Summary
この研究は、神経組織の制御のための局所的な磁力のエンジニアリングへのボトムアップアプローチを提示する。磁気ナノ粒子(MpPs)を搭載したニューロン様細胞は、垂直磁化を有するマイクロパターンプラットフォームによってプレート化され、制御される。また、磁気特性評価、MNP細胞取り込み、細胞生存率、および統計解析も記載されています。
Abstract
神経細胞を組織化されたニューラルネットワークに導く能力は、再生医療、組織工学、バイオインターフェースに大きな影響を与えます。多くの研究は、化学と地形の手がかりを使用してニューロンを指示することを目的としています。しかし、大規模な地域に対するミクロン規模の組織管理の報告はほとんどありません。ここでは、マイクロパターン化された磁気要素を埋め込んだ磁気プラットフォームを用いて、ニューロンをプリセット部位に配置し、ニューロンの成長をミクロンスケールの解像度で誘導するための効果的な方法が説明されている。磁気ナノ粒子(MpPs)を用いたニューロンの負荷は、磁気勾配の影響を受ける可能性のある敏感な磁気単位に変換することが実証されています。このアプローチに続いて、一般的なニューロンのようなモデルであるPC12細胞がメッキされ、超常磁性ナノ粒子がロードされた独自の磁気プラットフォームが製造されました。磁気パターンに対する有効な吸引力を与えるために、安定した垂直磁化を有する強磁性(FM)多層の薄膜を堆積させた。これらのMNP搭載PC12細胞は、磁気プラットフォームの上にメッキされ、分化され、磁気パターンに優先的に付着し、神経突起伸長はパターン形状とよく一致し、指向性ネットワークを形成した。磁気特性の定量的特性評価方法、細胞MNP取り込み、細胞生存率、および結果の統計的分析が提示される。このアプローチは、ニューラルネットワーク形成の制御を可能にし、磁力の操作を通じてニューロンと電極の界面を改善し、ネットワークのインビトロ研究に有効なツールとなり、新しい治療バイオインターフェーシングの方向性を提供する可能性がある。
Introduction
ニューロンの微細パターン化は、組織再生1、2、3、4、5および神経電子デバイス6、7、8の開発に大きな可能性を秘めている。しかし、生体組織と同様に、高い空間分解能におけるニューロンのミクロンスケール位置付けは、重大な課題を提起する。このスケールで事前に設計された構造を形成するには、相馬運動性および軸索の成長を局所的に制御することによって神経細胞プロセスの指導が必要である。これまでの研究では、神経細胞の成長を導く化学および物理的手掛かり9、10、11、12の使用が示唆されている。ここでは、磁場勾配13、14、15、16、17による細胞位置制御に焦点を当てた新しいアプローチで、MNPを搭載した細胞を磁気感受性ユニットに変え、遠隔操作することができる。
Kunzeらは、磁気チップおよびMNP負荷細胞を用いて細胞応答を誘導するために必要な力を特徴づけたが、細胞内の機械的緊張によって初期軸索伸長が引き起こされ得ることを証明した。Tay et al. は、高められた磁場勾配を有するマイクロ加工基材が、カルシウム指標染料19を用いてMNPを添加した神経回路の無線刺激を可能にすることを確認した。さらに、Tsengら.は細胞内に合体したナノ粒子を合体し、細胞張張20に近づく局在したナノ粒子媒介力を生じる。これは、機械的な力に対する細胞応答を研究するのに役立つマイクロ磁気基質の定義されたパターンの製造につながった。局在したナノ粒子媒介力の適用から生じる細胞張力は、細胞20内のナノ粒子を合体させることによって達成された。相補的な金属酸化物半導体(CMOS)-マイクロ流体ハイブリッドシステムは、CMOSチップにマイクロ電磁石の配列を埋め込み、磁気ビーズ21でタグ付けされた個々の細胞の動きを制御するLeeらによって開発された。
Alonら. 細胞22を見つけるためにマイクロスケール、事前にプログラムされた磁気パッドを磁気「ホットスポット」として使用した。また、マイクロパターン化された磁気アレイを用いて細胞内で特異的活性を刺激し、特定の細胞内位置23でナノ粒子を局地化することもできる。細胞MNPの取り込みが、リーチ、ラット、およびマウスの一次ニューロン24、25、26で実証された。ここで、これはラットPC12褐色細胞株で実証されており、これは以前にMp27の高い取り込み量を示すことを報告されている。近年、がん治療における薬物送達や熱療法など、28,29,30,31の様々な医療用途が行われている。具体的には、研究は、Mpとニューロンネットワーク32、33、34、35のアプリケーションを扱う。しかし、単一細胞レベルでMPを使用するニューロンの磁気組織は、さらなる調査に値する。
この研究では、ボトムアップアプローチが、神経の配置を制御するための事前に設計されたプラットフォームを介して局所的な磁力を設計するために記述されている。FM多層のミクロンスケールパターンの製作が発表されました。このユニークなFM多層構造は、安定した垂直磁化を生み出し、すべての磁気パターンに対する効果的な吸引力をもたらします。インキュベーションを介して、MPはPC12細胞にロードされ、磁気感受性ユニットに変換された。MNPに装填された細胞は、磁気プラットフォームの上にメッキされ、分化され、磁気パターンに優先的に結合され、神経突起の成長はパターン形状とよく一致し、指向性ネットワークを形成した。FM多層およびMNPsの磁気特性を特徴づけるためのいくつかの方法が説明されており、細胞MNP取り込みおよび細胞生存アッセイの技術も提示されている。さらに、神経成長の形態測定パラメータと結果の統計的分析が詳細に示されます。
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Protocol
注:バイオセーフティキャビネットですべての生物学的反応を行います。
1. 磁気プラットフォームの製造
- リトグラフ
- スクリバーペンを使ってガラスのスライドを2 x 2 cm2 に切ります。ガラススライドをアセトンで洗浄し、イソプロパノールを5分間超音波式浴で洗浄します。超高純度(UHP)窒素で乾燥します。
- 60sのスピンコーティングを使用してフォトレジストでガラスをコーティングし、厚さ1.5μmを達成し、100°Cで60sで焼きます。光抵抗体に適当な波長を用いて、フォトマスクまたはマスクレスリソグラフィを用いて、試料を光源に露出する。
- メーカーの指示に従って蒸留水(DW)で希釈し、開発者の40 sのために開発します。DWで45sで洗浄し、UHP窒素ガスで乾燥させます。光学顕微鏡でパターンを検査します。
- スパッタ堆積
- 蒸着システムのメインチャンバーにサンプルを挿入し、ベース圧力(10-8 トル×5まで待ちます)。ガスの流れを開きます。標準スパッタリング(28 sccm[標準立方体cm/分)のアルゴンフローを設定する]スパッタターゲットを点火し、スパッタ圧力を3 mTorrに設定します。
- 目的のレートが達成されるまで、各ターゲットの電力を増やします。
注意: Pd レート: 0.62 A/s = 1.0 nm in 16 s;Co80Fe20 レート: 0.32 A/s, 0.2 nm in 6.25 s. - 回転をオンにします。FMマルチレイヤーを、Co80Fe20とPdターゲットの間で交互に、それぞれターゲットシャッターを開閉して堆積する。Co 80 Fe20(0.2nm)/Pd(1.0 nm)の14の二重層を堆積させ、さらに2nm Pdキャッピング層で仕上げ。
- リフトオフ:サンプルをアセトンに30分間浸し、イソプロパノールですすいでください。その後、UHP窒素で乾燥し、使用するまで清潔で乾燥した環境でサンプルを保管してください。
2. 輸送測定による磁気デバイスの特性
- FMマルチレイヤーを搭載した、幅100μmの十字形の磁気バーを備えたSi基板またはガラススライドを使用します( 図1C インセットを参照)。両面テープを使用してサンプルをホルダーに取り付けます。
- ワイヤーボンダを用いて、4本のワイヤを試料に結合し、クロス電極の各脚に1本ずつ接続する。サンプルホルダーとサンプルを、磁場を持つ輸送測定システム内に設定し、磁場がサンプルに対して垂直になるようにします。室温で測定を行います。
- デバイスの横電圧(VT)測定を行います。 図1C( 差し込み)のマーキングに従ってください:接点1と3の間に1mAの電流を適用します。接点2と4の間のVT を測定する。次に、2と4の間の電流を印加し、1と3の間の電圧を測定します。最後に、両方の測定値の電圧と2で割った電圧の差を計算してVTを得る。スイッチ・システムを使用して、2つの測定構成を自動的に切り替えます。
- 5 mTのステップで0.4 Tから-0.4 Tの間の磁場を掃引し、フィールドの関数としてVT を測定する。横方向抵抗(VT/I)と磁場をプロットして、フィルム内の垂直磁化に比例する異常なホール信号を求めます。
磁気測定によるMpと磁気多層の特徴
- FM多層用マグネトメトリック測定
- FM多層をSi基板に堆積させる(セクション1.2を参照)。サンプルを4×4mm2 サイズの6つの正方形に切ります。サンプルを一方の上に積み重ね、磁場の方向に垂直なカプセルに配置します( 図1D のインセットを参照)。
- カプセルを磁力計に挿入し、室温で磁化を測定します。-0.4 T と 0.4 T の間で磁場を掃引します。
- 磁性層の厚さ、サンプルのサイズ、および基板数を考慮して、磁性体の総体積を計算します。磁化を磁性体の総体積で割る。
- 磁化(単位体積当たり)と磁場をプロットします。高磁場応答から基板の対磁性背景を引き、グラフからFMの飽和磁化を推定します。
- MP用マグネトメトリック測定
- 合成ポリマーカプセルに、指定された量のMPを挿入します。磁化飽和度の小さい値を測定する場合は、大きな体積を考慮してください。
- MPが溶媒に懸濁している場合は、カプセルを一晩開いたままにしてMPを乾燥させます。カプセルを磁力計に挿入し、室温で磁化を測定します。-0.2 T と 0.2 T の間の磁場を掃引します。
- 指定された体積に粒子濃度を掛けることで、MNPs の総質量を計算します。結果を 1 g に正規化します。
- 正規化磁化(グラム当たり)と磁場をプロットします。グラフから、MpMp の磁化飽和度を推定します。
4. コラーゲンコーティングプロトコル
- プラスチック皿のコーティング
- 500 mLのオートクレーブ二重蒸留水(DDW)にHCl 490 μLを加えて0.01 M HClを準備します。
注:このステップは、化学フードでのみ実行してください。 - 0.01 M HClで1:60-1:80のコラーゲンタイプ1(ラットの尾からの溶液)を希釈し、50μg/mLの最終作業濃度を得た。希釈液1.5mLを35mmの培養皿に入れます。1時間フードに皿を残し、覆われた。
- 溶液を取り出し、滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3倍洗浄する。皿は細胞の播種の準備ができている。
- 500 mLのオートクレーブ二重蒸留水(DDW)にHCl 490 μLを加えて0.01 M HClを準備します。
- コーティングガラススライド
- 希釈コラーゲン1(ラットテールからの溶液)30%v/vエタノールで1:50。35mmの皿をコーティングする場合は、20μLのコラーゲンを1mLの30%エタノールに加えます。
- 溶液で皿を覆い、すべての溶液が蒸発するまで待って、皿を数時間覆い残します。滅菌1x PBSで3倍を洗浄します。ガラススライドは、セルの播種の準備ができています。
5. 細胞MNPの取り込みと生存率
- セルラー MNP の取り込み
- 10%馬血清(HS)、5%のウシ血清(FBS)、1%L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.2%アンホテリシンをロズウェルパーク医学研究所(RPMI)培地に加え、0.22 μmナイロンフィルターを使用してフィルターを加え、PC12細胞培養用の基本的な成長培地を調製します。
- 1%馬血清(HS)、1%L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および0.2%アンホテリシンをRPMI培地に加え、PC12分化培地を調製し、0.22μmナイロンフィルターを使用してフィルターを加えます。
- 10 mLの塩基性増殖培地を用いた非処理培養フラスコで細胞を増殖させる。2~3日ごとに10mLの塩基性増殖培地をフラスコに加え、8日後に細胞をサブ培養する。
- 細胞の取り込みのために、遠心管内の細胞懸濁液を200×gと室温で8分間遠心し、上清を捨てます。
- 新鮮な塩基性増殖培地の3mLで細胞を再懸濁する。再度、細胞懸濁液を200×gと室温で5分間遠心し、上清を捨てる。新鮮な分化培地の3 mLで細胞を再懸濁します。
- 細胞を10x吸引し、注射器と針を使って細胞クラスターを分解する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、通常のコーティングされていない35mm皿に106 個の細胞を播種します。
- MNP懸濁液の計算された体積と分化媒体の体積を皿に加えて、所望のMNP濃度および総体積を達成する。細胞、MP、および分化媒体を混合します。37°Cで5%CO2加湿インキュベーターで24時間、皿をインキュベートします。
- 細胞懸濁液を室温で200×gで5分間遠心し、上清を捨てる。新鮮な分化培地の1mLで細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて細胞を数える。
- MNP ロードされたセルの分化
- 取り込みプロトコルを実行します(セクション5.1)。種子8×35mm上の104 MNP負荷細胞、分化媒体の存在下でのコラーゲン型lコーティング皿(セクション4.1のコラーゲンコーティングプロトコルを参照)。24時間後、 1:100 新鮮なマウス β-神経成長因子 (β-NGF) (最終濃度 50 ng/mL) を追加します。
- 分化培地を更新し、2日ごとに新鮮なネズミβ-NGFを追加します。光学顕微鏡を使用して2日ごとに細胞を画像化します。ネットワーク形成後(PC12細胞の場合は6~8日)、共焦点顕微鏡を用いて細胞を画像化し、粒子の蛍光を観察する。
- MNP負荷細胞の生存アッセイ:2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキシニリド(XTT)細胞生存率試験。
- ステップ 5.1.1 に従って基本成長培地を準備します。異なる濃度(0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、塩基成長培地で0.5mg/mL)、平らな96ウェルプレート(総体積100μL/ウェル)で三重化制御のためのMPなしで、異なる濃度のMNPsを有するPC12細胞を培養する。細胞を5%CO2で24時間培養し、37°Cで加湿インキュベーターを加湿する。
- 背景補正のためのセルなしの媒体を含む空白の井戸を準備します。XTT試薬溶液を解凍し 、N-メチルジベンゾピラジンメチル硫酸塩)を含む反応溶液を使用直前に37°C浴中に使用した。明確な溶液が得られるまで、穏やかに旋回します。
- 1つの96ウェルプレートの場合、XTT試薬5 mLと活性化溶液0.1 mLを混合します。各ウェルに反応液50μLを加え、ウェル内の染料の均等な分布のためにプレートをわずかに振り、5時間インキュベーターでプレートをインキュベーターにインキュベートします。
- 波長450nmの酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)リーダーを用いて、ブランクウェルに対するサンプルの吸光度を測定します。波長630nmを使用して基準吸光度を測定し、450nmの測定から差し引きます。
- XTT試薬と共に450nmでインキュベートした培養培地にわずかな自発的な吸光度が生じるので、他のウェルの平均吸光度からブランクウェルの平均吸光度を差し引く。細胞サンプルと同じ試験濃度で、MNPsの並列サンプルから信号値を引きます。
- MNP搭載細胞の生存率アッセイ:レサズリンベースの細胞生存率試験
- ステップ5.1.1に従って基本的な成長培地を準備する。異なる濃度(0.1 mg/mL、0.25mg/mL、塩基成長培地で0.5mg/mL)でMNPsを有するPC12細胞を培養し、24時間の平らな96ウェルプレートで三重化する制御としてMPなしで培養する。37°Cで5%CO2インキュベーターで24時間細胞をインキュベートする。 セルなしの培地を含む空白の井戸を準備します。
- 1倍のPBSで細胞を洗います。レサズリン系試薬(10%w/v)を培地に加え、37°Cインキュベーターで2時間インキュベートします。
- ELISAリーダーにサンプルの150 μLアリコートを置き、励起波長560nm、発光波長590nmで吸光度を測定します。細胞サンプルと同じ試験濃度のMNPsの並列サンプルから信号値を引きます。
誘導結合血漿(ICP)を用いた細胞内MNP濃度の特性評価
- ステップ5.1.1に従って基本的な成長培地を準備する。異なる濃度(0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、塩基成長培地で0.5mg/mL)、平らな96ウェルプレート(総体積100 μL/ウェル)で三重化制御としてMPなしで、MNPsを用いてPC12細胞を培養します。5%CO2でインキュベートし、37°Cで24時間加湿する。
- 懸濁液を遠心管(各ウェルから別々)に移し、200×gの遠心分離細胞を室温で5分間移動し、上清を捨てます。新鮮な分化培地の1mLで細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて細胞を数える。
- 100 μLの硝酸を100 μLずつ、少なくとも15分間別々に取り付けて細胞をライスします。5 mL の DDW をリセドセルに加え、溶液をフィルター処理します。
- ICPを使用して鉄濃度を測定し、細胞数を使用して細胞あたりのFe濃度を記録します。
7. 磁気プラットフォーム上での細胞分化と成長
- 70%v/v/エタノールでパターン化された基材を洗浄し、ボンネット内の35mm培養皿に基板を入れます。パターン化された基板の下に大きな磁石(約1500 Oe)を1分間置き、まず皿を磁石から上下に動かして磁石を取り外し、マグネットをボンネットから取り出します。紫外線を15分間点灯します。
- セクション4.2に従って、コラーゲン1型で基材をコーティングします。細胞MNP取り込み後(セクション5.1)、35mm培養皿中の105細胞を種子、2mLの分化培地を加えて細胞を懸濁させる。培養液を5%CO2で培養し、37°Cで加湿インキュベーターを行う。
- 24時間後、1:100新鮮なマウスβ-NGF(50 ng /mLの最終濃度)を加えます。分化培地を更新し、2日ごとに新鮮なネズミβ-NGFを追加します。光顕微鏡を用いて2日毎に細胞を画像化し、ネットワーク形成後、細胞上で免疫染色を行う(セクション8.1)。
8. MNPにロードされた細胞染色
- チューブリン免疫染色
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を16%w/v PFA溶液、4 mLの10x PBS、および26 mLのDDWを混合して調製します。50mLの1%PBTを、非イオン性界面活性剤の500 μLを1x PBSの50 mLに加えて調製します。25 mLの1x PBSで1%PBTの25 mLを混合して、0.5%PBTの50 mLを調製します。0.25%PBTで1%ウシ血清アルブミンと1%の正常ロバ血清を混合することによってブロッキング溶液を調製する。
注:PFAは化学フードの内側にのみ使用してください。 - 上清培地を細胞から取り出します。MNPに搭載された細胞を化学フード内部の室温で15分間、4%PFAで固定します。MNPにロードされた細胞を1x PBSで3倍、各洗浄ごとに5分、化学フードの中で洗います。
- MNPにロードした細胞を0.5%PBTで10分間透過させます。MNPにロードされた細胞を室温で45分間ブロッキング溶液にインキュベートし、次にウサギの抗α尿管抗体を4°Cで一晩ブロッキング溶液にインキュベートします。 MNPにロードされた細胞を1x PBSで3倍、各洗浄ごとに5分洗浄します。
- MNPに搭載された細胞を、暗闇の中で室温で45分間、Cy2コンジュゲートロバ抗ウサギ二次抗体でインキュベートします。MNPを装填した細胞を3倍のPBSで3倍、各洗浄で5分洗います。
- 共焦点イメージングを実行します。チューブリンの場合は、励起波長492nm、発光波長510nmを使用してください。MNPs(ローダミン)の場合、励起波長578nm、発光波長613nmを使用してください。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を16%w/v PFA溶液、4 mLの10x PBS、および26 mLのDDWを混合して調製します。50mLの1%PBTを、非イオン性界面活性剤の500 μLを1x PBSの50 mLに加えて調製します。25 mLの1x PBSで1%PBTの25 mLを混合して、0.5%PBTの50 mLを調製します。0.25%PBTで1%ウシ血清アルブミンと1%の正常ロバ血清を混合することによってブロッキング溶液を調製する。
- 4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)での核染色
- MNPを装填した細胞を3倍のPBSで3倍、各洗浄で5分洗います。サンプルの周りに余分な液体を取り除き、DAPIを含む取り付け媒体の1滴(約50μL)を加えて22mm x 22mmの領域を覆い、暗闇の中で室温で5分間インキュベートします。
- MNPを装填した細胞を3倍のPBSで3倍、各洗浄で5分洗います。共焦点イメージングを実行します。DAPI の場合、励起波長は 358 nm、発光波長は 461 nm です。MNPs(ローダミン)の場合、励起波長578nm、発光波長613nmを使用してください。
9. 測定と統計分析
- MNP負荷細胞分化の形態測定解析
- 細胞体から様々な距離での交点数を測定するために、培養細胞の位相画像をNGFで処理した後3日まで取得する。
注: 後で行った場合、セルはネットワークを開発し、単一セル解像度の測定を妨げる可能性があります。- 画像処理プログラムImageJで画像を開き、ニューロンJプラグインを使用して、半自動神経突起トレースと長さ測定36を可能にする。Neurite トレーサー プラグインを使用して、neurite をトレースし、データをバイナリイメージに変換します。ソーマの中心を定義します。
- ニューロンJプラグインで利用可能なSholl分析を実行します。最大半径を定義します。実験を3回繰り返します。各実験で100以上の細胞を分析します。
- 細胞体から様々な距離での交点数を測定するために、培養細胞の位相画像をNGFで処理した後3日まで取得する。
- 細胞ローカリゼーション分析
- 3日間のインキュベーション後に磁気領域に局在する細胞の割合を決定するために、MNP取り込みの有無にかかわらず細胞の共焦点顕微鏡画像を取得する。DAPI 染色を使用します(セクション8.2)。
- パターンの上または部分的にパターン (接触するセル) と、ないセルの上に手動でセルをカウントします。3つの実験について繰り返します。MNPで、取り込みなしで400以上の細胞を分析します。
- MNP の有無にかかわらず、細胞の総数の中から磁気パターンの上にある細胞の相対的な割合を計算します。
- 単一サンプル Z-test を実行して、細胞分布が等方性セルの着陸の結果であるか、または磁気パターンに好ましいバイアスがあるかを分析します。
- 成長方向性分析
- 神経突起伸長方向に対する影響を定量化するために、8日間のインキュベーション後にMNP処理の有無にかかわらず細胞の共焦点顕微鏡画像を取得する。免疫染色を行う(セクション8.1)。
- ImageJソフトウェアを使用して、両方の条件で細胞の神経突起と磁気ストライプの間の角度を測定します。
注: 磁気ストライプ上にある somas から発生するニューライトのみを解析します。 - 線分の方向を基準としたニューライトの角度の分布をプロットします(Δθ)。Δθの分布のカイ二乗検定を実行して、分布が正規または均一ではないことを実証します。
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Representative Results
異なる幾何学的形状を持つ磁気プラットフォームが製造された(図1A)。磁気パターンはスパッタリングによって堆積した:Co80Fe20およびPdの14の多層、0.2nmおよび1nm、それぞれ。電子顕微鏡は、磁気パターンの全高が〜18nmであることを明らかにした(図1B)。このユニークなFM多層堆積は、MNPにロードされたセルを全体の磁気パターンに対して引き付け、エッジ22、37だけでなく、基板面に対して垂直磁化異方性(PMA)を有する安定したプラットフォームを作成する。FM多層構造のパラメータは、FM多層の架橋装置を製作した磁気輸送測定(図1Cインセット)を特徴とし、基板に垂直な磁化を異常ホール効果(AHE)38を介して測定し、AHE抵抗は垂直磁化に比例する。AHE対磁場測定は、PMA強磁性素子を示すヒステリシスループを示した(図1C)。FM多層(ゼロ場での磁気モーメント)の残磁化は、高磁場における磁化飽和度(MS)と同一であった。また、FM多層の保磁場は~500Oeで、1,200 Oeで飽和に達し、装置の磁化が容易になり、意図しない磁場の影響に対する安定性を確保しました。マルチレイヤーのMS値は、項3.1に記載されているように磁力計(図1D)を用いて測定した。MSは270 emu/cm3で、これは同様の構造の以前の測定値と同等である。
蛍光酸化鉄(γ-Fe2O3)MpMpは、前の出版物39に従って調製した。MNPsは、酸化鉄からローダミンイソチオシアネートへの6層薄膜の共有結合結合およびヒト血清アルブミンによるコーティングを含む核化によって合成された。透過電子顕微鏡測定によれば、MNPsの乾燥直径径は-45のゼータ電位で~15nmであった。MNPsの磁気測定(図2A)は、磁化曲線にヒステリシスがなく、MpMpの超常磁性挙動、500Oeの低飽和磁場、および22 emu/gの比較的高いMSを示しています。磁気パターンを用いた細胞の局在化を制御するために、PC12細胞を24時間酸化鉄蛍光MNPsと混合した培地でインキュベートし、磁気単位に変換した。培地中のMNP濃度は変化させることができる。めっき実験では0.25mg/mLであった。共焦点顕微鏡画像は、DAPI染色後に撮影した(図2B)。MPはPC12細胞のソーマに内在したが、核には内部化されず、中央の暗い影によって反射された。その結果、核に赤い蛍光が存在せず、MNPが核に内在化されなかったか、細胞の外表面に結合していたことが示された。ICP測定を用いて、PC12細胞に内部化されたMNPsの量を定量化することが可能であった。培地中のMNP濃度の増加に伴って細胞内の鉄濃度が増加する(図2C)。
異なる濃度のMNP負荷PC12細胞の生存率を、XTT-およびレサズリンベースアッセイを用いて評価した。図3Aは、MNP処理後のPC12細胞を、コラーゲン被覆プラスチック皿の上に増殖および分化することを示す。分化に対する内在化されたMNPsの影響を調べるために、Sholl形態測定を行った。MNPにロードされた細胞とコントロール細胞との間の細胞形態に有意な差は認められなかった(t-test,p > 0.05, n = 3) (図3B)。PC12細胞の代謝活性を、異なるMNP濃度で細胞インキュベーションした後のXTT-およびレサズリンベースアッセイを用いて測定した。結果は、MPを使用しないPC12細胞の制御測定に正規化した。これらのMNP濃度は、細胞に対して有意な細胞毒性を示さなかったが、いずれの調製物(t-test、p>0.05、n=3)の細胞生存率の有意な差がないことに明らかである(図3C、D)。MNP搭載細胞を非装填細胞と比較し、同一の磁気基質でメッキおよび増殖させることにより、MNPが細胞めっきおよび発生に及ぼす影響を判断した。細胞を播種し、基質に付着させたままにした。2日ごとに、細胞はセクション7に記載されているように新鮮な培地およびNGFで処理した。図4は、MNP処理の有無にかかわらずPC12細胞を示し、20μm幅のストライプと100μmの間隔を持つ磁気基板上で成長し、分化しています。3日後、細胞を免疫染色、DAPI染色、および画像を採取した。
磁化された細胞は、磁気パターンに付着し、パターンに従って枝を成長させることが判明したが、MNP処理を行わない細胞は磁気デバイスに対する親和性を持たずに増殖した(図4A、B)。図4Cは、側面長200μm、ライン幅50μmの六角形幾何形状を有する基質上の細胞とネットワーク形成の位置を示す。細胞は6日後に画像化した。磁化された細胞は、縞状の基質と同様の親和性を有する磁気パターン上に位置していた。細胞の位置決めは、磁気パターンに位置する細胞体を数えたり、それらに付着して定量化した。細胞の相対比率は、細胞母集団全体から計算した。これは、MNP治療の有無にかかわらず細胞に対して行われた。磁気応答の有効面積は、磁気パターンの両辺に細胞の直径(PC12細胞の場合は10μm程度)を加えて算出した。磁気ストライプパターンの場合、有効磁面積比は33%であり、磁気ストライプ上にランダムに細胞が着陸する確率に対応した。その結果、MNPにロードされた細胞体の75%が磁気ストライプと接触しているのに対し、非磁化セルの35%だけがストライプ上に位置していた(非偏分布との統計的一致で)ことを示した(図4D)。統計分析は、測定が任意の細胞の着陸(1サンプルz-test、p<10-6、n=430)から得られていないことを示した。
これに対し、磁気六角形の統計解析では、MNPを装填した細胞のソーマの92%が磁気パターンに結合し、MNP処理を行わない細胞では38%であった(図4E)。六角形の有効面積比は基板の32%であった。六角形の統計解析では、測定が任意のセルランディング(1サンプルz-test、p<10-6、n =370)から導出されなかったことも示された。 その結果、MNP負荷細胞の磁気パターンに対する明確な好みが明らかになったが、MNPを持たない細胞は基板全体にランダムに付着した。細胞位置決め効果に加えて、これらの磁気プラットフォームは、成長する神経突起の方向性も制御することが判明した。図5Aは、MNPにロードされた細胞を、縞の向きに従って整列する神経突起を含む。対照的に、MPを持たない細胞の制御測定は、磁気パターンに関係なく、プラットフォーム全体で神経突起の成長を示した。
神経細胞の成長方向に対する磁気効果を評価するために、神経突起と磁気ストライプとの間の角度を測定した。このデータから、MNPにロードされた細胞の神経突起の80%が、ストライプ方向に対してΔθ<15°以内の磁気ストライプの方位と相関を示すことが明らかになった。しかし、その範囲で発達したMPを持たない細胞の神経突起の32%しか発達していない。MNP処理を行わない細胞は、磁気ストライプとの相関を示さず、均一な角度分布に従って成長した(図5B)。Δθの分布の統計分析は、それが正規または均一ではないことを明らかにしました(カイ二乗検定、p<0.001)。六角形の幾何学が神経突起の成長に及ぼす影響も実証された。図5Cは、六角形の磁気パターンとエッジ間の大きな円の上に磁化および非磁化されたPC12細胞のニューラルネットワーク開発の蛍光画像を示す。六角形の側の長さは200 μmで、線幅は10μmでした。円径は30μmであった。細胞のソマは円に対して高い親和性を示し、六角形の輪郭に沿って指向性のニューラルネットワークを開発した。拡大画像は、磁界に取り付けられたセルと、それらの輪郭に沿って成長する神経突起を示しています(図5D)。
図1: 磁気デバイスの特性評価( A) 様々な幾何学的形状を有する磁気デバイスの光学顕微鏡画像スケールバー=200μm(B)Co80 Fe20/Pd多層の走査型電子顕微鏡像と多層の概略。磁気パターンの全高は18 nmです。縮尺バー = 100 nm。(C)FM.インセットの磁界の強制・残膜を示す磁気デバイスの異常ホール効果測定:印の電極を有する装置の画像。(D)多層デバイスの磁気測定は、体積当たりに算出される磁化飽和値を示す。この図は、マーカスら37から変更されています。略語: AHE = 異常なホール効果;FM = 強磁性;B = 磁場。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PC12細胞の取り込み(A)室温でのMNPsの磁気測定(B)PC12細胞によるMNP取り込みの共焦点顕微鏡画像。DAPIで染色された核;ローダミンで標識されたMNPsは細胞に入る。スケールバー=10μm(C)ICP測定は、いくつかのMNP濃度でインキュベーションの24時間後にPC12細胞によって内部化された酸化鉄MNPs(pg)の測定。この図は、マーカスら37から変更されています。略語: MP = 磁性ナノ粒子;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール;ICP = 誘導結合プラズマ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MNP負荷PC12細胞生存率(A)MpNPsでインキュベートされた分化されたPC12細胞の共焦点顕微鏡画像。矢印は内部化されたMpNPsを有する分化された神経突起を示す。(B)分化3日後のPC12細胞の神経突起伸長のSholl分析(C)インキュベーションの24時間後にMNPsの濃度を増加させて処理したPC12細胞のXTT生存アッセイ。測定は、制御するために正規化されます。(D) 24時間のインキュベーション後にMNPsの濃度を増加させて処理したPC12細胞のレサズリン系生存アッセイ。測定は、制御するために正規化されます。両方の分析には統計的有意性はありません。この図は、マーカスら37から変更されています。略語: MP = 磁性ナノ粒子;XTT = 2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルフォフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキシニリド。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:磁気デバイス上の細胞局在化.(A)磁気ストライプ上に成長するMNNを搭載したPC12細胞の蛍光画像:(i)αチューブリン標識、(ii)DAPI染色、および(iii)合成画像。スケールバー= 100 μm(B) MNP処理を行わないPC12細胞の蛍光画像は、(A)のように磁気ストライプの上に成長する。(C)PC12細胞の蛍光画像は、MPの有無にかかわらず、六角形の磁気パターン上にある。スケールバー = 200 μm(D) 磁気ストライプ上に配置された MNP の有無にかかわらず、セル本体の割合。誤差範囲は標準偏差を表します。点線は、磁気ストライプにセルが着陸する確率を表します。(E) 磁気六角形上に位置する、MNP の有無にかかわらず、細胞体の割合。誤差範囲は標準偏差を表します。点線は、ランダム分布の磁気パターンに細胞が着陸する確率を表します。両方の分析には統計的有意性はありません。この図は、マーカスら37から変更されています。略語: MP = 磁性ナノ粒子;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ニューロンネットワーク方向性(A)MNP治療を伴うαチューブリン標識PC12細胞の共焦点顕微鏡画像(左)とMNP治療なし(右)、磁気ストライプの上に成長する。ストライプがマークされます。(B)極性ヒストグラムは、MNP処理を行わないPC12細胞(左)とMNP処理なし(右)に対する神経突起指向性効果を示す。方向角度の偏差は、ニューライトと磁気ストライプ方向(15°ビン)の角度の差として定義されます。(C)磁気六角形パターンの上に成長したPC12細胞の蛍光画像、MNP処理を伴う(左)とMNP処理なし(右)スケールバー= 200 μm(D) 磁気パターンに従って神経突起を発生する磁化セルのズームイン画像。スケールバー= 30 μmこの図は、マーカスら37から変更されています。略語: MP=磁気ナノ粒子この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
代表的な結果は、ミクロンスケールでのニューロンネットワーク形成を制御および組織するための提示された方法論の有効性を示す。MNP搭載PC12細胞は生存可能なままで、FM電極から特定の部位への磁力によって引き付けられた磁気感受性ユニットに変換された。これは、セルが細い線ではなく六角形の大きな頂点に優先的に接着した図5Cで最もよく示されています。また、細胞の分岐も磁気パターンに従って良好に発達した。すべての制御実験は、磁気力が細胞体の局在化と成長を指示したことを明確に示した。地形的な手掛かりが神経突起の伸び40、41を導くために使用できることが実証されたが、これは、MpMpを持たない細胞がパターンの形状に反応を示さなかったので、ここではそうではない。
ボトムアップアプローチを採用して、多くの研究施設で利用可能な標準的なフォトリソグラフィとスパッタリング堆積物を使用して、局所的な磁力を設計し、多くの研究者によるこれらの技術の採用を促進しました。ボトムアップアプローチは、研究者のニーズに応じて複雑なパターンや形状の設計を自由に行い、センチメートルの長さの領域に対するミクロンスケールの解像度を可能にします。その結果はガラススライド上で実証されたが、原則として、神経細胞の記録および刺激42,43のための柔軟な電極アレイのような生体内治療用途に適した他の生体適合性材料の上にデバイスを調製することができる。
これらのユニークなPMAプラットフォームは、多層堆積によって達成され、先に観察された22のように、エッジだけでなく、全体の磁気パターンに沿って強い磁場を生成する。さらに、FMは、大きな残磁化飽和、すなわち外部磁界を除去しても電極が完全に磁化されたままで、外部磁石を必要とせずに細胞を引き付け続ける設計されています。しかし、外部磁力は細胞内のMMPを完全に磁化するのを助け、めっきの間に引き付けおよび効率の力を高めることができる。FM設計における重要な考慮事項は、繰り返しの数でした。より多くの繰り返しは、有利である総磁気モーメントを増加させるが、多くの層を追加することも、層の混合を増加させ、安定性の低いPMAを引き起こし、最終的に面内磁化44、45の容易な軸および電極22、37の異なるエッジへの引き付けをもたらす。したがって、最大磁場で安定したPMAを確保するために、多層のFM数と組成を最適化する必要があります。
代表的な結果で提示されたMPは、試験された濃度でPC12細胞に対する毒性をほとんど示さなかったし、細胞に入ることができ、比較的高い磁気モーメントを有するにもかかわらず、細胞行動に影響を与えなかった。細胞の吸引力は、細胞内のMPの数と各MNPの磁化によって異なります。理想的には、両方とも高いはずです。ただし、両者の間にはトレードオフが存在する可能性があります。一部の商用議員では、細胞の生存率は良好であったが、磁気モーメントは弱すぎた。実験室で製造された他の粒子では、磁気モーメントは高かったが、Mpは凝集する傾向があり、細胞の生存率は低かった。したがって、MNを選択する際には、細胞の生存率をテストし、磁化を特徴付ける必要があります。ここで使用されるMPも蛍光であり、細胞内の位置を追跡することが容易になります。結果は、磁気パターンの形状に従って発達するニューライトを示し、蛍光はニューライトに沿ったMNPの存在を示す。
MNPsの細胞への内部化メカニズムは、以前に46を調査しました。Mpの細胞の取り込みは、その大きさ、形状、および表面化学に応じてエンドサイトーシスを介して起こる。これまでの研究では、異なるタイプのMPをニューロン24に取り込む方法を調べた。コーティングされたMPの細胞取り込みは、コーティングされていないMPの細胞取り込みよりも優れていた。図3A,Bに示すように、MPは細胞質に内在していたが、核の外にとどまり、発達中に神経突起に移された。さらに、NGFシグナル伝達経路を活性化したNGFに結合したMPも、エンドサイトーシス47,48を介して細胞内に内在化した。
この論文は、生体要素組織を必要とする研究に対する磁気操作の有効なツールボックスを提示する。磁力を使用することで、細胞の位置決めが可能になり、神経突起の成長を導きます。このメソッドは、複雑な幾何学的形状を持つプラットフォームの設計を可能にします。磁気的な魅力の力は、時間の経過とともに磁力の風景を変えることによって、神経ネットワーク形成を遠隔操作するように設計することができる。この方法論全体を簡単に拡張して、MNPsに結合できる他の要因や化学物質を制御し、ミクロンスケールの分解能で事前に設計された関心点に導くことができます。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、イスラエル科学技術省とイスラエル科学財団(569/16)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 15710 | |
| 6-well cell culture plate | FALCON | 353846 | |
| 96-well cell culture plate | SPL life sciences | 30096 | |
| Amphotericin B solution | Biological Industries | 03-028-1B | |
| AZ 1514H photoresist | MicroChemicals GmbH | ||
| AZ 351 B developer | MicroChemicals GmbH | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Biological Industries | 03-010-1B | |
| Cell and Tissue cultur flask | Biofil | TCF002250 | 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One | 627-160 | 35 mm |
| Cell Proliferation Kit (XTT-based) | Biological Industries | 20-300-1000 | |
| Centrifuge tube | Biofil | CFT021500 | 50 mL |
| Co80Fe20 at% sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Collagen type I | Corning Inc. | 354236 | Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-165-152 | |
| DAPI fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Disposable needle | KDL | 23 G | |
| Disposable syringe | Medispo | 1160227640 | 10 mL |
| Donor horse serum | Biological Industries | 04-124-1A | |
| ELISA reader | Merk Millipore | BioTek synergy 4 hybrid microplate reader | |
| Ethanol 70% | ROMICAL LTD | 19-009102-80 | |
| Ethanol absolute (Dehydrated) | Biolab-chemicals | 52505 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| Fresh murine β-NGF | Peprotech | 450-34 | |
| GMW C-frame electromagnet . | Buckley systems LTD | 3470, 45 mm | |
| Hydrochloric acid 32% | DAEJUNG CHEMICAL & METALS | 4170-4100 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health, Bethesda | NeuronJ plugin | |
| Inductively coupled plasma (ICP) | Ametek Spectro | SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma | |
| Keithley source-measure | Keithley | 2400 | |
| Keithley switching system | Keithley | 3700 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Light microscope | Leica | DMIL LED | |
| Maskless photolithography | Heidelberg Inst. | MLA150 | |
| Microscope Slides | BAR-NAOR | BN1042000C | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 438073 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Sigma | D9663 | |
| PBS 10x | hylabs | BP507/1LD | |
| PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
| Pd sputter target | ACI Alloys | 99.95% | |
| Penicillin-streptomycin nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| PrestoBlue cell viability reagent | Molecular probes | A-13261 | resazurin-based |
| Rabbit antibody to α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | ||
| RF magnetron sputtering system | Orion AJA Int. | Orion 8 | |
| RPMI 1640 with l-glutamine | Biological Industries | 01-100-1A | |
| Sonication bath | KUDOS | SK3210HP | Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W |
| SQUID magnetometer | Quantum Design, CA | ||
| Triton X-100 | CHEM-IMPEX INTERNATIONAL | 1279 | non-ionic surfactant |
| XTT cell viability reagent |
References
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