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Bioengineering

Fabricación De Plataformas Magnéticas Para La Organización A Escala De Micras De Las Neuronas Interconectadas

Published: July 14, 2021 doi: 10.3791/62013
Automatic Translation
1,4, 2,4, 2,4, 1,4, 2,4, 2,4, 3,4, 2,4, 1,4
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Summary

Este trabajo presenta un enfoque ascendente para la ingeniería de las fuerzas magnéticas locales para el control de la organización neuronal. Las células similares a neuronas cargadas con nanopartículas magnéticas (MNPs) están plateadas encima y controladas por una plataforma micro-modelada con magnetización perpendicular. También se describen la caracterización magnética, la absorción celular de MNP, la viabilidad celular y el análisis estadístico.

Abstract

La capacidad de dirigir las neuronas a redes neuronales organizadas tiene grandes implicaciones para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y la bio-interfaz. Muchos estudios han tenido como objetivo dirigir las neuronas utilizando señales químicas y topográficas. Sin embargo, los informes de control organizacional a escala de micras sobre grandes áreas son escasos. Aquí, se ha descrito un método eficaz para colocar neuronas en sitios preestablecidos y guiar la consecuencia neuronal con resolución a escala de micras, utilizando plataformas magnéticas incrustadas con micro-patrones, elementos magnéticos. Se ha demostrado que la carga de neuronas con nanopartículas magnéticas (MNPs) las convierte en unidades magnéticas sensibles que pueden ser influenciadas por gradientes magnéticos. Siguiendo este enfoque, se ha fabricado una plataforma magnética única en la que las células PC12, un modelo común similar a una neurona, se platearon y se cargaron con nanopartículas superparamagnéticas. Se depositaron películas delgadas de multicapas ferromagnéticas (FM) con magnetización perpendicular estable para proporcionar fuerzas de atracción efectivas hacia los patrones magnéticos. Estas células PC12 cargadas de MNP, plateadas y diferenciadas encima de las plataformas magnéticas, se unieron preferentemente a los patrones magnéticos, y la excrecencia de neurita estaba bien alineada con la forma del patrón, formando redes orientadas. Los métodos cuantitativos de la caracterización de las propiedades magnéticas, de la absorción celular de MNP, de la viabilidad de la célula, y del análisis estadístico de los resultados se presentan. Este enfoque permite el control de la formación de redes neuronales y mejora la interfaz neurona-electrodo a través de la manipulación de fuerzas magnéticas, que puede ser una herramienta eficaz para estudios in vitro de redes y puede ofrecer nuevas direcciones terapéuticas de biointerfase.

Introduction

Micropatterning de neuronas tiene un gran potencial para la regeneración de tejidos1,2,3,4,5 y el desarrollo de dispositivos neuroelectr electrónicos6,7,8. Sin embargo, el posicionamiento a escala micronescular de las neuronas a alta resolución espacial, como en los tejidos biológicos, plantea un desafío significativo. La formación de estructuras prediseñadas a esta escala requiere la guía de los procesos de las células nerviosas mediante el control local de la motilidad del soma y la excrecencia axonal. Estudios anteriores han sugerido el uso de señales químicas y físicas9,10,11,12 para guiar el crecimiento neuronal. Aquí, un nuevo enfoque se centra en el control del posicionamiento celular mediante gradientes de campo magnético13,14,15,16,17,convirtiendo las células cargadas con MNPs en unidades sensibles magnéticas, que pueden ser manipuladas remotamente.

Kunze et al., que caracterizaron la fuerza necesaria para inducir respuestas celulares utilizando células cargadas con chip magnético y MNP, demostraron que el alargamiento axonal temprano puede ser desencadenado por la tensión mecánica dentro de las células18. Tay et al. confirmaron que los sustratos microfabricados con gradientes de campo magnético mejorados permiten la estimulación inalámbrica de circuitos neuronales dosificados con MNPs utilizando colorantes indicadores de calcio19. Además, Tseng et al. unieron nanopartículas dentro de las células, dando lugar a fuerzas localizadas mediadas por nanopartículas que se acercaron a la tensión celular20. Esto condujo a la fabricación de patrones definidos de sustratos micromagnéticos que ayudaron a estudiar la respuesta celular a las fuerzas mecánicas. La tensión celular derivada de la aplicación de fuerzas localizadas mediadas por nanopartículas se logró mediante la fusión de nanopartículas dentro de las células20. Un sistema híbrido microfluídico-semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS) fue desarrollado por Lee et al., quienes integraron una matriz de microelectroimanes en el chip CMOS para controlar el movimiento de células individuales etiquetadas con perlas magnéticas21.

Utilizaron almohadillas magnéticas preprogramadas a microescala como "puntos calientes" magnéticos para localizar las células22. La actividad específica también podría estimularse dentro de las células utilizando matrices magnéticas micro-modeladas para localizar nanopartículas en ubicaciones subcelulares específicas23. La absorción celular de MNP se ha demostrado con éxito en las neuronas primarias de sanguijuela, rata y ratón24,25,26. Aquí, esto se ha demostrado en una línea celular del feocromocitoma pc12 de la rata, que se ha divulgado previamente para demostrar la alta absorción de MNPs27. En los últimos años, ha habido varias aplicaciones médicas de los MNPs, incluyendo la administración de fármacos y la termoterapia en tratamientos contra el cáncer28,29,30,31. En concreto, los estudios se ocupan de la aplicación de MNPs y redes neuronales32,33,34,35. Sin embargo, la organización magnética de las neuronas que utilizan MNPs a nivel unicelular merece una mayor investigación.

En este trabajo, se ha descrito un enfoque ascendente para diseñar fuerzas magnéticas locales a través de plataformas prediseñadas para controlar la disposición neuronal. Se ha presentado la fabricación de patrones a escala micron de multicapas fm. Esta estructura única de múltiples capas de FM crea una magnetización perpendicular estable que resulta en fuerzas de atracción efectivas hacia todos los patrones magnéticos. A través de la incubación, los MNPs se cargaron en células PC12, transformándolas en unidades magnéticas sensibles. Las células cargadas de MNP, plateadas y diferenciadas sobre las plataformas magnéticas, se unieron preferentemente a los patrones magnéticos, y la consecuencia de la neurita se alineó bien con la forma del patrón, formando redes orientadas. Se han descrito varios métodos para caracterizar las propiedades magnéticas de las multicapas fm y los MNPs, y también se han presentado técnicas para la absorción celular de MNP y ensayos de viabilidad celular. Además, se detallan los parámetros morfométricos del crecimiento neuronal y el análisis estadístico de los resultados.

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Protocol

NOTA: Realizar todas las reacciones biológicas en un gabinete de bioseguridad.

1. Fabricación de plataformas magnéticas

  1. litografía
    1. Corte las diapositivas de vidrio en 2 x 2 cm2 usando una pluma de escribano. Limpie los portaobjetos de vidrio en acetona y luego isopropanol durante 5 minutos cada uno en un baño de ultra sonicación. Secar con nitrógeno de ultra alta pureza (UHP).
    2. Cubra el vidrio con fotorresistente usando recubrimiento de espín a 6,000 rpm durante 60 s, para alcanzar un espesor de 1.5 μm, y hornee a 100 ° C durante 60 s. Exponga la muestra a una fuente de luz, utilizando una longitud de onda apropiada para fotorresistes, con un patrón deseado, utilizando una fotomáscara o litografía sin máscara.
    3. Desarrollar durante 40 s en un revelador, diluido en agua destilada (DW) de acuerdo con las instrucciones del fabricante; lavar en DW durante 45 s y secar con gas nitrógeno UHP. Inspeccione el patrón con un microscopio óptico.
  2. Deposición de sputter
    1. Inserte la muestra en la cámara principal del sistema de deposición y espere la presión base (~ 5 × 10-8 Torr). Abra el flujo de gas; establecer el flujo de argón para la pulverización estándar (28 sccm [cm cúbico estándar por minuto) en este documento. Encienda los objetivos de sputter, luego establezca la presión de sputter en 3 mTorr.
    2. Aumente la potencia de cada objetivo hasta que se alcance la velocidad deseada.
      NOTA: Velocidad de Pd: 0,62 A/s = 1,0 nm en 16 s; Co80Fe20 Velocidad: 0,32 A/s, 0,2 nm en 6,25 s.
    3. Activar la rotación. Deposite la fm multicapa, alternando entre los objetivos Co80Fe20 y Pd, abriendo y cerrando los obturadores objetivo, respectivamente. Deposite 14 bicapas de Co80Fe20 (0,2 nm)/Pd (1,0 nm), y termine con una capa de tapado de Pd adicional de 2 nm.
    4. Despegue: Remoje la muestra en acetona durante 30 min, y enjuague con isopropanol. Luego, seque con nitrógeno UHP, y mantenga la muestra en un ambiente limpio y seco hasta su uso.

2. Caracterización del dispositivo magnético a través de mediciones de transporte

  1. Utilice un sustrato si o una corredera de vidrio con una barra magnética en forma de cruz de 100 μm de ancho, depositada con multicapas de FM (ver recuadro de la Figura 1C). Acople la muestra al soporte mediante cinta de doble cara.
  2. Usando un bonder de alambre, una 4 alambres a la muestra, uno en cada pierna del electrodo cruzado. Fije el soporte de la muestra y la muestra dentro del sistema de medición de transporte con un campo magnético para que el campo magnético sea perpendicular a la muestra. Realizar mediciones a temperatura ambiente.
  3. Realizar la medición de voltaje transversal (VT)del dispositivo; siga las marcas de la Figura 1C (recuadro): aplique una corriente de 1 mA entre los contactos 1 y 3; medir la VT entre los contactos 2 y 4; luego, aplique una corriente entre 2 y 4, y mida el voltaje entre 1 y 3. Finalmente, se calcula la diferencia entre las tensiones tanto de las mediciones como de la división por 2 para obtener VT. Utilice un sistema de conmutación para cambiar automáticamente entre las dos configuraciones de medición.
  4. Barrer el campo magnético entre 0,4 T a -0,4 T en pasos de 5 mT y medir la VT en función del campo. Trazar la resistencia transversal (VT/I) frente al campo magnético para determinar la señal hall anómala, que es proporcional a la magnetización perpendicular en la película.

3. Caracterización de MNPs y multicapas magnéticas mediante mediciones de magnetometría

  1. Medición magnetométrica para multicapas fm
    1. Deposite la multicapa FM en el sustrato Si (ver sección 1.2). Cortar la muestra en 6 cuadrados de 4 x 4 mm2 tamaño. Apile las muestras una encima de la otra y organémoslas en la cápsula perpendicular a la dirección del campo magnético (ver recuadro de la Figura 1D).
    2. Inserte la cápsula en el magnetómetro y mida la magnetización a temperatura ambiente. Barrer el campo magnético entre -0,4 T y 0,4 T.
    3. Calcule el volumen total del material magnético, considerando el espesor de la capa magnética, el tamaño de las muestras y el número de sustratos. Divida la magnetización por el volumen total del material magnético.
    4. Trazar la magnetización (por unidad de volumen) frente al campo magnético. Restar el fondo diamagnético del sustrato de la respuesta de alto campo magnético y extrapolar la magnetización de saturación de la FM de la gráfica.
  2. Medición magnetométrica para MNPs
    1. Inserte una masa designada de MNPs en una cápsula de polímero sintético. Considere un volumen mayor si mide valores de saturación de magnetización pequeños.
    2. Si los MNPs están suspendidos en un solvente, seque los MNPs dejando la cápsula abierta durante la noche. Inserte la cápsula en el magnetómetro y mida la magnetización a temperatura ambiente. Barrer el campo magnético entre -0,2 T y 0,2 T.
    3. Calcule la masa total de los MNPs multiplicando el volumen designado por la concentración de partículas. Normalizar los resultados a 1 g.
    4. Trazar la magnetización normalizada (por gramo) frente al campo magnético. Extrapolar la saturación de magnetización de los MNPs a partir del gráfico.

4. Protocolo de recubrimiento de colágeno

  1. Revestimiento de platos de plástico
    1. Preparar 0,01 M de HCl añadiendo 490 μL de HCl a 500 mL de agua de doble destilación en autoclave (DDW).
      NOTA: Realice este paso sólo en la campana química.
    2. Diluir el colágeno tipo 1 (solución de cola de rata) 1:60-1:80 en 0,01 M HCl para obtener la concentración de trabajo final de 50 μg/mL. Colocar 1,5 mL de la solución diluida en un plato de cultivo de 35 mm. Dejar el plato en la campana durante 1 h, cubierto.
    3. Retire la solución y lave 3 veces en solución salina estéril 1x tamponada con fosfato (PBS). El plato está listo para la siembra celular.
  2. Revestimiento de portaobjetos de vidrio
    1. Diluya el colágeno tipo 1 (solución de cola de rata) 1:50 en etanol al 30% v/v. Para recubrir un plato de 35 mm, añadir 20 μL de colágeno a 1 mL de etanol al 30%.
    2. Cubra el plato con la solución, y espere hasta que toda la solución se evapore, dejando el plato al descubierto durante unas horas. Lavar 3x en estéril 1x PBS; el portaobjetos de vidrio está listo para la siembra celular.

5. Captación y viabilidad del MNP celular

  1. Absorción celular de MNP
    1. Prepare el medio básico de crecimiento para el cultivo celular pc12 agregando el suero del caballo del 10% (HS), el suero bovino fetal del 5% (FBS), la L-glutamina del 1%, la penicilina/la estreptomicina del 1%, y la anfotericina del 0,2% al medio del instituto médico del parque de Roswell (RPMI), y filtre usando un filtro de nylon de 0,22 μm.
    2. Agregue suero de caballo (HS) al 1%, L-glutamina al 1%, penicilina/estreptomicina al 1% y anfotericina al 0,2% al medio RPMI para preparar el medio de diferenciación PC12 y filtre con un filtro de nylon de 0,22 μm.
    3. Cultivar células en un matraz de cultivo no tratado con 10 ml de medio de crecimiento básico; añadir 10 mL de medio de crecimiento básico al matraz cada 2-3 días, y sub-cultivar las células después de 8 días.
    4. Para la absorción celular, centrífuga la suspensión celular en un tubo de centrífuga durante 8 minutos a 200 × g y temperatura ambiente, y deseche el sobrenadante.
    5. Resuspend las células en 3 mL de medio de crecimiento básico fresco. Una vez más, centrífuga la suspensión celular durante 5 min a 200 × g y temperatura ambiente, y deseche el sobrenadante. Resuspend las células en 3 mL de medio de diferenciación fresco.
    6. Aspirar las células 10x usando una jeringa y una aguja para romper los grupos celulares. Cuente las células usando un hemocytometer, y la semilla 106 células en un plato regular sin revestir 35 milímetros.
    7. Añadir a la antena parabólica el volumen calculado de suspensión MNP y el volumen de medio de diferenciación para lograr la concentración de MNP deseada y el volumen total. Mezcle las células, los MNPs, y el medio de la diferenciación; incubar el plato en una incubadora humidificada al 5% de CO2 a 37 °C durante 24 h.
    8. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 200 × g a temperatura ambiente, y desechar el sobrenadante. Resuspend las células en 1 mL del medio fresco de la diferenciación, y cuente las células usando un hemocytometer.
  2. Diferenciación celular cargada con MNP
    1. Realizar el protocolo de captación (sección 5.1). Semilla 8 × 104 células cargadas con MNP en un plato recubierto de colágeno de 35 mm, tipo l en presencia de medio de diferenciación (ver protocolo de recubrimiento de colágeno en la sección 4.1). Después de 24 h, añadir 1:100 factor de crecimiento del beta-nervio murino fresco (β-NGF) (concentración final 50 ng/mL).
    2. Renovar el medio de diferenciación y añadir β-NGF murino fresco cada 2 días. Imagen de las células cada 2 días utilizando microscopía óptica. Después de la formación de la red (6-8 días para las células PC12), la imagen de las células usando microscopia confocal, y observar la fluorescencia de las partículas.
  3. Ensayo de viabilidad para células cargadas con MNP: prueba de viabilidad celular de 2,3 bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilide (XTT).
    1. Prepare el medio de crecimiento básico de acuerdo con el paso 5.1.1. Cultivar las células PC12 con MNPs a diferentes concentraciones (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL y 0,5 mg/mL en medio de crecimiento básico) y también sin MNPs para el control por triplicado en una placa plana de 96 pocillos (volumen total de 100 μL/pocillo). Incubar las células durante 24 h en una incubadora humidificada al 5% deCO2,a 37 °C.
    2. Prepare pozos en blanco que contengan medio sin celdas para la corrección de fondo. Descongelar la solución de reactivo XTT y la solución de reacción que contiene N-metil dibenzopirazina metil sulfato) en un baño de 37 °C inmediatamente antes de su uso. Gire suavemente hasta que se obtengan soluciones claras.
    3. Para una placa de 96 pozos, mezcle 0,1 mL de solución de activación con 5 mL de reactivo XTT. Añadir 50 μL de la solución de reacción a cada pozo, agitar ligeramente la placa para una distribución uniforme del tinte en los pozos, y luego incubar la placa en una incubadora durante 5 h.
    4. Mida la absorbancia de la muestra contra los pozos en blanco utilizando un lector de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) a una longitud de onda de 450 nm. Mida la absorbancia de referencia utilizando una longitud de onda de 630 nm y reste de la medición de 450 nm.
    5. Como se produce una ligera absorbancia espontánea en el medio de cultivo incubado con el reactivo XTT a 450 nm, reste la absorbancia media de los pozos en blanco de la de los otros pozos. Reste los valores de la señal de muestras paralelas de MNPs en las mismas concentraciones probadas que las muestras de la célula.
  4. Ensayo de viabilidad para células cargadas con MNP: prueba de viabilidad celular basada en resazurínico
    1. Preparar el medio de crecimiento básico de acuerdo con el paso 5.1.1. Cultivar las células PC12 con MNPs a diferentes concentraciones (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL y 0,5 mg/mL en medio de crecimiento básico) y sin MNPs como control por triplicado en una placa plana de 96 pocillos durante 24 h. Incubar las células durante 24 h en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. Prepare pozos en blanco que contengan medio sin celdas.
    2. Lave las células con 1x PBS. Añadir el reactivo a base de resazurin (10% p/v) al medio e incubar durante 2 h en una incubadora de 37 °C.
    3. Coloque 150 μL alícuotas de las muestras en el lector ELISA y mida la absorbancia a una longitud de onda de excitación de 560 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. Reste los valores de la señal de las muestras paralelas de MNPs en las mismas concentraciones probadas que las muestras de la célula.

6. Caracterización de la concentración de MNP dentro de las células utilizando plasma acoplado inductivamente (ICP)

  1. Preparar el medio de crecimiento básico de acuerdo con el paso 5.1.1. Cultivar las células PC12 con MNPs a diferentes concentraciones (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL y 0,5 mg/mL en medio de crecimiento básico) y sin MNPs como control por triplicado en una placa plana de 96 pocillos (volumen total de 100 μL/pocillo). Incubar en una incubadora humidificada al 5% deCO2,a 37 °C durante 24 h.
  2. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga (de cada pozo por separado), centrifuge las células a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Resuspend las células en 1 mL del medio fresco de la diferenciación, y cuente las células usando un hemocytometer.
  3. Lyse las células por tratamiento con 100 μL de ácido nítrico al 70% a cada pozo por separado durante al menos 15 min. Agregue 5 mL de DDW a las células deslizado y filtre las soluciones.
  4. Mida la concentración del hierro usando el ICP y utilice la cuenta de célula para registrar la concentración del FE por la célula.

7. Diferenciación celular y crecimiento en plataforma magnética

  1. Limpie el sustrato estampado con etanol al 70% v/v/ y coloque el sustrato en un plato de cultivo de 35 mm en la campana. Coloque un imán grande (~ 1500 Oe) debajo del sustrato estampado durante 1 minuto y retire el imán moviendo primero el plato hacia arriba y lejos del imán, y luego saque el imán de la campana. Encienda la luz ultravioleta durante 15 min.
  2. Recubre el sustrato con colágeno tipo 1 según la sección 4.2. Suspender las células después de la absorción celular de MNP (sección 5.1), sembrar 105 células en un plato de cultivo de 35 mm, y añadir 2 mL de medio de diferenciación. Incubar el cultivo en una incubadora humidificada al 5% deCO2,a 37 ºC.
  3. Después de 24 h, añadir 1:100 murine fresco β-NGF (concentración final de 50 ng/mL). Renovar el medio de diferenciación y añadir β-NGF murino fresco cada 2 días. Realice una imagen de las células cada 2 días utilizando microscopía de luz y, después de la formación de la red, realice inmunotensiones en las células (sección 8.1).

8. Tinción de células cargadas con MNP

  1. Inmunotenstenimiento de tubulina
    1. Prepare una solución de paraformadehído al 4% (PFA) mezclando 10 mL de solución de PFA al 16%p/v, 4 mL de PBS 10x y 26 mL de DDW. Preparar 50 mL de PBT al 1% añadiendo 500 μL de un surfactante no iónico a 50 mL de 1x PBS. Preparar 50 mL de PBT al 0,5% mezclando 25 mL de PBT al 1% con 25 mL de 1x PBS. Prepare la solución de bloqueo mezclando 1% de albúmina sérica bovina y 1% de suero de burro normal en PBT al 0,25%.
      NOTA: Utilice PFA sólo dentro de la campana química.
    2. Retire el medio sobrenadante de las células. Fije las células cargadas de MNP en 4% de PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente dentro de una campana química. Lave las células cargadas de MNP 3x en 1x PBS, 5 min cada lavado, dentro de una campana química.
    3. Permeabilizar las células cargadas de MNP con PBT al 0,5% durante 10 min. Incubar las células cargadas de MNP primero en solución de bloqueo durante 45 min a temperatura ambiente y luego con anticuerpos anti-α-tubulina de conejo en solución de bloqueo durante la noche a 4 °C. Lave las células cargadas de MNP 3x en 1x PBS, 5 min cada lavado.
    4. Incubar las células cargadas con MNP con anticuerpo secundario anti-conejo de burro conjugado con Cy2 durante 45 min en la oscuridad y a temperatura ambiente. Lave las células cargadas de MNP 3x en 1x PBS, 5 min cada lavado.
    5. Realizar imágenes confocales. Para la tubulina, utilice una longitud de onda de excitación de 492 nm y una longitud de onda de emisión de 510 nm. Para los MNPs (rodamina), utilice una longitud de onda de excitación de 578 nm y una longitud de onda de emisión de 613 nm.
  2. Tinción nuclear con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)
    1. Lave las células cargadas de MNP 3x en 1x PBS, 5 min cada lavado. Retire el exceso de líquido alrededor de la muestra, agregue 1 gota (~ 50 μL) de medio de montaje que contenga DAPI para cubrir un área de 22 mm x 22 mm, e incube durante 5 min en la oscuridad y a temperatura ambiente.
    2. Lave las células cargadas de MNP 3x en 1x PBS, 5 min cada lavado. Realizar imágenes confocales. Para DAPI, utilice una longitud de onda de excitación de 358 nm y una longitud de onda de emisión de 461 nm. Para los MNPs (rodamina), utilice una longitud de onda de excitación de 578 nm y una longitud de onda de emisión de 613 nm.

9. Mediciones y análisis estadísticos

  1. Análisis morfométrico de la diferenciación celular cargada de MNP
    1. Para medir el número de intersecciones a varias distancias del cuerpo celular, adquiera imágenes de fase de células cultivadas hasta 3 días después del tratamiento con NGF.
      NOTA: Si se hace más tarde, las células pueden desarrollar redes, lo que impide las mediciones de resolución unicelular.
      1. Abra las imágenes en el programa de procesamiento de imágenes, ImageJ, y utilice el plug-in NeuronJ, que permite un trazado de neurita semiautomático y medición de longitud36. Utilizando el plug-in de trazador de neurita, rastree las neuritas y convierta los datos en imágenes binarias. Defina el centro del soma.
      2. Realizar análisis Sholl, disponible en el plug-in NeuronJ. Defina el radio máximo. Repita el experimento tres veces. Analice más de 100 células en cada experimento.
  2. Análisis de localización celular
    1. Para determinar el porcentaje de células localizadas en el área magnética después de 3 días de incubación, adquiera imágenes microscópicas confocales de células con y sin absorción de MNP. Utilizar tinción DAPI (sección 8.2).
    2. Cuente manualmente las celdas encima o parcialmente encima del patrón (celdas táctiles) y las celdas que no lo están. Repita para tres experimentos. Analizar más de 400 células con MNP y sin captación.
    3. Calcule la proporción relativa de las células que están encima de los patrones magnéticos a partir del número total de células, con y sin MNPs. Además, calcule el porcentaje del área efectiva del patrón magnético agregando el diámetro del cuerpo de la celda al ancho del patrón para determinar la probabilidad aleatoria de que las células aterrice en un patrón magnético.
    4. Realice una prueba Zde una sola muestra para analizar si la distribución celular es el resultado del aterrizaje de células isotrópicas, o si hay un sesgo preferido al patrón magnético.
  3. Análisis de direccionalidad de crecimiento
    1. Para cuantificar el efecto sobre la direccionalidad de la consecuencia de la neurita, adquiera imágenes microscópicas confocales de las células con y sin el tratamiento de MNP después de 8 días de incubación. Realizar inmuno-tinción (sección 8.1).
    2. Usando el software ImageJ, mida el ángulo entre la neurita celular y las bandas magnéticas en ambas condiciones.
      NOTA: Analice sólo las neuritas que se originan en somas ubicados en las bandas magnéticas.
    3. Trazar la distribución de los ángulos de las neuritas en relación con la dirección de las rayas (Δθ). Realizar una prueba de Chi cuadrado de la distribución de Δθ para demostrar que la distribución no es normal o uniforme.

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Representative Results

Se fabricaron plataformas magnéticas con diferentes formas geométricas (Figura 1A). Los patrones magnéticos fueron depositados por sputtering: 14 multicapas de Co80Fe20 y Pd, 0,2 nm y 1 nm, respectivamente. La microscopía electrónica reveló que la altura total de los patrones magnéticos era de ~18 nm (Figura 1B). Esta única deposición multicapa fm crea una plataforma estable con anisotropía de magnetización perpendicular (PMA) en relación con el plano de sustrato que permite la atracción de las células cargadas de MNP hacia todo el patrón magnético y no sólo a los bordes22,37. Los parámetros de la estructura multicapa de FM se caracterizaron por mediciones de magneto-transporte para las que se fabricó un dispositivo en forma de cruz de multicapas de FM(Figura 1C insertada), y la magnetización perpendicular al sustrato se midió mediante el efecto hall anómalo (AHE)38,donde la resistencia AHE es proporcional a la magnetización perpendicular. La medición de AHE vs campo magnético mostró un bucle de histéresis indicativo de ferroimanes PMA (Figura 1C). La magnetización remanente de las multicapas FM (momento magnético en campo cero) fue idéntica a la saturación de magnetización (MS)en campos altos. Además, el campo coercitivo de las multicapas FM fue de ~500 Oe, alcanzando la saturación a 1.200 Oe, lo que permitió una fácil magnetización del dispositivo y aseguró la estabilidad contra la influencia de campos magnéticos no intencionales. El valor MS de las multicapas se midió utilizando un magnetómetro(Figura 1D),tal como se describe en el punto 3.1. El MS era 270 emu/cm3,que está a la par con medidas anteriores de estructuras similares.

Óxido de hierro fluorescente (γ-Fe2O3)Los MNPs fueron preparados según una publicación anterior39. Los MNPs fueron sintetizados por el nucleation, incluyendo la conjugación covalente de películas finas seis-layered del óxido de hierro al isotiocianato y a la capa de la rodamina con la albúmina de suero humana. El tamaño del diámetro seco de los MNPs era ~15 nanómetro con el potencial zeta de -45, según la medida de microscopio electrónico de transmisión. Las mediciones magnetométricas de los MNPs(Figura 2A)muestran que la curva de magnetización no tuvo histéresis, indicando el comportamiento superparamagnético de los MNPs, un campo de baja saturación de 500 Oe, y un MS relativamente alto de 22 emu/g. Para controlar la localización celular usando patrones magnéticos, las células PC12 fueron incubadas en el medio mezclado con el óxido de hierro MNPs fluorescente por 24 h, transformándolos en unidades magnéticas. La concentración de MNP en el medio puede ser variada; era 0,25 mg/mL en los experimentos de galjanoplastia. Se tomaron imágenes microscópicas confocales después de la tinción de DAPI(Figura 2B). Los MNPs fueron internalizados en el soma de las células PC12, pero no en los núcleos, que fue reflejado por la sombra oscura en el centro. Los resultados muestran que no había florescencia roja en los núcleos, lo que indica que los MNPs no fueron internalizados en los núcleos o se habían unido a la superficie externa de las células. Usando medidas del ICP, era posible cuantificar las cantidades de MNPs internalizadas en las células PC12. La concentración de hierro en el interior de las células aumentó con el aumento de la concentración de MNP en el medio(Figura 2C).

La viabilidad de las células MNP-cargadas PC12 para diversas concentraciones de MNPs fue evaluada usando análisis XTT- y resazurin-basados. La Figura 3A muestra las células PC12 después del tratamiento con MNP, creciendo y diferenciándose sobre un plato de plástico recubierto de colágeno. Para examinar el impacto de los MNPs internalizados en la diferenciación, se realizó la medición morfológica sholl. No se observó diferencia significativa en la morfología celular entre las células cargadas con MNP y las células control(t-test,p > 0,05, n = 3)(Figura 3B). La actividad metabólica de las células PC12 fue medida usando análisis XTT- y resazurin-basados después de la incubación de la célula con diversas concentraciones de MNP. Los resultados fueron normalizados a la medida del control de las células PC12 sin MNPs. Estas concentraciones de MNPs no mostraron citotoxicidad significativa hacia las células, evidente en la falta de diferencias significativas en la viabilidad celular para cualquiera de los preparados(t-test,p > 0,05, n= 3)(Figura 3C,D). Los efectos de los MNPs sobre el revestimiento y el desarrollo celular se determinaron mediante la comparación de células cargadas con MNP con células no cargadas, plateadas y cultivadas en sustratos magnéticos idénticos. Las células fueron sembradas y dejadas para adherirse al substrato. Cada 2 días, las células fueron tratadas con el medio fresco y NGF según lo descrito en la sección 7. La Figura 4 muestra las células PC12 con y sin tratamiento de MNP, creciendo y diferenciándose sobre un sustrato magnético con rayas de 20 μm de ancho y espaciamiento de 100 μm. Después de 3 días de crecimiento, las células immunostained, DAPI-manchadas, y las imágenes fueron tomadas.

Se encontró que las células magnetizadas se unían a los patrones magnéticos y crecían ramas de acuerdo con los patrones, mientras que las células sin tratamiento con MNP crecieron sin afinidad con los dispositivos magnéticos (Figura 4A,B). La Figura 4C presenta el posicionamiento de las células y la formación de redes sobre un sustrato con geometría hexagonal de una longitud lateral de 200 μm y un ancho de línea de 50 μm. Las células fueron imaged después de 6 días. Las células magnetizadas fueron situadas en el patrón magnético, con afinidad similar a los substratos rayados. El posicionamiento celular se cuantificó contando los cuerpos celulares ubicados en los patrones magnéticos o unidos a ellos. La proporción relativa de células se calculó a partir de la población total de células. Esto fue hecha para las células con y sin el tratamiento de MNP. El área efectiva de la respuesta magnética se calculó agregando el diámetro de las células (~ 10 μm para las células PC12) a ambos bordes del patrón magnético. Para los patrones de banda magnética, la relación de área magnética efectiva fue del 33%, lo que correspondió a la probabilidad de que las células aterrizara aleatoriamente en las bandas magnéticas. Los resultados mostraron que el 75% de los cuerpos celulares cargados con MNP estaban en contacto con las bandas magnéticas, mientras que sólo el 35% de las células no magnetizadas estaban ubicadas en las rayas (en concordancia estadística con una distribución imparcial) (Figura 4D). El análisis estadístico indicó que la medición no se derivó del aterrizaje arbitrario de células (prueba zde una muestra, p < 10-6,n = 430).

Por el contrario, el análisis estadístico de los hexágonos magnéticos reveló que el 92% del soma de las células cargadas con MNP estaban unidos a los patrones magnéticos, en comparación con el 38% para las células sin tratamiento con MNP(Figura 4E). El cociente eficaz del área de los hexágonos era el 32% del substrato. El análisis estadístico para los hexágonos también indicó que la medición no se derivó del aterrizaje arbitrario de la célula (prueba zde una muestra, p <10 -6,n = 370). Los resultados revelaron una clara preferencia de las células cargadas con MNP por el patrón magnético, mientras que las células sin MNPs se adhirieron aleatoriamente a todo el sustrato. Además del efecto de posicionamiento celular, se encontró que estas plataformas magnéticas también controlan la direccionalidad de las neuritas en crecimiento. La Figura 5A muestra células cargadas de MNP con neuritas, alineándose según la orientación de las rayas. En contraste, la medición de control de células sin MNPs mostró un crecimiento de neurita a través de la plataforma independientemente de los patrones magnéticos.

Para evaluar el efecto magnético sobre la direccionalidad del crecimiento neuronal, se midió el ángulo entre las neuritas y las bandas magnéticas. Los datos revelaron que el 80% de las neuritas de las células cargadas de MNP mostraron correlación con la orientación de las bandas magnéticas, dentro de Δθ < 15° en relación con la dirección de las rayas. Sin embargo, sólo el 32% de las neuritas de las células sin MNPs se desarrollaron en ese rango. Las células sin tratamiento con MNP no mostraron correlación con las bandas magnéticas y crecieron de acuerdo con una distribución uniforme del ángulo(Figura 5B). El análisis estadístico de la distribución de Δθ reveló que no era normal o uniforme (prueba de Chi-cuadrado, p < 0,001). El efecto de la geometría hexagonal sobre crecimiento del neurite fue demostrado también. La Figura 5C muestra imágenes de fluorescencia del desarrollo de redes neuronales de células PC12 magnetizadas y no magnetizadas sobre un patrón magnético de hexágonos y grandes círculos entre los bordes. La longitud lateral del hexágono era de 200 μm y la anchura de las líneas era de 10 μm; el diámetro del círculo era de 30 μm. Los somas de la célula demostraron la alta afinidad para los círculos y desarrollaron una red de los nervios bien orientada a lo largo de los contornos hexagonales. Una imagen de zoom muestra las células unidas a un círculo magnético y las neuritas que crecen a lo largo de esos contornos (Figura 5D).

Figure 1
Figura 1:Caracterización de los dispositivos magnéticos. (A) Imágenes microscópicas ópticas de dispositivos magnéticos con diversas formas geométricas. Barra de escala = 200 μm. (B) Imagen de microscopio electrónico de barrido de Co80Fe20/Pd multicapas y un esquema de las multicapas. La altura total de los patrones magnéticos es de 18 nm. Barra de escala = 100 nm. (C) Anómalo Efecto Hall medición del dispositivo magnético que muestra los campos magnéticos coercitivos y remanentes de la FM. Recuadro: imagen del dispositivo con electrodos marcados. (D)La magnetometría del dispositivo multicapa muestra el valor de saturación de magnetización calculado por volumen. Esta cifra ha sido modificada de Marcus et al.37. Abreviaturas: AHE = Efecto Hall anómalo; FM = ferromagnético; B = campo magnético. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2:Captación de células PC12 de MNPs. (A)Medición magnetométrica de MNPs a temperatura ambiente. (B)Imagen de microscopía confocal de la absorción de MNP por las células PC12. Núcleos teñidos con DAPI; Los MNPs etiquetados con rodamina entran en las células. Barra de escala = 10 μm(C)de medición ICP de los MNPs de óxido de hierro internalizados (pg) por células PC12 después de 24 h de incubación con varias concentraciones de MNP. Esta cifra ha sido modificada de Marcus et al.37. Abreviaturas: MNPs = nanopartículas magnéticas; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; ICP = plasma acoplado inductivamente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3:Viabilidad de células PC12 cargadas con MNP. (A)Imágenes microscópicas confocales de células PC12 diferenciadas incubadas con MNPs. Las flechas muestran neuritas diferenciadas con MNPs internalizados. Barras de escala = 50 nm. (B)Análisis sholl de la consecuencia de la neurita de las células PC12 después de 3 días de diferenciación. (C)Ensayo de viabilidad XTT de células PC12 tratadas con concentraciones crecientes de MNPs después de 24 h de incubación. Las mediciones se normalizan para controlar. (D)Ensayo de viabilidad a base de resazurínico de células PC12 tratadas con concentraciones crecientes de MNPs después de 24 h de incubación. Las mediciones se normalizan para controlar. No hay significación estadística en ambos análisis. Esta cifra ha sido modificada de Marcus et al.37. Abreviaturas: MNPs = nanopartículas magnéticas; XTT = 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilide. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4:Localización celular sobre dispositivos magnéticos. (A)Imágenes fluorescentes de células PC12 cargadas con MNPs que crecen en las bandas magnéticas: (i) etiquetado de α-tubulina, (ii) tinción dapi, y (iii) imagen fusionada. Barra de escala = 100 μm.(B)Imágenes fluorescentes de células PC12 sin tratamiento con MNP, creciendo sobre las bandas magnéticas como en (A). (C) Imágenes de fluorescencia de células PC12, con y sin MNPs, en el patrón magnético hexagonal. Barra de escala = 200 μm. (D) Porcentaje de cuerpos celulares, con y sin MNPs, ubicados en las bandas magnéticas. Las barras de error representan la desviación estándar. La línea punteada representa la probabilidad de que las células aterrice en las bandas magnéticas. (E) Porcentaje de cuerpos celulares, con y sin MNPs, ubicados en los hexágonos magnéticos. Las barras de error representan la desviación estándar. La línea punteada representa la probabilidad de que las células aterrice en los patrones magnéticos para una distribución aleatoria. No hay significación estadística en ambos análisis. Esta cifra ha sido modificada de Marcus et al.37. Abreviaturas: MNPs = nanopartículas magnéticas; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 5
Figura 5:Direccionalidad de la red neuronal. (A)Imágenes microscópicas confocales de células PC12 etiquetadas con α-tubulina con tratamiento con MNP (izquierda) y sin tratamiento con MNP (derecha), creciendo sobre bandas magnéticas. Las rayas están marcadas. (B)Los histogramas polares presentan el efecto de direccionalidad de la neurita sobre las células PC12 (izquierda) con tratamiento con MNP y (derecha) sin tratamiento con MNP. La desviación del ángulo de orientación se define como la diferencia en el ángulo entre las neuritas y la orientación de la banda magnética (bins de 15°). (C)Imágenes de fluorescencia de células PC12 cultivadas sobre un patrón hexagonal magnético, (izquierda) con tratamiento con MNP y (derecha) sin tratamiento con MNP. Barra de escala = 200 μm. (D) Imagen de zoom de una célula magnetizada que desarrolla neuritas de acuerdo con el patrón magnético. Barra de escala = 30 μm. Esta cifra ha sido modificada de Marcus et al.37. Abreviatura: MNPs = nanopartículas magnéticas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

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Discussion

Los resultados representativos demuestran la eficacia de la metodología presentada para controlar y organizar la formación de redes neuronales a escala de micras. Las células PC12 cargadas con MNP siguieron siendo viables y se transformaron en unidades sensibles magnéticas que fueron atraídas por las fuerzas magnéticas de los electrodos fm a sitios específicos. Esto se demuestra mejor en la Figura 5C,donde las celdas se adhirieron preferentemente a los vértices más grandes de los hexágonos y no a las líneas delgadas. Por otra parte, la ramificación de las células también se desarrolló favorablemente siguiendo los patrones magnéticos. Todos los experimentos de control demostraron inequívocamente que las fuerzas magnéticas dirigía la localización de los cuerpos celulares y las excrecencias. Aunque se demostró que las señales topográficas se pueden utilizar para dirigir la excrecencia de neurita40,41,este no es el caso aquí, ya que las células sin MNPs no mostraron respuesta a la forma del patrón.

Se empleó un enfoque de abajo hacia arriba para diseñar las fuerzas magnéticas locales, utilizando fotolitografía estándar y deposiciones de pulverización que están disponibles en muchas instalaciones de investigación, facilitando la adopción de estas técnicas por muchos investigadores. El enfoque ascendente permite la libertad en el diseño de patrones y formas complejas de acuerdo con las necesidades de los investigadores, con resolución a escala de micras para áreas de longitud centimétrica. Aunque los resultados se demostraron en portaobjetos de vidrio, en principio, es posible preparar los dispositivos sobre otros materiales biocompatibles que son adecuados para aplicaciones terapéuticas in vivo, como matrices de electrodos flexibles para el registro neuronal y la estimulación42,43.

Estas plataformas PMA únicas, logradas por deposición multicapa, producen un fuerte campo magnético a lo largo de todo el patrón magnético y no sólo en los bordes, como se observó anteriormente22. Además, los FMs fueron diseñados con una gran saturación de magnetización remanente, es decir, incluso cuando se elimina el campo magnético externo, los electrodos permanecen completamente magnetizados y siguen atrayendo las células sin la necesidad de un imán externo. Sin embargo, una fuerza magnética externa puede ayudar a magnetizar completamente los MNPs en las células, aumentando así la fuerza de atracción y eficiencia durante el revestimiento. Una consideración importante en el diseño de FM fue el número de repeticiones. Si bien más repetición aumentará el momento magnético total, lo cual es favorable, la adición de muchas capas también aumentará la mezcla de capas, causando pma menos estable y finalmente resultará en una magnetización en el plano44,45 ejes fáciles y atracción a diferentes bordes de los electrodos22,37. Por lo tanto, es necesario optimizar el número FM y la composición de las multicapas para garantizar una PMA estable con campos magnéticos máximos.

Los MNPs presentados en los resultados representativos casi no mostraron toxicidad hacia las células PC12 en las concentraciones probadas, ni afectaron el comportamiento celular, a pesar de poder entrar en las células y tener un momento magnético relativamente alto. La fuerza de atracción en una célula depende del número de MNPs en la célula y de la magnetización de cada MNP. Idealmente, ambos deben ser altos; sin embargo, puede haber un equilibrio entre los dos. Con algunos MNPs comerciales, la viabilidad celular era buena, pero el momento magnético era demasiado débil. Para otras partículas fabricadas en el laboratorio, el momento magnético era alto, pero los MNPs tendían a agregarse y la viabilidad celular era baja. Por lo tanto, es importante probar la viabilidad celular y caracterizar su magnetización al elegir MNPs. Los MNPs utilizados aquí también son fluorescentes, lo que facilita el seguimiento de su ubicación en las celdas. Los resultados muestran neuritas que se desarrollan de acuerdo con la forma del patrón magnético, y la fluorescencia indica la presencia de MNPs a lo largo de las neuritas.

El mecanismo de internalización de los MNPs en células ha sido previamente investigado46. La absorción celular de MNPs ocurre vía endocitosis según su tamaño, forma, y química superficial. Estudios previos examinaron la absorción de diferentes tipos de MNPs en las neuronas24; La absorción celular de MNPs revestido era mejor que la absorción celular de MNPs sin revestir. Como se muestra en la Figura 3A,B,los MNPs fueron internalizados en el citoplasma, pero permanecieron fuera de los núcleos y fueron transferidos a las neuritas durante su desarrollo. Además, los MNPs conjugados a NGF que activó el camino de la señalización de NGF también fueron internalizados en células vía la endocitosis47,48.

Para concluir, este papel presenta una caja de herramientas eficaz de la manipulación magnética para la investigación que requiere la organización biológica del elemento. El uso de fuerzas magnéticas permite el posicionamiento de las células, dirigiendo el crecimiento de la neurita. Este método permite el diseño de plataformas con formas geométricas complejas. Las fuerzas de atracción magnética se pueden diseñar para manipular la formación de la red neuronal de forma remota cambiando el paisaje de la fuerza magnética con el tiempo. Toda esta metodología se puede extender fácilmente para controlar otros factores o productos químicos que se pueden acoplar a los MNPs y llevarlos a puntos de interés prediseñados, todo con resolución a escala de micras.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel y por la Fundación Israelí para la Ciencia (569/16).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

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Bioingeniería Número 173 nanopartículas magnéticas anisotropía de magnetización perpendicular (PMA) administración de fármacos magnéticos dirigidos manipulación de células magnéticas cultivo neuronal ingeniería neuronal bio-interconexión fotolitografía multicapas magnéticas
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Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

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