Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tillverkning av magnetiska plattformar för mikron-skala organisation av sammankopplade nervceller

Published: July 14, 2021 doi: 10.3791/62013
Automatic Translation
1,4, 2,4, 2,4, 1,4, 2,4, 2,4, 3,4, 2,4, 1,4
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Summary

Detta arbete presenterar en bottom-up strategi för konstruktion av lokala magnetiska krafter för kontroll av neuronal organisation. Neuronliknande celler laddade med magnetiska nanopartiklar (MNPs) pläteras ovanpå och styrs av en mikromönstrad plattform med vinkelrät magnetisering. Också beskrivna är magnetisk karakterisering, MNP cellupptag, cell livskraft och statistisk analys.

Abstract

Förmågan att leda nervceller till organiserade neurala nätverk har stora konsekvenser för regenerativ medicin, vävnadsteknik och biointerfacing. Många studier har syftat till att styra nervceller med kemiska och topografiska signaler. Det är dock ont om rapporter om organisatorisk kontroll i mikronskala över stora områden. Här har en effektiv metod beskrivits för att placera nervceller på förinställda platser och styra neuronal utväxt med mikron-skala upplösning, med hjälp av magnetiska plattformar inbäddade med mikromönstrade, magnetiska element. Det har visat sig att belastning av nervceller med magnetiska nanopartiklar (MNPs) omvandlar dem till känsliga magnetiska enheter som kan påverkas av magnetiska gradienter. Efter detta tillvägagångssätt har en unik magnetisk plattform tillverkats där PC12-celler, en vanlig neuronliknande modell, pläterades och laddades med superparamagnetiska nanopartiklar. Tunna filmer av ferromagnetic (FM) multilayers med stabil vinkelrät magnetisering deponerades för att ge effektiva attraktion krafter mot de magnetiska mönstren. Dessa MNP-laddade PC12 celler, pläterade och differentierade ovanpå de magnetiska plattformarna, var företrädesvis knutna till de magnetiska mönstren, och neurit utväxt var väl i linje med mönster form, bilda orienterade nätverk. Kvantitativa karakteriseringsmetoder för de magnetiska egenskaperna, cellulära MNP upptag, cell livskraft och statistisk analys av resultaten presenteras. Detta tillvägagångssätt möjliggör kontroll av neural nätverksbildning och förbättrar neuron-till-elektrodgränssnittet genom manipulering av magnetiska krafter, vilket kan vara ett effektivt verktyg för in vitro-studier av nätverk och kan erbjuda nya terapeutiska biointerfacing riktningar.

Introduction

Mikropapper av nervceller har stor potential för vävnadsregenerering1,2,3,4,5 och utvecklingen av neuroelektronatiska enheter6,7,8. Den mikronskalade positionering av nervceller med hög rumslig upplösning, som i biologiska vävnader, utgör dock en betydande utmaning. Att bilda fördesignade strukturer i denna skala kräver vägledning av nervcellsprocesser genom att lokalt kontrollera soma motilitet och axonal utväxt. Tidigare studier har föreslagit användning av kemiska och fysiska signaler9,10,11,12 för att vägleda neuronal tillväxt. Här fokuserar ett nytt tillvägagångssätt på att styra cellpositionering med magnetiska fältgradienter13,14,15,16,17, vilket förvandlar celler laddade med MNPs till magnetiska känsliga enheter, som kan fjärrmanipuleras.

Kunze et al., som karakteriserade kraften som behövs för att inducera cellulära svar med hjälp av magnetiska chip- och MNP-laddade celler, bevisade att tidig axonal förlängning kan utlösas av mekanisk spänning inuti celler18. bekräftade att mikrofabrikat med förbättrade magnetiska fältgradienter möjliggör trådlös stimulering av neurala kretsar som är doserade med MNPs med kalciumindikatorfärger19. Dessutom sammansmäckade Tseng et al. nanopartiklar inuti celler, vilket resulterade i lokaliserade nanopartikelmedlade krafter som närmade sig cellspänning20. Detta ledde till tillverkning av definierade mönster av mikromagnetiska substrat som hjälpte till att studera cellulärt svar på mekaniska krafter. Cellulära spänningar som härrör från tillämpningen av lokaliserade nanopartiklar medierade krafter uppnåddes genom sammanslagning nanopartiklar icellerna 20. Ett kompletterande halvledarsystem för metalloxid (CMOS)-mikrofluidiskt hybridsystem utvecklades av Lee et al. som inbäddade en rad mikroelektromagneter i CMOS-chippet för att styra rörelsen hos enskilda celler märkta med magnetiskapärlor 21.

Alon et al. använde mikroskale, förprogrammerade, magnetiska kuddar som magnetiska "hotspots" för att lokalisera celler22. Specifik aktivitet kan också stimuleras i celler med mikromönstrad magnetisk matris för att lokalisera nanopartiklar på specifika subcellulära platser23. CellulärT MNP upptag har framgångsrikt visats i leech, råtta och mus primära nervceller24,25,26. Här har detta visats på en råtta PC12 ferokroocytom cellinje, som tidigare har rapporterats visa högt upptag av MNPs27. Under de senaste åren har det funnits olika medicinska tillämpningar av MNPs, inklusive läkemedelsleverans och termoterapi icancerbehandlingar 28,29,30,31. Specifikt handlar studier om tillämpningen av MNPs och neuronnätverk32,33,34,35. Men den magnetiska organisationen av nervceller som använder MNPs på en encellig nivå förtjänar ytterligare undersökning.

I detta arbete har en bottom-up-metod beskrivits för att konstruera lokala magnetiska krafter via fördesignade plattformar för att kontrollera neuronala arrangemang. Tillverkningen av mikron-skala mönster av FM multilayers har presenterats. Denna unika, FM-flerskiktade struktur skapar stabil vinkelrät magnetisering som resulterar i effektiva attraktionskrafter mot alla magnetiska mönster. Via inkubation laddades MNPs i PC12 celler, omvandla dem till magnetiska känsliga enheter. MNP-laddade celler, pläterade och differentierade ovanpå de magnetiska plattformarna, var företrädesvis knutna till de magnetiska mönstren, och neurit utväxten var väl i linje med mönsterformen, bildar orienterade nätverk. Flera metoder har beskrivits för att karakterisera de magnetiska egenskaperna hos FM-multiskikten och MNPs, och tekniker för cellulära MNP-upptag och cell livskraft analyser har också presenterats. Dessutom är morfometriska parametrar för neuronal tillväxt och statistisk analys av resultaten detaljerade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Utför alla biologiska reaktioner i ett biosäkerhetsskåp.

1. Magnetisk plattformstillverkning

  1. litografi
    1. Skär glas glider in i 2 x 2 cm2 med en skrivare penna. Rengör glaset glider i aceton och sedan isopropanol i 5 min vardera i ett ultraljudsbad. Torka med ultrahög renhet (UHP) kväve.
    2. Täck glaset med fotoresist med spinnbeläggning vid 6 000 varv/min i 60 s, uppnå 1,5 μm tjocklek och grädda vid 100 °C i 60 s. Exponera provet för en ljuskälla med hjälp av en lämplig våglängd för fotoresist, med önskat mönster, med hjälp av en fotomask eller maskfri litografi.
    3. Utveckla i 40 s i en utvecklare, utspädd i destillerat vatten (DW) enligt tillverkarens instruktioner; tvätta i DW i 45 s och torka med UHP-kvävegas. Inspektera mönstret under ett optiskt mikroskop.
  2. Sputterdeposition
    1. För in provet i huvudkammaren i depositionssystemet och vänta på bastryck (~5 × 10-8 Torr). Öppna gasflödet; ställ in argonflödet för standardsputtring (28 fmcm [standard kubik cm per min) häri. Tänd sputtermålen och ställ sedan sputtertrycket på 3 mTorr.
    2. Öka effekten på varje mål tills önskad hastighet uppnås.
      OBS: Pd-hastighet: 0,62 A/s = 1,0 nm i 16 s; Co80Fe20-hastighet: 0,32 A/s, 0,2 nm på 6,25 s.
    3. Slå på rotationen. Sätt in FM-multiskiktet, alternera mellan Co80Fe20- och Pd-målen, genom att öppna respektive stänga målluckorna. Deponera 14 bilayers co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm) och avsluta med ytterligare 2 nm Pd-kapningsskikt.
    4. Lyft: Blötlägg provet i aceton i 30 minuter och skölj med isopropanol. Torka sedan med UHP-kväve och håll provet i en ren och torr miljö tills det används.

2. Karakterisering av magnetisk anordning via transportmätningar

  1. Använd ett Si-substrat eller en glasrutschbana med en tvärformad magnetstång med bredden 100 μm, deponerad med FM-multiskikt (se figur 1C-inset). Fäst provet på hållaren med dubbelsidig tejp.
  2. Bind 4 ledningar till provet med hjälp av en trådbindning, en på varje ben på tvärelektroden. Ställ in provhållaren och provet i transportmätningssystemet med ett magnetfält så att magnetfältet är vinkelrätt mot provet. Utför mätningar vid rumstemperatur.
  3. Utför tvärgående spänningsmätning (VT)av anordningen; följa markeringarna i figur 1C (inset): applicera en ström på 1 mA mellan kontakterna 1 och 3, mäta VT mellan kontakterna 2 och 4, applicera sedan en ström mellan 2 och 4 och mät spänningen mellan 1 och 3. Slutligen beräkna skillnaden mellan spänningarna i båda mätningarna och dividera med 2 för att erhålla VT. Använd ett växlingssystem för att automatiskt växla mellan de två mätkonfigurationerna.
  4. Svep magnetfältet mellan 0,4 T till -0,4 T i steg om 5 mT och mät VT som en funktion av fältet. Rita det tvärgående motståndet (VT/I) mot magnetfältet för att bestämma den avvikande Hall-signalen, som står i proportion till den vinkelräta magnetiseringen i filmen.

3. Karakterisering av MNPs och magnetiska multilager genom magnetometrimätningar

  1. Magnetometrisk mätning för FM-multilager
    1. Sätt in FM-multiskiktet på Si-substratet (se avsnitt 1.2). Skär provet i 6 rutor med storleken 4 x 4 mm2. Stapla proverna ovanpå varandra och ordna dem i kapseln vinkelrätt mot magnetfältets riktning (se figur 1D-inset).
    2. Sätt in kapseln i magnetometern och mät magnetiseringen vid rumstemperatur. Sopa magnetfältet mellan -0,4 T och 0,4 T.
    3. Beräkna magnetmaterialets totala volym med tanke på tjockleken på magnetskiktet, provens storlek och antalet substrat. Dividera magnetiseringen med det magnetiska materialets totala volym.
    4. Rita magnetiseringen (per enhetsvolym) mot magnetfältet. Subtrahera substratts diamagnetiska bakgrund från det höga magnetiska fältsvaret och extrapolera mättnadsmagnetiseringen av FM från diagrammet.
  2. Magnetometrisk mätning för MNPs
    1. Sätt in en angiven massa av MNPs i en syntetisk polymerkapsel. Överväg en större volym om du mäter små magnetiseringsmättnadsvärden.
    2. Om MNPs är upphängda i ett lösningsmedel, torka MNPs genom att lämna kapseln öppen över natten. Sätt in kapseln i magnetometern och mät magnetiseringen vid rumstemperatur. Sopa magnetfältet mellan -0,2 T och 0,2 T.
    3. Beräkna den totala massan av MNPs genom att multiplicera den angivna volymen med partikelkoncentrationen. Normalisera resultaten till 1 g.
    4. Rita den normaliserade magnetiseringen (per gram) mot magnetfältet. Extrapolera magnetiseringsmättnaden hos riksdagsledamöterna från grafen.

4. Protokoll för kollagenbeläggning

  1. Beläggning av plastfat
    1. Förbered 0,01 M HCl genom att tillsätta 490 μL HCl till 500 ml autoklaverat dubbeldestillerat vatten (DDW).
      OBS: Utför detta steg endast i den kemiska huven.
    2. Späd kollagen typ 1 (lösning från råttsvans) 1:60-1:80 i 0,01 M HCl för att erhålla den slutliga arbetskoncentrationen på 50 μg/ml. Placera 1,5 ml av den utspädda lösningen i en 35 mm odlingsform. Lämna skålen i huven i 1 h, täckt.
    3. Ta bort lösningen och tvätta 3x i steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Skålen är klar för cellsådd.
  2. Skjutbanor i beläggningsglas
    1. Späd kollagen typ 1 (lösning från råttsvans) 1:50 i 30% v/v etanol. För beläggning av en 35 mm skål, tillsätt 20 μL kollagen till 1 ml 30% etanol.
    2. Täck skålen med lösningen och vänta tills all lösning avdunstar och lämna skålen avtäckt i några timmar. Tvätta 3x i steril 1x PBS; glasrutschbanan är klar för cellsådd.

5. Mobilt MNP-upptag och livskraft

  1. MobilT MNP-upptag
    1. Förbered grundläggande tillväxtmedium för PC12-cellkultur genom att tillsätta 10% hästserum (HS), 5% fetala bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin och 0, 2% amphotericin till Roswell Park Medical Institute (RPMI) medium och filtrera med ett 0,22 μm nylonfilter.
    2. Tillsätt 1% hästserum (HS), 1% L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin och 0,2% amphotericin till RPMI medium för att förbereda PC12 differentiering medium och filtrera med ett 0,22 μm nylonfilter.
    3. Odla celler i en icke-behandlad odlingskolv med 10 ml grundläggande tillväxtmedium; tillsätt 10 ml bastillväxtmedium till kolven var 2-3: e dag och underkultur cellerna efter 8 dagar.
    4. För cellupptag, centrifugera cellupphängningen i ett centrifugeringsrör i 8 min vid 200 × g och rumstemperatur och kassera supernaten.
    5. Återanvänd cellerna i 3 ml färskt bastillväxtmedium. Återigen, centrifug cellupphängningen i 5 min vid 200 × g och rumstemperatur och kassera supernaten. Återanvänd cellerna i 3 ml färskt differentieringsmedium.
    6. Aspirera cellerna 10x med en spruta och en nål för att bryta upp cellkluster. Räkna cellerna med en hemocytometer och frö 106 celler i en vanlig obestruken 35 mm skål.
    7. Tillsätt den beräknade volymen MNP-suspension och volym differentieringsmedium till skålen för att uppnå önskad MNP-koncentration och total volym. Blanda cellerna, MNPs och differentieringsmediet; inkubera skålen i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 °C i 24 timmar.
    8. Centrifugera cellupphängningen i 5 min vid 200 × g vid rumstemperatur och kassera supernaten. Återanvänd cellerna i 1 ml färskt differentieringsmedium och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
  2. MNP-laddad cell differentiering
    1. Utför upptagsprotokoll (avsnitt 5.1). Frö 8 × 104 MNP-laddade celler på en 35 mm, kollagentyp l-belagd maträtt i närvaro av differentieringsmedium (se kollagenbeläggningsprotokoll i avsnitt 4.1). Efter 24 h, tillsätt 1:100 färsk murin beta-nerv tillväxtfaktor (β-NGF) (slutlig koncentration 50 ng/mL).
    2. Förnya differentieringsmediet och tillsätt färsk murin β-NGF varannan dag. Avbilda cellerna varannan dag med optisk mikroskopi. Efter nätverksbildning (6-8 dagar för PC12-celler), avbilda cellerna med konfokal mikroskopi och observera partiklarnas fluorescens.
  3. Livsduglighetsanalys för MNP-laddade celler: 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxanilid (XTT) cell livskraft test.
    1. Förbered det grundläggande tillväxtmediet enligt steg 5.1.1. Odla PC12-cellerna med MNPs vid olika koncentrationer (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml och 0,5 mg/ml i grundläggande tillväxtmedium) och även utan MNPs för kontroll i tre exemplar i en platt 96-brunnsplatta (total volym på 100 μL/brunn). Inkubera cellerna i 24 timmar i en 5% CO2,fuktad inkubator vid 37 °C.
    2. Förbered tomma brunnar som innehåller medium utan celler för bakgrundskorrigering. Tina XTT-reagenslösningen och reaktionslösningen som innehåller N-metyldibenzopyrazinmetylsulfat) i ett 37 °C-bad omedelbart före användning. Snurra försiktigt tills tydliga lösningar har erhållits.
    3. För en 96-brunnsplatta, blanda 0,1 ml aktiveringslösning med 5 ml XTT-reagens. Tillsätt 50 μL av reaktionslösningen till varje brunn, skaka plattan något för en jämn fördelning av färgämnet i brunnarna och inkubera sedan plattan i en inkubator i 5 timmar.
    4. Mät provets absorbans mot de tomma brunnarna med hjälp av en enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) vid en våglängd på 450 nm. Mät referensabsorbansen med en våglängd på 630 nm och subtrahera den från 450 nm-mätningen.
    5. Eftersom liten spontan absorbans uppstår i odlingsmediet inkuberat med XTT-reagenset vid 450 nm, subtrahera den genomsnittliga absorbansen av de tomma brunnarna från de andra brunnarna. Subtrahera signalvärden från parallella prover av parlamentsledamöter i samma testade koncentrationer som cellproverna.
  4. Lönsamhetsanalys för MNP-laddade celler: återförsäljningszurinbaserat cellviabilitetstest
    1. Förbered grundläggande tillväxtmedium enligt steg 5.1.1. Odla PC12-cellerna med MNPs vid olika koncentrationer (0, 1 mg/ml, 0,25 mg/ml och 0,5 mg/ml i grundläggande tillväxtmedium) och utan MNPs som kontroll i tre exemplar i en platt 96-brunnsplatta i 24 timmar. Inkubera cellerna i 24 timmar i en 5% CO2 inkubator vid 37 °C. Förbered tomma brunnar som innehåller medium utan celler.
    2. Tvätta cellerna med 1x PBS. Tillsätt det återsubrinbaserade reagenset (10 % w/v) i mediet och inkubera i 2 timmar i en inkubator på 37 °C.
    3. Placera 150 μL alikvoter av proverna i ELISA-läsaren och mät absorbansen vid en excitationsvåglängd på 560 nm och utsläppsvåglängden på 590 nm. Subtrahera signalvärdena från de parallella proverna av parlamentsledamöter i samma testade koncentrationer som cellproverna.

6. Karakterisering av MNP-koncentrationen inuti cellerna med induktivt kopplade plasma (ICP)

  1. Förbered grundläggande tillväxtmedium enligt steg 5.1.1. Odla PC12-cellerna med MNPs vid olika koncentrationer (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml och 0,5 mg/ml i grundläggande tillväxtmedium) och utan MNPs som kontroll i tre exemplar i en platt 96-brunnsplatta (total volym på 100 μL/brunn). Inkubera i en 5% CO2,fuktad inkubator vid 37 °C i 24 timmar.
  2. Överför suspensionen till ett centrifugeringsrör (från varje brunn separat), centrifugceller vid 200 × g i 5 min vid rumstemperatur och kassera supernaten. Återanvänd cellerna i 1 ml färskt differentieringsmedium och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
  3. Lysa cellerna genom behandling med 100 μL 70% salpetersyra till varje brunn separat i minst 15 min. Tillsätt 5 ml DDW till de lysade cellerna och filtrera lösningarna.
  4. Mät järnkoncentrationen med hjälp av ICP och använd cellantalet för att registrera Fe-koncentrationen per cell.

7. Cell differentiering och tillväxt på magnetisk plattform

  1. Rengör det mönstrade substratet med 70% v/v/ etanol och placera substratet i en 35 mm odlingsform i huven. Placera en stor magnet (~1500 Oe) under det mönstrade substratet i 1 min och ta bort magneten genom att först flytta skålen upp och bort från magneten och sedan ta magneten ur huven. Tänd ultraviolett ljus i 15 min.
  2. Täck substratet med kollagen typ 1 enligt avsnitt 4.2. Suspendera cellerna efter cellulärt MNP-upptag (avsnitt 5.1), kärna 105 celler i en 35 mm odlingsform och tillsätt 2 ml differentieringsmedium. Inkubera kulturen i en 5% CO2,fuktad inkubator vid 37 °C.
  3. Efter 24 h, tillsätt 1:100 färsk murin β-NGF (slutlig koncentration av 50 ng/ml). Förnya differentieringsmediet och tillsätt färsk murin β-NGF varannan dag. Avbilda cellerna varannan dag med hjälp av ljusmikroskopi, och efter nätverksbildning, utför immunostaining på cellerna (avsnitt 8.1).

8. MNP-laddad cellfärgning

  1. Tubulin immunostaining
    1. Förbered 4% paraformaldehydlösning (PFA) genom att blanda 10 ml 16% w/v PFA-lösning, 4 ml 10x PBS och 26 ml DDW. Förbered 50 ml 1% PBT genom att tillsätta 500 μL av en icke-jonisk tensid till 50 ml 1x PBS. Förbered 50 ml 0,5% PBT genom att blanda 25 ml 1% PBT med 25 ml 1x PBS. Förbered blockeringslösning genom att blanda 1% bovint serumalbumin och 1% normalt åsneserum i 0,25% PBT.
      OBS: Använd endast PFA inuti den kemiska huven.
    2. Ta bort det övernaturliga mediet från cellerna. Fixera de MNP-laddade cellerna i 4% PFA i 15 min vid rumstemperatur inuti en kemisk huva. Tvätta de MNP-laddade cellerna 3x i 1x PBS, 5 min varje tvätt, inuti en kemisk huva.
    3. Permeabilisera de MNP-laddade cellerna med 0,5% PBT i 10 min. Inkubera de MNP-laddade cellerna först i blockeringslösning i 45 minuter vid rumstemperatur och sedan med kaninantikroppsantikroppen α tubulin i blockerande lösning över natten vid 4 °C. Tvätta MNP-laddade celler 3x i 1x PBS, 5 min varje tvätt.
    4. Inkubera de MNP-laddade cellerna med Cy2-konjugerad åsna antikanin sekundär antikropp i 45 min i mörker och vid rumstemperatur. Tvätta de MNP-laddade cellerna 3x i 1x PBS, 5 min varje tvätt.
    5. Utför konfokal avbildning. För tubulin, använd en excitation våglängd på 492 nm och en emissionsvåglängd på 510 nm. För MNPs (rhodamin), använd en excitation våglängd på 578 nm och en utsläppsvåglängd på 613 nm.
  2. Nukleär färgning med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)
    1. Tvätta de MNP-laddade cellerna 3x i 1x PBS, 5 min varje tvätt. Avlägsna överflödig vätska runt provet, tillsätt 1 droppe (~ 50 μL) monteringsmedium som innehåller DAPI för att täcka en yta på 22 mm x 22 mm och inkubera i 5 minuter i mörker och vid rumstemperatur.
    2. Tvätta de MNP-laddade cellerna 3x i 1x PBS, 5 min varje tvätt. Utför konfokal avbildning. För DAPI, använd en excitation våglängd på 358 nm och en utsläppsvåglängd på 461 nm. För MNPs (rhodamin), använd en excitation våglängd på 578 nm och en utsläppsvåglängd på 613 nm.

9. Mätningar och statistisk analys

  1. Morfometrisk analys av MNP-laddad celldi differentiering
    1. För att mäta antalet korsningar på olika avstånd från cellkroppen, förvärva fasbilder av odlade celler upp till 3 dagar efter behandling med NGF.
      Obs: Om det görs senare kan cellerna utveckla nätverk, vilket förhindrar mätningar av encellsupplösning.
      1. Öppna bilderna i bildbehandlingsprogrammet ImageJ och använd NeuronJ-plugin-programmet, vilket möjliggör halvautomatisk neuritspårning och längdmätning36. Spåra neuriterna med hjälp av plugin-programmet neuriter och konvertera data till binära bilder. Definiera mitten av soma.
      2. Utför Sholl-analys, tillgänglig i NeuronJ-plugin-programmet. Definiera den maximala radien. Upprepa experimentet tre gånger. Analysera mer än 100 celler i varje experiment.
  2. Analys av celllokalisering
    1. För att bestämma procentandelen celler lokaliserade på magnetområdet efter 3 dagars inkubation, förvärva konfokala mikroskopiska bilder av celler med och utan MNP-upptag. Använd DAPI-färgning (avsnitt 8.2).
    2. Räkna cellerna manuellt ovanpå eller delvis ovanpå mönstret (röra celler) och de celler som inte är det. Upprepa för tre experiment. Analysera mer än 400 celler med MNP och utan upptag.
    3. Beräkna den relativa andelen celler som ligger ovanpå de magnetiska mönstren av det totala antalet celler, med och utan MNPs. Beräkna dessutom procentandelen av magnetmönstrets effektiva område genom att lägga till cellkroppens diameter till mönsterbredden för att bestämma den slumpmässiga sannolikheten för att celler landar på ett magnetiskt mönster.
    4. Utför ett enda Z-testför att analysera om cellfördelningen är ett resultat av isotropisk celllandning, eller om det finns en föredragen partiskhet i magnetmönstret.
  3. Analys av tillväxtriktning
    1. För att kvantifiera effekten på neurit utväxt riktning, förvärva konfokal mikroskopiska bilder av cellerna med och utan MNP behandling efter 8 dagars inkubation. Utför immunfärgning (avsnitt 8.1).
    2. Mät vinkeln mellan cell neuriten och magnetbanden under båda förhållanden med ImageJ-programvara.
      OBS: Analysera endast neuriter som härstammar från somas som ligger på de magnetiska ränderna.
    3. Rita fördelningen av neuritens vinklar i förhållande till ränderna (Δθ). Utför en Chi-kvadratisk provning av fördelningen av Δθ för att visa att fördelningen inte är normal eller enhetlig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Magnetiska plattformar med olika geometriska former tillverkades (figur 1A). Magnetiska mönster deponerades genom sputtering: 14 multilayers av Co80Fe20 och Pd, 0,2 nm respektive 1 nm. Elektronmikroskopi visade att den totala höjden på de magnetiska mönstren var ~18 nm (figur 1B). Denna unika FM-flerskiktsdeposition skapar en stabil plattform med vinkelrät magnetiseringsanisotropi (PMA) i förhållande till substratplanet som möjliggör attraktionen av MNP-laddade celler mot hela magnetmönstret och inte bara tillkanterna 22,37. Parametrarna för FM-multiskiktsstrukturen kännetecknades av magnetotransportmätningar för vilka en korsformad anordning av FM-multiskikt tillverkades (figur 1C inset), och magnetiseringen vinkelrätt mot substratet mättes via den avvikande halleffekten (AHE)38, där AHE-motståndet står i proportion till den vinkelräta magnetiseringen. AHE vs magnetfältsmätning visade en hysteresslinga som indikerar PMA ferromagnets (Figur 1C). Restmagnetiseringen av FM-multiskikten (magnetiskt ögonblick vid nollfält) var identisk med magnetiseringsmättnaden (MS)vid höga fält. Dessutom var det tvångsfältet för FM-multiskikten ~ 500 Oe, når mättnad vid 1 200 Oe, vilket möjliggjorde enkel magnetisering av enheten och säkerställde stabilitet mot påverkan av oavsiktliga magnetfält. MS-värdet för multiskikten mättes med hjälp av en magnetometer (figur 1D), enligt beskrivningen i avsnitt 3.1. MS var 270 emu/cm3, vilket är i nivå med tidigare mätningar av liknande strukturer.

Fluorescerande järnoxid (γ-Fe2O3) MNPs utarbetades enligt en tidigare publikation39. MNPs syntetiserades av nukleation, inklusive kovaleent konjugation av sex-skiktade tunna filmer av järnoxid till rhodamin isothiocyanate och beläggning med mänskliga serum albumin. MNPs storlek på torr diameter var ~15 nm med zetapotentialen -45, enligt transmissionselektronmikroskopisk mätning. De magnetometriska mätningarna av MNPs (Figur 2A) visar att magnetiseringskurvan inte hade någon hysteres, vilket indikerar superparamagnetiskt beteende hos MNPs, ett lågt mättnadsfält på 500 Oe och relativt höga MS på 22 emu/g. För att styra celllokalisering med hjälp av magnetiska mönster inkuberades PC12-celler i medium blandat med järnoxid fluorescerande MNPs för 24 h, omvandla dem till magnetiska enheter. MNP-koncentrationen i mediet kan varieras; det var 0,25 mg/ml i plätering experimenten. Konfokala mikroskopiska bilder togs efter DAPI-färgning (Figur 2B). MNPs internaliserades i PC12 cellernas soma, men inte i atomkärnorna, vilket återspeglades av den mörka skuggan i mitten. Resultaten visar att det inte fanns någon röd florescence i atomkärnorna, vilket indikerar att MNPs inte internaliserades i kärnkärnorna eller hade fästs på cellernas yttre yta. Med hjälp av ICP mätningar, var det möjligt att kvantifiera mängden MNPs internaliserades i PC12 celler. Järnkoncentrationen inuti cellerna ökade med ökningen av MNP-koncentrationen i mediet (figur 2C).

Livskraften hos MNP-laddade PC12-celler för olika koncentrationer av MNPs utvärderades med XTT- och resazurinbaserade analyser. Figur 3A visar PC12-celler efter MNP-behandling, växande och differentierande ovanpå en kollagenbelagd plasträtt. För att undersöka effekten av internaliserade MNPs på differentiering utfördes Sholl morfologiska mätning. Ingen signifikant skillnad observerades i cellmorfologi mellan de MNP-laddade cellerna ochkontrollcellerna( t -test, p > 0,05, n = 3) (Figur 3B). Den metaboliska aktiviteten hos PC12-cellerna mättes med XTT- och resazurinbaserade analyser efter cellinkubation med olika MNP-koncentrationer. Resultaten normaliserades till kontroll mätning av PC12 celler utan MNPs. Dessa koncentrationer av MNPs visade ingen signifikant cytotoxicitet mot cellerna, vilket framgår av bristen på signifikanta skillnader i cell livskraft för något avpreparaten( t -test, p > 0,05, n = 3) (Figur 3C,D). Effekterna av MNPs på cellplätering och utveckling bestämdes genom att jämföra MNP-laddade celler med icke-laddade celler, pläterade och odlade på identiska magnetiska substrat. Cellerna såddes och lämnades att hålla fast vid substratet. Varannan dag behandlades cellerna med färskt medium och NGF enligt beskrivningen i avsnitt 7. Figur 4 visar PC12-celler med och utan MNP-behandling, växande och differentierande på ett magnetiskt substrat med 20 μm breda ränder och 100 μm avstånd. Efter 3 dagars tillväxt var cellerna immunostained, DAPI-färgas och bilder togs.

De magnetiserade cellerna visade sig fästa vid de magnetiska mönstren och växa grenar enligt mönstren, medan celler utan MNP-behandling växte utan affinitet till de magnetiska enheterna (Figur 4A, B). Figur 4C visar placering av celler och nätverksbildning på ett substrat med sexkantig geometri med en sidolängd på 200 μm och en linjebredd på 50 μm. Celler avbildades efter 6 dagar. De magnetiserade cellerna var belägna på det magnetiska mönstret, med liknande affinitet till de randiga substraten. Cellpositionering kvantifierades genom att räkna cellkropparna som ligger på de magnetiska mönstren eller fästs på dem. Den relativa andelen celler beräknades från den totala cellpopulationen. Detta gjordes för celler med och utan MNP behandling. Det effektiva området för det magnetiska svaret beräknades genom att lägga till cellernas diameter (~ 10 μm för PC12-celler) till båda kanterna av magnetmönstret. För de magnetiska randmönstren var det effektiva magnetiska områdesförhållandet 33%, vilket motsvarade sannolikheten för att cellerna landade slumpmässigt på de magnetiska ränderna. Resultaten visade att 75% av MNP-laddade cellkroppar var i kontakt med de magnetiska ränderna, medan endast 35% av de icke-magnetiserade cellerna var belägna på ränderna (i statistiskt samförstånd med en opartisk fördelning) (Figur 4D). Statistisk analys visade att mätningen inte härleddes från godtycklig celllandning (z-testmed ett prov, p < 10-6, n = 430).

Däremot visade den statistiska analysen av de magnetiska hexagonerna att 92% av de MNP-laddade cellernas soma var kopplade till de magnetiska mönstren, jämfört med 38% för celler utan MNP-behandling (Figur 4E). Hexagons effektiva areaförhållande var 32% av substratet. Statistisk analys för hexagonerna visade också att mätningen inte härleddes från godtycklig celllandning (z-testmed ett prov, p < 10-6, n = 370). Resultaten visade en tydlig preferens av MNP-laddade celler för det magnetiska mönstret, medan celler utan MNPs klibbade slumpmässigt till hela substratet. Förutom cellpositioneringseffekten befanns dessa magnetiska plattformar också kontrollera riktningen hos de växande neuriterna. Figur 5A visar MNP-laddade celler med neuriter, i linje med rändernas orientering. Kontrollmätningen av celler utan MNPs visade däremot neurittillväxt över plattformen oavsett magnetmönster.

För att utvärdera den magnetiska effekten på neuronal tillväxt riktning mättes vinkeln mellan neuriterna och de magnetiska ränderna. Data visade att 80% av neuriterna i MNP-laddade celler uppvisade korrelation med de magnetiska ränderna orientering, inom Δθ < 15° i förhållande till ränderna riktning. Emellertid framkallade endast 32% av neuritesna av celler utan MNPs i det spänner. Celler utan MNP-behandling visade ingen korrelation med de magnetiska ränderna och växte enligt en enhetlig vinkelfördelning (figur 5B). Statistisk analys av fördelningen av Δθ visade att det inte var normalt eller enhetligt (Chi-square test, p < 0,001). Effekten av den sexkantiga geometrin på neurit tillväxt visades också. Figur 5C visar fluorescensbilder av neural nätverksutveckling av magnetiserade och omagnetiserade PC12-celler ovanpå ett magnetiskt mönster av hexagoner och stora cirklar mellan kanterna. Sidolängden på hexagonen var 200 μm och linjebredden var 10 μm; cirkeldiametern var 30 μm. Cell somas visade hög affinitet för cirklarna och utvecklat ett välorienterat neurala nätverk längs de sexkantiga konturerna. En inzoomningsbild visar celler som är fästa vid en magnetisk cirkel och neuriter som växer längs dessa konturer (figur 5D).

Figure 1
Bild 1:Karakterisering av magnetanordningarna. Skalstång = 200 μm. (B) Scanning elektron mikroskopisk bild av Co80Fe20/Pd multilager och ett schema över multiskikten. Den totala höjden på magnetmönstren är 18 nm. Skalstång = 100 nm. C)Avvikande halleffektmätning av magnetanordningen som visar FM. Insets tvångs- och restmagnetiska fält: bild av anordning med märkta elektroder. (D) Magnetometri av flerskiktsanordning visar magnetiseringsmättnadsvärdet beräknat per volym. Denna siffra har ändrats från Marcus et al.37. Förkortningar: AHE = Avvikande Hall-effekt; FM = ferromagnetisk; B = magnetfält. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2:PC12-cellupptag av MNPs. (A) Magnetometrisk mätning av MNPs vid rumstemperatur. (B) Konfokal mikroskopibild av MNP upptag av PC12 celler. Nuclei färgas med DAPI; MNPs märkta med rhodamin kommer in i cellerna. Skalstång = 10 μm (C) ICP-mätning av de internaliserade järnoxid MNPs (pg) av PC12-celler efter 24 h inkubation med flera MNP-koncentrationer. Denna siffra har ändrats från Marcus et al.37. Förkortningar: MNPs = magnetiska nanopartiklar; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; ICP = induktivt kopplade plasma. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3:MNP-laddad PC12-cellens livskraft. (A) Konfokala mikroskopiska bilder av differentierade PC12-celler inkuberade med MNPs. Pilar visar differentierade neuriter med internaliserade MNPs. Skalstänger = 50 nm. (B) Sholl analys av neurit utväxt av PC12 celler efter 3 dagar av differentiering. C)XTT-livsduglighetsanalys av PC12-celler som behandlats med ökande koncentrationer av MNPs efter 24 h inkubation. Mätningar normaliseras för att styra. D)Återförsäljningsbaserad lönsamhetsanalys av PC12-celler som behandlats med ökande koncentrationer av MNPs efter 24 h inkubation. Mätningar normaliseras för att styra. Det finns ingen statistisk signifikans i båda analyserna. Denna siffra har ändrats från Marcus et al.37. Förkortningar: MNPs = magnetiska nanopartiklar; XTT = 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxanilid. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Celllokalisering ovanpå magnetiska enheter. (A) Fluorescerande bilder av PC12-celler laddade med MNPs som växer på de magnetiska ränderna: (i) α-tubulinmärkning, (ii) DAPI-färgning och (iii) sammanslagen bild. Skalstång = 100 μm. (B) Fluorescerande bilder av PC12-celler utan MNP-behandling, som växer ovanpå de magnetiska ränderna som i (A). (C) Fluorescensbilder av PC12-celler, med och utan MNPs, på det sexkantiga magnetiska mönstret. Skalstång = 200 μm. (D) Procentandel cellkroppar, med och utan MNPs, placerade på de magnetiska ränderna. Felstaplar representerar standardavvikelse. Den prickade linjen representerar sannolikheten för att celler landar på de magnetiska ränderna. e)Procentandel cellkroppar, med och utan MNPs, placerade på de magnetiska hexagonerna. Felstaplar representerar standardavvikelse. Den prickade linjen representerar sannolikheten för att celler landar på magnetmönstren för en slumpmässig fördelning. Det finns ingen statistisk signifikans i båda analyserna. Denna siffra har ändrats från Marcus et al.37. Förkortningar: MNPs = magnetiska nanopartiklar; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Bild 5:Neuronal nätverksriktning. (A) Konfokala mikroskopiska bilder av α-tubulinmärkta PC12-celler med MNP-behandling (vänster) och utan MNP-behandling (höger), växande ovanpå magnetiska ränder. Ränderna är markerade. (B) Polar histogram presenterar neurit riktningseffekten på PC12 celler (vänster) med MNP behandling och (höger) utan MNP behandling. Avvikelsen för orienteringsvinkeln definieras som skillnaden i vinkeln mellan neuriterna och den magnetiska randorienteringen (15° behållare). (C) Fluorescensbilder av PC12-celler som odlas ovanpå ett magnetiskt sexkantigt mönster, (vänster) med MNP-behandling och (höger) utan MNP-behandling. Skalstång = 200 μm. (D) Zoom-in bild av en magnetiserad cell som utvecklar neuriter enligt magnetmönstret. Skalstång = 30 μm. Denna siffra har ändrats från Marcus et al.37. Förkortning: RIKSDAGSARTIKLAR = magnetiska nanopartiklar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De representativa resultaten visar effektiviteten av den presenterade metoden för att kontrollera och organisera neuronal nätverksbildning på mikronskalan. De MNP-laddade PC12-cellerna förblev livskraftiga och omvandlades till magnetiska känsliga enheter som lockades av de magnetiska krafterna från FM-elektroderna till specifika platser. Detta visas bäst i figur 5C, där cellerna företrädesvis klibbade vid hexagonernas större hörn och inte de tunna linjerna. Dessutom utvecklades förgrening av cellerna också positivt efter de magnetiska mönstren. Alla kontrollexperiment visade otvetydigt att de magnetiska krafterna styrde lokaliseringen av cellkropparna och utväxten. Även om det visades att topografiska signaler kan användas för att rikta neurit utväxt40,41, är detta inte fallet här, eftersom celler utan MNPs visade inget svar på mönstrets form.

En bottom-up-metod användes för att konstruera de lokala magnetiska krafterna, med hjälp av standardfotolitografi och sputteringdepositioner som finns tillgängliga i många forskningsanläggningar, vilket underlättade många forskares antagande av dessa tekniker. Nedifrån och upp-metoden möjliggör frihet i utformningen av komplexa mönster och former enligt forskarnas behov, med mikron-skala upplösning för centimeterlängdsområden. Även om resultaten visades på glasbilder, är det i princip möjligt att förbereda enheterna ovanpå andra biokompatibla material som är lämpliga för in vivo terapeutiska applikationer som flexibla elektrodmatriser för neuronal inspelning och stimulering42,43.

Dessa unika PMA-plattformar, uppnådda av flerskiktsdeposition, producerar ett starkt magnetfält längs hela magnetmönstret och inte bara på kanterna, som observerades tidigare22. Dessutom designades FMs med en stor restmagnetiseringsmättnad, det vill säga även när det yttre magnetfältet tas bort förblir elektroderna helt magnetiserade och fortsätter att locka cellerna utan behov av en extern magnet. En extern magnetisk kraft kan dock hjälpa till att helt magnetisera parlamentsledamöterna i cellerna, vilket ökar kraften i attraktion och effektivitet under plätering. En viktig faktor i FM-design var antalet repetitioner. Medan mer upprepning kommer att öka det totala magnetiska ögonblicket, vilket är gynnsamt, kommer att lägga till många lager också öka lagerblandningen, vilket orsakar mindre stabil PMA och slutligen resultera i en magnetisering i planet44,45 enkel axel och attraktion till olika kanter av elektroderna22,37. Därför är det nödvändigt att optimera FM-talet och sammansättningen av multiskikten för att säkerställa stabil PMA med maximala magnetfält.

De MNPs som presenteras i de representativa resultaten visade nästan ingen toxicitet mot PC12-cellerna vid de testade koncentrationerna, inte heller påverkade de cellbeteendet, trots att de kunde komma in i cellerna och ha ett relativt högt magnetiskt ögonblick. Attraktionskraften på en cell beror på antalet MNPs i cellen och magnetiseringen av varje MNP. Helst bör båda vara höga; Det kan dock finnas en kompromiss mellan de två. Med vissa kommersiella riksdagsledamöter var cellens livskraft god, men det magnetiska ögonblicket var för svagt. För andra partiklar som tillverkades i laboratoriet var det magnetiska ögonblicket högt, men parlamentsledamöterna tenderade att aggregera och cellens livskraft var låg. Således är det viktigt att testa cellens livskraft och karakterisera deras magnetisering när man väljer MNPs. De riksdagsledamöter som används här är också fluorescerande, vilket gör det enkelt att spåra deras placering i cellerna. Resultaten visar neuriter som utvecklas beroende på formen på magnetmönstret, och fluorescensen indikerar närvaron av MNPs längs neuriterna.

Internaliseringsmekanismen för riksdagsledamöter i celler har tidigare undersökts46. Cellulärt upptag av MNPs sker via endocytos beroende på deras storlek, form och ytkemi. Tidigare studier undersökte användningen av olika typer av MNPs i nervceller24; Cellulär upptag av belagda MNPs var bättre än cellulära upptaget av obelagda MNPs. Som visas i figur 3A, B, internaliserades MNPs i cytoplasman, men förblev utanför kärnorna och överfördes till neuriterna under deras utveckling. Dessutom konjugerade MNPs till NGF som aktiverade NGF signalvägen internaliserades också i celler via endocytos47,48.

Sammanfattningsvis presenterar detta dokument en effektiv verktygslåda för magnetisk manipulation för forskning som kräver biologisk elementorganisation. Användningen av magnetiska krafter möjliggör positionering av celler, vilket styr neurittillväxt. Denna metod möjliggör design av plattformar med komplexa geometriska former. Kraften i magnetisk attraktion kan konstrueras för att manipulera den neurala nätverksbildningen på distans genom att ändra det magnetiska kraftlandskapet över tid. Hela denna metod kan enkelt utvidgas för att kontrollera andra faktorer eller kemikalier som kan kopplas till parlamentsledamöterna och föra dem till fördesignade intressanta platser, alla med mikronupplösning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av ministeriet för vetenskap & teknik, Israel, och av Israel Science Foundation (569/16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Tags

Bioengineering utgåva 173 magnetiska nanopartiklar vinkelrät magnetiseringsanotropi (PMA) magnetisk riktad läkemedelsleverans magnetisk cellmanipulation neural kultur neural teknik biointerfacing fotolitografi magnetiska multilager
Tillverkning av magnetiska plattformar för mikron-skala organisation av sammankopplade nervceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., … More

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter