Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור פלטפורמות מגנטיות עבור ארגון בקנה מידה מיקרון של נוירונים מחוברים

Published: July 14, 2021 doi: 10.3791/62013
Automatic Translation
1,4, 2,4, 2,4, 1,4, 2,4, 2,4, 3,4, 2,4, 1,4
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Summary

עבודה זו מציגה גישה מלמטה למעלה להנדסה של כוחות מגנטיים מקומיים לשליטה בארגון העצבי. תאים דמויי נוירון עמוסים ננו-חלקיקים מגנטיים (MNPs) מצופים על גבי ונשלטים על ידי פלטפורמה מיקרו בדוגמת עם מגנטיזציה בניצב. כמו כן מתוארים אפיון מגנטי, ספיגה תאית MNP, כדאיות התא, וניתוח סטטיסטי.

Abstract

ליכולת לכוון נוירונים לרשתות עצביות מאורגנות יש השלכות רבות על רפואה רגנרטיבית, הנדסת רקמות וביו-התערבות. מחקרים רבים נועדו לכוון נוירונים באמצעות רמזים כימיים טופוגרפיים. עם זאת, דיווחים על שליטה ארגונית בקנה מידה מיקרון על פני שטחים גדולים הם נדירים. כאן, שיטה יעילה תוארה להצבת נוירונים באתרים מוגדרים מראש והנחיית צמחיית עצבים ברזולוציה בקנה מידה מיקרון, באמצעות פלטפורמות מגנטיות מוטבע עם מיקרו בדוגמת, אלמנטים מגנטיים. הוכח כי טעינת נוירונים עם חלקיקים מגנטיים (MNPs) ממירה אותם ליחידות מגנטיות רגישות שיכולות להיות מושפעות ממדרגיים מגנטיים. בעקבות גישה זו, פלטפורמה מגנטית ייחודית כבר מפוברק שבו תאי PC12, מודל נפוץ דמוי נוירון, היו מצופים וטעונים עם חלקיקים superparamagnetic. סרטים דקים של רב שכבות פרומגנטיות (FM) עם מגנטיזציה ניצבת יציבה הופקדו כדי לספק כוחות משיכה יעילים לכיוון הדפוסים המגנטיים. תאי PC12 אלה, המצופה והמבדילים על גבי הפלטפורמות המגנטיות, היו מחוברים באופן מועדף לתבניות המגנטיות, וצמחיית הנויריטים הייתה מיושרת היטב עם צורת התבנית, ויצרה רשתות מכוונות. מוצגות שיטות אפיון כמותי של התכונות המגנטיות, ספיגת MNP תאית, כדאיות התא וניתוח סטטיסטי של התוצאות. גישה זו מאפשרת שליטה על היווצרות רשת עצבית ומשפרת ממשק נוירון לאלקטרודה באמצעות מניפולציה של כוחות מגנטיים, אשר יכול להיות כלי יעיל למחקרים במבחנה של רשתות ועשוי להציע כיוונים טיפוליים חדשניים biointerfacing.

Introduction

Micropatterning של נוירונים מחזיק פוטנציאל גדול עבורהתחדשות רקמות 1,2,3,4,5 ופיתוח של מכשירים נוירו-אלקטרוניים6,7,8. עם זאת, המיקום בקנה מידה מיקרון של נוירונים ברזולוציה מרחבית גבוהה, כמו ברקמות ביולוגיות, מהווה אתגר משמעותי. יצירת מבנים מעוצבים מראש בקנה מידה זה דורשת הדרכה של תהליכי תאי עצב על ידי שליטה מקומית תנועתיות סומה וצמחיית אקסונל. מחקרים קודמים הראו שימוש ברמזים כימיים ופיזיים9,10,11,12 להנחיית צמיחה עצבית. כאן, גישה חדשנית מתמקדת בשליטה על מיקום התאים על ידי שיפוע שדה מגנטי13,14,15,16,17, הפיכת תאים טעונים עם MNPs ליחידות רגישות מגנטיות, אשר ניתן לתפעל מרחוק.

Kunze et al., שאפיין את הכוח הדרוש כדי לגרום לתגובות הסלולר באמצעות שבב מגנטי- ותאים טעונים MNP, הוכיח כי התארכות אקסונית מוקדמת יכולה להיות מופעלת על ידי מתח מכני בתוך תאים18. Tay et al. אישר כי מצעים מיקרו מפוברק עם שיפוע שדה מגנטי משופר לאפשר גירוי אלחוטי של מעגלים עצביים מנוקד עם MNPs באמצעות צבעי מחוון סידן19. יתר על כן, Tseng et al. חלקיקים מתמזגים בתוך תאים, וכתוצאה מכך כוחות מתווכים חלקיקים מקומיים שהתקרבו למתח התאי20. זה הוביל לייצור דפוסים מוגדרים של מצעים מיקרומגנטיים שעזרו ללמוד תגובה תאית לכוחות מכניים. מתח תאי הנובע מיישום של כוחות מתווכים ננו-חלקיקים מקומיים הושג על ידי התמזגות חלקיקים בתוך תאים20. מערכת היברידית מיקרופלואידית משלימה תחמוצת מתכת (CMOS) פותחה על ידי Lee et al. שהטמיע מערך של מיקרו אלקטרומגנטים בשבב CMOS כדי לשלוט בתנועה של תאים בודדים מתויגים עם חרוזים מגנטיים21.

אלון ואח' השתמשו ברפידות מגנטיות מיקרו-סולם, מתוכנתות מראש, כ"נקודות חמות" מגנטיות לאיתור תאים22. פעילות ספציפית יכולה גם להיות מגורה בתוך תאים באמצעות מערכים מגנטיים בדוגמת מיקרו כדי להתאים חלקיקים במקומות תת תאיים ספציפיים23. ספיגת MNP הסלולר הוכח בהצלחה עלוקה, חולדה, ועכבר נוירונים ראשוניים24,25,26. כאן, זה הוכח על קו תא PC12 pheochromocytoma חולדה, אשר דווח בעבר להראות ספיגה גבוהה של MNPs27. בשנים האחרונות היו יישומים רפואיים שונים של חברי פרלמנט, כולל אספקת תרופות ותרמותרפיה בטיפולי סרטן28,29,30,31. באופן ספציפי, מחקרים עוסקים ביישום של MNPs ורשתות נוירונים32,33,34,35. עם זאת, הארגון המגנטי של נוירונים באמצעות MNPs ברמת תא יחיד ראוי לחקירה נוספת.

בעבודה זו, גישה מלמטה למעלה תוארה להנדס כוחות מגנטיים מקומיים באמצעות פלטפורמות מעוצבות מראש לשליטה בסידור העצבי. הייצור של דפוסים בקנה מידה מיקרון של שכבות FM הוצגה. מבנה רב שכבתי ייחודי זה יוצר מגנטיזציה ניצבת יציבה שתוצאתה כוחות משיכה יעילים כלפי כל הדפוסים המגנטיים. באמצעות דגירה, חברי פרלמנט הועמסו לתאי PC12, והפכו אותם ליחידות רגישות מגנטיות. תאים טעונים MNP, מצופים ומובחנים על גבי הפלטפורמות המגנטיות, היו מחוברים באופן מועדף לתבניות המגנטיות, וצמחיית הנויריטים הייתה מיושרת היטב עם צורת התבנית, ויצרה רשתות מכוונות. מספר שיטות תוארו כדי לאפיין את התכונות המגנטיות של שכבות FM ו- MNPs, וטכניקות עבור ספיגת MNP הסלולר מבחני הכדאיות התא הוצגו גם. בנוסף, מפורטים פרמטרים מורפומטריים של צמיחה עצבית וניתוח סטטיסטי של התוצאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: בצע את כל התגובות הביולוגיות בארון biosafety.

1. ייצור פלטפורמה מגנטית

  1. הדפס אבן
    1. חותכים מגלשות זכוכית ל-2x2 ס"מ2 באמצעות עט סופר. נקה את מגלשות הזכוכית באצטון ולאחר מכן איזופרופנול במשך 5 דקות כל אחד באמבט אולטרה sonication. יבש עם חנקן טוהר גבוה במיוחד (UHP).
    2. מצפים את הזכוכית עם פוטורסיסט באמצעות ציפוי ספין ב 6,000 סל"ד עבור 60 s, כדי להשיג 1.5 מיקרומטר עובי, ואופים ב 100 מעלות צלזיוס עבור 60 s. לחשוף את המדגם למקור אור, באמצעות אורך גל מתאים עבור photoresist, עם דפוס הרצוי, באמצעות פוטומסק או ליתוגרפיה ללא מסכה.
    3. לפתח במשך 40 s במפתח, מדולל במים מזוקקים (DW) על פי הוראות היצרן; לשטוף DW במשך 45 s, ויבש עם גז חנקן UHP. בדוק את התבנית תחת מיקרוסקופ אופטי.
  2. תצהיר ספוטר
    1. הכנס את הדגימה לתא הראשי של מערכת התצהיר והמתן ללחץ בסיס (~ 5 × 10-8 טור). פתח את זרימת הגז; הגדר את זרימת הארגון עבור sputtering סטנדרטי (28 sccm [ס"מ מעוקב סטנדרטי לדקה) בזאת. להצית את מטרות sputter, ולאחר מכן להגדיר את הלחץ sputter ל 3 mTorr.
    2. הגדל את העוצמה בכל יעד עד להשגת הקצב הרצוי.
      הערה: Pd Rate: 0.62 A/s = 1.0 ננומטר ב- 16 שניות; Co80Fe20 שיעור: 0.32 A/s, 0.2 ננומטר ב 6.25 s.
    3. הפעל סיבוב. להפקיד את multilayer FM, לסירוגין בין Co80Fe20 ו Pd מטרות, על ידי פתיחה וסגירה של תריסי היעד, בהתאמה. הפקד 14 bilayers של Co80Fe20 (0.2 ננומטר)/Pd (1.0 ננומטר), ולסיים עם שכבת 2 ננומטר נוספת Pd capping.
    4. הרמה: משרים את הדגימה באצטון במשך 30 דקות, ושוטף עם isopropanol. לאחר מכן, יבש עם חנקן UHP, ולשמור את המדגם בסביבה נקייה ויבשה עד השימוש.

2. אפיון המכשיר המגנטי באמצעות מדידות הובלה

  1. השתמש במצע Si או בשקופית זכוכית עם פס מגנטי בצורת צלב ברוחב 100 מיקרומטר, המופקד עם שכבות FM (ראה איור 1C inset). חבר את הדגימה למחזיק באמצעות קלטת דו-צדדית.
  2. באמצעות משועבד תיל, קשר 4 חוטים לדגימה, אחד על כל רגל של האלקטרודה הצולבת. הגדר את מחזיק הדגימה ודגימה בתוך מערכת מדידת התובלה עם שדה מגנטי, כך השדה המגנטי הוא בניצב לדגימה. בצע מדידות בטמפרטורת החדר.
  3. בצע מדידת מתח רוחבי (VT)של ההתקן; עקבו אחר הסימונים באיור 1C (כניסה): החל זרם של 1 mA בין אנשי קשר 1 ו- 3; למדוד אתV T בין מגעים 2 ו 4; לאחר מכן, להחיל זרם בין 2 ל 4, ולמדוד את המתח בין 1 ל 3. לבסוף, לחשב את ההפרש בין המתחים של שתי המדידות ולחלק על ידי 2 כדי לקבל VT. השתמש במערכת מיתוג כדי לעבור באופן אוטומטי בין שתי תצורות המדידה.
  4. לטאטא את השדה המגנטי בין 0.4 T כדי -0.4 T בשלבים של 5 mT ולמדוד את VT כפונקציה של השדה. התווה את ההתנגדות הרוחבית (VT/I) לעומת השדה המגנטי כדי לקבוע את אות האולם החריג, שהוא פרופורציונלי למגנטיזציה הניצבת בסרט.

3. אפיון של MNPs ורב שכבתי מגנטי על ידי מדידות מגנטומטריה

  1. מדידה מגנטומטרית עבור שכבות FM
    1. הפקד את שכבת FM על המצע Si (ראה סעיף 1.2). חותכים את המדגם ל 6 ריבועים של 4 x 4 מ"מ2 גודל. עורמים את הדגימות אחת מעל השנייה ומסדרים אותן בכמוסה בניצב לכיוון השדה המגנטי (ראו איור 1D inset).
    2. הכנס את הקפסולה לתוך המגנטומטר ולמדוד את המגנטיזציה בטמפרטורת החדר. לטאטא את השדה המגנטי בין -0.4 T ו 0.4 T.
    3. לחשב את הנפח הכולל של החומר המגנטי, בהתחשב בעובי השכבה המגנטית, בגודל הדגימות ובמספר המצעים. חלק את המגנטיזציה לפי הנפח הכולל של החומר המגנטי.
    4. התווה את המגנטיזציה (ליחידת נפח) לעומת השדה המגנטי. הפחת את הרקע הסמאגנטי של המצע מתגובת השדה המגנטי הגבוה והנח את מגנטיזציית הרוויה של ה- FM מהגרף.
  2. מדידה מגנטומטרית עבור MNPs
    1. הכנס מסה ייעודית של חברי פרלמנט לכמוסת פולימר סינתטית. שקול נפח גדול יותר אם מודדים ערכי רוויה קטנים של מגנטיזציה.
    2. אם חברי הפרלמנט מושעים בממס, יבש את חברי הפרלמנט על ידי השארת הקפסולה פתוחה למשך הלילה. הכנס את הקפסולה לתוך המגנטומטר ולמדוד את המגנטיזציה בטמפרטורת החדר. לטאטא את השדה המגנטי בין -0.2 T ו 0.2 T.
    3. חשב את המסה הכוללת של חברי הפרלמנט על-ידי הכפלת הנפח המיועד בריכוז החלקיקים. לנרמל את התוצאות ל 1 גרם.
    4. התווה את המגנטיזציה המנורמלת (לגרם) לעומת השדה המגנטי. לשער את רוויית המגנטיזציה של חברי הפרלמנט מהגרף.

4. פרוטוקול ציפוי קולגן

  1. ציפוי מנות פלסטיק
    1. הכן 0.01 M HCl על ידי הוספת 490 μL של HCl ל 500 מ"ל של מים מזוקקים כפולים autoclaved (DDW).
      הערה: בצע שלב זה רק במכסה המנוע הכימי.
    2. לדלל קולגן מסוג 1 (פתרון מזנב חולדה) 1:60-1:80 ב 0.01 M HCl כדי להשיג את ריכוז העבודה הסופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל. מניחים 1.5 מ"ל של הפתרון המדולל בצלחת תרבות 35 מ"מ. השאירו את המנה במכסה המנוע למשך שעה, מכוסה.
    3. הסר את הפתרון, ולשטוף 3x מלוחים סטריליים 1x פוספט אגירה (PBS). המנה מוכנה לזריעת תאים.
  2. ציפוי שקופיות זכוכית
    1. לדלל קולגן מסוג 1 (פתרון מזנב עכברוש) 1:50 ב 30% v / v אתנול. לציפוי צלחת 35 מ"מ, להוסיף 20 μL של קולגן ל 1 מ"ל של 30% אתנול.
    2. מכסים את המנה בתמיסה, ומחכים עד שכל הפתרון מתאדה, משאירים את המנה חשופה לכמה שעות. לשטוף 3x ב סטרילי 1x PBS; שקופית הזכוכית מוכנה לזריעת תאים.

5. ספיגת MNP סלולרית וכדאיות

  1. ספיגת MNP סלולרית
    1. הכן מדיום צמיחה בסיסי לתרבות התאים PC12 על ידי הוספת 10% סרום סוסים (HS), 5% סרום שור עוברי (FBS), 1% ל-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.2% אמפוטריצין למדיום המכון הרפואי רוזוול פארק (RPMI), וסינון באמצעות מסנן ניילון של 0.22 מיקרומטר.
    2. הוסיפו 1% סרום סוסים (HS), 1% ל-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.2% אמפיטריצין למדיום RPMI להכנת מדיום הבידול של PC12, ומסננים באמצעות מסנן ניילון 0.22 מיקרומטר.
    3. לגדל תאים בבקבוק תרבות שאינו מטופל עם 10 מ"ל של מדיום צמיחה בסיסי; להוסיף 10 מ"ל של מדיום צמיחה בסיסית לבקבוק כל 2-3 ימים, ותת תרבות התאים לאחר 8 ימים.
    4. לספיגה תאית, צנטריפוגה השעיית התא בצינור צנטריפוגה במשך 8 דקות ב 200 × g וטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant.
    5. Resuspend התאים ב 3 מ"ל של מדיום צמיחה בסיסי טרי. שוב, צנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 200 × g וטמפרטורת החדר, ולזרוק את supernatant. resuspend התאים ב 3 מ"ל של מדיום בידול טרי.
    6. לשאוף את התאים 10x באמצעות מזרק ומחט לשבור אשכולות תאים. לספור את התאים באמצעות hemocytometer, וזרע 106 תאים בצלחת רגילה לא צבוע 35 מ"מ.
    7. הוסף למנה את הנפח המחושב של המתלה MNP ונפח של מדיום בידול כדי להשיג את ריכוז MNP הרצוי ואת הנפח הכולל. ערבבו את התאים, ה- MNPs והבינוני; דגירה את המנה באינקובטור לחות CO2 5% ב 37 °C (60 °F) עבור 24 שעות.
    8. צנטריפוגה השעיית התא במשך 5 דקות ב 200 × g בטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant. Resuspend התאים ב 1 מ"ל של מדיום בידול טרי, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
  2. בידול תאים טעון MNP
    1. בצע פרוטוקול ספיגה (סעיף 5.1). זרע 8 × 104 תאים טעונים MNP על צלחת 35 מ"מ, קולגן סוג l מצופה בנוכחות מדיום בידול (ראה פרוטוקול ציפוי קולגן בסעיף 4.1). לאחר 24 שעות, להוסיף 1:100 גורם גדילה בטא עצבי מורין טרי (β-NGF) (ריכוז סופי 50 ng/mL).
    2. לחדש את מדיום הבידול ולהוסיף מורין טרי β-NGF כל 2 ימים. תמונה התאים כל 2 ימים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. לאחר היווצרות הרשת (6-8 ימים עבור תאי PC12), תמונה התאים באמצעות מיקרוסקופיה confocal, ולבחון את הפלואורסצנטיות של החלקיקים.
  3. בדיקת כדאיות לתאים טעונים MNP: 2,3-ביס-(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפופניל)-2H-טטרזוליום-5-קרבוקסניליד (XTT) בדיקת כדאיות התא.
    1. הכינו את מדיום הצמיחה הבסיסי לפי שלב 5.1.1. לטפח את תאי PC12 עם MNPs בריכוזים שונים (0.1 מ"ג / מ"ל, 0.25 מ"ג / מ"ל, ו 0.5 מ"ג / מ"ל במדיום צמיחה בסיסי) וגם ללא MNPs לשליטה משולשת בצלחת שטוחה 96-באר (נפח כולל של 100 μL / באר). דגירה התאים עבור 24 שעות ב 5% CO2, חממה לחה ב 37 °C (69 °F).
    2. הכן בארות ריקות המכילות מדיום ללא תאים לתיקון רקע. להפשיר את הפתרון ריאגנט XTT, ואת פתרון התגובה המכיל N-מתיל dibenzopyrazine מתיל סולפט) באמבטיה 37 מעלות צלזיוס מיד לפני השימוש. מערבולת בעדינות עד פתרונות ברורים מתקבלים.
    3. לקבלת צלחת אחת של 96 באר, יש לערבב 0.1 מ"ל של פתרון הפעלה עם 5 מ"ל של ריאגנט XTT. מוסיפים 50 μL של פתרון התגובה לכל באר, מעט לנער את הצלחת לחלוקה שווה של הצבע בבארות, ולאחר מכן דגירה את הצלחת באינקובטור במשך 5 שעות.
    4. למדוד את ספיגת המדגם נגד בארות ריקות באמצעות אנזים מקושר immunosorbent assay (ELISA) קורא באורך גל של 450 ננומטר. למדוד את ספיגת ההפניה באמצעות אורך גל של 630 ננומטר ולחסר אותו ממדידת 450 ננומטר.
    5. כמו ספיגה ספונטנית קלה מתרחשת במדיום התרבות דגירה עם ריאגנט XTT ב 450 ננומטר, לחסר את הספיגה הממוצעת של בארות ריקות מזה של בארות אחרות. הפחת ערכי אותות מדגימות מקבילות של חברי פרלמנט באותם ריכוזים שנבדקו כמו דגימות התאים.
  4. בדיקת כדאיות לתאים טעונים MNP: בדיקת כדאיות תאים מבוססת resazurin
    1. הכן מדיום צמיחה בסיסי לפי שלב 5.1.1. לטפח את תאי PC12 עם MNPs בריכוזים שונים (0.1 מ"ג / מ"ל, 0.25 מ"ג / מ"ל, ו 0.5 מ"ג / מ"ל במדיום צמיחה בסיסי) וללא MNPs כשליטה משולשת בצלחת שטוחה 96-באר עבור 24 שעות. דגירה התאים עבור 24 שעות ב 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (69 °F). הכן בארות ריקות המכילות מדיום ללא תאים.
    2. לשטוף את התאים עם 1x PBS. מוסיפים את ריאגנט מבוסס resazurin (10% w / v) למדיום דגירה עבור 2 שעות באינקובטור 37 °C (70 °F).
    3. מניחים 150 μL aliquots של הדגימות בקורא ELISA, ולמדוד את הספיגה באורך גל עירור של 560 ננומטר ואורך גל פליטה של 590 ננומטר. הפחת את ערכי האות מהדגימות המקביליות של חברי פרלמנט באותם ריכוזים שנבדקו כמו דגימות התאים.

6. אפיון ריכוז MNP בתוך התאים באמצעות פלזמה מצמדית השראתית (ICP)

  1. הכן מדיום צמיחה בסיסי לפי שלב 5.1.1. לטפח את תאי PC12 עם MNPs בריכוזים שונים (0.1 מ"ג / מ"ל, 0.25 מ"ג / מ"ל, ו 0.5 מ"ג / מ"ל במדיום צמיחה בסיסי) וללא MNPs כשליטה משולשת בצלחת שטוחה 96-באר (נפח כולל של 100 μL / גם). דגירה ב 5% CO2,חממה לחה ב 37 °C (69 °F) עבור 24 שעות.
  2. מעבירים את ההשעיה לצינור צנטריפוגה (מכל באר בנפרד), תאי צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. Resuspend התאים ב 1 מ"ל של מדיום בידול טרי, ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
  3. Lyse התאים על ידי טיפול עם 100 μL של 70% חומצה חנקתית לכל באר בנפרד לפחות 15 דקות. הוסף 5 מ"ל של DDW לתאים lysed ולסנן את הפתרונות.
  4. למדוד את ריכוז הברזל באמצעות ICP ולהשתמש בספירת התאים כדי להקליט ריכוז Fe לכל תא.

7. בידול וצמיחה של תאים בפלטפורמה מגנטית

  1. לנקות את המצע בדוגמת עם 70% v / v / אתנול ומניחים את המצע בצלחת תרבות 35 מ"מ במכסה המנוע. מניחים מגנט גדול (~ 1500 Oe) מתחת למצע בדוגמת במשך 1 דקות ולהסיר את המגנט על ידי הזזת המנה הראשונה למעלה והתרחקות מהמגנט, ולאחר מכן לקחת את המגנט מחוץ למכסה המנוע. הדליקו את האור האולטרה סגול במשך 15 דקות.
  2. מצפים את המצע עם קולגן מסוג 1 לפי סעיף 4.2. להשעות את התאים לאחר ספיגת MNP הסלולר (סעיף 5.1), זרע 105 תאים בצלחת תרבות 35 מ"מ, ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום בידול. דגירה את התרבות ב 5% CO2,חממה לחה ב 37 °C (69 °F).
  3. לאחר 24 שעות, להוסיף 1:100 מורין טרי β-NGF (ריכוז סופי של 50 ng/mL). לחדש את מדיום הבידול ולהוסיף מורין טרי β-NGF כל 2 ימים. תמונה התאים כל 2 ימים באמצעות מיקרוסקופיה אור, ולאחר היווצרות הרשת, לבצע immunostaining על התאים (סעיף 8.1).

8. כתמי תאים טעונים MNP

  1. טובולין אימונוסטין
    1. הכן 4% פתרון paraformaldehyde (PFA) על ידי ערבוב 10 מ"ל של 16% w / v פתרון PFA, 4 מ"ל של 10x PBS, ו 26 מ"ל של DDW. הכן 50 מ"ל של 1% PBT על ידי הוספת 500 μL של פעילי שטח שאינם יוניים ל 50 מ"ל של 1x PBS. הכן 50 מ"ל של 0.5% PBT על ידי ערבוב 25 מ"ל של 1% PBT עם 25 מ"ל של 1x PBS. הכן פתרון חסימה על ידי ערבוב 1% אלבומין סרום שור ו 1% סרום חמור רגיל ב 0.25% PBT.
      הערה: השתמש PFA רק בתוך מכסה המנוע הכימי.
    2. הסר את המדיום העל-טבעי מהתאים. לתקן את התאים טעון MNP ב 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתוך מכסה המנוע כימי. לשטוף את התאים MNP טעון 3x ב 1x PBS, 5 דקות כל לשטוף, בתוך מכסה המנוע הכימי.
    3. לחלחל לתאים טעונים MNP עם 0.5% PBT במשך 10 דקות. דגירה תאים טעונים MNP הראשון בחסימת פתרון במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן עם נוגדן ארנב נגד α-tubulin בחסימת פתרון לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף תאים טעונים MNP 3x ב 1x PBS, 5 דקות כל לשטוף.
    4. דגירה תאים טעונים MNP עם נוגדן משני נגד ארנב חמור Cy2 מצומד במשך 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים MNP טעון 3x ב 1x PBS, 5 דקות כל לשטוף.
    5. בצע הדמיה קונפוקלית. עבור טובולין, השתמש באורך גל עירור של 492 ננומטר ואורך גל פליטה של 510 ננומטר. עבור חברי הפרלמנט (רודמין), השתמש באורך גל עירור של 578 ננומטר ואורך גל פליטה של 613 ננומטר.
  2. כתמים גרעיניים עם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)
    1. לשטוף את התאים MNP טעון 3x ב 1x PBS, 5 דקות כל לשטוף. הסר נוזל עודף סביב המדגם, להוסיף 1 טיפה (~ 50 μL) של הרכבה בינונית המכילה DAPI כדי לכסות שטח של 22 מ"מ x 22 מ"מ, ואת הדגירה במשך 5 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
    2. לשטוף את התאים MNP טעון 3x ב 1x PBS, 5 דקות כל לשטוף. בצע הדמיה קונפוקלית. עבור DAPI, השתמש באורך גל עירור של 358 ננומטר ואורך גל פליטה של 461 ננומטר. עבור חברי הפרלמנט (רודמין), השתמש באורך גל עירור של 578 ננומטר ואורך גל פליטה של 613 ננומטר.

9. מדידות וניתוח סטטיסטי

  1. ניתוח מורפומטרי של בידול תאים טעון MNP
    1. כדי למדוד את מספר הצמתים במרחקים שונים מגוף התא, לרכוש תמונות שלב של תאים תרבותיים עד 3 ימים לאחר הטיפול עם NGF.
      הערה: אם הדבר נעשה מאוחר יותר, התאים עלולים לפתח רשתות ולמנוע מדידות של רזולוציה של תא יחיד.
      1. פתח את התמונות בתוכנית עיבוד התמונה ImageJ, והשתמש בתוסף NeuronJ, המאפשר מעקב נויריט חצי אוטומטי ומדידתאורך 36. באמצעות תוסף המעקב של Neurite, עקבו אחר הנויריטים והמירו את הנתונים לתמונות בינאריות. הגדר את מרכז הסומא.
      2. בצע ניתוח Sholl, זמין בתוסף NeuronJ. הגדר את הרדיוס המקסימלי. חזור על הניסוי שלוש פעמים. לנתח יותר מ -100 תאים בכל ניסוי.
  2. ניתוח לוקליזציה של תאים
    1. כדי לקבוע את אחוז התאים המותאמים לאזור המגנטי לאחר 3 ימים של דגירה, לרכוש תמונות מיקרוסקופיות confocal של תאים עם וללא ספיגת MNP. השתמש בכתם DAPI (סעיף 8.2).
    2. לספור ידנית את התאים על גבי או חלקית על גבי התבנית (תאים נוגעים) ואת התאים שאינם. חזור על הפעולה לשלושה ניסויים. לנתח יותר מ 400 תאים עם MNP וללא ספיגה.
    3. חשב את החלק היחסי של התאים שנמצאים בראש הדפוסים המגנטיים מתוך המספר הכולל של תאים, עם ובלי MNPs. בנוסף, לחשב את אחוז האזור היעיל של התבנית המגנטית על ידי הוספת קוטר גוף התא לרוחב התבנית כדי לקבוע את ההסתברות האקראית של תאים הנחיתה על דפוס מגנטי.
    4. בצע מדגם יחיד Z-test כדי לנתח אם התפלגות התא היא תוצאה של נחיתת תא isotropic, או אם יש הטיה מועדפת לתבנית המגנטית.
  3. ניתוח כיווניות צמיחה
    1. כדי לכמת את ההשפעה על כיווניות נוייריט מחוץ לגדולה, לרכוש תמונות מיקרוסקופיות confocal של התאים עם וללא טיפול MNP לאחר 8 ימים של דגירה. בצע חיסון מכתים (סעיף 8.1).
    2. באמצעות תוכנת ImageJ, למדוד את הזווית בין נויריט התא ואת הפסים המגנטיים בשני התנאים.
      הערה: נתח רק נויריטים שמקורם בסומות הממוקמות על הפסים המגנטיים.
    3. התווה את התפלגות זוויות הנויריטים ביחס לכיוון הפסים (Δθ). בצע מבחן Chi בריבוע של התפלגות Δθ כדי להוכיח כי ההתפלגות אינה נורמלית או אחידה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פלטפורמות מגנטיות עם צורות גיאומטריות שונות היו מפוברקות (איור 1A). דפוסים מגנטיים הופקדו על ידי sputtering: 14 שכבות של Co80Fe20 ו Pd, 0.2 ננומטר ו 1 ננומטר, בהתאמה. מיקרוסקופ אלקטרונים חשף את הגובה הכולל של התבניות המגנטיות כ- 18 ננומטר(איור 1B). תצהיר רב שכבתי ייחודי זה של FM יוצר פלטפורמה יציבה עם אניזוטרופיה של מגנטיזציה ניצבת (PMA) יחסית למישור המצע המאפשר משיכה של התאים הטעונים MNP לכיוון התבנית המגנטית כולה ולא רק לקצוות22,37. הפרמטרים של המבנה הרב שכבתי FM התאפיינו במדידות תחבורה מגנטו שעבורן מכשיר בצורת צלב של שכבות FM היה מפוברק (איור 1C inset), והמגנטיזציה בניצב למצע נמדדה באמצעות אפקט האולם החריג (AHE)38, שבו ההתנגדות AHE היא פרופורציונלית למגנטיזציה הניצבת. מדידת השדה המגנטי AHE לעומת השדה המגנטי הראתה לולאת היסטרזיס המעידה על פרומגנטות PMA(איור 1C). המגנטיזציה השרידית של שכבות FM (רגע מגנטי בשדה אפס) הייתה זהה לרוויית המגנטיזציה (MS)בשדות גבוהים. בנוסף, השדה הכופה של שכבות FM היה ~ 500 Oe, להגיע רוויה ב 1,200 Oe, אשר אפשר מגנטיזציה קלה של המכשיר והבטיח יציבות נגד ההשפעה של שדות מגנטיים לא מכוונים. ערך MS של הרב-שכבתי נמדד באמצעות מגנטומטר (איור 1D), כמתואר בסעיף 3.1. MS היה 270 אמו / ס"מ3, אשר שווה עם מדידות קודמות של מבנים דומים.

תחמוצת ברזל פלואורסצנטית (γ-Fe2O3) חברי פרלמנט הוכנו על פי פרסום קודם39. חברי הפרלמנט סונתבו על ידי גרעינים, כולל ההטיה הקוולנטית של סרטים דקים בעלי שש שכבות של תחמוצת ברזל לרודמין isothiocyanate וציפוי עם אלבומין סרום אנושי. גודל הקוטר היבש של MNPs היה ~ 15 ננומטר עם פוטנציאל זטה של -45, על פי המדידה מיקרוסקופית אלקטרונים ההולכה. המדידות המגנטיות של חברי הפרלמנט (איור 2A) מראות כי לעקומת המגנטיזציה לא הייתה היסטרזיס, מה שמצביע על התנהגות סופר-פרמגנטית של חברי הפרלמנט, שדה רוויה נמוך של 500 Oe ו- MS גבוה יחסית של 22 אמו/g. כדי לשלוט בלוקליזציה של תאים באמצעות דפוסים מגנטיים, תאי PC12 דגירו במדיום מעורבב עם MNPs פלואורסצנטי תחמוצת ברזל במשך 24 שעות, והפכו אותם ליחידות מגנטיות. ריכוז MNP במדיום יכול להיות מגוון; זה היה 0.25 מ"ג / מ"ל בניסויי הציפוי. תמונות מיקרוסקופיות קונפוקל צולמו לאחר כתמי DAPI (איור 2B). חברי הפרלמנט הופנמו לסומה של תאי PC12, אך לא לתוך הגרעינים, אשר באו לידי ביטוי על ידי הצל הכהה במרכז. התוצאות מראות כי לא הייתה פלורנציה אדומה בגרעינים, מה שמצביע על כך שחברי הפרלמנט לא הופנמו לגרעין או היו מחוברים לפני השטח החיצוניים של התאים. באמצעות מדידות ICP, ניתן היה לכמת את כמויות חברי הפרלמנט שהופנמו לתאי PC12. ריכוז הברזל בתוך התאים גדל עם העלייה בריכוז ה-MNP במדיום (איור 2C).

הכדאיות של תאי PC12 טעונים MNP עבור ריכוזים שונים של MNPs הוערך באמצעות XTT- ו resazurin מבוססי מבחנים. איור 3A מציג תאי PC12 לאחר טיפול MNP, גדל ומבדיל על גבי צלחת פלסטיק מצופה קולגן. כדי לבחון את ההשפעה של חברי פרלמנט מופנמים על בידול, בוצעה מדידה מורפולוגית של שול. במורפולוגיה של התאים לא נצפה הבדל משמעותי בין התאים הטעונים על-ידי MNP לבין תאי הבקרה (t-test,p > 0.05, n = 3) ( איור3B). הפעילות המטבולית של תאי PC12 נמדדה באמצעות מבחנים מבוססי XTT ו- resazurin לאחר דגירה של תאים עם ריכוזי MNP שונים. התוצאות נורמלו למדידת הבקרה של תאי PC12 ללא MNPs. ריכוזים אלה של חברי פרלמנט לא הראו ציטוטוקסיות משמעותית כלפי התאים, והדבר בא לידי ביטוי בהיעדר הבדלים משמעותיים בכדאיות התאים בכל אחת מההכנות (t-test,p > 0.05, n = 3) ( איור3C,D). ההשפעות של חברי פרלמנט על ציפוי והתפתחות תאים נקבעו על ידי השוואת תאים טעונים MNP לתאים שאינם טעונים, מצופה וגדל על מצעים מגנטיים זהים. התאים נזרעו והושארו לדבוק במצע. כל יומיים, התאים טופלו במדיום טרי וב-NGF כמתואר בסעיף 7. איור 4 מציג תאי PC12 עם וללא טיפול MNP, הגדל ומבדיל על מצע מגנטי עם פסים ברוחב 20 מיקרומטר ומרווח של 100 מיקרומטר. לאחר 3 ימים של צמיחה, התאים היו immunostained, DAPI מוכתם, ותמונות צולמו.

התאים הממגנטים נמצאו מחוברים לדפוסים המגנטיים ומגדלים ענפים בהתאם לדפוסים, בעוד שתאים ללא טיפול MNP גדלו ללא זיקה למכשירים המגנטיים(איור 4A, B). איור 4C מציג את מיקום התאים ואת היווצרות הרשת על מצע עם גיאומטריה משושה באורך צד של 200 מיקרומטר ורוחב קו של 50 מיקרומטר. התאים צולמו לאחר 6 ימים. התאים הממגנטים היו ממוקמים על התבנית המגנטית, עם זיקה דומה למצעים המפוספסים. מיקום התאים כומת על ידי ספירת גופי התאים הממוקמים על התבניות המגנטיות או מחוברים אליהם. החלק היחסי של התאים חושב מתוך אוכלוסיית התאים הכוללת. זה נעשה עבור תאים עם וללא טיפול MNP. האזור היעיל של התגובה המגנטית חושב על ידי הוספת קוטר התאים (~ 10 מיקרומטר לתאי PC12) לשני הקצוות של התבנית המגנטית. עבור דפוסי הפס המגנטי, יחס האזור המגנטי היעיל היה 33%, אשר תאם את ההסתברות של התאים לנחות באופן אקראי על הפסים המגנטיים. התוצאות הראו כי 75% מגופי התאים הטעונים ב-MNP היו במגע עם הפסים המגנטיים, בעוד שרק 35% מהתאים הלא ממוגנטים היו ממוקמים על הפסים (בהסכמה סטטיסטית עם התפלגות לא משוחדת)(איור 4D). ניתוח סטטיסטי הצביע על כך שהמדידה לא נגזרה מנחיתה שרירותית של תאים (דגימה אחת z-test, p < 10-6, n = 430).

לעומת זאת, הניתוח הסטטיסטי של המשושים המגנטיים גילה כי 92% מהסומה של התאים הטעונים ב-MNP חוברו לדפוסים המגנטיים, לעומת 38% לתאים ללא טיפול MNP (איור 4E). יחס השטח האפקטיבי של המשושים היה 32% מהמצע. ניתוח סטטיסטי עבור המשושים גם הצביע על כך שהמדידה לא נגזרה מנחיתת תאים שרירותית (דגימה אחת z-test, p < 10-6, n = 370). התוצאות חשפו העדפה ברורה של התאים הטעונים על ידי MNP לתבנית המגנטית, בעוד שתאים ללא חברי פרלמנט דבקו באופן אקראי במצע כולו. בנוסף לאפקט מיקום התאים, פלטפורמות מגנטיות אלה נמצאו גם לשלוט בכיוון של neurites גדל. איור 5A מציג תאים טעונים ב-MNP עם נויריטים, המתיישרים לפי כיוון הפסים. לעומת זאת, מדידת הבקרה של תאים ללא חברי פרלמנט הראתה צמיחה נויריטית ברחבי הפלטפורמה ללא קשר לדפוסים המגנטיים.

כדי להעריך את ההשפעה המגנטית על כיווניות הצמיחה העצבית, נמדדה הזווית בין הנויריטים לפסים המגנטיים. הנתונים גילו כי 80% מהנויריטים של תאים טעונים MNP הפגינו מתאם עם כיוון הפסים המגנטיים, בטווח Δθ < 15° ביחס לכיוון הפסים. עם זאת, רק 32% מהנויריטים של תאים ללא חברי פרלמנט התפתחו בטווח זה. תאים ללא טיפול MNP לא הראו מתאם עם הפסים המגנטיים וגדלו בהתאם להתפלגות זווית אחידה (איור 5B). ניתוח סטטיסטי של התפלגות Δθ גילה כי זה לא היה נורמלי או אחיד (מבחן צ'י ריבוע, p < 0.001). ההשפעה של הגיאומטריה המשושה על צמיחת נויריט הודגמה גם כן. איור 5C מציג תמונות פלואורסצנטיות של התפתחות רשת עצבית של תאי PC12 ממוגנטים ולא ממוגנטים על גבי תבנית מגנטית של משושים ועיגולים גדולים בין הקצוות. אורך הצד של המשושה היה 200 מיקרומטר ורוחב הקווים היה 10 מיקרומטר; קוטר העיגול היה 30 מיקרומטר. סומס התא הראה זיקה גבוהה למעגלים ופיתח רשת עצבית מכוונת היטב לאורך קווי המתאר המשושה. תמונת זום-אין מדגימה תאים המחוברים לעיגול מגנטי ונאוריטים הגדלים לאורך קווי מתאר אלה (איור 5D).

Figure 1
איור 1: אפיון ההתקנים המגנטיים. (A) תמונות מיקרוסקופיות אופטיות של התקנים מגנטיים עם צורות גיאומטריות שונות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) סריקת תמונה מיקרוסקופית אלקטרונים של Co80Fe20/ Pd רב שכבתי שרטוט של הרב שכבתי. הגובה הכולל של הדפוסים המגנטיים הוא 18 ננומטר. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. (C)מדידת אפקט האולם החריג של המכשיר המגנטי המציגה את השדות המגנטיים הכופים והשרידים של FM. Inset: תמונה של מכשיר עם אלקטרודות מסומנות. (D) מגנטומטריה של התקן רב שכבתי מציגה את ערך הרוויה של המגנטיזציה המחושב לפי אמצעי אחסון. נתון זה שונה ממרקוס ואח '37. קיצורים: AHE = אפקט האולם החריג; FM = פרומגנטי; B = שדה מגנטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ספיגת תא PC12 של MNPs. (A) מדידה מגנטומטרית של MNPs בטמפרטורת החדר. (B) תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית של ספיגת MNP על ידי תאי PC12. גרעינים מוכתמים ב- DAPI; חברי פרלמנט המסומנים ברודמין נכנסים לתאים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (C) מדידת ICP של MNPs תחמוצת ברזל מופנם (pg) על ידי תאי PC12 לאחר 24 שעות של דגירה עם מספר ריכוזי MNP. נתון זה שונה ממרקוס ואח '37. קיצורים: MNPs = חלקיקים מגנטיים; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; ICP = פלזמה מצמדית השראתית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הכדאיות של תאי PC12 הטעונים על-ידי MNP. (A) תמונות מיקרוסקופיות קונפוקאליות של תאי PC12 מובחנים המודגרים עם MNPs. חצים מראים נויריטים מובחנים עם MNPs מופנמים. (B) ניתוח Sholl של נוייריט מצמח של תאי PC12 לאחר 3 ימים של בידול. (C)XTT הכדאיות בדיקה של תאי PC12 שטופלו עם ריכוזים הולכים וגדלים של MNPs לאחר 24 שעות של דגירה. המדידות מנורמלות לשליטה. (D)מבחני הכדאיות מבוססי Resazurin של תאי PC12 שטופלו בריכוזים הולכים וגדלים של MNPs לאחר 24 שעות של דגירה. המדידות מנורמלות לשליטה. אין מובהקות סטטיסטית בשני הניתוחים. נתון זה שונה ממרקוס ואח '37. קיצורים: MNPs = חלקיקים מגנטיים; XTT = 2,3-ביס-(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפנוניל)-2H-טטרזוליום-5-קרבוקסניליד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: לוקליזציה של תאים על גבי התקנים מגנטיים. (A) תמונות פלואורסצנטיות של תאי PC12 עמוסים ב- MNPs הגדלים על הפסים המגנטיים: (i) תיוג α-טובולין, (ii) כתמי DAPI ו- (iii) תמונה ממוזגת. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) תמונות פלואורסצנטיות של תאי PC12 ללא טיפול MNP, גדל על גבי הפסים המגנטיים כמו ב (A). (C) תמונות פלואורסצנטיות של תאי PC12, עם ובלי MNPs, על התבנית המגנטית המשושה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (D) אחוז גופי התאים, עם ובלי MNPs, ממוקם על הפסים המגנטיים. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. הקו המקווקו מייצג את ההסתברות שתאים ינחתו על הפסים המגנטיים. (ה)אחוז גופי התאים, עם ובלי MNPs, ממוקם על משושים מגנטיים. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. הקו המקווקו מייצג את ההסתברות שתאים ינחתו על התבניות המגנטיות עבור התפלגות אקראית. אין מובהקות סטטיסטית בשני הניתוחים. נתון זה שונה ממרקוס ואח '37. קיצורים: MNPs = חלקיקים מגנטיים; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: כיווניות רשת עצבית. (A) תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות של תאי PC12 עם תווית α-טובולין עם טיפול MNP (משמאל) וללא טיפול MNP (מימין), הגדלים על גבי פסים מגנטיים. הפסים מסומנים. (B)היסטוגרמות קוטביות מציגות את אפקט הכיווניות הנוירית על תאי PC12 (משמאל) עם טיפול MNP ו -(מימין) ללא טיפול MNP. סטיית זווית הכיוון מוגדרת כהבדל בזווית בין הנאוריטים לבין כיוון הפס המגנטי (סלים של 15°). (C) תמונות פלואורסצנטיות של תאי PC12 הגדלים על גבי תבנית משושה מגנטית, (משמאל) עם טיפול MNP ו (מימין) ללא טיפול MNP. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (D) זום-in תמונה של תא ממוגנט פיתוח neurites על פי התבנית המגנטית. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. נתון זה שונה ממרקוס ואח '37. קיצור: MNPs = חלקיקים מגנטיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התוצאות הייצוגיות ממחישות את האפקטיביות של המתודולוגיה המוצגת לשליטה וארגון היווצרות רשת עצבית בקנה מידה מיקרון. תאי PC12 הטעונים על ידי MNP נשארו בני קיימא והפכו ליחידות רגישות מגנטיות שנמשכו על ידי הכוחות המגנטיים מאלקטרודות FM לאתרים ספציפיים. הדבר בא לידי ביטוי בצורה הטובה ביותר באיור 5C, שבו התאים דבקים באופן מועדף בקודקים הקודקודים הגדולים יותר של המשושים ולא בקווים הדקים. יתר על כן, הסתעפות התאים התפתחה לטובה גם בעקבות הדפוסים המגנטיים. כל ניסויי הבקרה הראו באופן חד משמעי שהכוחות המגנטיים כיוונו את לוקליזציה של גופי התאים והצמחייה. למרות שהוכח כי רמזים טופוגרפיים יכולים לשמש להכוונת נוייריט מחוץ40,41, זה לא המקרה כאן, כמו תאים ללא MNPs הראו שום תגובה לצורת התבנית.

גישה מלמטה למעלה ננקטו כדי להנדס את הכוחות המגנטיים המקומיים, באמצעות פוטוליטוגרפיה סטנדרטית ותצהירים sputtering הזמינים במתקני מחקר רבים, להקל על אימוץ טכניקות אלה על ידי חוקרים רבים. הגישה מלמטה למעלה מאפשרת חופש בתכנון דפוסים וצורות מורכבים בהתאם לצורכי החוקרים, עם רזולוציה בקנה מידה מיקרון לאזורים באורך סנטימטר. למרות התוצאות הוכחו על שקופיות זכוכית, באופן עקרוני, ניתן להכין את ההתקנים על גבי חומרים אחרים תואמים ביולוגית המתאימים יישומים טיפוליים vivo כגון מערכי אלקטרודה גמישים להקלטה עצבית וגירוי42,43.

פלטפורמות PMA ייחודיות אלה, שהושגו על ידי תצהיר רב שכבתי, מייצרות שדה מגנטי חזק לאורך כל התבנית המגנטית ולא רק בקצוות, כפי שנצפה קודם לכן22. בנוסף, FMs תוכננו עם רוויית מגנטיזציה שריד גדול, כלומר, גם כאשר השדה המגנטי החיצוני מוסר, האלקטרודות נשארות ממוגנטות לחלוטין וממשיכות למשוך את התאים ללא צורך במגנט חיצוני. עם זאת, כוח מגנטי חיצוני יכול לסייע במגנט מלא של חברי הפרלמנט בתאים, ובכך להגדיל את כוח המשיכה והיעילות במהלך הציפוי. שיקול חשוב בעיצוב FM היה מספר החזרות. בעוד חזרה יותר יגדיל את הרגע המגנטי הכולל, וזה חיובי, הוספת שכבות רבות גם להגדיל את השכבה intermixing, גורם PMA פחות יציב ולבסוף לגרום מגנטיזציה במישור44,45 ציר קל משיכה לקצוות שונים של האלקטרודות22,37. לכן, יש צורך לייעל את מספר FM והרכב של multilayers כדי להבטיח PMA יציב עם שדות מגנטיים מקסימליים.

חברי הפרלמנט שהוצגו בתוצאות הייצוגיות הראו כמעט שום רעילות כלפי תאי PC12 בריכוזים שנבדקו, וגם לא השפיעו על ההתנהגות התאית, למרות היכולת להיכנס לתאים ויש להם רגע מגנטי גבוה יחסית. כוח המשיכה בתא תלוי במספר חברי הפרלמנט בתא ובמגנטיזציה של כל MNP. באופן אידיאלי, שניהם צריכים להיות גבוהים; עם זאת, ייתכנו פשרות בין השניים. עם כמה חברי פרלמנט מסחריים, הכדאיות של התאים הייתה טובה, אבל הרגע המגנטי היה חלש מדי. עבור חלקיקים אחרים מפוברק במעבדה, הרגע המגנטי היה גבוה, אבל MNPs נטו לצבור ואת הכדאיות התא היה נמוך. לכן, חשוב לבדוק את הכדאיות של התאים ולאפיין את המגנטיזציה שלהם בעת בחירת MNPs. חברי הפרלמנט המשמשים כאן הם גם פלואורסצנטיים, מה שמקל על המעקב אחר מיקומם בתאים. התוצאות מראות נויריטים המתפתחים בהתאם לצורת התבנית המגנטית, והפלואורסצנטיות מצביעה על נוכחותם של חברי פרלמנט לאורך הנויריטים.

מנגנון ההפנמה של חברי פרלמנט לתאים נחקר בעבר46. ספיגה תאית של MNPs מתרחשת באמצעות אנדוציטוזיס בהתאם לגודלם, צורתם וכימיה פני השטח שלהם. מחקרים קודמים בחנו את ספיגת סוגים שונים של חברי פרלמנט לנוירונים24; ספיגה סלולרית של חברי פרלמנט מצופים הייתה טובה יותר מהספיגה הסלולרית של חברי פרלמנט לא מצופים. כפי שניתן לראות באיור 3A(B),חברי פרלמנט הופנמו לציטופלסמה, אך נשארו מחוץ לגרעין והועברו לנוריטים במהלך התפתחותם. בנוסף, MNPs מצומדים NGF שהפעיל את מסלול איתות NGF הופנמו גם לתאים באמצעות אנדוציטוזיס47,48.

לסיכום, מאמר זה מציג ארגז כלים יעיל של מניפולציה מגנטית למחקר הדורש ארגון יסודות ביולוגיים. השימוש בכוחות מגנטיים מאפשר מיקום תאים, המכוונים את צמיחת הנויריטים. שיטה זו מאפשרת עיצוב פלטפורמות עם צורות גיאומטריות מורכבות. ניתן לתכנן את כוחות המשיכה המגנטית כדי לתפעל את היווצרות הרשת העצבית מרחוק על ידי שינוי נוף הכוח המגנטי לאורך זמן. ניתן להרחיב בקלות את כל המתודולוגיה הזו כדי לשלוט בגורמים או כימיקלים אחרים שניתן לחבר לחברי הפרלמנט ולהביא אותם לנקודות עניין מתוכננות מראש, כולן ברזולוציה בקנה מידה מיקרון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, ישראל והקרן הישראלית למדע (569/16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 173 חלקיקים מגנטיים אניזוטרופיה של מגנטיזציה ניצבת (PMA) אספקת תרופות ממוקדות מגנטיות מניפולציה של תאים מגנטיים תרבות עצבית הנדסה עצבית ביו-התפגיעות פוטוליטוגרפיה רב שכבתי מגנטי
ייצור פלטפורמות מגנטיות עבור ארגון בקנה מידה מיקרון של נוירונים מחוברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., … More

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter