Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon av magnetiske plattformer for mikron-skala organisering av sammenkoblede nevroner

Published: July 14, 2021 doi: 10.3791/62013
Automatic Translation
1,4, 2,4, 2,4, 1,4, 2,4, 2,4, 3,4, 2,4, 1,4
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Summary

Dette arbeidet presenterer en nedenfra-og-opp-tilnærming til prosjektering av lokale magnetiske krefter for kontroll av nevronisk organisering. Nevronlignende celler lastet med magnetiske nanopartikler (MNPer) er belagt på toppen og styres av en mikromønstret plattform med vinkelrett magnetisering. Også beskrevet er magnetisk karakterisering, MNP cellulært opptak, celle levedyktighet og statistisk analyse.

Abstract

Evnen til å lede nevroner inn i organiserte nevrale nettverk har store implikasjoner for regenerativ medisin, vevsteknikk og bio-grensesnitt. Mange studier har som mål å lede nevroner ved hjelp av kjemiske og topografiske signaler. Rapporter om organisatorisk kontroll på mikron-skala over store områder er imidlertid knappe. Her er det beskrevet en effektiv metode for å plassere nevroner på forhåndsinnstilte steder og veilede nevronal utvekst med mikron-skala oppløsning, ved hjelp av magnetiske plattformer innebygd med mikromønstrede, magnetiske elementer. Det har blitt demonstrert at lasting av nevroner med magnetiske nanopartikler (MNPer) konverterer dem til sensitive magnetiske enheter som kan påvirkes av magnetiske gradienter. Etter denne tilnærmingen har en unik magnetisk plattform blitt fabrikkert på hvilke PC12-celler, en vanlig nevronlignende modell, ble belagt og lastet med superparamagnetiske nanopartikler. Tynne filmer av ferromagnetiske (FM) flerlagsmotorer med stabil vinkelrett magnetisering ble avsatt for å gi effektive tiltrekningskrefter mot de magnetiske mønstrene. Disse MNP-lastede PC12-cellene, belagt og differensiert på toppen av de magnetiske plattformene, ble fortrinnsvis festet til de magnetiske mønstrene, og nevrittutveksten var godt tilpasset mønsterformen og dannet orienterte nettverk. Kvantitative karakteriseringsmetoder for magnetiske egenskaper, cellulært MNP-opptak, celle levedyktighet og statistisk analyse av resultatene presenteres. Denne tilnærmingen muliggjør kontroll av nevral nettverksdannelse og forbedrer nevron-til-elektrode-grensesnittet gjennom manipulering av magnetiske krefter, noe som kan være et effektivt verktøy for in vitro-studier av nettverk og kan tilby nye terapeutiske biointerfacing retninger.

Introduction

Mikropattering av nevroner har stort potensial for vevregenerering1,2,3,4,5 og utvikling av nevro-elektroniske enheter6,7,8. Imidlertid utgjør den mikron-skalerte posisjoneringen av nevroner med høy romlig oppløsning, som i biologisk vev, en betydelig utfordring. Å danne predesignede strukturer i denne skalaen krever veiledning av nervecelleprosesser ved å lokalt kontrollere soma motilitet og axonal utvekst. Tidligere studier har antydet bruk av kjemiske og fysiske signaler9,10,11,12 for å veilede nevronvekst. Her fokuserer en ny tilnærming på å kontrollere celleposisjonering ved magnetiske feltgradienter13,14,15,16,17, snu celler lastet med MNPer til magnetiske sensitive enheter, som kan manipuleres eksternt.

Kunze et al., som karakteriserte kraften som trengs for å indusere cellulære responser ved hjelp av magnetiske chip- og MNP-ladede celler, viste at tidlig axonal forlengelse kan utløses av mekanisk spenning inne i celle18. Tay et al. bekreftet at mikro-fabrikkerte substrater med forbedrede magnetiske feltgradienter gir mulighet for trådløs stimulering av nevrale kretser dosert med MNPer ved hjelp av kalsiumindikatorfargestoffer19. Videre samlet Tseng et al. sammenknyttede nanopartikler inne i celler, noe som resulterte i lokaliserte nanopartikkelmediert krefter som nærmet seg cellulær spenning20. Dette førte til fabrikasjon av definerte mønstre av mikromagnetiske substrater som bidro til å studere cellulær respons på mekaniske krefter. Cellulær spenning som oppstår ved bruk av lokaliserte nanopartikkelmedierte krefter ble oppnådd ved å samle nanopartikler i celle20. Et komplementært metalloksid halvleder (CMOS)-mikrofluidisk hybridsystem ble utviklet av Lee et al. som innebygd en rekke mikroelektromagneter i CMOS-brikken for å kontrollere bevegelsen til individuelle celler merket med magnetiske perler21.

Alon et al. brukte mikroskala, forhåndsprogrammerte, magnetiske pads som magnetiske "hot spots" for å finne cellene22. Spesifikk aktivitet kan også stimuleres i celler ved hjelp av mikromønstrede magnetiske matriser for å lokalisere nanopartikler på bestemte subcellulære steder23. Cellulært MNP-opptak har blitt demonstrert i leech, rotte og mus primære nevroner24,25,26. Her har dette blitt demonstrert på en rotte PC12 pheochromocytoma cellelinje, som tidligere har blitt rapportert å vise høyt opptak av MNPs27. De siste årene har det vært ulike medisinske anvendelser av MNPer, inkludert legemiddellevering og termoterapi i kreftbehandlinger28,29,30,31. Spesielt håndterer studier anvendelsen av MNPer og nevronnettverk32,33,34,35. Imidlertid fortjener den magnetiske organiseringen av nevroner som bruker MNPer på et enkeltcellet nivå videre undersøkelse.

I dette arbeidet har en nedenfra-og-opp-tilnærming blitt beskrevet for å konstruere lokale magnetiske krefter via forhåndsdesignede plattformer for å kontrollere nevronarrangement. Fabrikasjonen av mikron-skala mønstre av FM flerlags har blitt presentert. Denne unike, FM flerlags strukturen skaper stabil vinkelrett magnetisering som resulterer i effektive tiltrekningskrefter mot alle magnetiske mønstre. Via inkubasjon ble MNPer lastet inn i PC12-celler, og forvandlet dem til magnetiske sensitive enheter. MNP-lastede celler, belagt og differensiert på toppen av de magnetiske plattformene, ble fortrinnsvis festet til de magnetiske mønstrene, og nevrittutveksten var godt tilpasset mønsterformen og dannet orienterte nettverk. Flere metoder har blitt beskrevet for å karakterisere de magnetiske egenskapene til FM-flerlags- og MNP-ene, og teknikker for cellulære MNP-opptak og celle levedyktighetsanalyser har også blitt presentert. I tillegg er morfometriske parametere for nevronvekst og statistisk analyse av resultatene detaljert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Utfør alle biologiske reaksjoner i et biosikkerhetsskap.

1. Magnetisk plattform fabrikasjon

  1. litografi
    1. Klipp glass glir inn i 2 x 2 cm2 med en skriverpenn. Rengjør glasssklier i aceton og deretter isopropanol i 5 min hver i et ultra-sonikeringsbad. Tørk med ultrahøy renhet (UHP) nitrogen.
    2. Belegge glasset med fotoresist ved hjelp av spin-belegg ved 6000 rpm i 60 s, for å oppnå 1,5 μm tykkelse, og bake ved 100 °C i 60 s. Utsett prøven for en lyskilde ved hjelp av en passende bølgelengde for fotoresist, med et ønsket mønster, ved hjelp av en fotomaske eller maskefri litografi.
    3. Utvikle for 40 s i en utvikler, fortynnet i destillert vann (DW) i henhold til produsentens instruksjoner; vask i DW i 45 s, og tørk med UHP nitrogengass. Inspiser mønsteret under et optisk mikroskop.
  2. Sputter avsetning
    1. Sett prøven inn i hovedkammeret i avsetningssystemet og vent på grunntrykk (~5 × 10-8 Torr). Åpne gassstrømmen; sett argonstrømmen for standard sputtering (28 sccm [standard kubikk cm per min) heri. Tenn sputtermålene, og sett deretter sputtertrykket til 3 mTorr.
    2. Øk strømmen på hvert mål til ønsket hastighet er oppnådd.
      MERK: Pd Rate: 0,62 A/s = 1,0 nm i 16 s; Co80Fe20 Rate: 0,32 A/s, 0,2 nm på 6,25 s.
    3. Slå på rotasjon. Deponer FM-flerlagsmålet, vekslende mellom Co80Fe20- og Pd-målene, ved å åpne og lukke målskoddene. Deponer 14 bilayers av Co80Fe20 (0.2 nm)/Pd (1.0 nm), og avslutt med en ekstra 2 nm Pd capping lag.
    4. Løft av: Bløtlegg prøven i aceton i 30 min, og skyll med isopropanol. Tørk deretter med UHP-nitrogen, og hold prøven i et rent og tørt miljø til bruk.

2. Karakterisering av magnetisk enhet via transportmålinger

  1. Bruk et Si-substrat eller glasssklie med en tverrformet magnetisk stang på 100 μm bredde, avsatt med FM-flerlags (se figur 1C-innfelt). Fest prøven til holderen ved hjelp av dobbeltsidig tape.
  2. Bruk en trådbinding til å binde 4 ledninger til prøven, en på hvert ben på tverrelektroden. Sett prøveholderen og prøven inne i transportmålingssystemet med et magnetfelt slik at magnetfeltet er vinkelrett på prøven. Utfør målinger ved romtemperatur.
  3. Utfør tverrspenning (VT) måling av enheten; følg markeringene i figur 1C (innsett): Bruk en strøm på 1 mA mellom kontakt 1 og 3; måle VT mellom kontakt 2 og 4; Bruk deretter en strøm mellom 2 og 4, og mål spenningen mellom 1 og 3. Til slutt beregner du forskjellen mellom spenningene til begge målingene og deler med 2 for å oppnå VT. Bruk et byttesystem til å bytte automatisk mellom de to målingskonfigurasjonene.
  4. Sveip magnetfeltet mellom 0,4 T til -0,4 T i trinn på 5 mT og mål VT som en funksjon av feltet. Plott den tverrgående motstanden (VT/ I) vs. magnetfeltet for å bestemme det uregelmessige Hall-signalet, som er proporsjonalt med vinkelrett magnetisering i filmen.

3. Karakterisering av MNPer og magnetiske flerlagsmotorer ved magnetometrimålinger

  1. Magnetometrisk måling for FM-flerlags
    1. Deponer FM-flerlagset på Si-substratet (se pkt. 1.2). Klipp prøven i 6 firkanter på 4 x 4 mm2 størrelse. Stable prøvene oppå den andre og ordne dem i kapselen vinkelrett på retningen til magnetfeltet (se figur 1D-innfelt).
    2. Sett kapselen inn i magnetometeret og mål magnetiseringen ved romtemperatur. Feie magnetfeltet mellom -0,4 T og 0,4 T.
    3. Beregn det totale volumet av det magnetiske materialet, med tanke på tykkelsen på det magnetiske laget, størrelsen på prøvene og antall substrater. Del magnetiseringen med det totale volumet av det magnetiske materialet.
    4. Plott magnetiseringen (per enhetsvolum) i forhold til magnetfeltet. Trekk den diamagnetiske bakgrunnen til substratet fra den høye magnetiske feltresponsen og ekstrapoler metningsmagnetiseringen av FM fra grafen.
  2. Magnetometrisk måling for MNPer
    1. Sett inn en utpekt masse MNPer i en syntetisk polymerkapsel. Vurder et større volum hvis du måler små magnetiseringsmetningsverdier.
    2. Hvis MNP-ene er suspendert i et løsningsmiddel, tørker du MNP-ene ved å la kapselen stå åpen over natten. Sett kapselen inn i magnetometeret og mål magnetiseringen ved romtemperatur. Feie magnetfeltet mellom -0,2 T og 0,2 T.
    3. Beregn den totale massen av MNP-ene ved å multiplisere det angitte volumet med partikkelkonsentrasjonen. Normaliser resultatene til 1 g.
    4. Plott den normaliserte magnetiseringen (per gram) i forhold til magnetfeltet. Ekstrapoler magnetiseringsmetningen til MNPene fra grafen.

4. Protokoll for kollagenbelegg

  1. Belegg plastretter
    1. Forbered 0,01 M HCl ved å tilsette 490 μL HCl til 500 ml autoklavert dobbeltdestillert vann (DDW).
      MERK: Utfør dette trinnet bare i den kjemiske hetten.
    2. Fortynn kollagen type 1 (oppløsning fra rottehale) 1:60-1:80 i 0,01 M HCl for å oppnå den endelige arbeidskonsentrasjonen på 50 μg/ml. Legg 1,5 ml av den fortynnede oppløsningen i en 35 mm kulturrett. La parabolen stå i hetten i 1 time, dekket.
    3. Fjern oppløsningen, og vask 3x i steril 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Retten er klar for cellesåing.
  2. Belegg glass lysbilder
    1. Fortynn kollagen type 1 (oppløsning fra rottehale) 1:50 i 30% v / v etanol. For belegg av en 35 mm tallerken, tilsett 20 μL kollagen til 1 ml 30% etanol.
    2. Dekk parabolen med løsningen, og vent til all løsningen fordamper, slik at parabolen blir avdekket i noen timer. Vask 3x i steril 1x PBS; glasssklie er klar for cellesåing.

5. Cellulært MNP-opptak og levedyktighet

  1. Cellulært MNP-opptak
    1. Forbered grunnleggende vekstmedium for PC12 cellekultur ved å legge til 10% hesteserum (HS), 5% foster bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin /streptomycin og 0,2% amfotericin til Roswell Park Medical Institute (RPMI) medium, og filtrer med et 0,22 μm nytt filter.
    2. Tilsett 1% hesteserum (HS), 1% L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin og 0,2% amfotericin til RPMI-medium for å forberede PC12 differensieringsmedium, og filtrer med et 0,22 μm nylonfilter.
    3. Vokse celler i en ikke-behandlet kulturflaske med 10 ml grunnleggende vekstmedium; tilsett 10 ml grunnleggende vekstmedium i kolben hver 2-3 dager, og underkultur cellene etter 8 dager.
    4. For cellulært opptak, sentrifuger cellefjæringen i et sentrifugerør i 8 min ved 200 × g og romtemperatur, og kast supernatanten.
    5. Resuspend cellene i 3 ml frisk grunnleggende vekstmedium. Igjen, sentrifuger cellefjæringen i 5 min ved 200 × g og romtemperatur, og kast supernatanten. Resuspend cellene i 3 ml frisk differensieringsmedium.
    6. Aspirer cellene 10x ved hjelp av en sprøyte og en nål for å bryte opp celleklynger. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer, og frø 106 celler i en vanlig ubestrøket 35 mm tallerken.
    7. Legg til parabolen det beregnede volumet av MNP-suspensjon og volum av differensieringsmedium for å oppnå ønsket MNP-konsentrasjon og totalt volum. Bland cellene, MNPene og differensieringsmediet. inkuber retten i en 5% CO2 fuktet inkubator ved 37 °C i 24 timer.
    8. Sentrifuger cellefjæringen i 5 min ved 200 × g ved romtemperatur, og kast supernatanten. Resuspend cellene i 1 ml frisk differensieringsmedium, og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
  2. MNP-lastet celledifferensiering
    1. Utføre opptaksprotokoll (avsnitt 5.1). Frø 8 × 104 MNP-lastede celler på en 35 mm, kollagen type l-belagt tallerken i nærvær av differensieringsmedium (se kollagenbeleggprotokoll i avsnitt 4.1). Etter 24 timer, tilsett 1:100 frisk murine beta-nerve vekstfaktor (β-NGF) (sluttkonsentrasjon 50 ng /ml).
    2. Forny differensieringsmediet og tilsett fersk murine β-NGF annenhver dag. Bilde cellene hver annen dag ved hjelp av optisk mikroskopi. Etter nettverksdannelse (6-8 dager for PC12-celler), bilde cellene ved hjelp av konfektmikroskopi, og observere partiklenes fluorescens.
  3. Levedyktighetsanalyse for MNP-lastede celler: 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfoenyl)-2H-tetrazolium-5-karboksanilid (XTT) celle levedyktighetstest.
    1. Forbered det grunnleggende vekstmediet i henhold til trinn 5.1.1. Dyrk PC12-cellene med MNPer ved forskjellige konsentrasjoner (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml og 0,5 mg/ml i grunnleggende vekstmedium) og også uten MNPer for kontroll i triplikat i en flat 96-brønnsplate (totalt volum på 100 μL/brønn). Inkuber cellene i 24 timer i en 5% CO2, fuktet inkubator ved 37 °C.
    2. Klargjør tomme brønner som inneholder medium uten celler for bakgrunnskorrigering. Tine XTT-reagensoppløsningen, og reaksjonsløsningen som inneholder N-metyldibenzopyrazinmetylsulfat) i et 37 °C bad umiddelbart før bruk. Virvle forsiktig til klare løsninger er oppnådd.
    3. For en 96-brønns plate blander du 0,1 ml aktiveringsløsning med 5 ml XTT-reagens. Tilsett 50 μL av reaksjonsløsningen til hver brønn, rist platen litt for en jevn fordeling av fargestoffet i brønnene, og inkuber deretter platen i en inkubator i 5 timer.
    4. Mål absorbansen av prøven mot de tomme brønnene ved hjelp av en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) leser ved en bølgelengde på 450 nm. Mål referanseabsorberingen ved hjelp av en bølgelengde på 630 nm og trekk den fra 450 nm-målingen.
    5. Ettersom det oppstår en liten spontan absorbans i kulturmediet inkubert med XTT-reagenset ved 450 nm, trekker du den gjennomsnittlige absorbansen av de tomme brønnene fra de andre brønnene. Trekk signalverdier fra parallelle prøver av MNPer ved de samme testede konsentrasjonene som celleprøvene.
  4. Levedyktighetsanalyse for MNP-lastede celler: resazurin-basert celle levedyktighetstest
    1. Forbered grunnleggende vekstmedium i henhold til trinn 5.1.1. Dyrk PC12-cellene med MNPer ved forskjellige konsentrasjoner (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml og 0,5 mg/ml i grunnleggende vekstmedium) og uten MNPer som kontroll i triplikat i en flat 96-brønnsplate i 24 timer. Inkuber cellene i 24 timer i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C. Forbered tomme brønner som inneholder medium uten celler.
    2. Vask cellene med 1x PBS. Tilsett det resazurinbaserte reagenset (10 % m/v) i mediet og inkuber i 2 timer i en inkubator på 37 °C.
    3. Plasser 150 μL aliquots av prøvene i ELISA-leseren, og mål absorbansen ved en eksitasjonsbølgelengde på 560 nm og utslippsbølgelengde på 590 nm. Trekk signalverdiene fra parallelle prøver av MNPer ved de samme testede konsentrasjonene som celleprøvene.

6. Karakterisering av MNP-konsentrasjon inne i cellene ved hjelp av induktivt koblet plasma (ICP)

  1. Forbered grunnleggende vekstmedium i henhold til trinn 5.1.1. Dyrk PC12-cellene med MNPer ved forskjellige konsentrasjoner (0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml og 0,5 mg/ml i grunnleggende vekstmedium) og uten MNPer som kontroll i triplikat i en flat 96-brønnsplate (totalt volum på 100 μL/brønn). Inkuber i en 5% CO2, fuktet inkubator ved 37 °C i 24 timer.
  2. Overfør suspensjonen til et sentrifugerør (fra hver brønn separat), sentrifugeceller ved 200 × g i 5 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten. Resuspend cellene i 1 ml frisk differensieringsmedium, og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer.
  3. Lyse cellene ved behandling med 100 μL 70% salpetersyre til hver brønn separat i minst 15 min. Tilsett 5 ml DDW i lyscellene og filtrer løsningene.
  4. Mål jernkonsentrasjonen ved hjelp av ICP og bruk celleantallet til å registrere Fe-konsentrasjon per celle.

7. Celledifferensiering og vekst på magnetisk plattform

  1. Rengjør det mønstrede substratet med 70% v / v / etanol og legg substratet i en 35 mm kulturrett i hetten. Plasser en stor magnet (~1500 Oe) under det mønstrede substratet i 1 min og fjern magneten ved først å flytte parabolen opp og bort fra magneten, og ta deretter magneten ut av hetten. Slå på ultrafiolett lys i 15 min.
  2. Belegge substratet med kollagentype 1 i henhold til pkt. 4.2. Suspender cellene etter cellulært MNP-opptak (avsnitt 5.1), frø 105 celler i en 35 mm kulturrett, og tilsett 2 ml differensieringsmedium. Inkuber kulturen i en 5% CO2, fuktet inkubator ved 37 °C.
  3. Etter 24 timer, tilsett 1:100 frisk murine β-NGF (sluttkonsentrasjon på 50 ng/ml). Forny differensieringsmediet og tilsett fersk murine β-NGF annenhver dag. Bilde cellene hver annen dag ved hjelp av lysmikroskopi, og etter nettverksdannelse, utfør immunstaining på cellene (avsnitt 8.1).

8. MNP-lastet cellefarging

  1. Tubulin immunstaining
    1. Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) oppløsning ved å blande 10 ml 16% m / v PFA-løsning, 4 ml 10x PBS og 26 ml DDW. Forbered 50 ml 1 % PBT ved å tilsette 500 μL av et ikke-ionisk overflateaktivt middel til 50 ml 1x PBS. Forbered 50 ml 0,5 % PBT ved å blande 25 ml 1 % PBT med 25 ml 1x PBS. Forbered blokkeringsløsning ved å blande 1% bovint serumalbumin og 1% normalt eselserum i 0,25% PBT.
      MERK: Bruk PFA kun inne i den kjemiske hetten.
    2. Fjern det supernatante mediet fra cellene. Fest de MNP-lastede cellene i 4% PFA i 15 minutter ved romtemperatur inne i en kjemisk hette. Vask de MNP-lastede cellene 3x i 1x PBS, 5 min hver vask, inne i en kjemisk hette.
    3. Permeabiliser de MNP-lastede cellene med 0,5 % PBT i 10 minutter. Inkuber de MNP-lastede cellene først i blokkeringsløsning i 45 minutter ved romtemperatur og deretter med kanin anti-α-tubulin antistoff i blokkeringsløsning over natten ved 4 °C. Vask MNP-lastede celler 3x i 1x PBS, 5 min hver vask.
    4. Inkuber de MNP-belastede cellene med Cy2-konjugert esel anti-kanin sekundært antistoff i 45 min i mørke og ved romtemperatur. Vask de MNP-lastede cellene 3x i 1x PBS, 5 min hver vask.
    5. Utfør konfomisk avbildning. For tubulin, bruk en eksitasjonsbølgelengde på 492 nm og en utslippsbølgelengde på 510 nm. For MNPs (rhodamine), bruk en eksitasjonsbølgelengde på 578 nm og en utslippsbølgelengde på 613 nm.
  2. Kjernefysisk farging med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)
    1. Vask de MNP-lastede cellene 3x i 1x PBS, 5 min hver vask. Fjern overflødig væske rundt prøven, tilsett 1 dråpe (~ 50 μL) monteringsmedium som inneholder DAPI for å dekke et område på 22 mm x 22 mm, og inkubere i 5 minutter i mørke og ved romtemperatur.
    2. Vask de MNP-lastede cellene 3x i 1x PBS, 5 min hver vask. Utfør konfomisk avbildning. For DAPI, bruk en eksitasjonsbølgelengde på 358 nm og en utslippsbølgelengde på 461 nm. For MNPs (rhodamine), bruk en eksitasjonsbølgelengde på 578 nm og en utslippsbølgelengde på 613 nm.

9. Målinger og statistisk analyse

  1. Morfometrisk analyse av MNP-lastet celledifferensiering
    1. For å måle antall kryss på ulike avstander fra cellekroppen, skaff deg fasebilder av dyrkede celler opptil 3 dager etter behandling med NGF.
      MERK: Hvis det gjøres senere, kan cellene utvikle nettverk, og forhindre måling av enkeltcelleoppløsning.
      1. Åpne bildene i bildebehandlingsprogrammet, ImageJ, og bruk NeuronJ-plugin-modulen, som muliggjør en halvautomatisk nevrittsporing og lengdemåling36. Bruk neurite tracer plug-in, spore neurites og konvertere dataene til binære bilder. Definer midten av soma.
      2. Utfør Sholl-analyse, tilgjengelig i NeuronJ-plugin-modulen. Definer maksimal radius. Gjenta eksperimentet tre ganger. Analyser mer enn 100 celler i hvert eksperiment.
  2. Analyse av cellelokalisering
    1. For å bestemme prosentandelen av celler lokalisert på det magnetiske området etter 3 dager med inkubasjon, skaff konfiskeringsmikroskopiske bilder av celler med og uten MNP-opptak. Bruk DAPI-farging (pkt. 8.2).
    2. Tell cellene på toppen eller delvis på toppen av mønsteret (berøringsceller) og cellene som ikke er det. Gjenta for tre eksperimenter. Analyser mer enn 400 celler med MNP og uten opptak.
    3. Beregn den relative andelen av cellene som er på toppen av de magnetiske mønstrene ut av det totale antall celler, med og uten MNPer. I tillegg beregner du prosentandelen av det magnetiske mønsterets effektive område ved å legge cellekroppdiameteren til mønsterbredden for å bestemme den tilfeldige sannsynligheten for at celler lander på et magnetisk mønster.
    4. Utfør en enkelt prøve Z-test for å analysere om cellefordelingen er et resultat av isotrop cellelanding, eller om det er en foretrukket skjevhet til det magnetiske mønsteret.
  3. Analyse av vekstretning
    1. For å kvantifisere effekten på nevrittutvekst direksjonalitet, skaff konfikale mikroskopiske bilder av cellene med og uten MNP-behandling etter 8 dager med inkubasjon. Utfør immunfarging (pkt. 8.1).
    2. Bruk ImageJ programvare, måle vinkelen mellom cellen neurite og magnet striper under begge forhold.
      MERK: Analyser bare nevritter som stammer fra somas plassert på magnetstripene.
    3. Plott fordelingen av neurittenes vinkler i forhold til striperetningen (Δθ). Utfør en Kjikvadrattest av fordelingen av Δθ for å vise at fordelingen ikke er normal eller ensartet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Magnetiske plattformer med forskjellige geometriske former ble fremstilt (figur 1A). Magnetiske mønstre ble avsatt ved sputtering: 14 flerlags co80Fe20 og Pd, henholdsvis 0,2 nm og 1 nm. Elektronmikroskopi avslørte den totale høyden på de magnetiske mønstrene til ~18 nm (Figur 1B). Denne unike FM-flerlagsavsetningen skaper en stabil plattform med vinkelrett magnetiseringsantisotropi (PMA) i forhold til substratplanet som muliggjør tiltrekningen av MNP-belastede celler mot hele magnetmønsteret og ikke bare til kantene22,37. Parametrene til FM-flerlagsstrukturen var preget av magnetotransportmålinger der en kryssformet enhet av FM-flerlagsmotorer ble fremstilt (figur 1C-innfelt), og magnetiseringen vinkelrett på substratet ble målt via den uregelmessige halleffekten (AHE)38, hvor AHE-motstanden er proporsjonal med vinkelrett magnetisering. Målingen av AHE vs magnetfelt viste en hystereseløkke som indikerer PMA-ferromagnett (figur 1C). Den resterende magnetiseringen av FM-flerlagsene (magnetisk øyeblikk ved null felt) var identisk med magnetiseringsmetningen (MS) på høye felt. I tillegg var tvangsfeltet til FM-flerlagsenhetene ~ 500 Oe, og nådde metning ved 1200 Oe, noe som gjorde det mulig å enkelt magnetisere enheten og sikret stabilitet mot påvirkning av utilsiktede magnetiske felt. MS-verdien til flerlagsene ble målt ved hjelp av et magnetometer (figur 1D), som beskrevet i avsnitt 3.1. MS var 270 emu /cm3, som er på nivå med tidligere målinger av lignende strukturer.

Fluorescerende jernoksid (γ-Fe2O3) MNPer ble utarbeidet i henhold til en tidligere publikasjon39. MNP-ene ble syntetisert ved kjernedannelse, inkludert kovalent konjugering av sekslags tynne filmer av jernoksid til rhodaminisiocyanat og belegg med humant serumalbumin. Den tørre diameterstørrelsen på MNP-ene var ~ 15 nm med zetapotensial på -45, i henhold til overføringselektronmikroskopisk måling. De magnetometriske målingene til MNP-ene (figur 2A) viser at magnetiseringskurven ikke hadde hysterese, noe som indikerer MNPs superparamagnetiske oppførsel, et lavt metningsfelt på 500 Oe og relativt høy MS på 22 emu/g. For å kontrollere cellelokalisering ved hjelp av magnetiske mønstre ble PC12-celler inkubert i medium blandet med jernoksidfluorescerende MNPer i 24 timer, og forvandlet dem til magnetiske enheter. MNP-konsentrasjonen i mediet kan varieres; det var 0,25 mg/ml i platingeksperimentene. Konfokale mikroskopiske bilder ble tatt etter DAPI-farging (figur 2B). MNPene ble internalisert til PC12-cellenes soma, men ikke inn i kjernen, noe som ble reflektert av den mørke skyggen i midten. Resultatene viser at det ikke var rød florescens i kjernene, noe som indikerer at MNPene ikke ble internalisert i kjernen eller hadde festet til den ytre overflaten av cellene. Ved hjelp av ICP-målinger var det mulig å kvantifisere mengdenE MNPer internalisert i PC12-cellene. Jernkonsentrasjonen inne i cellene økte med økningen i MNP-konsentrasjonen i mediet (Figur 2C).

Levedyktigheten til MNP-lastede PC12-celler for forskjellige konsentrasjoner av MNPer ble evaluert ved hjelp av XTT- og resazurin-baserte analyser. Figur 3A viser PC12-celler etter MNP-behandling, dyrking og differensiering på toppen av en kollagenbelagt plastfat. For å undersøke effekten av internaliserte MNPer på differensiering, ble Sholl morfologiske måling utført. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i cellemorfologi mellom de MNP-lastede cellene og kontrollcellene (t-test, p > 0,05, n = 3) (Figur 3B). Den metabolske aktiviteten til PC12-cellene ble målt ved hjelp av XTT- og resazurin-baserte analyser etter celleinkubasjon med forskjellige MNP-konsentrasjoner. Resultatene ble normalisert til kontrollmålingen av PC12-celler uten MNPer. Disse konsentrasjonene av MNPer viste ingen signifikant cytotoksisitet mot cellene, tydelig i mangel på signifikante forskjeller i celle levedyktighet for noen av preparatene (t-test, p > 0,05, n = 3) (Figur 3C,D). Effektene av MNPer på cellebelegg og utvikling ble bestemt ved å sammenligne MNP-belastede celler med ikke-belastede celler, belagt og dyrket på identiske magnetiske substrater. Celler ble sådd og igjen for å holde seg til substratet. Annenhver dag ble celler behandlet med friskt medium og NGF som beskrevet i avsnitt 7. Figur 4 viser PC12-celler med og uten MNP-behandling, dyrking og differensiering på et magnetisk substrat med 20 μm brede striper og 100 μm avstand. Etter 3 dager med vekst ble cellene immunostert, DAPI-farget og bilder ble tatt.

De magnetiserte cellene ble funnet å feste seg til de magnetiske mønstrene og vokse grener i henhold til mønstrene, mens celler uten MNP-behandling vokste uten affinitet til de magnetiske enhetene (Figur 4A, B). Figur 4C presenterer plasseringen av celler og nettverksdannelse på et substrat med sekskantet geometri av en sidelengde på 200 μm og linjebredde på 50 μm. Celler ble avbildet etter 6 dager. De magnetiserte cellene var plassert på det magnetiske mønsteret, med lignende affinitet som de stripete substratene. Celleposisjonering ble kvantifisert ved å telle cellelegemene som ligger på de magnetiske mønstrene eller festet til dem. Den relative andelen celler ble beregnet fra den totale cellepopulasjonen. Dette ble gjort for celler med og uten MNP-behandling. Det effektive området av den magnetiske responsen ble beregnet ved å legge cellenes diameter (~ 10 μm for PC12-celler) til begge kantene av det magnetiske mønsteret. For magnetstripemønstrene var det effektive magnetiske arealforholdet 33%, noe som tilsvarte sannsynligheten for at cellene landet tilfeldig på magnetstripene. Resultatene viste at 75% av MNP-belastede cellelegemer var i kontakt med magnetstripene, mens bare 35% av de ikke-magnetiserte cellene var plassert på stripene (i statistisk avtale med en objektiv fordeling) (Figur 4D). Statistisk analyse indikerte at målingen ikke var avledet fra vilkårlig cellelanding (en-prøve z-test, p < 10-6, n = 430).

Den statistiske analysen av de magnetiske sekskantene viste derimot at 92 % av de MNP-lastede cellenes soma var festet til de magnetiske mønstrene, sammenlignet med 38 % for celler uten MNP-behandling (figur 4E). Det effektive arealforholdet til sekskantene var 32% av substratet. Statistisk analyse for sekskantene indikerte også at målingen ikke var avledet fra vilkårlig cellelanding (en-prøve z-test, p < 10-6, n = 370). Resultatene viste en klar preferanse for de MNP-lastede cellene for det magnetiske mønsteret, mens celler uten MNPer fulgte tilfeldig til hele substratet. I tillegg til celleposisjoneringseffekten ble disse magnetiske plattformene funnet å også kontrollere retningen til de voksende nevrittene. Figur 5A viser MNP-lastede celler med neuritter, justert i henhold til stripenes orientering. I motsetning viste kontrollmålingen av celler uten MNPer nevrittvekst over plattformen uavhengig av de magnetiske mønstrene.

For å evaluere den magnetiske effekten på nevron vekstretningalitet ble vinkelen mellom nevrittene og magnetstripene målt. Dataene viste at 80% av nevrittene til MNP-belastede celler viste korrelasjon med magnetstripens orientering, innenfor Δθ < 15° i forhold til stripenes retning. Imidlertid utviklet bare 32% av nevrittene av celler uten MNPer i det området. Celler uten MNP-behandling viste ingen sammenheng med magnetstripene og vokste i henhold til en jevn vinkelfordeling (Figur 5B). Statistisk analyse av fordelingen av Δθ viste at det ikke var normalt eller ensartet (Chi-square test, p < 0,001). Effekten av sekskantet geometri på nevrittvekst ble også demonstrert. Figur 5C viser fluorescensbilder av nevral nettverksutvikling av magnetiserte og ikke-magnetiserte PC12-celler på toppen av et magnetisk mønster av sekskanter og store sirkler mellom kantene. Sidelengden på sekskanten var 200 μm og linjebredden var 10 μm; sirkeldiameteren var 30 μm. Celle somas viste høy affinitet for sirklene og utviklet et godt orientert nevralt nettverk langs de sekskantede konturene. Et zoom-inn-bilde viser celler som er knyttet til en magnetisk sirkel, og neuritter som vokser langs disse konturene (Figur 5D).

Figure 1
Figur 1: Karakterisering av de magnetiske enhetene. (A) Optiske mikroskopiske bilder av magnetiske enheter med ulike geometriske former. Skalastang = 200 μm. (B) Skanning elektron mikroskopisk bilde av Co80Fe20/ Pd flerlags og et skjematisk av flerlags. Den totale høyden på de magnetiske mønstrene er 18 nm. Skalastang = 100 nm. (C) Uregelmessig halleffektmåling av den magnetiske enheten som viser de tvangsmessige og resterende magnetiske feltene på FM. Innfelt: bilde av enhet med merkede elektroder. (D) Magnetometri av flerlagsenhet viser magnetiseringsmetningsverdien beregnet per volum. Denne figuren er endret fra Marcus et al.37. Forkortelser: AHE = Uregelmessig Hall effekt; FM = ferromagnetisk; B = magnetfelt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: PC12-celleopptak av MNPer. (A) Magnetometrisk måling av MNPer ved romtemperatur. (B) Konfektmikroskopibilde av MNP-opptak av PC12-celler. Nuclei farget med DAPI; MNPer merket med rhodamin kommer inn i cellene. Skalastang = 10 μm (C) ICP-måling av internaliserte jernoksid MNPer (pg) av PC12-celler etter 24 timers inkubasjon med flere MNP-konsentrasjoner. Denne figuren er endret fra Marcus et al.37. Forkortelser: MNPs = magnetiske nanopartikler; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; ICP = induktivt koblet plasma. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: MNP-lastet PC12-celle levedyktighet. (A) Konfokale mikroskopiske bilder av differensierte PC12-celler inkubert med MNPer. Piler viser differensierte nevritter med internaliserte MNPer. Skalastenger = 50 nm. (B) Sholl analyse av nevritt utvekst av PC12 celler etter 3 dager med differensiering. (C) XTT levedyktighetsanalyse av PC12-celler behandlet med økende konsentrasjoner av MNPer etter 24 timers inkubasjon. Målinger normaliseres for å kontrollere. (D) Resazurin-basert levedyktighetsanalyse av PC12-celler behandlet med økende konsentrasjoner av MNPer etter 24 timers inkubasjon. Målinger normaliseres for å kontrollere. Det er ingen statistisk signifikans i begge analysene. Denne figuren er endret fra Marcus et al.37. Forkortelser: MNPs = magnetiske nanopartikler; XTT = 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboksanilid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Cellelokalisering på toppen av magnetiske enheter. (A) Fluorescerende bilder av PC12-celler lastet med MNPer som vokser på magnetstripene: (i) α-tubulinmerking, (ii) DAPI-farging og (iii) sammenslått bilde. Skalastang = 100 μm. (B) Fluorescerende bilder av PC12-celler uten MNP-behandling, vokser på toppen av magnetstripene som i (A). (C) Fluorescensbilder av PC12-celler, med og uten MNPer, på det sekskantede magnetiske mønsteret. Skalalinje = 200 μm. (D) Prosentandel av cellelegemer, med og uten MNPer, plassert på magnetstripene. Feilfelt representerer standardavvik. Den stiplede linjen representerer sannsynligheten for at celler lander på magnetstripene. (E) Prosentandelen av cellelegemer, med og uten MNPer, plassert på de magnetiske sekskantene. Feilfelt representerer standardavvik. Den prikkede linjen representerer sannsynligheten for at celler lander på de magnetiske mønstrene for en tilfeldig fordeling. Det er ingen statistisk signifikans i begge analysene. Denne figuren er endret fra Marcus et al.37. Forkortelser: MNPs = magnetiske nanopartikler; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Retningsretning for nevronnettverket. (A) Konfokale mikroskopiske bilder av α-tubulin-merkede PC12-celler med MNP-behandling (venstre) og uten MNP-behandling (høyre), vokser på toppen av magnetiske striper. Stripene er merket. (B) Polare histogrammer presenterer den nevrittiske retningseffekten på PC12-celler (venstre) med MNP-behandling og (høyre) uten MNP-behandling. Avviket i orienteringsvinkelen er definert som forskjellen i vinkelen mellom nevrittene og magnetstriperetningen (15° skuffer). (C) Fluorescensbilder av PC12-celler dyrket på toppen av et magnetisk sekskantet mønster, (venstre) med MNP-behandling og (høyre) uten MNP-behandling. Skalalinje = 200 μm. (D) Zoom-inn-bilde av en magnetisert celle som utvikler nevritter i henhold til det magnetiske mønsteret. Skalastang = 30 μm. Denne figuren er endret fra Marcus et al.37. Forkortelse: MNPs = magnetiske nanopartikler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De representative resultatene viser effektiviteten av den presenterte metodikken for å kontrollere og organisere nevronal nettverksdannelse i mikronskala. De MNP-lastede PC12-cellene forble levedyktige og ble forvandlet til magnetiske sensitive enheter som ble tiltrukket av magnetkreftene fra FM-elektrodene til bestemte steder. Dette er best demonstrert i figur 5C, der cellene fortrinnsvis festet seg til de større toppunktene i sekskantene og ikke de tynne linjene. Videre utviklet forgrening av cellene seg også gunstig etter de magnetiske mønstrene. Alle kontrolleksperimenter demonstrerte entydig at de magnetiske kreftene styrte lokaliseringen av cellelegemene og utvekstene. Selv om det ble demonstrert at topografiske signaler kan brukes til å lede neurite utvekst40,41, er dette ikke tilfelle her, da celler uten MNPer ikke viste noe svar på mønsterets form.

En nedenfra-og-opp-tilnærming ble brukt til å konstruere de lokale magnetiske kreftene, ved hjelp av standard fotolittografi og sputtering avsetninger som er tilgjengelige i mange forskningsfasiliteter, noe som letter mange forskeres vedtakelse av disse teknikkene. Nedenfra-og-opp-tilnærmingen gir frihet i utformingen av komplekse mønstre og former i henhold til forskernes behov, med mikronskala oppløsning for centimeterlengdeområder. Selv om resultatene ble demonstrert på glasssklier, er det i prinsippet mulig å forberede enhetene på toppen av andre biokompatible materialer som er egnet for in vivo terapeutiske applikasjoner som fleksible elektrodematriser for nevronal registrering og stimulering42,43.

Disse unike PMA-plattformene, oppnådd ved flerlagsavsetning, produserer et sterkt magnetfelt langs hele magnetmønsteret og ikke bare på kantene, som observert tidligere22. I tillegg ble FMs designet med en stor restmagnetiseringsmetning, det vil si selv når det eksterne magnetfeltet fjernes, forblir elektrodene fullt magnetiserte og fortsetter å tiltrekke seg cellene uten behov for en ekstern magnet. Imidlertid kan en ekstern magnetisk kraft hjelpe til med å fullstendig magnetisere MNPene i cellene, og dermed øke tiltrekningskraften og effektiviteten under plating. En viktig vurdering i FM-design var antall repetisjoner. Mens mer repetisjon vil øke det totale magnetiske øyeblikket, noe som er gunstig, vil det å legge til mange lag også øke lagsammensetningen, noe som forårsaker mindre stabil PMA og til slutt resulterer i en magnetisering i plan44,45 enkel akse og tiltrekning til forskjellige kanter av elektrodene22,37. Derfor er det nødvendig å optimalisere FM-nummeret og sammensetningen av flerlagsene for å sikre stabil PMA med maksimale magnetiske felt.

MNPs presentert i de representative resultatene viste nesten ingen toksisitet mot PC12-cellene ved de testede konsentrasjonene, og de påvirket heller ikke cellulær oppførsel, til tross for at de kunne komme inn i cellene og ha et relativt høyt magnetisk øyeblikk. Tiltrekningskraften på en celle avhenger av antall MNPer i cellen og magnetiseringen av hver MNP. Ideelt sett bør begge være høye; Det kan imidlertid være en avveining mellom de to. Med noen kommersielle MNPer var celle levedyktigheten god, men det magnetiske øyeblikket var for svakt. For andre partikler som ble fremstilt i laboratoriet, var det magnetiske øyeblikket høyt, men MNPene hadde en tendens til å aggregere og celle levedyktigheten var lav. Dermed er det viktig å teste celle levedyktighet og karakterisere magnetiseringen når du velger MNPer. MNPene som brukes her er også fluorescerende, noe som gjør det enkelt å spore plasseringen i cellene. Resultatene viser nevritter som utvikler seg i henhold til formen på det magnetiske mønsteret, og fluorescens indikerer tilstedeværelsen av MNPer langs nevrittene.

Internaliseringsmekanismen til MNPer i celler har tidligere blitt undersøkt46. Cellulært opptak av MNPer skjer via endokytose i henhold til størrelse, form og overflatekjemi. Tidligere studier undersøkte opptaket av ulike typer MNPer i nevroner24; cellulært opptak av belagte MNPer var bedre enn det cellulære opptaket av ubestrøket MNPer. Som vist i figur 3A,B, MNPs ble internalisert inn i cytoplasma, men forble utenfor kjernene og ble overført til nevrittene under utviklingen. I tillegg ble MNPer konjugert til NGF som aktiverte NGF-signalveien, også internalisert i celler via endokytose47,48.

For å konkludere presenterer dette papiret en effektiv verktøykasse med magnetisk manipulasjon for forskning som krever biologisk elementorganisasjon. Bruken av magnetiske krefter muliggjør posisjonering av celler, som styrer nevrittvekst. Denne metoden muliggjør design av plattformer med komplekse geometriske former. Kreftene til magnetisk tiltrekning kan konstrueres for å manipulere nevral nettverksdannelse eksternt ved å endre magnetkraftlandskapet over tid. Hele denne metodikken kan enkelt utvides for å kontrollere andre faktorer eller kjemikalier som kan kobles til MNP-ene og bringe dem til forhåndsdesignede interessepunkter, alle med mikron-skala oppløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Vitenskaps- og teknologidepartementet, Israel, og av Den israelske vitenskapsstiftelsen (569/16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Tags

Bioengineering Utgave 173 magnetiske nanopartikler vinkelrett magnetiseringsanotropi (PMA) magnetisk målrettet legemiddellevering magnetisk cellemanipulering nevral kultur nevralteknikk bio-interfacing fotolitografi magnetiske flerlags
Fabrikasjon av magnetiske plattformer for mikron-skala organisering av sammenkoblede nevroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., … More

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter