Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

इंटरकनेक्टेड न्यूरॉन्स के माइक्रोन-स्केल संगठन के लिए चुंबकीय प्लेटफार्मों का निर्माण

Published: July 14, 2021 doi: 10.3791/62013
Automatic Translation
1,4, 2,4, 2,4, 1,4, 2,4, 2,4, 3,4, 2,4, 1,4
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Summary

यह काम न्यूरोनल संगठन के नियंत्रण के लिए स्थानीय चुंबकीय बलों की इंजीनियरिंग के लिए एक बॉटम-अप दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। चुंबकीय नैनोकणों (एमएएनपी) से भरी न्यूरॉन जैसी कोशिकाओं को ऊपर चढ़ाया जाता है और लंबवत चुंबकीयकरण के साथ एक सूक्ष्म पैटर्न वाले मंच द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसके अलावा चुंबकीय लक्षण वर्णन, एमएनपी सेलुलर तेज, सेल व्यवहार्यता, और सांख्यिकीय विश्लेषण कर रहे हैं वर्णित हैं ।

Abstract

संगठित तंत्रिका नेटवर्क में न्यूरॉन्स को निर्देशित करने की क्षमता पुनर्योजी चिकित्सा, ऊतक इंजीनियरिंग, और जैव-इंटरफेसिंग के लिए बहुत निहितार्थ है। कई अध्ययनों का उद्देश्य रासायनिक और स्थलाकृतिक संकेतों का उपयोग करके न्यूरॉन्स को निर्देशित करना है। हालांकि, बड़े क्षेत्रों में एक माइक्रोन पैमाने पर संगठनात्मक नियंत्रण की रिपोर्ट दुर्लभ हैं । यहां, पूर्व निर्धारित स्थलों में न्यूरॉन्स रखने और सूक्ष्म पैटर्न वाले, चुंबकीय तत्वों के साथ एम्बेडेड चुंबकीय प्लेटफार्मों का उपयोग करके, माइक्रो-स्केल रिज़ॉल्यूशन के साथ न्यूरोनल आउटग्रोथ का मार्गदर्शन करने के लिए एक प्रभावी विधि का वर्णन किया गया है। यह प्रदर्शित किया गया है कि चुंबकीय नैनोकणों (एमएएनपी) के साथ न्यूरॉन्स लोड िंग उन्हें संवेदनशील चुंबकीय इकाइयों में परिवर्तित करता है जो चुंबकीय ढाल से प्रभावित हो सकते हैं। इस दृष्टिकोण के बाद, एक अद्वितीय चुंबकीय मंच तैयार किया गया है जिस पर PC12 कोशिकाओं, एक आम न्यूरॉन की तरह मॉडल, चढ़ाया और सुपरप्रामैग्नेटिक नैनोकणों के साथ भरी हुई थी । चुंबकीय पैटर्न की ओर प्रभावी आकर्षण बल प्रदान करने के लिए स्थिर लंबवत चुंबकीकरण के साथ फेरोमैग्नेटिक (एफएम) मल्टीलेयर की पतली फिल्में जमा की गईं। चुंबकीय प्लेटफार्मों के ऊपर प्लेटेड और विभेदित इन एमएनपी-लोडेड PC12 कोशिकाओं को अधिमानतः चुंबकीय पैटर्न से जोड़ा गया था, और न्यूराइट आउटग्रोथ को पैटर्न आकार के साथ अच्छी तरह से गठबंधन किया गया था, उन्मुख नेटवर्क बनाते थे। चुंबकीय गुणों के मात्रात्मक लक्षण वर्णन विधियां, सेलुलर एमएनपी तेज, सेल व्यवहार्यता, और परिणामों का सांख्यिकीय विश्लेषण प्रस्तुत किए जाते हैं। यह दृष्टिकोण तंत्रिका नेटवर्क गठन के नियंत्रण को सक्षम बनाता है और चुंबकीय बलों के हेरफेर के माध्यम से न्यूरॉन-टू-इलेक्ट्रोड इंटरफेस में सुधार करता है, जो नेटवर्क के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एक प्रभावी उपकरण हो सकता है और उपन्यास चिकित्सीय बायोइंटरफेसिंग दिशाओं की पेशकश कर सकता है।

Introduction

न्यूरॉन्स के माइक्रोपैटर्निंग में ऊतक उत्थान 1 ,2, 3,4,5 और न्यूरो-इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के विकास की अपार संभावनाएं हैं6,7,8. हालांकि, उच्च स्थानिक संकल्प पर न्यूरॉन्स की माइक्रोन-स्केल्ड स्थिति, जैविक ऊतकों के रूप में, एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गई है। इस पैमाने पर पूर्वसाइन्ड संरचनाओं को बनाने के लिए स्थानीय रूप से सोमा मोटिविटी और एक्सोनल आउटग्रोथ को नियंत्रित करके तंत्रिका कोशिका प्रक्रियाओं के मार्गदर्शन की आवश्यकता होती है। पिछले अध्ययनों में न्यूरोनल विकास का मार्गदर्शन करने के लिए रासायनिक और भौतिक संकेतों9,10,11,12 के उपयोग का सुझाव दिया गया है। यहां, एक उपन्यास दृष्टिकोण चुंबकीय क्षेत्र ढाल13, 14, 15, 16, 17द्वारा सेल पोजिशनिंगकोनियंत्रितकरने पर केंद्रितहै,जो एमएनपी से भरी कोशिकाओं को चुंबकीय-संवेदनशील इकाइयों में बदल रहा है, जिसे दूर से हेरफेर किया जा सकता है।

कुंज एट अल. जो चुंबकीय चिप और एमएनपी-भरी हुई कोशिकाओं का उपयोग कर सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए आवश्यक बल की विशेषता है, ने साबित कर दिया कि जल्दी अक्षीय विस्तार कोशिकाओं के अंदर यांत्रिक तनाव से ट्रिगर किया जा सकता है18। Tay et al. ने पुष्टि की कि उन्नत चुंबकीय क्षेत्र ढाल के साथ माइक्रो-निर्मित सब्सट्रेट्स कैल्शियम इंडिकेटर रंगों19का उपयोग करके एमएनपी के साथ किए गए तंत्रिका सर्किट की वायरलेस उत्तेजना की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, Tseng एट अल कोशिकाओं के अंदर नैनोकणों को मिलाया, जिसके परिणामस्वरूप स्थानीय नैनोपार्टिकल-मध्यस्थता बलों ने सेलुलर तनाव20से संपर्क किया । इससे माइक्रोमैग्नेटिक सब्सट्रेट्स के परिभाषित पैटर्न का निर्माण हुआ जिसने यांत्रिक बलों के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने में मदद की। स्थानीयकृत नैनोपार्टिकल-मध्यस्थता बलों के अनुप्रयोग से उत्पन्न सेलुलर तनाव20कोशिकाओं के भीतर नैनोकणों को मिलाकर हासिल किया गया था । एक पूरक धातु ऑक्साइड सेमीकंडक्टर (सीएमओएस) -माइक्रोफ्लुइडिक हाइब्रिड सिस्टम ली एट अल द्वारा विकसित किया गया था, जिसने चुंबकीय मोतियों के साथ टैग की गई व्यक्तिगत कोशिकाओं की गति को नियंत्रित करने के लिए सीएमओएस चिप में माइक्रो-इलेक्ट्रोमैग्नेट की एक सरणी एम्बेडेड की थी21।

एलन एट अल ने22कोशिकाओं का पता लगाने के लिए चुंबकीय "हॉट स्पॉट" के रूप में सूक्ष्म पैमाने, पूर्व-प्रोग्राम, चुंबकीय पैड का उपयोग किया। विशिष्ट उपकोशिकीय स्थानों पर नैनोकणों को स्थानीयकृत करने के लिए सूक्ष्म पैटर्न वाले चुंबकीय सरणी का उपयोग करकेकोशिकाओंके भीतर विशिष्ट गतिविधि को भी उत्तेजित किया जा सकता है । सेलुलर एमएनपी तेज सफलतापूर्वक जोंक, चूहा, औरमाउस प्राथमिक न्यूरॉन्स24, 25,26में प्रदर्शित किया गया है । यहां, यह एक चूहा PC12 pheochromocytoma सेल लाइन है, जो पहले MNPs27के उच्च तेज दिखाने के लिए सूचित किया गया है पर प्रदर्शन किया गया है । हाल के वर्षों में, एमएनपी के विभिन्न चिकित्सा अनुप्रयोग ों मेंकैंसर उपचार28, 29, 30,31में दवा वितरण और थर्मोथेरेपी शामिल हैं। विशेष रूप से, अध्ययन एमएनपी और न्यूरॉन नेटवर्क 32 ,33,34,35के अनुप्रयोगसे निपटतेहैं . हालांकि, एक एकल सेल स्तर पर MNPs का उपयोग कर न्यूरॉन्स के चुंबकीय संगठन आगे की जांच के हकदार हैं ।

इस काम में, न्यूरोनल व्यवस्था को नियंत्रित करने के लिए पूर्वसाइन्ड प्लेटफार्मों के माध्यम से स्थानीय चुंबकीय बलों को इंजीनियर करने के लिए एक बॉटम-अप दृष्टिकोण वर्णित किया गया है। एफएम मल्टीलेयर्स के माइक्रोन-स्केल पैटर्न का निर्माण प्रस्तुत किया गया है। यह अद्वितीय, एफएम बहुस्तरीय संरचना स्थिर लंबवत चुंबकीयकरण बनाती है जिसके परिणामस्वरूप सभी चुंबकीय पैटर्न की ओर प्रभावी आकर्षण बल होते हैं। इनक्यूबेशन के माध्यम से, MNPs PC12 कोशिकाओं में लोड किया गया, उंहें चुंबकीय संवेदनशील इकाइयों में बदल रहा है । एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं, चुंबकीय प्लेटफार्मों के ऊपर चढ़ाया और विभेदित, अधिमानतः चुंबकीय पैटर्न से जुड़े थे, और न्यूराइट आउटग्रोथ पैटर्न आकार के साथ अच्छी तरह से गठबंधन किया गया था, उन्मुख नेटवर्क बनाने । एफएम मल्टीलेयर्स और एमएनपी के चुंबकीय गुणों की विशेषता के लिए कई तरीकों का वर्णन किया गया है, और सेलुलर एमएनपी तेज और सेल व्यवहार्यता परख के लिए तकनीक भी प्रस्तुत की गई है। इसके अतिरिक्त, न्यूरोनल विकास और परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण के रूपोमेट्रिक पैरामीटर विस्तृत हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: जैव बचाव कैबिनेट में सभी जैविक प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करें।

1. चुंबकीय मंच निर्माण

  1. अश्म मुद्रण
    1. एक मुंशी कलम का उपयोग कर 2 x 2 सेमी2 में कांच स्लाइड कटें। कांच की स्लाइड्स को एसीटोन में साफ करें और फिर अल्ट्रा-सोनिकेशन बाथ में 5 मिनट के लिए आइसोप्रोपेनॉल करें । अल्ट्रा-हाई प्योरिटी (यूएचपी) नाइट्रोजन के साथ सूखा।
    2. 60 एस के लिए 6,000 आरपीएम पर स्पिन-कोटिंग का उपयोग करके फोटोरेसिस्ट के साथ ग्लास को कोट करें, 1.5 माइक्रोन मोटाई प्राप्त करने के लिए, और 60 एस के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें। फोटोमास्क या मास्क-कम लिथोग्राफी का उपयोग करके, वांछित पैटर्न के साथ, फोटोरेसिस्ट के लिए उपयुक्त तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके, एक प्रकाश स्रोत के लिए नमूना का पर्दाफाश करें।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आसुत पानी (DW) में पतला, डेवलपर में 40 एस के लिए विकसित करें; 45 एस के लिए DW में धोएं, और यूएचपी नाइट्रोजन गैस के साथ सूखें। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत पैटर्न का निरीक्षण करें।
  2. धूम जमा
    1. नमूना को बयान प्रणाली के मुख्य कक्ष में डालें और बेस प्रेशर (~ 5 ×10-8 टोर) की प्रतीक्षा करें। गैस प्रवाह खोलें; मानक स्पंदन (28 एससीसीएम [मानक घन सेमी प्रति मिनट) के लिए आर्गन प्रवाह निर्धारित करें। धूम लक्ष्य प्रज्वलित, तो 3 mTorr करने के लिए धूम दबाव सेट।
    2. प्रत्येक लक्ष्य पर तब तक शक्ति बढ़ाएं जब तक वांछित दर प्राप्त न हो जाए।
      नोट: पीडी दर: 0.62 ए /एस = 16 एस में 1.0 एनएम; सीओ80एफई20 रेट: 0.32 ए/एस, 0.2 एनएम में 6.25 एस।
    3. रोटेशन चालू करें। क्रमशः लक्ष्य शटर खोलकर और बंद करके, सीओ80एफई20 और पीडी लक्ष्यों के बीच बारी-बारी से एफएम मल्टीलेयर जमा करें। सीओ 80 एफई20 (0.2एनएम) /पीडी (1.0 एनएम) के 14 बाइलेयर्स जमा करें और अतिरिक्त 2 एनएम पीडी कैपिंग लेयर के साथ खत्म करें।
    4. लिफ्ट-ऑफ: नमूने को एसीटोन में 30 मिनट के लिए भिगो दें, और आइसोप्रोपैनॉल के साथ कुल्ला करें। फिर, यूएचपी नाइट्रोजन के साथ सूखें, और उपयोग तक एक स्वच्छ और शुष्क वातावरण में नमूना रखें।

2. परिवहन माप के माध्यम से चुंबकीय उपकरण का लक्षण वर्णन

  1. एफएम मल्टीलेयर के साथ जमा 100 माइक्रोन चौड़ाई के क्रॉस-आकार के मैग्नेटिक बार के साथ एसआई सब्सट्रेट या ग्लास स्लाइड का उपयोग करें (चित्रा 1C इनसेट देखें)। दो तरफा टेप का उपयोग कर धारक को नमूना संलग्न करें।
  2. एक तार बॉंडर का उपयोग करना, नमूने के लिए 4 तारों को बॉन्ड करें, क्रॉस इलेक्ट्रोड के प्रत्येक पैर पर एक। नमूना धारक और नमूना एक चुंबकीय क्षेत्र के साथ परिवहन माप प्रणाली के अंदर सेट ताकि चुंबकीय क्षेत्र नमूना करने के लिए लंबवत है । कमरे के तापमान पर माप करें।
  3. डिवाइस के ट्रांसवर्स वोल्टेज (वीटी)माप करें; चित्रा 1C (इनसेट) में चिह्नों का पालन करें: संपर्क 1 और 3 के बीच 1 एमए की धारा लागू करें; संपर्क 2 और 4 के बीच वीटी को मापने; फिर, 2 और 4 के बीच एक धारा लागू करें, और 1 और 3 के बीच वोल्टेज को मापें। अंत में, वी टी प्राप्त करने के लिए दोनों मापों के वोल्टेज के बीच अंतर की गणना करें और 2 से विभाजितकरें। दो माप विन्यास के बीच स्वचालित रूप से बदलने के लिए एक स्विचिंग सिस्टम का उपयोग करें।
  4. चुंबकीय क्षेत्र को 5 मीटर के चरणों में 0.4 टी से -0.4 टी के बीच स्वीप करें और वीटी को क्षेत्र के एक समारोह के रूप में मापें। असंगत हॉल सिग्नल निर्धारितकरने के लिए चुंबकीय क्षेत्र बनाम ट्रांसवर्स प्रतिरोध (वी टी/आई) को प्लॉट करें, जो फिल्म में लंबवत चुंबकीयकरण के आनुपातिक है ।

3. मैग्नेटोमेट्री मापन द्वारा एमएनपी और चुंबकीय मल्टीलेयर का लक्षण वर्णन

  1. एफएम मल्टीलेयर के लिए मैग्नेटोमेट्रिक माप
    1. एसआई सब्सट्रेट पर एफएम मल्टीलेयर जमा करें (धारा 1.2 देखें)। नमूना 4 x 4 मिमी2 आकार के 6 वर्गों में काट लें। नमूनों को दूसरे के शीर्ष पर ढेर करें और उन्हें चुंबकीय क्षेत्र की दिशा में कैप्सूल लंबवत में व्यवस्थित करें (चित्रा 1D इनसेट देखें)।
    2. कैप्सूल को मैग्नेटोमीटर में डालें और कमरे के तापमान पर मैग्नेटाइजेशन को मापें। -0.4 टी और 0.4 टी के बीच चुंबकीय क्षेत्र झाडू।
    3. चुंबकीय परत की मोटाई, नमूनों के आकार और सब्सट्रेट्स की संख्या को ध्यान में रखते हुए चुंबकीय सामग्री की कुल मात्रा की गणना करें। चुंबकीय सामग्री की कुल मात्रा से चुंबकत्व को विभाजित करें।
    4. चुंबकीय क्षेत्र बनाम चुंबकीकरण (प्रति यूनिट मात्रा) को प्लॉट करें। उच्च चुंबकीय क्षेत्र प्रतिक्रिया से सब्सट्रेट की डायमैग्नेटिक पृष्ठभूमि को घटाएं और ग्राफ से एफएम के संतृप्ति चुंबकीयकरण को एक्सट्रपलेशन करें।
  2. एमएनपी के लिए मैग्नेटोमेट्रिक माप
    1. एक सिंथेटिक बहुलक कैप्सूल में MNPs के एक नामित द्रव्यमान डालें। यदि छोटे चुंबकीय संतृप्ति मूल्यों को मापने के लिए एक बड़ी मात्रा पर विचार करें।
    2. अगर एमएनपी को सॉल्व करने में निलंबित कर दिया जाता है तो रातोंरात कैप्सूल खुला छोड़कर एमएनपी को सुखा लें। कैप्सूल को मैग्नेटोमीटर में डालें और कमरे के तापमान पर मैग्नेटाइजेशन को मापें। चुंबकीय क्षेत्र को -0.2 टी और 0.2 टी के बीच स्वीप करें।
    3. कण एकाग्रता द्वारा निर्धारित मात्रा को गुणा करके एमएनपी के कुल द्रव्यमान की गणना करें। परिणामों को 1 ग्राम तक सामान्य करें।
    4. सामान्यीकृत चुंबकीय (प्रति ग्राम) बनाम चुंबकीय क्षेत्र को प्लॉट करें। ग्राफ से एमएनपी के चुंबकीय संतृप्ति को एक्सट्रपलेशन करें।

4. कोलेजन-कोटिंग प्रोटोकॉल

  1. प्लास्टिक व्यंजन कोटिंग
    1. 0.01 एम एचसीएल को एचसीएल के 490 माइक्रोन को ऑटोक्लेव्ड डबल-डिस्टिल्ड वाटर (डीडीडब्ल्यू) के 500 एमएल में जोड़कर तैयार करें।
      नोट: केवल रासायनिक हुड में इस कदम को करें।
    2. तनु कोलेजन टाइप 1 (चूहे की पूंछ से समाधान) 1:60-1:80 में ०.०१ एम एचसीएल ५० μg/एमएल के अंतिम काम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए । 35 मिमी कल्चर डिश में पतला समाधान का 1.5 एमएल रखें। 1 घंटे के लिए हुड में पकवान छोड़ दें, कवर किया।
    3. समाधान निकालें, और बाँझ 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 3x धोएं। यह डिश सेल सीडिंग के लिए तैयार है।
  2. कोटिंग ग्लास स्लाइड
    1. तनु कोलेजन टाइप 1 (चूहे की पूंछ से समाधान) 1:50 में 30% v/v इथेनॉल । 35 मिमी डिश कोटिंग के लिए, 30% इथेनॉल के 1 मिलील में 20 माइक्रोन को कोलेजन जोड़ें।
    2. समाधान के साथ पकवान को कवर करें, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी समाधान वाष्पित न हो जाए, पकवान को कुछ घंटों के लिए खुला छोड़ दें। बाँझ 1x पीबीएस में 3x धोएं; ग्लास स्लाइड सेल सीडिंग के लिए तैयार है।

5. सेलुलर एमएनपी तेज और व्यवहार्यता

  1. सेलुलर एमएनपी तेज
    1. PC12 सेल कल्चर के लिए बेसिक ग्रोथ मीडियम तैयार करें 10% हॉर्स सीरम (एचएस), 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% एल-ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.2% एम्फोटेरिसिन रोसवेल पार्क मेडिकल इंस्टीट्यूट (RPMI) मीडियम, और फिल्टर को जोड़कर 0.22 माइक्रोन्सल फिल्टर का उपयोग करके।
    2. PC12 विभेदन माध्यम तैयार करने के लिए 1% हॉर्स सीरम (एचएस), 1% एल-ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 0.2% एम्फोटेरिसिन को आरपीएमआई माध्यम में जोड़ें, और 0.22 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
    3. बुनियादी विकास माध्यम के 10 एमएल के साथ एक गैर-इलाज संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं को बढ़ाएं; हर 2-3 दिनों में फ्लास्क में बुनियादी विकास माध्यम के 10 एमएल जोड़ें, और 8 दिनों के बाद कोशिकाओं को उप-संस्कृति करें।
    4. सेलुलर तेज के लिए, 200 × जी और कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, और सुपरनैंट त्यागें।
    5. फ्रेश बेसिक ग्रोथ मीडियम के 3 एमएल में सेल्स को रिस्पेंड करें। फिर, 200 × जी और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, और सुपरनैंट त्यागें। ताजा विभेदन माध्यम के 3 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
    6. कोशिका समूहों को तोड़ने के लिए एक सिरिंज और सुई का उपयोग करके कोशिकाओं को 10x करें। एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें, और एक नियमित रूप से अनकोटेड 35 मिमी डिश में 106 कोशिकाओं को बीज दें।
    7. वांछित एमएनपी एकाग्रता और कुल मात्रा को प्राप्त करने के लिए एमएनपी निलंबन की गणना की गई मात्रा और भेदभाव माध्यम की मात्रा में जोड़ें। कोशिकाओं, MNPs, और भेदभाव माध्यम मिलाएं; 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में पकवान को इनक्यूबेट करें।
    8. कमरे के तापमान पर 200 × जी पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र करें, और सुपरनेट को त्यागें। ताजा भेदभाव माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  2. एमएनपी-लोडेड सेल भेदभाव
    1. तेज प्रोटोकॉल (धारा 5.1) करें। बीज 8 × 104 एमएनपी-लोडेड कोशिकाएं 35 मिमी पर, कोलेजन प्रकार एल-लेपित डिश विभेदन माध्यम की उपस्थिति में (धारा 4.1 में कोलेजन कोटिंग प्रोटोकॉल देखें)। 24 घंटे के बाद, 1:100 ताजा मुरीन बीटा-तंत्रिका विकास कारक (β-एनजीएफ) (अंतिम एकाग्रता ५० एनजी/एमएल) जोड़ें ।
    2. विभेदन माध्यम को नवीनीकृत करें और हर 2 दिनों में ताजा मुरीन β-एनजीएफ जोड़ें। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर हर 2 दिनों में कोशिकाओं की छवि। नेटवर्क गठन (PC12 कोशिकाओं के लिए 6-8 दिन) के बाद, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कोशिकाओं की छवि, और कणों के फ्लोरेसेंस का निरीक्षण करें।
  3. एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं के लिए व्यवहार्यता परख: 2,3-बीआईएस-(2-मेथॉक्सी-4-नाइट्रो-5-सल्फोफेनिल) - 2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) सेल व्यवहार्यता परीक्षण।
    1. चरण 5.1.1 के अनुसार बुनियादी विकास माध्यम तैयार करें। विभिन्न सांद्रता (०.१ मिलीग्राम/एमएल, ०.२५ मिलीग्राम/एमएल, और ०.५ मिलीग्राम/एमएल बुनियादी विकास माध्यम में) और एक फ्लैट ९६-वेल प्लेट (१०० μL की कुल मात्रा/ 5% सीओ 2 में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें,37डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर।
    2. पृष्ठभूमि सुधार के लिए कोशिकाओं के बिना माध्यम युक्त खाली कुओं तैयार करें। उपयोग से तुरंत पहले 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में XTT रिएजेंट समाधान, और एन-मिथाइल डिबेनजोपिटीन मिथाइल सल्फेट युक्त प्रतिक्रिया समाधान को पिघलाएं। स्पष्ट समाधान प्राप्त होने तक धीरे-धीरे भंवर करें।
    3. एक 96-वेल प्लेट के लिए, एक्सटी रीएजेंट के 5 एमएल के साथ एक्टिवेशन सॉल्यूशन के 0.1 एमएल मिलाएं। प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया समाधान के 50 μL जोड़ें, थोड़ा कुओं में डाई के एक भी वितरण के लिए थाली हिला, और फिर 5 घंटे के लिए एक इनक्यूबेटर में थाली इनक्यूबेट ।
    4. 450 एनएम की तरंगदैर्ध्य में एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) रीडर का उपयोग करके खाली कुओं के खिलाफ नमूने के अवशोषण को मापें। 630 एनएम की तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके संदर्भ अवशोषण को मापें और इसे 450 एनएम माप से घटाएं।
    5. चूंकि 450 एनएम पर एक्सटीटीई रिएजेंट के साथ संस्कृति माध्यम में मामूली सहज अवशोषण होता है, इसलिए अन्य कुओं से खाली कुओं के औसत अवशोषण को घटाना। सेल नमूनों के रूप में एक ही परीक्षण सांद्रता पर MNPs के समानांतर नमूनों से संकेत मूल्यों घटाना ।
  4. एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं के लिए व्यवहार्यता परख: resazurin आधारित सेल व्यवहार्यता परीक्षण
    1. चरण 5.1.1 के अनुसार बुनियादी विकास माध्यम तैयार करें। 24 घंटे के लिए एक फ्लैट ९६-वेल प्लेट में ट्रिपलिटेट में नियंत्रण के रूप में विभिन्न सांद्रता (०.१ मिलीग्राम/एमएल, ०.२५ मिलीग्राम/एमएल, और ०.५ मिलीग्राम/एमएल) पर MNPs के साथ PC12 कोशिकाओं की खेती करें । 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं के बिना माध्यम युक्त खाली कुओं तैयार करें।
    2. कोशिकाओं को 1x पीबीएस से धोएं। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए मीडियम और इनक्यूबेटर में रिसज़ुरिन बेस्ड रिएजेंट (10% डब्ल्यू/वी) जोड़ें।
    3. एलिसा रीडर में नमूनों के 150 μL aliquots रखें, और 560 एनएम की एक उत्तेजन तरंग दैर्ध्य और 590 एनएम की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापने। सेल नमूनों के रूप में एक ही परीक्षण सांद्रता पर MNPs के समानांतर नमूनों से संकेत मूल्यों घटाना ।

6. प्रेरक युग्मित प्लाज्मा (आईसीपी) का उपयोग करके कोशिकाओं के अंदर एमएनपी एकाग्रता का लक्षण वर्णन

  1. चरण 5.1.1 के अनुसार बुनियादी विकास माध्यम तैयार करें। विभिन्न सांद्रता (०.१ मिलीग्राम/एमएल, ०.२५ मिलीग्राम/एमएल, और ०.५ मिलीग्राम/एमएल बुनियादी विकास माध्यम में) और एमएनपी के बिना एक फ्लैट ९६-वेल प्लेट (१०० μl/well की कुल मात्रा) में ट्रिपलिटेट में नियंत्रण के रूप में एमएनपी के साथ PC12 कोशिकाओं की खेती करें । 5% सीओ 2 में इनक्यूबेट,24घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर।
  2. निलंबन को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब (प्रत्येक अच्छी तरह से अलग से) में स्थानांतरित करें, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 × जी पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और सुपरनैंट को त्यागें। ताजा भेदभाव माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  3. कम से कम 15 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से अलग से 70% नाइट्रिक एसिड के 100 माइक्रोन के साथ उपचार द्वारा कोशिकाओं को Lyse। lysed कोशिकाओं में डीडीडब्ल्यू के 5 एमएल जोड़ें और समाधान फ़िल्टर करें।
  4. आईसीपी का उपयोग करके लोहे की एकाग्रता को मापें और प्रति सेल एफई एकाग्रता रिकॉर्ड करने के लिए सेल काउंट का उपयोग करें।

7. चुंबकीय मंच पर सेल भेदभाव और विकास

  1. 70% v/v/इथेनॉल के साथ पैटर्न वाले सब्सट्रेट को साफ करें और सब्सट्रेट को हुड में 35 मिमी कल्चर डिश में रखें। 1 मिनट के लिए पैटर्न वाले सब्सट्रेट के नीचे एक बड़ा चुंबक (~ 1500 ओई) रखें और पहले डिश को चुंबक से ऊपर और दूर ले जाकर चुंबक को हटा दें, और फिर चुंबक को हुड से बाहर निकालें। पराबैंगनी प्रकाश को 15 मिनट के लिए चालू करें।
  2. सेक्शन 4.2 के अनुसार कोलेजन टाइप 1 के साथ सब्सट्रेट को कोट करें। सेलुलर एमएनपी तेज (धारा 5.1), बीज 10 5 कोशिकाओं को35 मिमी संस्कृति पकवान में निलंबित करें, और भेदभाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। संस्कृति को 5% सीओ2में इनक्यूबेट करें, 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर।
  3. 24 घंटे के बाद, 1:100 ताजा मुरीन β-NGF (५० एनजी/एमएल की अंतिम एकाग्रता) जोड़ें । विभेदन माध्यम को नवीनीकृत करें और हर 2 दिनों में ताजा मुरीन β-एनजीएफ जोड़ें। प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हर 2 दिनों में कोशिकाओं की छवि बनाएं, और नेटवर्क गठन के बाद, कोशिकाओं (धारा 8.1) पर इम्यूनोस्टेटिंग करते हैं।

8. एमएनपी-लोडेड सेल धुंधला

  1. तुबुलिन इम्यूनोदाता
    1. 16% डब्ल्यू/वी पीएफए समाधान के 10 एमएल, 10x पीबीएस के 4 एमएल और डीडीडब्ल्यू के 26 एमएल मिलाकर 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड (पीएफए) समाधान तैयार करें। 1x पीबीएस के 50 एमएल में नॉन-आयनिक सर्फेक्टेंट के 500 माइक्रोन जोड़कर 1% पीबीटी का 50 एमएल तैयार करें। 1 प्रतिशत पीबीटी के 25 एमएल को मिलाकर 05 प्रतिशत पीबीटी का 50 एमएल तैयार करें। 0.25% पीबीटी में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन और 1% सामान्य गधा सीरम मिलाकर अवरुद्ध समाधान तैयार करें।
      नोट: केवल रासायनिक हुड के अंदर पीएफए का उपयोग करें।
    2. कोशिकाओं से सुपरनेट माध्यम निकालें। एक रासायनिक हुड के अंदर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% पीएफए में MNP-भरी हुई कोशिकाओं को ठीक करें । एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं को 1x पीबीएस में 3x, 5 मिनट प्रत्येक धोने, एक रासायनिक हुड के अंदर धोएं।
    3. एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 0.5% पीबीटी के साथ पार करें। एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं को पहले कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में और फिर खरगोश विरोधी α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान अवरुद्ध करने में इनक्यूबेट करें। 1x पीबीएस में एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं को 3x धोएं, प्रत्येक धोने में 5 मिनट।
    4. अंधेरे में और कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए Cy2-conjugated गधे विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ MNP भरी हुई कोशिकाओं को इनक्यूबेट । एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं को 1x पीबीएस में 3x, 5 मिनट प्रत्येक धोने को धोएं।
    5. कॉन्फोकल इमेजिंग करें। ट्यूबलिन के लिए, 492 एनएम की एक उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 510 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें। एमएनपी (रोडामाइन) के लिए 578 एनएम की एक्सटेंशन वेवलेंथ और 613 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें।
  2. 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) के साथ परमाणु धुंधला
    1. एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं को 1x पीबीएस में 3x, 5 मिनट प्रत्येक धोने को धोएं। नमूने के चारों ओर अतिरिक्त तरल निकालें, 22 मिमी x 22 मिमी के क्षेत्र को कवर करने के लिए DAPI युक्त बढ़ते माध्यम की 1 बूंद (~ 50 माइक्रोन) जोड़ें, और अंधेरे में और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं को 1x पीबीएस में 3x, 5 मिनट प्रत्येक धोने को धोएं। कॉन्फोकल इमेजिंग करें। DAPI के लिए, 358 एनएम की एक उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 461 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें। एमएनपी (रोडामाइन) के लिए 578 एनएम की एक्सटेंशन वेवलेंथ और 613 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें।

9. माप और सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एमएनपी-लोडेड सेल भेदभाव का मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण
    1. कोशिका निकाय से विभिन्न दूरी पर चौराहों की संख्या को मापने के लिए, एनजीएफ के साथ उपचार के बाद 3 दिनों तक सुसंस्कृत कोशिकाओं की चरण छवियों को प्राप्त करें।
      नोट: यदि बाद में किया जाता है, तो कोशिकाएं नेटवर्क विकसित कर सकती हैं, एकल-कोशिका संकल्प माप को रोक सकती हैं।
      1. इमेज प्रोसेसिंग प्रोग्राम, इमेजजे में छवियों को खोलें, और न्यूरोनजे प्लग-इन का उपयोग करें, जो एक अर्ध-स्वचालित न्यूराइट ट्रेसिंग और लंबाई माप36को सक्षम बनाता है। न्यूराइट ट्रेसर प्लग-इन का उपयोग करके, न्यूराइट्स का पता लगाएं और डेटा को बाइनरी इमेज में परिवर्तित करें। सोमा के केंद्र को परिभाषित करें।
      2. न्यूरोनजे प्लग-इन में उपलब्ध शोल विश्लेषण करें। अधिकतम त्रिज्या को परिभाषित करें। प्रयोग को तीन बार दोहराएं। प्रत्येक प्रयोग में 100 से अधिक कोशिकाओं का विश्लेषण करें।
  2. सेल स्थानीयकरण विश्लेषण
    1. इनक्यूबेशन के 3 दिनों के बाद चुंबकीय क्षेत्र पर स्थानीय कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए, एमएनपी तेज के साथ और बिना कोशिकाओं की कॉन्फोकल सूक्ष्म छवियों को प्राप्त करें। DAPI धुंधला (धारा 8.2) का प्रयोग करें।
    2. मैन्युअल रूप से कोशिकाओं को पैटर्न (छू कोशिकाओं) और कोशिकाओं के ऊपर या आंशिक रूप से गिनें जो नहीं हैं। तीन प्रयोगों के लिए दोहराएं। एमएनपी के साथ और तेज के बिना 400 से अधिक कोशिकाओं का विश्लेषण करें।
    3. कोशिकाओं की कुल संख्या से बाहर चुंबकीय पैटर्न के ऊपर हैं कि कोशिकाओं के सापेक्ष अनुपात की गणना, के साथ और MNPs के बिना । इसके अतिरिक्त, एक चुंबकीय पैटर्न पर लैंडिंग कोशिकाओं की यादृच्छिक संभावना निर्धारित करने के लिए पैटर्न चौड़ाई के लिए कोशिका शरीर व्यास जोड़कर चुंबकीय पैटर्न के प्रभावी क्षेत्र के प्रतिशत की गणना ।
    4. यह विश्लेषण करने के लिए एक एकल नमूना जेड-परीक्षण करें कि क्या सेल वितरण आइसोट्रोपिक सेल लैंडिंग का परिणाम है, या यदि चुंबकीय पैटर्न के लिए पसंदीदा पूर्वाग्रह है।
  3. विकास दिशात्मक विश्लेषण
    1. न्यूराइट आउटग्रोथ दिशात्मकता पर प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए, इनक्यूबेशन के 8 दिनों के बाद एमएनपी उपचार के साथ और बिना कोशिकाओं की कॉन्फोकल सूक्ष्म छवियों को प्राप्त करें। इम्यूनो-धुंधला (धारा 8.1) करें।
    2. इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, दोनों स्थितियों में सेल न्यूराइट और चुंबकीय धारियों के बीच कोण को मापें।
      नोट: चुंबकीय धारियों पर स्थित सोमासे से उत्पन्न होने वाले केवल न्यूराइट्स का विश्लेषण करें।
    3. धारियों (Δθ) की दिशा के सापेक्ष न्यूराइट्स के कोणों के वितरण की साजिश करें। यह प्रदर्शित करने के लिए Δθ के वितरण का ची-चुकता परीक्षण करें कि वितरण सामान्य या समान नहीं है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विभिन्न ज्यामितीय आकृतियों वाले चुंबकीय प्लेटफार्मों को निर्मित किया गया था(चित्रा 1A)। चुंबकीय पैटर्न स्पंदन द्वारा जमा किए गए थे: सीओ80एफई20 और पीडी के 14 मल्टीलेयर क्रमशः 0.2 एनएम और 1 एनएम। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ने चुंबकीय पैटर्न की कुल ऊंचाई ~ 18 एनएम(चित्रा 1 बी)होने का पता चला । यह अद्वितीय एफएम मल्टीलेयर जमाव सब्सट्रेट विमान के सापेक्ष लंबवत चुंबकीयकरण एनिसोट्रोपी (पीएमए) के साथ एक स्थिर मंच बनाता है जो एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं के आकर्षण को पूरे चुंबकीय पैटर्न की ओर सक्षम बनाता है और न केवल किनारों22,37तक। एफएम मल्टीलेयर संरचना के मापदंडों को मैग्नेटो-परिवहन मापन द्वारा चिह्नित किया गया था जिसके लिए एफएम मल्टीलेयर का एक क्रॉस-आकार का उपकरण गढ़ा गया था(चित्रा 1C इनसेट), और सब्सट्रेट के लिए चुंबकीकरण लंबवत को असंगत हॉल प्रभाव (एएचई)38के माध्यम से मापा गया था, जहां एएचई प्रतिरोध लंबवत चुंबकीयकरण के आनुपातिक है। एएचई बनाम चुंबकीय क्षेत्र माप ने पीएमए फेरोमोग्नेट्स(चित्रा 1C)का एक हिस्टीरेसिस लूप संकेत दिखाया। एफएम मल्टीलेयर्स (शून्य क्षेत्र में चुंबकीय क्षण) का अवशेष चुंबकीयकरण उच्च क्षेत्रों में चुंबकीय संतृप्ति (एमएस) केसमान था। इसके अलावा, एफएम मल्टीलेयर्स का बलपूर्वक क्षेत्र ~ 500 ओई था, जो 1,200 ओई पर संतृप्ति तक पहुंच गया था, जिसने डिवाइस के आसान चुंबकीयकरण को सक्षम किया और गैरइरादतन चुंबकीय क्षेत्रों के प्रभाव के खिलाफ स्थिरता सुनिश्चित की। मल्टीलेयर के एमएस मूल्य को मैग्नेटोमीटर(चित्रा 1D)का उपयोग करके मापा गया था, जैसा कि धारा 3.1 में वर्णित है। एमएस २७० ईएमयू/सेमी 3 था, जो इसी तरह कीसंरचनाओंके पिछले माप के बराबर है ।

फ्लोरोसेंट आयरन ऑक्साइड (γ - Fe2O3)एमएनपी पिछले प्रकाशन39के अनुसार तैयार किए गए थे . एमएनपी को नाभिक द्वारा संश्लेषित किया गया था, जिसमें लोहे के ऑक्साइड की छह स्तरित पतली फिल्मों को रोडामाइन आइसोथियोसायनेट और मानव सीरम एल्बुमिन के साथ कोटिंग के सहसंयोजक शामिल थे । ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक मापन के अनुसार, एमएनपी का शुष्क व्यास आकार ~15 एनएम था, जिसमें -45 की जीटा क्षमता थी। एमएनपी(चित्रा 2 ए)के मैग्नेटोमेट्रिक माप बताते हैं कि मैग्नेटाइजेशन कर्व में कोई उन्माद नहीं था, जो एमएनपी के सुपरपरामैग्नेटिक व्यवहार, ५०० ओई के कम संतृप्ति क्षेत्र और 22 ईएमयू/जी के अपेक्षाकृत उच्च एमएस का संकेत देता है । चुंबकीय पैटर्न का उपयोग कर सेल स्थानीयकरण को नियंत्रित करने के लिए, PC12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए लौह ऑक्साइड फ्लोरोसेंट एमएनपी के साथ मध्यम मिश्रित में इनक्यूबेटेड किया गया था, जिससे उन्हें चुंबकीय इकाइयों में बदल दिया गया था । माध्यम में एमएनपी एकाग्रता विविध हो सकती है; यह चढ़ाना प्रयोगों में ०.२५ मिलीग्राम/एमएल था । DAPI धुंधला(चित्रा 2B)के बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक छवियां ली गई थीं। MNPs PC12 कोशिकाओं ' सोमा में भली भांति थे, लेकिन नाभिक में नहीं है, जो केंद्र में अंधेरे छाया से परिलक्षित होता था । परिणाम बताते हैं कि नाभिक में कोई लाल फ्लोरेसेंस नहीं था, जो इंगित करता है कि एमएनपी को नाभिक में आंतरिक नहीं किया गया था या कोशिकाओं की बाहरी सतह से जुड़ा हुआ था । आईसीपी माप का उपयोग करके, PC12 कोशिकाओं में आंतरिक एमएनपी की मात्रा को निर्धारित करना संभव था। माध्यम(चित्रा 2C)में एमएनपी एकाग्रता में वृद्धि के साथ कोशिकाओं के अंदर लौह एकाग्रता में वृद्धि हुई।

एमएनपी की विभिन्न सांद्रता के लिए एमएनपी-लोडेड PC12 कोशिकाओं की व्यवहार्यता का मूल्यांकन XTT-और resazurin-आधारित परख का उपयोग करके किया गया था । चित्रा 3A एमएनपी उपचार के बाद PC12 कोशिकाओं से पता चलता है, बढ़ रही है और एक कोलेजन लेपित प्लास्टिक पकवान के ऊपर अंतर । भेदभाव पर आंतरिक MNPs के प्रभाव की जांच करने के लिए, Sholl रूपात्मक माप किया गया था । एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं और नियंत्रण कोशिकाओं(टी-टेस्ट,पी > 0.05, एन = 3)(चित्रा 3बी)के बीच सेल आकृति विज्ञान में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था। PC12 कोशिकाओं की मेटाबोलिक गतिविधि को विभिन्न एमएनपी सांद्रता के साथ सेल इनक्यूबेशन के बाद XTT-और resazurin-आधारित परख का उपयोग करके मापा गया था। परिणामों को MNPs के बिना PC12 कोशिकाओं के नियंत्रण माप को सामान्य बनाया गया था। एमएनपी की इन सांद्रता ने कोशिकाओं की ओर कोई महत्वपूर्ण साइटोटॉक्सिकिटी नहीं दिखाई, जो किसी भी तैयारी(टी-टेस्ट,पी > ०.०५, एन = 3)(चित्रा 3C,D)के लिए सेल व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण अंतर की कमी में स्पष्ट है । सेल प्लेटिंग और विकास पर एमएनपी के प्रभाव का निर्धारण एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं की तुलना गैर-लोडेड कोशिकाओं से करके किया गया था, चढ़ाया गया और समान चुंबकीय सब्सट्रेट्स पर उगाया गया । कोशिकाओं को वरीयता दी गई और सब्सट्रेट का पालन करने के लिए छोड़ दिया गया। हर 2 दिन में कोशिकाओं को ताजा माध्यम और एनजीएफ के साथ माना जाता था जैसा कि धारा 7 में वर्णित है । चित्रा 4 एमएनपी उपचार के साथ और बिना PC12 कोशिकाओं को दिखाता है, 20 माइक्रोन चौड़ी धारियों और 100 माइक्रोन स्पेसिंग के साथ चुंबकीय सब्सट्रेट पर बढ़ रहा है और अंतर करता है। विकास के 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं इम्यूनो दाग, DAPI दाग थे, और छवियों को ले जाया गया ।

चुंबकीय कोशिकाओं को चुंबकीय पैटर्न से जोड़कर देखना और पैटर्न के अनुसार शाखाएं उगाने के लिए पाया गया, जबकि एमएनपी उपचार के बिना कोशिकाओं में चुंबकीय उपकरणों(चित्रा 4A,बी)के लिए कोई आत्मीयता के साथ वृद्धि हुई । चित्रा 4C 200 माइक्रोन की एक तरफ लंबाई और 50 माइक्रोन की लाइन चौड़ाई के षट्कोणीय ज्यामिति के साथ एक सब्सट्रेट पर कोशिकाओं और नेटवर्क गठन की स्थिति प्रस्तुत करता है। कोशिकाओं को 6 दिनों के बाद चित्रित किया गया था। चुंबकीय कोशिकाएं चुंबकीय पैटर्न पर स्थित थीं, धारीदार सब्सट्रेट्स के समान आत्मीयता के साथ। कोशिका स्थिति चुंबकीय पैटर्न पर स्थित कोशिका निकायों की गिनती या उनसे जुड़ी द्वारा निर्धारित किया गया था। कोशिकाओं के सापेक्ष अनुपात की गणना कुल सेल आबादी से की गई थी। यह एमएनपी उपचार के साथ और बिना कोशिकाओं के लिए किया गया था। चुंबकीय प्रतिक्रिया के प्रभावी क्षेत्र की गणना चुंबकीय पैटर्न के दोनों किनारों में कोशिकाओं के व्यास (PC12 कोशिकाओं के लिए ~ 10 माइक्रोन) जोड़कर की गई थी। चुंबकीय धारी पैटर्न के लिए, प्रभावी चुंबकीय क्षेत्र अनुपात 33% था, जो चुंबकीय धारियों पर बेतरतीब ढंग से उतरने वाली कोशिकाओं की संभावना से मेल खाता था। परिणामों से पता चला है कि एमएनपी-लोडेड सेल निकायों का 75% चुंबकीय धारियों के संपर्क में था, जबकि संयुक्त राष्ट्र-चुंबकीय कोशिकाओं का केवल 35% धारियों (निष्पक्ष वितरण के साथ सांख्यिकीय समझौते में)(चित्रा 4D)पर स्थित था। सांख्यिकीय विश्लेषण से संकेत मिला कि माप मनमाने ढंग से सेल लैंडिंग (एक नमूना जेड-परीक्षण,पी < 10-6, एन = 430) से प्राप्त नहीं हुआ था।

इसके विपरीत, चुंबकीय हेक्सागोन के सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं के 92% सोमा चुंबकीय पैटर्न से जुड़े हुए थे, जबकि एमएनपी उपचार(चित्रा 4E)के बिना कोशिकाओं के लिए 38% की तुलना में। हेक्सागोन का प्रभावी क्षेत्र अनुपात सब्सट्रेट का 32% था। हेक्सागोन के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण ने यह भी संकेत दिया कि माप मनमाने ढंग से सेल लैंडिंग (एक नमूना जेड-टेस्ट, पी < 10-6, एन = 370) से प्राप्त नहीं हुआ था। परिणामों से चुंबकीय पैटर्न के लिए एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं की स्पष्ट वरीयता का पता चला, जबकि एमएनपी के बिना कोशिकाओं ने पूरे सब्सट्रेट का बेतरतीब ढंग से पालन किया । सेल-पोजिशनिंग प्रभाव के अलावा, ये चुंबकीय प्लेटफार्म बढ़ते न्यूराइट्स की दिशात्मकता को भी नियंत्रित करने के लिए पाए गए थे। चित्रा 5A एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं को न्यूराइट्स के साथ दिखाता है, जो धारियों के अभिविन्यास के अनुसार संरेखित होता है। इसके विपरीत, एमएनपी के बिना कोशिकाओं के नियंत्रण माप ने चुंबकीय पैटर्न की परवाह किए बिना मंच में न्यूराइट विकास दिखाया।

न्यूरोनल ग्रोथ डायरेक्शनलिटी पर चुंबकीय प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए न्यूराइट्स और मैग्नेटिक स्ट्राइप्स के बीच के कोण को मापा गया । आंकड़ों से पता चला है कि एमएनपी-लोडेड कोशिकाओं के 80% न्यूराइट्स ने धारियों की दिशा के सापेक्ष 15 डिग्री Δθ < के भीतर चुंबकीय धारियों के अभिविन्यास के साथ सहसंबंध प्रदर्शित किया। हालांकि, उस रेंज में विकसित एमएनपी के बिना कोशिकाओं के न्यूराइट्स का केवल 32%। एमएनपी उपचार के बिना कोशिकाओं ने चुंबकीय धारियों के साथ कोई संबंध नहीं दिखाया और एक समान कोण वितरण(चित्रा 5B) केअनुसार वृद्धि हुई। Δθ के वितरण के सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि यह सामान्य या समान नहीं था (ची-स्क्वायर टेस्ट, पी < ०.००१) । न्यूराइट विकास पर षट्कोणीय ज्यामिति के प्रभाव का भी प्रदर्शन किया गया। चित्रा 5C षट्कोणों के चुंबकीय पैटर्न और किनारों के बीच बड़े हलकों के ऊपर चुंबकीय और संयुक्त राष्ट्र-चुंबकीय PC12 कोशिकाओं के तंत्रिका नेटवर्क विकास की फ्लोरेसेंस छवियों को दिखाता है। हेक्सागन की साइड लंबाई 200 माइक्रोन थी और लाइनों की चौड़ाई 10 माइक्रोन थी; सर्कल व्यास 30 माइक्रोन था। सेल सोमस ने हलकों के लिए उच्च आत्मीयता दिखाई और षट्कोणीय रूपरेखा के साथ एक अच्छी तरह से उन्मुख तंत्रिका नेटवर्क विकसित किया। एक ज़ूम-इन छवि एक चुंबकीय सर्कल से जुड़ी कोशिकाओं को दर्शाती है और उन रूपरेखा(चित्रा 5D)के साथ बढ़ रही न्यूराइट्स ।

Figure 1
चित्र 1:चुंबकीय उपकरणों का लक्षण वर्णन। (ए)विभिन्न ज्यामितीय आकृतियों वाले चुंबकीय उपकरणों की ऑप्टिकल सूक्ष्म छवियां। स्केल बार = 200 माइक्रोन (बी)सीओ80 Fe 20/पीडीमल्टीलेयर की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक इमेज और मल्टीलेयर्स की एक योजनाबद्ध। चुंबकीय पैटर्न की कुल ऊंचाई 18 एनएम है। स्केल बार = 100 एनएम। (ग)एफएम के बलपूर्वक और अवशेष चुंबकीय क्षेत्रों को दिखाने वाले चुंबकीय उपकरण का असंगत हॉल प्रभाव माप । इनसेट: चिह्नित इलेक्ट्रोड के साथ डिवाइस की छवि । (घ)मल्टीलेयर डिवाइस के मैग्नेटोमेट्री प्रति मात्रा की गणना चुंबकीय संतृप्ति मूल्य से पता चलता है । इस आंकड़े को मार्कस एट अल३७से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त रूप: एएचई = असंगत हॉल प्रभाव; एफएम = फेरोमैग्नेटिक; B = चुंबकीय क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:एमएनपी का पीसी12 सेल तेज। (ए)कमरे के तापमान पर एमएनपी का मैग्नेटोमेट्रिक माप। (ख)PC12 कोशिकाओं द्वारा एमएनपी तेज की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि । नाभिक DAPI के साथ दाग; रोडामाइन के साथ लेबल किए गए एमएनपी कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन(सी)कई एमएनपी सांद्रता के साथ इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद PC12 कोशिकाओं द्वारा आंतरिक लोहे ऑक्साइड MNPs (स्नातकोत्तर) के आईसीपी माप। इस आंकड़े को मार्कस एट अल३७से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त रूप: MNPs = चुंबकीय नैनोकण; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; आईसीपी = प्रेरक रूप से युग्मित प्लाज्मा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:एमएनपी-लोडेड PC12 सेल व्यवहार्यता। (ए)विभेदित PC12 कोशिकाओं की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक छवियां एमएनपी के साथ इनक्यूबेटेड । तीर आंतरिक MNPs के साथ विभेदित न्यूराइट्स दिखाते हैं । स्केल बार = ५० एनएम । (ख)भेदभाव के 3 दिनों के बाद PC12 कोशिकाओं के न्यूराइट आउटग्रोथ का शोल विश्लेषण । (ग)इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद एमएनपी की बढ़ती सांद्रता के साथ व्यवहार किए गए PC12 कोशिकाओं की XTT व्यवहार्यता परख । माप को नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं। (घ)24 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद एमएनपी की सांद्रता बढ़ाने के साथ व्यवहार की गई PC12 कोशिकाओं की Resazurin आधारित व्यवहार्यता परख । माप को नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं। दोनों विश्लेषणों में इसका कोई सांख्यिकीय महत्व नहीं है । इस आंकड़े को मार्कस एट अल३७से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त रूप: MNPs = चुंबकीय नैनोकण; XTT = 2,3-बीआईएस-(2-मेथॉक्सी-4-नाइट्रो-5-सल्फोफेनिल) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:चुंबकीय उपकरणों के ऊपर सेल स्थानीयकरण। (ए)चुंबकीय धारियों पर बढ़ती एमएनपी के साथ भरी हुई PC12 कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियां: (i) α-ट्यूबलिन लेबलिंग, (ii) DAPI धुंधला, और (iii) विलय छवि । स्केल बार = 100 माइक्रोन (बी)एमएनपी उपचार के बिना PC12 कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियां, चुंबकीय धारियों के शीर्ष पर बढ़ रही हैं(ए)। (ग)षट्कोणीय चुंबकीय पैटर्न पर, एमएनपी के साथ और बिना पीसी12 कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस छवियां। स्केल बार = 200 माइक्रोन(D)कोशिका निकायों का प्रतिशत, एमएनपी के साथ और बिना, चुंबकीय धारियों पर स्थित है। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। बिंदीदार रेखा चुंबकीय धारियों पर उतरने वाली कोशिकाओं की संभावना का प्रतिनिधित्व करती है। (ई)कोशिका निकायों का प्रतिशत, एमएनपी के साथ और बिना, चुंबकीय हेक्सागोन पर स्थित है। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। बिंदीदार रेखा एक यादृच्छिक वितरण के लिए चुंबकीय पैटर्न पर उतरने वाली कोशिकाओं की संभावना का प्रतिनिधित्व करती है। दोनों विश्लेषणों में इसका कोई सांख्यिकीय महत्व नहीं है । इस आंकड़े को मार्कस एट अल३७से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त रूप: MNPs = चुंबकीय नैनोकण; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:न्यूरोनल नेटवर्क दिशात्मकता। (A)एमएनपी उपचार (बाएं) और एमएनपी उपचार (दाएं) के साथ α-ट्यूबलिन लेबल PC12 कोशिकाओं की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक छवियां, चुंबकीय धारियों के ऊपर बढ़ रही हैं । धारियों को चिह्नित किया जाता है। (ख)ध्रुवीय हिस्टोग्राम एमएनपी उपचार के साथ PC12 कोशिकाओं (बाएं) पर न्यूराइट दिशात्मक प्रभाव और (दाएं) एमएनपी उपचार के बिना प्रस्तुत करते हैं । अभिविन्यास कोण के विचलन को न्यूराइट्स और चुंबकीय धारी अभिविन्यास (15 डिग्री डिब्बे) के बीच कोण में अंतर के रूप में परिभाषित किया गया है। (ग)PC12 कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस छवियां एक चुंबकीय षट्कोणीय पैटर्न के ऊपर उगाई जाती हैं, (बाएं) एमएनपी उपचार के साथ और (दाएं) एमएनपी उपचार के बिना। स्केल बार = 200 माइक्रोन (D)चुंबकीय पैटर्न के अनुसार न्यूराइट विकसित करने वाली चुंबकीय कोशिका की जूम-इन छवि। स्केल बार = 30 माइक्रोन। इस आंकड़े को मार्कस एट अल३७से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त नाम: MNPs = चुंबकीय नैनोकणों। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रतिनिधि परिणाम माइक्रोन-स्केल पर न्यूरोनल नेटवर्क गठन को नियंत्रित करने और व्यवस्थित करने के लिए प्रस्तुत पद्धति की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करते हैं। एमएनपी-लोडेड PC12 कोशिकाएं व्यवहार्य रहीं और चुंबकीय संवेदनशील इकाइयों में तब्दील हो गईं जो एफएम इलेक्ट्रोड से विशिष्ट स्थलों तक चुंबकीय बलों द्वारा आकर्षित की गई थीं । यह सबसे अच्छा चित्रा 5Cमें प्रदर्शित किया जाता है, जहां कोशिकाओं को अधिमानतः हेक्सागोन के बड़े vertices का पालन किया और पतली लाइनों नहीं । इसके अलावा, कोशिकाओं की शाखाओं में बंटी भी चुंबकीय पैटर्न के बाद अनुकूल विकसित की है । सभी नियंत्रण प्रयोगों ने स्पष्ट रूप से प्रदर्शन किया कि चुंबकीय बलों ने कोशिका निकायों और वृद्धि के स्थानीयकरण का निर्देश दिया । यद्यपि यह प्रदर्शित किया गया था कि स्थलाकृतिक संकेतों का उपयोग न्यूराइट आउटग्रोथ40, 41 केनिर्देशनके लिए किया जा सकता है, यह यहां ऐसा नहीं है, क्योंकि एमएनपी के बिना कोशिकाओं ने पैटर्न के आकार का कोई जवाब नहीं दिखाया।

कई शोधकर्ताओं द्वारा इन तकनीकों को अपनाने की सुविधा देने वाली मानक फोटोलिथोग्राफी और स्पंदन डिपोशन का उपयोग करके स्थानीय चुंबकीय बलों को इंजीनियर करने के लिए एक बॉटम-अप दृष्टिकोण नियोजित किया गया था। नीचे दृष्टिकोण जटिल पैटर्न और आकार के डिजाइन में शोधकर्ताओं की जरूरतों के अनुसार स्वतंत्रता की अनुमति देता है, माइक्रोन के साथ सेंटीमीटर लंबाई क्षेत्रों के लिए पैमाने पर संकल्प । यद्यपि परिणाम ग्लास स्लाइड पर प्रदर्शित किए गए थे, सिद्धांत रूप में, अन्य जैव संगत सामग्रियों के ऊपर उपकरणों को तैयार करना संभव है जो वीवो चिकित्सीय अनुप्रयोगों जैसे न्यूरोनल रिकॉर्डिंग और उत्तेजना42,43के लिए लचीले इलेक्ट्रोड सरणी में उपयुक्त हैं।

मल्टीलेयर जमाव द्वारा प्राप्त ये अद्वितीय पीएमए प्लेटफॉर्म, पूरे चुंबकीय पैटर्न के साथ एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र का उत्पादन करते हैं और न केवल किनारों पर, जैसा कि पहले22देखा गया था। इसके अतिरिक्त, एफएमएस को एक बड़े अवशेष चुंबकीय संतृप्ति के साथ डिजाइन किया गया था, यानी, बाहरी चुंबकीय क्षेत्र को हटाए जाने पर भी इलेक्ट्रोड पूरी तरह से चुंबकीय रहते हैं और बाहरी चुंबक की आवश्यकता के बिना कोशिकाओं को आकर्षित करते रहते हैं। हालांकि, एक बाहरी चुंबकीय बल कोशिकाओं में एमएनपी को पूरी तरह से चुंबकीय बनाने में सहायता कर सकता है, इस प्रकार चढ़ाना के दौरान आकर्षण और दक्षता के बल में वृद्धि होती है। एफएम डिजाइन में एक महत्वपूर्ण विचार पुनरावृत्ति की संख्या थी । जबकि अधिक पुनरावृत्ति कुल चुंबकीय क्षण में वृद्धि करेगी, जो अनुकूल है, कई परतों को जोड़ने से परत इंटरमिक्सिंग में भी वृद्धि होगी, जिससे कम स्थिर पीएमए होगा और अंत में एक इन-प्लेन मैग्नेटाइजेशन44,45 आसान धुरी और इलेक्ट्रोड22,37के विभिन्न किनारों पर आकर्षण होगा। इसलिए, अधिकतम चुंबकीय क्षेत्रों के साथ स्थिर पीएमए सुनिश्चित करने के लिए एफएम संख्या और मल्टीलेयर की संरचना को अनुकूलित करना आवश्यक है।

प्रतिनिधि परिणामों में प्रस्तुत MNPs परीक्षण सांद्रता पर PC12 कोशिकाओं की ओर लगभग कोई विषाक्तता दिखाया, और न ही वे सेलुलर व्यवहार को प्रभावित किया, कोशिकाओं में प्रवेश करने में सक्षम होने के बावजूद और एक अपेक्षाकृत उच्च चुंबकीय क्षण होने । एक सेल पर आकर्षण बल सेल में एमएनपी की संख्या और प्रत्येक एमएनपी के चुंबकीय करण पर निर्भर करता है। आदर्श रूप में, दोनों उच्च होना चाहिए; हालांकि, दोनों के बीच ट्रेडऑफ हो सकता है । कुछ वाणिज्यिक एमएनपी के साथ, सेल व्यवहार्यता अच्छी थी, लेकिन चुंबकीय क्षण बहुत कमजोर था। प्रयोगशाला में निर्मित अन्य कणों के लिए, चुंबकीय क्षण अधिक था, लेकिन MNPs कुल और सेल व्यवहार्यता कम करने के लिए खड़ा था । इस प्रकार, सेल व्यवहार्यता का परीक्षण करना और एमएनपी चुनते समय उनके चुंबकीयकरण की विशेषता होना महत्वपूर्ण है। यहां इस्तेमाल होने वाले एमएनपी भी फ्लोरोसेंट होते हैं, जिससे कोशिकाओं में उनकी लोकेशन को ट्रैक करना आसान हो जाता है। परिणाम चुंबकीय पैटर्न के आकार के अनुसार विकसित होने वाले न्यूराइट्स को दिखाते हैं, और फ्लोरेसेंस न्यूराइट्स के साथ एमएनपी की उपस्थिति को इंगित करता है।

एमएनपी के आंतरिककरण तंत्र की कोशिकाओं में पहले46जांच की जा चुकी है . एमएनपी का सेलुलर तेज उनके आकार, आकार और सतह रसायन शास्त्र के अनुसार एंडोसाइटोसिस के माध्यम से होता है। पिछले अध्ययनों में न्यूरॉन्स24में विभिन्न प्रकार के एमएनपी के तेज की जांच की गई थी . लेपित एमएनपी का सेलुलर तेज अनकोटेड एमएनपी के सेलुलर तेज से बेहतर था । जैसा कि चित्र 3 ए,बीमें दिखाया गया है, एमएनपी को साइटोप्लाज्म में आंतरिक किया गया था, लेकिन नाभिक से बाहर रहे और उनके विकास के दौरान न्यूराइट्स को स्थानांतरित कर दिया गया। इसके अतिरिक्त, एनजीएफ सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करने वाले एनजीएफ को संयोजित एमएनपी को भी एंडोसाइटोसिस47,48के माध्यम से कोशिकाओं में आंतरिक रूप दिया गया था ।

समाप्त करने के लिए, यह पेपर जैविक तत्व संगठन की आवश्यकता वाले अनुसंधान के लिए चुंबकीय हेरफेर का एक प्रभावी टूलबॉक्स प्रस्तुत करता है। चुंबकीय बलों का उपयोग कोशिकाओं की स्थिति को सक्षम बनाता है, जो न्यूराइट विकास का निर्देशन करता है। यह विधि जटिल ज्यामितीय आकृतियों वाले प्लेटफार्मों के डिजाइन को सक्षम बनाती है। चुंबकीय आकर्षण की ताकतों को समय के साथ चुंबकीय बल परिदृश्य को बदलकर तंत्रिका नेटवर्क गठन में दूर से हेरफेर करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है। इस पूरी पद्धति को आसानी से अन्य कारकों या रसायनों को नियंत्रित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है जिन्हें एमएनपी में जोड़ा जा सकता है और उन्हें माइक्रोन-स्केल संकल्प के साथ ब्याज के पूर्वनियोजित बिंदुओं पर लाया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

इस शोध को इजराइल के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय और इजरायली साइंस फाउंडेशन (569/16) द्वारा समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 173 चुंबकीय नैनोकण लंबवत चुंबकीयकरण एनिसोट्रोपी (पीएमए) चुंबकीय लक्षित दवा वितरण चुंबकीय कोशिका हेरफेर तंत्रिका संस्कृति तंत्रिका इंजीनियरिंग जैव-इंटरफेसिंग फोटोलिथोग्राफी चुंबकीय मल्टीलेयर
इंटरकनेक्टेड न्यूरॉन्स के माइक्रोन-स्केल संगठन के लिए चुंबकीय प्लेटफार्मों का निर्माण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., … More

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter