v PFA 解决方案、4 mL 的 10 倍 PBS 和 26 mL 的 DDW 来准备 4% 的副甲醛 (PFA) 溶液。通过将非离子表面活性剂的 500 μL 添加到 1x PBS 的 50 mL 中,准备 50 mL 的 1% PBT。通过将 25 mL 的 1% PBT 与 1x PBS 的 25 mL 混合,准备 0.5% PBT 的 50 mL。通过在 0.25% PBT 中混合 1% 牛血清白蛋白和 1% 普通驴血清来准备阻塞解决方案。
- 核染色与 4+,6-迪亚米迪诺-2-苯林多尔 (DAPI)
- 用 1 倍 PBS 清洗 MNP 加载的电池 3 次,每次洗涤 5 分钟。取出样品周围的过量液体,加入1滴(+50μL)含有DAPI的安装介质,覆盖22毫米×22毫米的区域,并在黑暗和室温下孵育5分钟。
- 用 1 倍 PBS 清洗 MNP 加载的电池 3 次,每次洗涤 5 分钟。执行共焦成像。对于 DAPI,使用 358 nm 的激发波长和 461 nm 的发射波长。对于 MNP(罗达明),使用 578 nm 的激发波长和 613 nm 的发射波长。
9. 测量和统计分析
- MNP加载细胞分化的形态分析
- 为了测量与细胞体不同距离的交叉点数,使用NGF治疗后3天获得培养细胞的相位图像。
注:如果以后完成,细胞可能会发展网络,防止单细胞分辨率测量。- 打开图像处理程序"ImageJ"中的图像,并使用神经元J插件,实现半自动中性跟踪和长度测量36。使用中性物跟踪器插件,跟踪中性酸盐并将数据转换为二进制图像。定义索马的中心。
- 执行肖尔分析,可在神经元J插件中找到。定义最大半径。重复实验三次。分析每个实验中的100多个细胞。
- 为了测量与细胞体不同距离的交叉点数,使用NGF治疗后3天获得培养细胞的相位图像。
- 细胞定位分析
- 要确定在孵化 3 天后在磁区定位的细胞百分比,获取有或不吸收 MNP 的细胞的共焦显微图像。使用 DAPI 染色(第 8.2 节)。
- 手动计算图案(触摸单元)上方或部分上方的单元格以及未在模式(触摸单元格)上的单元格。重复进行三个实验。使用 MNP 分析 400 多个细胞,无需吸收。
- 计算磁模式上与无MNPs的细胞总数中的相对比例。此外,通过将细胞体直径添加到图案宽度中来计算磁模式有效区域的百分比,以确定细胞落在磁性模式上的随机概率。
- 执行单个样本 Z测试,以分析细胞分布是否是同向细胞着陆的结果,或者是否对磁模式有偏好的偏差。
- 增长方向分析
- 要量化对中性粒细胞生长方向性的影响,在8天的孵化后获取有或没有MNP治疗的细胞的共聚焦微观图像。执行免疫染色(第 8.1 节)。
- 使用 ImageJ 软件,测量两种条件下细胞中性粒细胞和磁条之间的角度。
注:仅分析来自磁条上的索玛斯的中性物。 - 绘制中性石与条纹方向(Δθ)的分布。对Δθ的分布进行奇平方测试,以证明分配不正常或不均匀。
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Representative Results
制造了具有不同几何形状的磁平台(图1A)。磁模式通过溅射沉积:14个多层的Co80Fe20和Pd,分别为0.2纳米和1纳米。电子显微镜显示磁模式的总高度为~18纳米(图1B)。这种独特的调频多层沉积创造了一个稳定的平台,与基板平面相对于基板平面的垂直磁化同位素(PMA),使MNP加载的细胞对整个磁模式的吸引力,而不仅仅是边缘22,37。FM多层结构的参数以磁传输测量为特征,其中制造了调频多层的交叉形状装置(图1C插图),通过异常大厅效应(AHE)38测量与基板垂直的磁化,其中AHE电阻与垂直磁化成正比。AHE 与磁场测量显示,一个滞后循环指示 PMA 铁氧体 (图 1C)。FM多层机(零场磁力矩)的残余磁化与高场的磁化饱和度(MS)相同。此外,FM多层机的强制场为约500 Oe,达到1,200 Oe的饱和度,使设备易于磁化,并确保不受无意磁场影响的稳定性。多层机的MS值是使用磁力计(图1D)测量的,如第3.1节所述。MS为270埃穆/厘米3,与先前对类似结构的测量相当。
荧光氧化铁(γ-Fe2O3)是根据先前的出版物39编制的。议员们通过核合成,包括将氧化铁的六层薄膜与罗达明异氰酸酯和人类血清白蛋白的共价结合。根据传输电子显微测量,MNP的干直径为约15纳米,Zeta潜力为-45。MNP(图2A)的磁度测量显示,磁化曲线没有滞后,表明MNP的超参数化行为,500 Oe的低饱和场,以及22 emu/g的相对较高的MS。 为了使用磁模式控制细胞定位,PC12细胞在中等中等温度下与氧化铁荧光MNPs混合24小时,将其转化为磁性单位。中期的MNP浓度可以变化:电镀实验中为0.25毫克/mL。对焦微观图像是在DAPI染色(图2B)后拍摄的。议员们被内化到PC12细胞的索马中,而不是内化到核中,而核核则被中间的暗影所反射。结果表明,核中没有红花,这表明议员们没有内化到核中,也没有附着在细胞的外表面。使用ICP测量,可以量化内化到PC12细胞中的MNP数量。细胞内的铁浓度随着中等(图2C)MNP浓度的增加而增加。
使用基于 XTT 和雷萨祖林的测定评估了 MNP 加载的 PC12 细胞对于不同浓度的 MNP 的可行性。图3A显示MNP治疗后PC12细胞,在胶原蛋白涂层塑料盘上生长和分化。为了检查内化议员对分化的影响,进行了Sholl形态测量。在MNP加载细胞和对照细胞(t-测试,p>0.05,n =3)(图3B)之间的细胞形态没有显著差异。PC12细胞的代谢活性是在细胞孵化后,使用XTT和雷萨祖林基检测来测量的,其细胞的MNP浓度不同。结果标准化为没有 MNP 的 PC12 单元的控制测量。这些MNP浓度没有显示对细胞的显著细胞毒性,这表现在任何制剂(t-测试,p>0.05,n =3)(图3C,D)细胞生存能力缺乏显著差异。MNP 对细胞电镀和发展的影响通过将 MNP 加载的细胞与未加载的细胞进行比较来确定,这些细胞在相同的磁基板上镀层和生长。细胞被播种并留在基材上。每2天,细胞接受第7节所述的新鲜介质和NGF治疗。图4显示 PC12 细胞有和没有 MNP 治疗,生长和分化在磁基板上,有 20μm 宽条纹和 100μm 间距。经过3天的生长,细胞被免疫污染,DAPI染色,并拍摄了图像。
磁化细胞被发现附着在磁性模式上,并根据模式生长分支,而没有MNP处理的细胞生长与磁性装置没有亲和力(图4A,B)。图 4C表示细胞和网络形成的定位,基板具有侧长 200μm 和线宽 50μm 的六角形几何形状。细胞在6天后被成像。磁化细胞位于磁性图案上,与条纹基材具有相似的亲和力。细胞定位通过计算位于磁模式或附着在它们上的细胞体来量化。细胞的相对比例是从细胞总数中计算出来的。这是为有和没有MNP治疗的细胞做的。磁响应的有效区域是通过将细胞的直径(PC12细胞的 10μm)添加到磁性模式的两个边缘来计算的。对于磁条模式,有效磁区比为33%,与细胞随机降落在磁条上的概率相对应。结果显示,75%的MNP加载细胞体与磁条接触,而只有35%的未磁化细胞位于条纹上(在统计上同意不偏不倚的分布)(图4D)。统计分析表明,测量并非来自任意细胞着陆(单样本z-测试,p<10-6,n =430)。
相比之下,对磁六边形的统计分析显示,92%的MNP加载细胞的索马附着在磁性模式上,而没有MNP治疗的细胞(图4E)为38%。六边形的有效面积比为基材的32%。对六边形的统计分析还表明,测量并非来自任意细胞着陆(单样本z测试,p < 10-6,n = 370)。结果表明,MNP加载的细胞明显倾向于磁性模式,而没有MNP的细胞则随机粘附在整个基材上。除了细胞定位效应外,这些磁性平台还能够控制生长中的中性粒细胞的方向性。图 5A显示 MNP 加载的细胞与中性粒细胞,根据条纹的方向对齐。相比之下,对没有 MNP 的细胞的控制测量显示,无论磁模式如何,整个平台的中性生长都显示中性。
为了评估磁性对神经元生长方向性的影响,测量了中性粒体和磁条纹之间的角度。数据显示,MNP加载细胞80%的中子与磁条的方向相关,相对于条纹的方向Δθ <15°。然而,只有32%的细胞中,没有MNP的中子在该范围内发育。未经MNP治疗的细胞与磁条没有相关性,根据均匀的角度分布(图5B)生长。对Δθ分布的统计分析表明,这是不正常或不均匀的(Chi-square测试,p <0.001)。六边形几何学对中性生长的影响也得到了证明。 图5C 显示了磁化和未磁化PC12细胞的神经网络发展的荧光图像,该图像位于六边形的磁性图案和边缘之间的大圆圈上。六边形的侧长为 200 μm,线宽为 10μm;圆直径为30μm。细胞索玛斯表现出对圆圈的高度亲和力,并沿着六边形轮廓发展了一个方向良好的神经网络。放大图像显示连接到磁圈的细胞和沿这些轮廓生长的中性物(图 5D)。
图1:磁性装置的特征。 (A) 具有不同几何形状的磁性装置的光学微观图像。比例杆 = 200 μm. (B) 扫描 Co80Fe20/Pd 多层的电子显微图像和多层示意图。磁模式的总高度为 18 nm。比例栏=100纳米。(C) 显示调频强制和残余磁场的磁性装置的异常大厅效应测量。(D) 多层设备的磁力测量显示按体积计算的磁化饱和值。这个数字已经从马库斯等人37修改。缩写:AHE =异常大厅效果;调频=铁磁:B = 磁场。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2:PC12在室温下对MNP进行磁度测量。(B) PC12细胞吸收的MNP的聚焦显微镜图像。核染有DAPI;标有罗达明的议员进入牢房。比例杆 = 10 μm(C) ICP 测量内部氧化铁 MNP (pg) 由 PC12 细胞在 24 小时后孵化与几个 MNP 浓度。这个数字已经从马库斯等人37修改。缩写:MNP = 磁性纳米粒子;达皮 = 4+,6-迪亚米迪诺-2-菲尼林多尔;ICP=电感耦合等离子体。请单击此处查看此图的较大版本。
图3:MNP加载的PC12细胞生存能力。 (A)与MNPs一起孵育的分化PC12细胞的聚焦微观图像。 箭头显示有内化MNPs的分化中性粒细胞。 比例杆 = 50 纳米。(B) 经过3天的分化后,对PC12细胞的中性生长进行肖尔分析。(C) XTT 生存能力检测 PC12 细胞,在 24 小时孵化后,MNP 浓度增加。测量标准化以进行控制。(D) 基于雷萨祖林的 PC12 细胞的生存能力检测,在 24 h 孵化后,MNP 浓度增加。测量标准化以进行控制。这两种分析都没有统计学意义。这个数字已经从马库斯等人37修改。缩写:MNP = 磁性纳米粒子;XTT = 2,3-比斯 -(2-甲氧-4-硝基-5-磺胺)-2H-四氧化二氮-5-碳化物。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4:磁性设备上的细胞定位。 (A)PC12细胞的荧光图像,其中含有生长在磁条上的MNP:(一) α-图布林标签,(二) DAPI染色和(iii) 合并图像。比例杆 = 100μm. (B) 未经 MNP 处理的 PC12 细胞的荧光图像,如(A)一样生长在磁条之上。(C) PC12细胞的荧光图像,有和没有MNPs,在六边形磁模式。比例杆 = 200μm. (D) 细胞体的百分比,有和没有 MNP,位于磁条上。错误条表示标准偏差。虚线表示细胞降落在磁条上的概率。(E) 细胞体的百分比,有和没有MNPs,位于磁六边形上。错误条表示标准偏差。虚线表示细胞降落在磁性模式上进行随机分布的概率。这两种分析都没有统计学意义。这个数字已经从马库斯等人37修改。缩写:MNP = 磁性纳米粒子;达皮 = 4+, 6 - 迪亚米迪诺 - 2 - 菲尼林多尔。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5:神经元网络方向性。(A)通过MNP治疗(左)和没有MNP治疗(右)的α图布林标记的PC12细胞的聚焦微观图像,生长在磁条之上。条纹被标记。(B) 极地直方图通过MNP治疗对PC12细胞(左)和(右)进行MNP治疗,呈现中性定向效应。方向角度的偏差定义为中性粒度和磁条方向(15° 箱)之间的角度差异。(C) PC12 细胞的荧光图像生长在磁六边形图案之上,(左)与 MNP 治疗和 (右) 没有 MNP 治疗。比例尺 = 200μm. (D) 根据磁性模式放大磁化细胞发展中性物的图像。比例杆 =30 μm。这个数字已经从马库斯等人37修改。缩写:MNP=磁性纳米粒子。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
具有代表性的结果表明,在微米尺度上控制和组织神经元网络形成的方法的有效性。MNP 加载的 PC12 电池仍然可行,并被转换为磁敏单位,这些单元被从调频电极到特定部位的磁力所吸引。这在图 5C中表现得最好,其中细胞优先粘附在六边形较大的顶点上,而不是细线。此外,细胞的分支也随着磁模式的发展而发展。所有的控制实验都明确表明,磁力引导细胞体和生长的本地化。虽然事实证明地形线索可用于引导中性生长40,41,但这里的情况并非如此,因为没有MNPs的细胞对模式的形状没有反应。
采用自下而上的方法,利用许多研究设施中现有的标准光刻和溅射沉积来设计当地磁力,从而促进许多研究人员采用这些技术。自下而上的方法允许根据研究人员的需求自由设计复杂的图案和形状,对厘米长的区域具有微米尺度分辨率。虽然结果在玻璃幻灯片上得到了证明,但原则上,可以在其他生物相容材料上准备适合体内治疗应用的设备,如用于神经元记录和刺激的柔性电极阵列42,43。
这些独特的PMA平台,通过多层沉积实现,产生一个强大的磁场沿整个磁模式,不仅在边缘,如前22观察到的。此外,FM 的设计具有较大的残余磁化饱和度,即即使去除外部磁场,电极仍保持完全磁化,无需外部磁铁即可继续吸引电池。然而,外部磁力可以帮助细胞中的MNP完全磁化,从而在电镀过程中增加吸引力和效率。调频设计的一个重要考虑因素是重复次数。虽然更多的重复将增加总磁矩,这是有利的,添加许多层也会增加层混合,导致不太稳定的PMA,并最终导致机载磁化44,45易轴和吸引到电极22,37的不同边缘。因此,有必要优化多层机的调频数和组成,以确保具有最大磁场的PMA稳定。
代表结果中显示的MNP在测试浓度下几乎没有对PC12细胞产生毒性,也没有影响细胞行为,尽管能够进入细胞并具有相对较高的磁性时刻。细胞的吸引力取决于细胞中的 Mnp 数量和每个 Mnp 的磁化。理想情况下,两者都应该很高:然而,两者之间可能会有一个权衡。与一些商业议员,细胞的生存能力是好的,但磁性的时刻太弱。对于实验室中制造的其他粒子,磁性极高,但 MNP 倾向于聚合,细胞存活率较低。因此,在选择 MNP 时,测试细胞的生存能力并描述其磁化性非常重要。这里使用的议员也是荧光灯,这使得它很容易跟踪他们在细胞中的位置。结果表明,中性粒体根据磁性模式的形状发展,荧光表示中性金矿沿线存在MNP。
此前,已对议员进入细胞的内化机制进行了调查。MNP 的细胞吸收通过内分泌发生,根据其大小、形状和表面化学。先前的研究检查了不同类型的MNP进入神经元24:涂层 Mnps 的蜂窝吸收比未涂装 Mps 的蜂窝吸收要好。如图3A所示,B,MNP被内化成细胞质,但留在细胞核之外,并在发育过程中转移到中性。此外,与激活NGF信号通路的NGF结合的MNP也通过内分泌47,48内化细胞。
最后,本文为需要生物元素组织的研究提供了有效的磁性操纵工具箱。磁力的使用使细胞定位,引导中性生长。这种方法能够设计具有复杂几何形状的平台。磁力的吸引力可以通过随着时间的改变而远程操纵神经网络的形成。这整个方法可以很容易地扩展,以控制其他因素或化学品,可以耦合到MNP,并把他们带到预先设计的兴趣点,所有与微米级分辨率。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究得到了以色列科学和技术部以及以色列科学基金会(569/16)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Disposable needle | KDL | 23 G | |
Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Light microscope | Leica | DMIL LED | |
Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
XTT cell viability reagent |
References
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