Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling af magnetiske platforme til Micron-Scale Organisation af sammenkoblede neuroner

Published: July 14, 2021 doi: 10.3791/62013
Automatic Translation
1,4, 2,4, 2,4, 1,4, 2,4, 2,4, 3,4, 2,4, 1,4
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Summary

Dette arbejde præsenterer en bottom-up tilgang til konstruktion af lokale magnetiske kræfter til kontrol af neuronal organisation. Neuron-lignende celler fyldt med magnetiske nanopartikler (PARP'er) er belagt på toppen og kontrolleret af en mikromønstret platform med vinkelret magnetisering. Også beskrevet er magnetisk karakterisering, MNP cellulære optagelse, celle levedygtighed, og statistisk analyse.

Abstract

Evnen til at lede neuroner ind i organiserede neurale netværk har store konsekvenser for regenerativ medicin, vævsteknik og biointerfacing. Mange undersøgelser har til formål at lede neuroner ved hjælp af kemiske og topografiske signaler. Der er imidlertid kun få rapporter om organisatorisk kontrol i mikronskala over store områder. Her er en effektiv metode blevet beskrevet til at placere neuroner på forudindstillede steder og vejlede neuronal udvækst med mikron-skala opløsning, ved hjælp af magnetiske platforme indlejret med mikro-mønstrede, magnetiske elementer. Det er blevet påvist, at lastning neuroner med magnetiske nanopartikler (PARP'er) konverterer dem til følsomme magnetiske enheder, der kan påvirkes af magnetiske gradienter. Efter denne tilgang er en unik magnetisk platform blevet fremstillet på hvilke PC12-celler, en fælles neuronlignende model, blev belagt og fyldt med superparamagnetiske nanopartikler. Tynde film af ferromagnetiske (FM) multilayers med stabil vinkelret magnetisering blev deponeret for at give effektive tiltrækning kræfter mod magnetiske mønstre. Disse MNP-belastede PC12-celler, belagt og differentieret oven på de magnetiske platforme, var fortrinsvis knyttet til de magnetiske mønstre, og neurite udvæksten var godt afstemt med mønsterformen og dannede orienterede netværk. Kvantitative karakteriseringsmetoder af de magnetiske egenskaber, cellulær MNP-optagelse, celle levedygtighed og statistisk analyse af resultaterne præsenteres. Denne tilgang gør det muligt at kontrollere neural netværksdannelse og forbedrer neuron-til-elektrode-grænsefladen gennem manipulation af magnetiske kræfter, som kan være et effektivt værktøj til in vitro-undersøgelser af netværk og kan tilbyde nye terapeutiske biointerfacing retninger.

Introduction

Mikromaling af neuroner rummer et stort potentiale for vævsregenerering1,2,3,4,5 og udvikling af neuroelektroniske enheder6,7,8. Imidlertid udgør den mikronskalerede positionering af neuroner ved høj rumlig opløsning, som i biologisk væv, en betydelig udfordring. Dannelse af foruddesignede strukturer i denne skala kræver vejledning af nervecelleprocesser ved lokalt at kontrollere soma motilitet og axonal udvækst. Tidligere undersøgelser har foreslået brugen af kemiske og fysiske signaler9,10,11,12 til at styre neuronal vækst. Her fokuserer en ny tilgang på at kontrollere cellepositionering ved hjælp af magnetfeltgradienter13,14,15,16,17, dreje celler fyldt med parlamentsmedlemmer til magnetisk følsomme enheder, som kan fjernstyres manipuleret.

Kunze et al., der karakteriserede den kraft, der er nødvendig for at fremkalde cellulære reaktioner ved hjælp af magnetiske chip- og MNP-belastede celler, beviste, at tidlig axonal forlængelse kan udløses af mekanisk spænding inde i celler18. Tay et al. bekræftede, at mikrofabrikerede substrater med forbedrede magnetfeltgradienter giver mulighed for trådløs stimulering af neurale kredsløb doseret med parlamentsmedlemmer ved hjælp af calciumindikatorfarvestoffer19. Desuden Tseng et al. coalesced nanopartikler inde i celler, hvilket resulterer i lokaliserede nanopartikel-medierede kræfter, der nærmede sig cellulære spændinger20. Dette førte til fremstilling af definerede mønstre af mikromagnetiske substrater, der hjalp med at studere cellulær reaktion på mekaniske kræfter. Cellulære spændinger som følge af anvendelsen af lokaliserede nanopartikelmedierede kræfter blev opnået ved at samle nanopartikler icellerne 20. En supplerende metaloxid halvleder (CMOS)-mikrofluidic hybrid system blev udviklet af Lee et al., der indlejrede en række mikro-elektromagneter i CMOS-chippen for at kontrollere bevægelsen af individuelle celler mærket med magnetiske perler21.

Alon et al. brugte mikroskala, forprogrammerede, magnetiske puder som magnetiske "hot spots" til at lokalisere celler22. Specifik aktivitet kan også stimuleres i celler ved hjælp af mikromønstrede magnetmatrixer til lokalisering af nanopartikler på bestemte subcellulære steder23. Cellulære MNP optagelse er blevet demonstreret med succes i igle, rotte, og musen primære neuroner24,25,26. Her er dette blevet påvist på en rotte PC12 pheochromocytoma cellelinje, som tidligere er blevet rapporteret til at vise høj optagelse af parlamentsmedlemmer27. I de senere år har der været forskellige medicinske anvendelser af parlamentsmedlemmer, herunder lægemiddellevering og termoterapi ikræftbehandlinger 28,29,30,31. Specifikt, undersøgelser beskæftiger sig med anvendelsen af parlamentsmedlemmer og neuron netværk32,33,34,35. Men den magnetiske organisering af neuroner ved hjælp af parlamentsmedlemmer på en enkelt celle niveau fortjener yderligere undersøgelse.

I dette arbejde er en bottom-up-tilgang blevet beskrevet for at konstruere lokale magnetiske kræfter via foruddesignede platforme til styring af neuronal arrangement. Fremstillingen af mikron-skala mønstre af FM multilayers er blevet præsenteret. Denne unikke, FM flerlags struktur skaber stabil vinkelret magnetisering, der resulterer i effektive attraktion kræfter mod alle de magnetiske mønstre. Via inkubation blev parlamentsmedlemmer indlæst i PC12-celler og omdannede dem til magnetiske følsomme enheder. MNP-belastede celler, belagt og differentieret oven på de magnetiske platforme, var fortrinsvis knyttet til de magnetiske mønstre, og neurite udvækst var godt afstemt med mønsteret form, danner orienterede netværk. Flere metoder er blevet beskrevet for at karakterisere de magnetiske egenskaber FM multilayers og parlamentsmedlemmer, og teknikker til cellulære MNP optagelse og celle levedygtighed assays er også blevet præsenteret. Derudover er morfometriske parametre for neuronal vækst og statistisk analyse af resultaterne detaljerede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Udfør alle biologiske reaktioner i et biosikkerhedsskab.

1. Magnetisk platform fabrikation

  1. litografi
    1. Skær glasrutsjebaner i 2 x 2 cm2 ved hjælp af en skrivepen. Rengør glasrutsjebanerne i acetone og isopropanol i 5 minutter hver i et ultra-sonikeringsbad. Tør med ultra-høj renhed (UHP) nitrogen.
    2. Glasglasset belægges med fotoresist med spin-coating ved 6.000 omdrejninger i minuttet i 60 s for at opnå en tykkelse på 1,5 μm og bages ved 100 °C i 60 s. Prøven udsættes for en lyskilde ved hjælp af en passende bølgelængde for fotoresist med et ønsket mønster ved hjælp af en fotomaske eller maskefri litografi.
    3. Udvikle 40'ere i en udvikler, fortyndet i destilleret vand (DW) i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger vask i DW i 45 s, og tør med UHP nitrogengas. Undersøg mønsteret under et optisk mikroskop.
  2. Sputter-deposition
    1. Prøven sættes ind i aflejringssystemets hovedkammer, og der ventes på basistryk (~5 × 10-8 Torr). Åbn gasstrømmen. indstille argon flow for standard sputtering (28 sccm [standard kubik cm per min) heri. Tænd sputter mål, derefter indstille sputter pres til 3 mTorr.
    2. Forøg strømmen på hvert mål, indtil den ønskede hastighed er opnået.
      BEMÆRK: Pd Rate: 0,62 A/s = 1,0 nm i 16 s; Co80Fe20 Rate: 0,32 A/s, 0,2 nm i 6,25 s.
    3. Slå rotation til. Indbelejr FM-multilayer, skiftevis mellem Co80Fe20 og Pd mål, ved at åbne og lukke målet skodder, henholdsvis. Depositum 14 bilayers af Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm), og af med en ekstra 2 nm Pd udjævning lag.
    4. Lift-off: Prøven sættes i blød i acetone i 30 minutter, og skyl med isopropanol. Derefter tørres med UHP nitrogen, og prøven holdes i et rent og tørt miljø, indtil den bruges.

2. Karakterisering af magnetisk anordning via transportmålinger

  1. Brug et Si-underlag eller en glassjebane med en korsformet magnetbjælke på 100 μm bredde, deponeret med FM-multilag (se figur 1C indsat). Fastgør prøven til holderen ved hjælp af dobbeltsidet tape.
  2. Ved hjælp af en trådbinding binder 4 ledninger til prøven, en på hvert ben af krydselektroden. Prøveholderen og prøven ind i transportmålesystemet indstilles med et magnetfelt, således at magnetfeltet er vinkelret på prøven. Udfør målinger ved stuetemperatur.
  3. Udfør måling af enhedens tværgående spænding (VT). følg markeringerne i figur 1C (indsat): anvende en strøm på 1 mA mellem kontakt 1 og 3 måle VT mellem kontakt 2 og 4 derefter anvende en strøm mellem 2 og 4, og måle spændingen mellem 1 og 3. Endelig beregnes forskellen mellem spændingerne i både målingerne og dividere med 2 for at opnå VT. Brug et skiftsystem til automatisk at skifte mellem de to målekonfigurationer.
  4. Magnetfeltet fejes mellem 0,4 T og -0,4 T i trin på 5 mT, og VT måles som en funktion af feltet. Plot den tværgående modstand (VT/ I) vs magnetfeltet til at bestemme unormale Hall signal, som er proportional med vinkelret magnetisering i filmen.

3. Karakterisering af parlamentsmedlemmer og magnetiske multilayers ved magnetometri målinger

  1. Magnetometrisk måling af FM-multilag
    1. Fm-multilayer'en deponeres på Si-substratet (se afsnit 1.2). Prøven skæres i 6 kvadrater på 4 x 4 mm2. Stak prøverne oven på hinanden og arranger dem i kapslen vinkelret på magnetfeltets retning (se figur 1D-indsat).
    2. Sæt kapslen i magnetometeret, og mål magnetiseringen ved stuetemperatur. Fej magnetfeltet mellem -0,4 T og 0,4 T.
    3. Det magnetiske materiales samlede volumen beregnes under hensyntagen til tykkelsen af det magnetiske lag, prøvernes størrelse og antallet af substrater. Divider magnetiseringen med det samlede volumen af det magnetiske materiale.
    4. Plot magnetisering (pr enhed volumen) vs magnetfeltet. Træk substratets diamagnetiske baggrund fra den høje magnetfeltrespons, og ekstrapolere Mætningsmagnetiseringen af FM fra grafen.
  2. Magnetometrisk måling for parlamentsmedlemmer
    1. Indsæt en udpeget masse af parlamentsmedlemmer i en syntetisk polymer kapsel. Overvej et større volumen, hvis du måler små magnetiseringsmætningsværdier.
    2. Hvis parlamentsmedlemmerne er ophængt i et opløsningsmiddel, skal de parlamentsmedlemmer tørres ved at lade kapslen stå åben natten over. Sæt kapslen i magnetometeret, og mål magnetiseringen ved stuetemperatur. Fej magnetfeltet mellem -0,2 T og 0,2 T.
    3. Den samlede masse af de parlamentsmedlemmer, der er beregnet til at multiplicere det angivne volumen med partikelkoncentrationen, beregnes. Normaliser resultaterne til 1 g.
    4. Plot den normaliserede magnetisering (pr gram) vs magnetfeltet. Ekstrapolere magnetisering mætning af parlamentsmedlemmer fra grafen.

4. Protokol for kollagenbelægning

  1. Belægning plast retter
    1. Der fremstilles 0,01 M HCl ved at tilsætte 490 μL HCl til 500 mL autoklaveret dobbeltdestilleret vand (DDW).
      BEMÆRK: Udfør kun dette trin i den kemiske emhætte.
    2. Fortyndet kollagen type 1 (opløsning fra rottehale) 1:60-1:80 i 0,01 M HCl for at opnå den endelige arbejdskoncentration på 50 μg/ml. Placer 1,5 ml af den fortyndede opløsning i en 35 mm dyrkningsskål. Lad skålen i emhætten i 1 time, dækket.
    3. Opløsningen fjernes, og 3x vaskes i steril 1x fosfatbufferet saltvand (PBS). Skålen er klar til cellesåning.
  2. Belægning glas dias
    1. Fortyndet kollagen type 1 (opløsning fra rottehale) 1:50 i 30% v/v ethanol. Til belægning af en 35 mm skål tilsættes 20 μL kollagen til 1 mL 30% ethanol.
    2. Dæk skålen med opløsningen, og vent, indtil hele opløsningen fordamper, så skålen er afdækket i et par timer. Vask 3x i steril 1x PBS; glasrutsjebanen er klar til cellesåning.

5. Mobil MNP optagelse og levedygtighed

  1. Mobil MNP-optagelse
    1. Forbered grundlæggende vækstmedium til PC12 cellekultur ved at tilføje 10% hesteserum (HS), 5% føtal kvægserum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin og 0,2% amphotericin til Roswell Park Medical Institute (RPMI) medium, og filtrer ved hjælp af et 0,22 μm nylonfilter.
    2. Tilsæt 1% hesteserum (HS), 1% L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin og 0,2% amphotericin til RPMI-medium for at forberede PC12-differentieringsmedium, og filtrer ved hjælp af et 0,22 μm nylonfilter.
    3. Vokse celler i en ikke-behandlet dyrkningskolbe med 10 mL basisvækstmedium der tilsættes 10 mL basisvækstmedium til kolben hver 2-3 dage, og cellerne subkulturer efter 8 dage.
    4. For cellulær optagelse, centrifuge celle suspensionen i en centrifuge rør i 8 min ved 200 × g og stuetemperatur, og kassér supernatant.
    5. Resuspend cellerne i 3 mL frisk grundlæggende vækst medium. Igen, centrifuge celle suspension i 5 min ved 200 × g og stuetemperatur, og kassér supernatant. Resuspend cellerne i 3 mL frisk differentiering medium.
    6. Aspirere cellerne 10x ved hjælp af en sprøjte og en nål til at bryde op celle klynger. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, og frø 106 celler i en almindelig ubestrøget 35 mm skål.
    7. Tilsæt til skålen det beregnede volumen af MNP-suspension og volumen af differentieringsmedium for at opnå den ønskede MNP-koncentration og samlede volumen. Bland celler, parnps og differentieringsmedium; skålen i en 5% CO2 befugtet inkubator ved 37 °C i 24 timer.
    8. Centrifuge celleaffjedringen i 5 min ved 200 × g ved stuetemperatur, og kassér supernatanten. Resuspend cellerne i 1 mL frisk differentiering medium, og tælle cellerne ved hjælp af en hæmocytometer.
  2. MNP-indlæst celledifferentiering
    1. Udfør optagelsesprotokol (afsnit 5.1). Frø 8 × 104 MNP-belastede celler på en 35 mm, kollagen type l-coated fad i nærværelse af differentiering medium (se kollagen belægning protokol i punkt 4.1). Efter 24 timer tilsættes 1:100 frisk murine beta-nerve vækstfaktor (β-NGF) (endelig koncentration 50 ng/mL).
    2. Forny differentieringsmediet, og tilsæt frisk murine β-NGF hver 2. dag. Billede cellerne hver 2. dag ved hjælp af optisk mikroskopi. Efter netværksdannelse (6-8 dage for PC12-celler) skal du afbilde cellerne ved hjælp af konfokal mikroskopi og observere partiklernes fluorescens.
  3. Levedygtighedsanalyse for MNP-belastede celler: 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) cellelevedygtighedstest.
    1. Forbered det grundlæggende vækstmedium i henhold til trin 5.1.1. Pc12-cellerne dyrkes med parlamentsmedlemmer i forskellige koncentrationer (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL og 0,5 mg/mL i det grundlæggende vækstmedium) og også uden MNP'er til kontrol i tre eksemplarer i en flad 96-brøndsplade (samlet volumen på 100 μL/brønd). Cellerne inkuberes i 24 timer i en 5% CO2, befugtet inkubator ved 37 °C.
    2. Forbered tomme brønde, der indeholder medium uden celler, til baggrundskorrektion. XTT-reagensopløsningen og reaktionsopløsningen, der indeholder N-methyldibenzopyrazinmethylethulfat, optøs i et 37 °C bad umiddelbart før brug. Hvirvel forsigtigt, indtil der opnås klare opløsninger.
    3. For en 96-brønds plade blandes 0,1 ml aktiveringsopløsning med 5 ml XTT-reagens. Tilsættes 50 μL af reaktionsopløsningen til hver brønd, ryst pladen lidt for en jævn fordeling af farvestoffet i brøndene, og inkubat derefter pladen i en inkubator i 5 timer.
    4. Prøvens absorbans måles i forhold til de tomme brønde ved hjælp af en enzymrelateret immunosorbentanalyselæser (ELISA) ved en bølgelængde på 450 nm. Referenceabsorpmentet måles ved hjælp af en bølgelængde på 630 nm, og det trækkes fra 450 nm-målingen.
    5. Da der forekommer let spontan absorbans i dyrkningsmediet, der inkuberes med XTT-reagenset ved 450 nm, trækkes den gennemsnitlige absorbans af de tomme brønde fra de andre brøndes. Træk signalværdier fra parallelle prøver af parlamentsmedlemmer i samme testede koncentrationer som celleprøverne.
  4. Levedygtighedsanalyse for MNP-belastede celler: resazurinbaseret cellerygtighedstest
    1. Forbered basisvækstmedium i henhold til trin 5.1.1. Pc12-cellerne dyrkes med parlamentsmedlemmer i forskellige koncentrationer (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL og 0,5 mg/mL i basisvækstmedium) og uden MNP'er som kontrol i tre eksemplarer i en flad 96-brøndsplade i 24 timer. Cellerne inkuberes i 24 timer i en 5% CO 2-inkubator ved 37 °C. Forbered tomme brønde, der indeholder medium uden celler.
    2. Vask cellerne med 1x PBS. Det resazurinbaserede reagens (10% w/v) til mediet tilsættes og inkuberes i 2 timer i en 37 °C inkubator.
    3. Prøverne anbringes på 150 μL aliquots i ELISA-læseren, og absorbansen måles ved en excitationsbølgelængde på 560 nm og en emissionsbølgelængde på 590 nm. Træk signalværdierne fra de parallelle prøver af parlamentsmedlemmer i samme testede koncentrationer som celleprøverne.

6. Karakterisering af MNP-koncentrationen inde i cellerne ved hjælp af induktivt koblet plasma (ICP)

  1. Forbered basisvækstmedium i henhold til trin 5.1.1. Pc12-cellerne dyrkes med parlamentsmedlemmer i forskellige koncentrationer (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL og 0,5 mg/mL i det grundlæggende vækstmedium) og uden MNP'er som kontrol i tre eksemplarer i en flad plade på 96 brønde (samlet volumen på 100 μL/godt). Inkuber i en 5% CO2, befugtet inkubator ved 37 °C i 24 timer.
  2. Suspensionen overføres til et centrifugerør (fra hver brønd separat), centrifugeceller ved 200 × g i 5 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten. Resuspend cellerne i 1 mL frisk differentiering medium, og tælle cellerne ved hjælp af en hæmocytometer.
  3. Lys cellerne ved behandling med 100 μL på 70% salpetersyre til hver brønd separat i mindst 15 min. Tilsæt 5 mL DDW til lyscellerne, og filtrer opløsningerne.
  4. Mål jernkoncentrationen ved hjælp af ICP, og brug celletallet til at registrere Fe-koncentrationen pr. celle.

7. Celledifferentiering og vækst på magnetisk platform

  1. Rengør det mønstrede substrat med 70% v/v/ethanol og læg underlaget i en 35 mm kulturret i emhætten. Placer en stor magnet (~ 1500 Oe) under mønstret substrat i 1 min og fjern magneten ved først at flytte skålen op og væk fra magneten, og derefter tage magneten ud af emhætten. Tænd for ultraviolet lys i 15 minutter.
  2. Substratet belægges med kollagentype 1 i henhold til punkt 4.2. Cellerne suspenderes efter cellulær MNP-optagelse (afsnit 5.1), frø 105 celler i en 35 mm kulturskål, og der tilsættes 2 mL differentieringsmedium. Inkuber kulturen i en 5% CO2,befugtet inkubator ved 37 °C.
  3. Efter 24 timer tilsættes 1:100 frisk murine β-NGF (endelig koncentration på 50 ng/mL). Forny differentieringsmediet, og tilsæt frisk murine β-NGF hver 2. dag. Billede cellerne hver anden dag ved hjælp af lysmikroskopi, og efter netværksdannelse udfører immunostaining på cellerne (afsnit 8.1).

8. MNP-loaded celle farvning

  1. Tubulin immunostaining
    1. Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning ved at blande 10 ml 16% w/v PFA opløsning, 4 ml 10x PBS og 26 ml DDW. Der fremstilles 50 mL PBT på 1% ved at tilsætte 500 μL af et nonionisk overfladeaktivt middel til 50 mL 1x PBS. Forbered 50 mL på 0,5% PBT ved at blande 25 mL af 1% PBT med 25 mL 1x PBS. Forbered blokeringsopløsning ved at blande 1% kvægserumalbumin og 1% normalt æselserum i 0,25% PBT.
      BEMÆRK: Brug kun PFA inde i den kemiske emhætte.
    2. Fjern det supernatantmedie fra cellerne. Fix MNP-loaded celler i 4% PFA i 15 min ved stuetemperatur inde i en kemisk hætte. Vask MNP-loaded celler 3x i 1x PBS, 5 min hver vask, inde i en kemisk hætte.
    3. Gennemtræng MNP-loaded celler med 0,5% PBT i 10 min. De MNP-belastede celler inkuberes først i blokeringsopløsningen i 45 minutter ved stuetemperatur og derefter med kaninanti- α tubulinantistof i blokeringsopløsning natten over ved 4 °C. Vask MNP-belastede celler 3x i 1x PBS, 5 min hver vask.
    4. Inkuber MNP-loaded celler med Cy2-konjugerede æsel anti-kanin sekundære antistof i 45 min i mørke og ved stuetemperatur. Vask MNP-loaded celler 3x i 1x PBS, 5 min hver vask.
    5. Udfør konfokal billedbehandling. For tubulin anvendes en excitationsbølgelængde på 492 nm og en emissionsbølgelængde på 510 nm. For de nationale parlamentsmedlemmer (rhodamin) anvendes en excitationsbølgelængde på 578 nm og en emissionsbølgelængde på 613 nm.
  2. Nuklear farvning med 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
    1. Vask MNP-loaded celler 3x i 1x PBS, 5 min hver vask. Overskydende væske fjernes omkring prøven, der tilsættes 1 dråbe (~50 μL) monteringsmedium, der indeholder DAPI, for at dække et areal på 22 mm x 22 mm og inkuberes i 5 minutter i mørke og ved stuetemperatur.
    2. Vask MNP-loaded celler 3x i 1x PBS, 5 min hver vask. Udfør konfokal billedbehandling. For DAPI skal du bruge en excitationsbølgelængde på 358 nm og en emissionsbølgelængde på 461 nm. For de nationale parlamentsmedlemmer (rhodamin) anvendes en excitationsbølgelængde på 578 nm og en emissionsbølgelængde på 613 nm.

9. Målinger og statistisk analyse

  1. Morfometrisk analyse af MNP-indlæst celledifferentiering
    1. For at måle antallet af kryds i forskellige afstande fra cellekroppen skal du erhverve fasebilleder af dyrkede celler op til 3 dage efter behandling med NGF.
      BEMÆRK: Hvis det gøres senere, kan cellerne udvikle netværk, hvilket forhindrer målinger af enkeltcelleopløsning.
      1. Åbn billederne i billedbehandlingsprogrammet ImageJ, og brug NeuronJ-plug-in'en, som muliggør en halvautomatisk neuritsporing og længdemåling36. Brug plug-in'en til neuritsporing til at spore neuritterne, og konverter dataene til binære billeder. Definer midten af soma.
      2. Udfør Sholl-analyse, der er tilgængelig i NeuronJ-plug-in'en. Definer maksimal radius. Gentag eksperimentet tre gange. Analyser mere end 100 celler i hvert eksperiment.
  2. Analyse af cellelokalisering
    1. For at bestemme procentdelen af celler lokaliseret på det magnetiske område efter 3 dages inkubation, erhverve konfokale mikroskopiske billeder af celler med og uden MNP optagelse. Brug DAPI-farvning (afsnit 8.2).
    2. Tæl cellerne manuelt oven på eller delvist oven på mønsteret (rørende celler) og de celler, der ikke er. Gentag for tre eksperimenter. Analyser mere end 400 celler med MNP og uden optagelse.
    3. Beregn den relative andel af de celler, der er på toppen af de magnetiske mønstre ud af det samlede antal celler, med og uden parlamentsmedlemmer. Derudover beregne den procentdel af det magnetiske mønster effektive område ved at tilføje cellekroppen diameter til mønsteret bredde for at bestemme den tilfældige sandsynlighed for celler landing på et magnetisk mønster.
    4. Udfør en enkelt prøve Z-testfor at analysere, om cellefordelingen er et resultat af isotropcellelanding, eller om der er en foretrukken bias frem for det magnetiske mønster.
  3. Analyse af vækstretningalitet
    1. For at kvantificere effekten på neurit udvækst directionality, erhverve konfokale mikroskopiske billeder af cellerne med og uden MNP behandling efter 8 dages inkubation. Immun farvning udføres (afsnit 8.1).
    2. Brug ImageJ-software til at måle vinklen mellem celleekastit og magnetstriber under begge forhold.
      BEMÆRK: Analyser kun neuritter, der stammer fra somas placeret på de magnetiske striber.
    3. Fordelingen af neuritternes vinkler afbildes i forhold til stribernes retning (Δθ). Udfør en Chi-kvadreret test af Δθ's fordeling for at påvise, at fordelingen ikke er normal eller ensartet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Magnetiske platforme med forskellige geometriske former blev fremstillet (Figur 1A). Magnetiske mønstre blev deponeret ved sputtering: 14 multilayers af Co80Fe20 og Pd, 0,2 nm og 1 nm, hhv. Elektronmikroskopi afslørede den samlede højde af de magnetiske mønstre til at være ~ 18 nm (Figur 1B). Denne unikke FM multilayer deposition skaber en stabil platform med vinkelret magnetisering anisotropi (PMA) i forhold til substratet plan, der gør det muligt attraktion af MNP-belastede celler mod hele magnetisk mønster og ikke kun til kanterne22,37. Parametrene for FM-flerlagsstrukturen var kendetegnet ved magnetotransportmålinger, for hvilke en krydsformet enhed af FM-multilag blev fremstillet(Figur 1C indsat), og magnetiseringen vinkelret på substratet blev målt via den unormale halleffekt (AHE)38, hvor AHE-modstanden er proportional med den vinkelret magnetisering. Målingen af AHE vs. magnetfelt viste en hysteresesløjfe, der tydede på PMA-ferromagneter (figur 1C). Restmagnetiseringen af FM-multilayers (magnetisk øjeblik ved nulfelt) var identisk med magnetiseringsmætningen (MS)ved høje felter. Derudover var FM-multilayers tvangsområde ~ 500 Oe og nåede mætning ved 1.200 Oe, hvilket muliggjorde let magnetisering af enheden og sikrede stabilitet mod påvirkning af utilsigtede magnetfelter. Multilayers MS-værdi blev målt ved hjælp af et magnetometer (Figur 1D) som beskrevet i punkt 3.1. MS var 270 emu/cm3, hvilket er på niveau med tidligere målinger af lignende strukturer.

Fluorescerende jernoxid (γ-Fe2O3)parlamentsmedlemmer blev udarbejdet i henhold til en tidligere publikation39. De parlamentsmedlemmer blev syntetiseret ved nukleation, herunder den kovalent bøjning af seks-lags tynde film af jernoxid til rhodamin isothiocyanat og belægning med human serum albumin. Den tørre diameter størrelse af parlamentsmedlemmer var ~ 15 nm med zeta potentiale på -45, ifølge transmission elektron mikroskopiske måling. De magnetometriske målinger af parlamentsmedlemmer (Figur 2A) viser, at magnetisering kurven ikke havde hysterese, hvilket indikerer superparamagnetisk opførsel af parlamentsmedlemmer, en lav mætning felt på 500 Oe, og relativt høje MS på 22 emu / g. For at kontrollere cellelokalisering ved hjælp af magnetiske mønstre blev PC12-celler inkuberet i medium blandet med jernoxidfluorescerende parlamentsmedlemmer i 24 timer og omdannede dem til magnetiske enheder. MNP-koncentrationen i mediet kan varieres; det var 0,25 mg/mL i platingforsøgene. Konfokale mikroskopiske billeder blev taget efter DAPI farvning (Figur 2B). De parlamentsmedlemmer blev internaliseret i PC12 celler 'soma, men ikke i kernerne, som blev afspejlet af den mørke skygge i midten. Resultaterne viser, at der ikke var nogen rød florescence i kernerne, hvilket indikerer, at parlamentsmedlemmer ikke blev internaliseret i kernerne eller havde knyttet til den ydre overflade af cellerne. Ved hjælp af ICP-målinger var det muligt at kvantificere mængden af parlamentsmedlemmer, der blev internaliseret i PC12-cellerne. Jernkoncentrationen inde i cellerne steg med stigningen i MNP-koncentrationen i mediet (Figur 2C).

Levedygtigheden af MNP-loaded PC12 celler til forskellige koncentrationer af parlamentsmedlemmer blev evalueret ved hjælp af XTT- og resazurin-baserede assays. Figur 3A viser PC12-celler efter MNP-behandling, der vokser og differentierer oven på en kollagenbelagt plastskål. For at undersøge virkningen af internaliserede parlamentsmedlemmer på differentiering, Sholl morfologiske måling blev udført. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i cellemorfologi mellem de MNP-indlæste celler og kontrolceller(t-test,p > 0,05, n = 3) (Figur 3B). Pc12-cellernes metaboliske aktivitet blev målt ved hjælp af XTT- og resazurinbaserede assays efter celleinkubation med forskellige MNP-koncentrationer. Resultaterne blev normaliseret til kontrolmåling af PC12-celler uden parlamentsmedlemmer. Disse koncentrationer af parlamentsmedlemmer viste ingen signifikant cytotoksicitet over for cellerne, hvilket fremgår af manglen på væsentlige forskelle i celledygtighed for nogen af præparaterne (t-test, p > 0,05, n = 3) (Figur 3C,D). Virkningerne af parlamentsmedlemmer på cellebelægning og udvikling blev bestemt ved at sammenligne MNP-belastede celler med ikke-indlæste celler, belagt og dyrket på identiske magnetiske substrater. Celler blev seedet og overladt til at overholde substratet. Hver anden dag blev cellerne behandlet med frisk medium og NGF som beskrevet i afsnit 7. Figur 4 viser PC12-celler med og uden MNP-behandling, der vokser og differentierer på et magnetisk substrat med 20 μm brede striber og 100 μm afstand. Efter 3 dages vækst blev cellerne immunostained, DAPI-farvede, og billeder blev taget.

De magnetiserede celler viste sig at knytte sig til de magnetiske mønstre og vokse grene i henhold til mønstrene, mens celler uden MNP-behandling voksede uden affinitet til de magnetiske enheder (Figur 4A, B). Figur 4C viser placeringen af celler og netværksdannelse på et substrat med sekskantet geometri af en sidelængde på 200 μm og en linjebredde på 50 μm. Celler blev afbildet efter 6 dage. De magnetiserede celler var placeret på det magnetiske mønster, med lignende affinitet som de stribede substrater. Celleplacering blev kvantificeret ved at tælle cellelegemer placeret på de magnetiske mønstre eller knyttet til dem. Den relative andel af celler blev beregnet ud fra den samlede cellepopulation. Dette blev gjort for celler med og uden MNP behandling. Det effektive område af den magnetiske respons blev beregnet ved at tilføje cellernes diameter (~10 μm for PC12-celler) til begge kanter af det magnetiske mønster. For magnetstribemønstrene var det effektive magnetiske områdeforhold 33%, hvilket svarede til sandsynligheden for, at cellerne landede tilfældigt på de magnetiske striber. Resultaterne viste, at 75% af MNP-belastede cellelegemer var i kontakt med de magnetiske striber, mens kun 35% af de ikke-magnetiserede celler var placeret på striberne (i statistisk aftale med en upartisk fordeling) (Figur 4D). Statistisk analyse viste, at målingen ikke var afledt af vilkårlig cellelanding (en stikprøve z-test, p < 10-6, n = 430).

I modsætning hertil viste den statistiske analyse af de magnetiske sekskanter, at 92% af de MNP-belastede cellers soma var knyttet til de magnetiske mønstre sammenlignet med 38% for celler uden MNP-behandling (Figur 4E). Det effektive arealforhold for sekskanterne var 32% af substratet. Statistisk analyse for sekskanterne viste også, at målingen ikke var afledt af vilkårlig cellelanding (en stikprøve z-test, p < 10-6, n = 370). Resultaterne afslørede en klar præference for MNP-indlæste celler for det magnetiske mønster, mens celler uden parlamentsmedlemmer klæbede tilfældigt til hele substratet. Ud over cellepositioneringseffekten viste det sig, at disse magnetiske platforme også styre retningen af de voksende neuritter. Figur 5A viser MNP-belastede celler med neuritter, der flugter efter stribernes retning. I modsætning hertil viste kontrolmålingen af celler uden parlamentsmedlemmer neuritvækst på tværs af platformen uanset de magnetiske mønstre.

For at evaluere den magnetiske effekt på neuronal vækstretningalitet blev vinklen mellem neuritterne og de magnetiske striber målt. Dataene viste, at 80% af neuritterne i MNP-belastede celler udviste korrelation med magnetstribenes retning inden for Δθ < 15° i forhold til stribernes retning. Men kun 32% af neuritterne i celler uden parlamentsmedlemmer udviklet i dette område. Celler uden MNP-behandling viste ingen sammenhæng med de magnetiske striber og voksede efter en ensartet vinkelfordeling (Figur 5B). Statistisk analyse af fordelingen af Δθ viste, at den ikke var normal eller ensartet (Chi-square test, s. < 0,001). Effekten af den sekskantede geometri på neuritvæksten blev også påvist. Figur 5C viser fluorescens billeder af neurale netværk udvikling af magnetiseret og un-magnetiseret PC12 celler oven på et magnetisk mønster af sekskanter og store cirkler mellem kanterne. Sekskantens sidelængde var 200 μm, og linjernes bredde var 10 μm; cirklens diameter var 30 μm. Celle somas viste høj affinitet for cirklerne og udviklede et velorienteret neuralt netværk langs de sekskantede konturer. Et zoom-in-billede demonstrerer celler, der er knyttet til en magnetisk cirkel, og neuritter, der vokser langs disse konturer (Figur 5D).

Figure 1
Figur 1: Karakterisering af de magnetiske anordninger. Skalalinje = 200 μm. (B) Scanning af elektronmikroskopisk billede af Co80Fe20/Pd-multilag og et skema over flerlagsdræberne. Den samlede højde af de magnetiske mønstre er 18 nm. Skalalinje = 100 nm. (C) Unormal halleffektmåling af den magnetiske anordning, der viser FM's tvingende og rekreationsmæssige magnetfelter: billede af anordning med mærkede elektroder. (D) Magnetometri af multilayer enhed viser magnetisering mætning værdi beregnet pr volumen. Dette tal er blevet ændret fra Marcus et al.37. Forkortelser: AHE = Unormal Hall effekt; FM = ferromagnetisk; B = magnetfelt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: PC12-celleoptagelse af parlamentsmedlemmer. (B) Confocal mikroskopi billede af MNP optagelse af PC12 celler. Nuclei farvet med DAPI; Parlamentsmedlemmer mærket med rhodamin ind i cellerne. Skalastang = 10 μm (C) ICP-måling af de internaliserede jernoxid-parnps (pg) af PC12-celler efter 24 timers inkubation med flere MNP-koncentrationer. Dette tal er blevet ændret fra Marcus et al.37. Forkortelser: Parlamentsmedlemmer = magnetiske nanopartikler; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; ICP = induktivt koblet plasma. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: MNP-belastet PC12-cellelevedygtighed. (A) Konfokale mikroskopiske billeder af differentierede PC12-celler inkuberet med parlamentsmedlemmer. Pile viser differentierede neuritter med internaliserede parlamentsmedlemmer. Skalalinjer = 50 nm. (B) Sholl-analyse af neuritudvækst af PC12-celler efter 3 dages differentiering. (C) XTT-levedygtighedsanalyse af PC12-celler, der er behandlet med stigende koncentrationer af parlamentsmedlemmer efter 24 timers inkubation. Målinger normaliseres for at styre. (D) Resazurin-baseret levedygtighedsanalyse af PC12-celler behandlet med stigende koncentrationer af parlamentsmedlemmer efter 24 timers inkubation. Målinger normaliseres for at styre. Der er ingen statistisk betydning i begge analyser. Dette tal er blevet ændret fra Marcus et al.37. Forkortelser: Parlamentsmedlemmer = magnetiske nanopartikler; XTT = 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Cellelokalisering oven på magnetiske anordninger. (A) Fluorescerende billeder af PC12-celler fyldt med parlamentsmedlemmer, der vokser på magnetstriber: (i) α-tubulinmærkning, (ii) DAPI-farvning og (iii) fusioneret billede. Skalabjælke = 100 μm. (B) Fluorescerende billeder af PC12-celler uden MNP-behandling, der vokser oven på de magnetiske striber som i (A). (C) Fluorescensbilleder af PC12-celler, med og uden MNP'er, på det sekskantede magnetiske mønster. Skalastang = 200 μm. (D) Procentdel af cellekroppe, med og uden parlamentsmedlemmer, placeret på de magnetiske striber. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen. Den syrrede linje repræsenterer sandsynligheden for, at celler lander på de magnetiske striber. (E)Procentdel af cellekroppe, med og uden parlamentsmedlemmer, placeret på de magnetiske sekskanter. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen. Den syrlige linje repræsenterer sandsynligheden for, at celler lander på de magnetiske mønstre for en tilfældig fordeling. Der er ingen statistisk betydning i begge analyser. Dette tal er blevet ændret fra Marcus et al.37. Forkortelser: Parlamentsmedlemmer = magnetiske nanopartikler; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Neuronal netværksretningalitet. (A) Konfokale mikroskopiske billeder af α tubulinmærkede PC12-celler med MNP-behandling (til venstre) og uden MNP-behandling (til højre), der vokser oven på magnetiske striber. Striberne er markeret. (B) Polære histogrammer præsenterer neuritretningseffekten på PC12-celler (venstre) med MNP-behandling og (højre) uden MNP-behandling. Retningsvinklens afvigelse defineres som forskellen i vinklen mellem neuritterne og magnetstriberetningen (15° beholdere). (C) Fluorescensbilleder af PC12-celler, der dyrkes oven på et magnetisk sekskantet mønster (til venstre) med MNP-behandling og (til højre) uden MNP-behandling. Skalabjælke = 200 μm. (D) Zoom-in billede af en magnetiseret celle, der udvikler neuritter i henhold til det magnetiske mønster. Skalastang = 30 μm. Dette tal er blevet ændret fra Marcus et al.37. Forkortelse: Parnps = magnetiske nanopartikler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De repræsentative resultater viser effektiviteten af den præsenterede metode til styring og organisering af neuronal netværksdannelse på mikron-skalaen. De MNP-belastede PC12-celler forblev levedygtige og blev omdannet til magnetiske følsomme enheder, der blev tiltrukket af de magnetiske kræfter fra FM-elektroderne til specifikke steder. Dette fremgår bedst af figur 5C, hvor cellerne fortrinsvis overholdt sekskanternes større knudepunkter og ikke de tynde linjer. Desuden udviklede forgrening af cellerne sig også positivt efter de magnetiske mønstre. Alle kontroleksperimenter viste utvetydigt, at de magnetiske kræfter styrede lokaliseringen af cellekroppene og udvæksten. Selv om det blev påvist, at topografiske signaler kan bruges til at lede neurit udvækst40,41, dette er ikke tilfældet her, da celler uden parlamentsmedlemmer viste ingen reaktion på formen af mønsteret.

En bottom-up tilgang blev anvendt til at konstruere de lokale magnetiske kræfter, ved hjælp af standard fotolitografi og sputtering depositioner, der er tilgængelige i mange forskningsfaciliteter, lette vedtagelsen af disse teknikker af mange forskere. Bottom-up-tilgangen giver frihed i udformningen af komplekse mønstre og former i henhold til forskernes behov med mikron-skala opløsning for centimeter længde områder. Selvom resultaterne blev demonstreret på glasrutsjebaner, er det i princippet muligt at forberede enhederne oven på andre biokompatible materialer, der er egnede til in vivo terapeutiske applikationer såsom fleksible elektrode arrays til neuronal optagelse og stimulering42,43.

Disse unikke PMA-platforme, opnået ved flerlagsaflejring, producerer et stærkt magnetfelt langs hele magnetmønsteret og ikke kun på kanterne, som observeret tidligere22. Derudover blev FMs designet med en stor rest magnetisering mætning, dvs selv når det eksterne magnetfelt er fjernet, elektroderne forbliver fuldt magnetiseret og holde tiltrække cellerne uden behov for en ekstern magnet. Men en ekstern magnetisk kraft kan hjælpe med fuldt magnetisering af parlamentsmedlemmer i cellerne, hvilket øger kraften af tiltrækning og effektivitet under plating. En vigtig overvejelse i FM-design var antallet af gentagelser. Mens mere gentagelse vil øge det samlede magnetiske øjeblik, hvilket er gunstigt, vil tilføjelse af mange lag også øge lagblanding, hvilket forårsager mindre stabil PMA og endelig resultere i en magnetisering i flyet44,45 let akse og tiltrækning til forskellige kanter af elektroderne22,37. Derfor er det nødvendigt at optimere FM-nummeret og sammensætningen af multilayers for at sikre stabil PMA med maksimale magnetfelter.

De parlamentsmedlemmer, der blev præsenteret i de repræsentative resultater, viste næsten ingen toksicitet mod PC12-cellerne ved de testede koncentrationer, og de påvirkede heller ikke cellulær adfærd, på trods af at de kunne komme ind i cellerne og have et relativt højt magnetisk øjeblik. Tiltrækningskraften på en celle afhænger af antallet af parlamentsmedlemmer i cellen og magnetiseringen af hver MNP. Ideelt set bør begge være høje; Der kan dog være en afvejning mellem de to. Med nogle kommercielle parlamentsmedlemmer, celle levedygtighed var god, men den magnetiske øjeblik var for svag. For andre partikler fremstillet i laboratoriet, den magnetiske øjeblik var høj, men parlamentsmedlemmer tendens til at samle og celle levedygtighed var lav. Derfor er det vigtigt at teste celle levedygtighed og karakterisere deres magnetisering, når du vælger parlamentsmedlemmer. De parlamentsmedlemmer, der anvendes her, er også fluorescerende, hvilket gør det nemt at spore deres placering i cellerne. Resultaterne viser neuritter udvikle sig i henhold til formen af det magnetiske mønster, og fluorescens indikerer tilstedeværelsen af parlamentsmedlemmer langs neuritterne.

Internaliseringsmekanismen for parlamentsmedlemmer i celler er tidligere blevet undersøgt46. Cellulær optagelse af parlamentsmedlemmer sker via endokytose i henhold til deres størrelse, form og overfladekemi. Tidligere undersøgelser undersøgte optagelsen af forskellige typer parlamentsmedlemmer i neuroner24; cellulær optagelse af belagte parlamentsmedlemmer var bedre end den cellulære optagelse af ubestrøget parlamentsmedlemmer. Som det fremgår af figur 3A,B, blev parlamentsmedlemmer internaliseret i cytoplasmaet, men forblev uden for kernerne og blev overført til neuritterne under deres udvikling. Derudover parlamentsmedlemmer konjugeret til NGF, der aktiverede NGF signalering vej blev også internaliseret i celler via endokytose47,48.

Afslutningsvis præsenterer dette papir en effektiv værktøjskasse med magnetisk manipulation til forskning, der kræver biologisk elementorganisation. Brugen af magnetiske kræfter gør det muligt at placere celler, lede neuritvækst. Denne metode gør det muligt at designe platforme med komplekse geometriske former. Kræfterne i magnetisk tiltrækning kan manipuleres til at manipulere neurale netværk dannelse fjernt ved at ændre den magnetiske kraft landskab over tid. Hele denne metode kan let udvides til at kontrollere andre faktorer eller kemikalier, der kan kobles til parlamentsmedlemmer og bringe dem til foruddefinerede interessepunkter, alle med mikron-skala opløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Ministeriet for Videnskab &Teknologi, Israel, og af den israelske Science Foundation (569/16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Tags

Bioengineering magnetiske nanopartikler vinkelret magnetisering anisotropi (PMA) magnetisk målrettet lægemiddellevering magnetisk cellemanipulation neural kultur neural teknik bio-interfacing fotolitografi magnetiske multilayers
Fremstilling af magnetiske platforme til Micron-Scale Organisation af sammenkoblede neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., … More

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter