Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Birbirine Bağlı Nöronların Mikron Ölçekli Organizasyonu için Manyetik Platformların İmalatı

Published: July 14, 2021 doi: 10.3791/62013
Automatic Translation
1,4, 2,4, 2,4, 1,4, 2,4, 2,4, 3,4, 2,4, 1,4
1Department of Physics, Bar-Ilan University, 2Faculty of Engineering, Bar-Ilan University, 3Department of chemistry, Bar-Ilan University, 4The Institutes of Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

Summary

Bu çalışma, nöronal organizasyonun kontrolü için yerel manyetik kuvvetlerin mühendisliğine aşağıdan yukarıya bir yaklaşım sunun. Manyetik nanopartiküllerle (MNP) yüklenen nöron benzeri hücreler, dik manyetizasyonlu mikro desenli bir platform tarafından kaplanır ve kontrol edilir. Ayrıca manyetik karakterizasyon, MNP hücresel alım, hücre canlılığı ve istatistiksel analiz açıklanmaktadır.

Abstract

Nöronları organize sinir ağlarına yönlendirme yeteneğinin rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve biyo-interfacing için büyük etkileri vardır. Birçok çalışma, nöronları kimyasal ve topoğrafik ipuçları kullanarak yönlendirmeyi amaçladı. Bununla birlikte, geniş alanlar üzerinde mikron ölçeğinde örgütsel kontrol raporları azdır. Burada, nöronların önceden ayarlanmış bölgelere yerleştirilmesi ve mikro desenli, manyetik elementlerle gömülü manyetik platformlar kullanılarak mikron ölçeğinde çözünürlükle nöronal büyümenin yönlendirilmesinde etkili bir yöntem tanımlanmıştır. Nöronların manyetik nanopartiküllerle (MNPs) yüklenmesinin onları manyetik gradyanlardan etkilenebilecek hassas manyetik birimlere dönüştürdüğü gösterilmiştir. Bu yaklaşımın ardından, yaygın bir nöron benzeri model olan PC12 hücrelerinin kaplandığı ve süperparmagnetik nanopartiküllerle yüklendiği benzersiz bir manyetik platform üretilmiştir. Manyetik desenlere doğru etkili çekim kuvvetleri sağlamak için stabil dik manyetizasyona sahip ferromanyetik (FM) çok katmanlı ince filmler birikti. Manyetik platformların üzerine kaplanmış ve farklılaştırılmış bu MNP yüklü PC12 hücreleri tercihen manyetik desenlere tutturuldu ve neurit büyüme desen şekliyle iyi hizalandı ve yönlendirilmiş ağlar oluşturdu. Manyetik özelliklerin nicel karakterizasyon yöntemleri, hücresel MNP alımı, hücre canlılığı ve sonuçların istatistiksel analizi sunulmaktadır. Bu yaklaşım, sinir ağı oluşumunun kontrolünü sağlar ve ağların in vitro çalışmaları için etkili bir araç olabilen ve yeni terapötik biyointerör yönleri sunabilen manyetik kuvvetlerin manipülasyonu yoluyla nöron-elektrot arayüzünü geliştirir.

Introduction

Nöronların mikropatternasyonu doku yenilenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir1,2,3,4,5 ve nöro-elektronik cihazların geliştirilmesi6,7,8. Bununla birlikte, nöronların biyolojik dokularda olduğu gibi yüksek uzamsal çözünürlükte mikron ölçekli konumlandırılması önemli bir zorluk teşkil eder. Bu ölçekte önceden tasarlanmış yapıların oluşturulması, soma hareketliliğini ve aksonal büyümeyi lokal olarak kontrol ederek sinir hücresi süreçlerinin yönlendirilmesini gerektirir. Önceki çalışmalar, nöronal büyümeyi yönlendirmek için kimyasal ve fiziksel ipuçları9,10,11,12'nin kullanılmasını önermiştir. Burada, yeni bir yaklaşım,13 , 14 , 15,16,17manyetik alangradyanlarıtarafından hücre konumlandırmasını kontrol etmeye odaklanır, MNP'lerle yüklü hücreleri uzaktan manipüle edilebilen manyetik duyarlı birimlere dönüştürür.

Manyetik çip ve MNP yüklü hücreler kullanarak hücresel yanıtları teşvik etmek için gereken kuvveti karakterize eden Kunze ve ark., erken aksonal uzamanın hücrelerin içindeki mekanik gerilim tarafından tetiklenebileceğini kanıtladı18. Tay ve ark. gelişmiş manyetik alan gradyanları ile mikro fabrikasyon substratların, kalsiyum gösterge boyaları19kullanılarak MNP'lerle yapılan sinir devrelerinin kablosuz uyarılmasına izin verdiğini doğruladı. Dahası, Tseng ve ark. hücrelerin içindeki nanopartikülleri birleştirdi, bu da hücresel gerilime yaklaşan lokalize nanopartikül aracılı kuvvetlerle sonuçlandı20. Bu, mekanik kuvvetlere hücresel tepkinin incelenmesine yardımcı olan tanımlanmış mikromanyetik substrat desenlerinin imalat edilmesine yol açtı. Lokalize nanopartikül aracılı kuvvetlerin uygulanmasından kaynaklanan hücresel gerilim, nanopartiküllerin hücreler içinde birleştirilmesiyle elde edilmiştir20. Manyetik boncuklarla etiketlenmiş tek tek hücrelerin hareketini kontrol etmek için CMOS çipine bir dizi mikro elektromıknatıs gömen Lee ve ark. tarafından tamamlayıcı bir metal oksit yarı iletken (CMOS)-mikroakışkan hibrid sistem geliştirilmiştir21.

Alon ve ark. hücreleri bulmak için manyetik "sıcak noktalar" olarak mikro ölçekli, önceden programlanmış, manyetik pedler kullandı22. Belirli hücre altı konumlarda nanopartikülleri lokalize etmek için mikro desenli manyetik diziler kullanılarak hücrelerde belirli aktivite uyarılabilir23. Hücresel MNP alımı sülük, sıçan ve fare birincil nöronlarında başarıyla gösterilmiştir24,25,26. Burada, bu daha önce MNPs27'ninyüksek alımını gösterdiği bildirilen bir sıçan PC12 feokromositoma hücre hattında gösterilmiştir. Son yıllarda, kanser tedavilerinde ilaç dağıtımı ve termoterapi de dahil olmak üzere MNP'lerin çeşitli tıbbi uygulamaları olmuştur28,29,30,31. Özellikle, çalışmalar MNP'lerin ve nöron ağlarının uygulanmasıyla ilgilenir32,33,34,35. Bununla birlikte, MNP'leri tek hücreli düzeyde kullanan nöronların manyetik organizasyonu daha fazla araştırmayı hak ediyor.

Bu çalışmada, nöronal düzenlemeyi kontrol etmek için önceden tasarlanmış platformlar aracılığıyla yerel manyetik kuvvetleri tasarlamak için aşağıdan yukarıya bir yaklaşım tanımlanmıştır. FM çok katmanlı mikron ölçekli desenlerin imalatı sunulmuştur. Bu benzersiz, FM çok katmanlı yapı, tüm manyetik desenlere doğru etkili çekim kuvvetleri sağlayan kararlı dik manyetizasyon oluşturur. İnkübasyon yoluyla, MNP'ler PC12 hücrelerine yüklenerek manyetik hassas birimlere dönüştürüldü. Manyetik platformların üzerinde kaplanmış ve farklılaştırılmış MNP yüklü hücreler tercihen manyetik desenlere tutturuldu ve neurit büyüme desen şekliyle iyi hizalandı ve yönlendirilmiş ağlar oluşturdu. FM çok katmanlı ve MNP'lerin manyetik özelliklerini karakterize etmek için çeşitli yöntemler tanımlanmıştır ve hücresel MNP alımı ve hücre canlılığı tahlilleri için teknikler de sunulmuştur. Ayrıca nöronal büyümenin morfometrik parametreleri ve sonuçların istatistiksel analizi ayrıntılı olarak yer sunulur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Tüm biyolojik reaksiyonları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.

1. Manyetik platform imalatı

  1. taş baskı
    1. Cam slaytları bir katip kalemi kullanarak 2 x 2 cm2'ye kesin. Cam slaytları asetonda temizleyin ve ardından ultra sonikasyon banyosunda her biri 5 dakika boyunca izopropanol. Ultra yüksek saflıkta (UHP) azot ile kurutun.
    2. Camı 1,5 μm kalınlık elde etmek için 60 s için 6.000 rpm'de spin-kaplama kullanarak fotoresistle kaplayın ve 60 s için 100 °C'de pişirin. Fotoresist için uygun bir dalga boyu kullanarak, istenen bir desenle, foto maskesiz veya maskesiz litografi kullanarak örneği bir ışık kaynağına maruz bırakmayın.
    3. Üreticinin talimatlarına göre damıtılmış suda (DW) seyreltilmiş bir geliştiricide 40 s için geliştirin; DW'de 45 sn yıkayın ve UHP azot gazı ile kurutun. Deseni optik mikroskop altında inceleyin.
  2. Sputter biriktirme
    1. Numuneyi biriktirme sisteminin ana odasına yerleştirin ve baz basıncını bekleyin (~5 × 10-8 Torr). Gaz akışını açın; standart püskürtme için argon akışını ayarlayın (28 sccm [standart kübik cm/ dakika başına) burada. Sputter hedeflerini ateşle, sonra sputter basıncını 3 mTorr'a ayarlayın.
    2. İstenilen oran elde edilene kadar her hedefteki gücü artırın.
      NOT: Pd Oranı: 0,62 A/s = 16 sn'de 1,0 nm; Co80Fe20 Oran: 0.32 A/sn, 0.2 nm içinde 6.25 s.
    3. Dönüşü açın. Sırasıyla hedef panjurları açıp kapatarak Co80Fe20 ve Pd hedefleri arasında değişen FM çok katmanlısını yatırın. Co80 Fe 20 (0.2nm)/Pd (1.0 nm) 14 bilayer yatırın ve ek bir 2 nm Pd kapak katmanı ile bitirin.
    4. Kaldırma: Numuneyi asetonda 30 dakika bekletin ve izopropanol ile durulayın. Daha sonra UHP azot ile kurutun ve numuneyi kullanıma kadar temiz ve kuru bir ortamda saklayın.

2. Manyetik cihazın taşıma ölçümleri ile karakterizasyonu

  1. FM çok katmanlı ile birleştirilmiş 100 μm genişliğinde çapraz şekilli manyetik çubuklu bir Si substratı veya cam slayt kullanın (bkz. Şekil 1C içe). Örneği çift taraflı bant kullanarak tutucuya takın.
  2. Bir tel yapıştırıcı kullanarak, çapraz elektrodun her bacağında bir tane olmak üzere numuneye 4 tel bağlayın. Numune tutucuyu ve numuneyi manyetik alanla taşıma ölçüm sisteminin içine yerleştirin, böylece manyetik alan örneğe dik olacak şekilde ayarlayın. Oda sıcaklığında ölçümler gerçekleştirin.
  3. Cihazın enine voltaj (VT)ölçümünü yapın; Şekil 1C'deki (inset) işaretleri takip edin: kontak 1 ve 3 arasında 1 mA'lık bir akım uygulayın; VT'yi 2 ve 4 arasındaki kişiler arasında ölçmek; ardından, 2 ile 4 arasında bir akım uygulayın ve voltajı 1 ile 3 arasında ölçün. Son olarak, her iki ölçümün voltajları arasındaki farkı hesaplayın ve VTelde etmek için 2'ye bölün. İki ölçüm konfigürasyonu arasında otomatik olarak geçiş yapmak için bir anahtarlama sistemi kullanın.
  4. Manyetik alanı 5 mT'lik adımlarla 0,4 T ile -0,4 T arasında süpürün ve alanın bir işlevi olarak VT'yi ölçün. Filmdeki dik manyetizasyonla orantılı anormal Hall sinyalini belirlemek için enine direnci (VT/ I) ve manyetik alanı çizin.

3. MNP'lerin ve manyetik çok katmanlıların manyetometri ölçümleri ile karakterizasyonu

  1. FM çok katmanlılar için manyetometrik ölçüm
    1. FM çok katmanlıyı Si alt tabakasına yatırın (bkz. bölüm 1.2). Numuneyi 4 x 4 mm2 boyutunda 6 kare halinde kesin. Örnekleri üst üste yığın ve manyetik alanın yönüne dik kapsülde düzenleyin (bkz. Şekil 1D iç).
    2. Kapsülü manyetometreye yerleştirin ve oda sıcaklığında manyetizasyonu ölçün. Manyetik alanı -0,4 T ile 0,4 T arasında süpürün.
    3. Manyetik katmanın kalınlığını, örneklerin boyutunu ve substrat sayısını göz önünde bulundurarak manyetik malzemenin toplam hacmini hesaplayın. Manyetizasyonu manyetik malzemenin toplam hacmine bölün.
    4. Manyetik alana karşı manyetizasyonu (birim hacim başına) çizin. Substratın diamanyetik arka planını yüksek manyetik alan tepkisinden çıkarın ve FM'in doygunluk mıknatıslanmasını grafikten tahmin edin.
  2. MNP'ler için manyetometrik ölçüm
    1. Sentetik bir polimer kapsülün içine belirlenmiş bir MNP kütlesi yerleştirin. Küçük manyetizasyon doygunluk değerlerini ölçüyorsanız daha büyük bir hacim düşünün.
    2. MNP'ler bir çözücüde askıya alınırsa, kapsülü gece boyunca açık bırakarak MNP'leri kurutun. Kapsülü manyetometreye yerleştirin ve oda sıcaklığında manyetizasyonu ölçün. Manyetik alanı -0.2 T ile 0.2 T arasında süpürün.
    3. Belirlenen hacmi parçacık konsantrasyonu ile çarparak MNP'lerin toplam kütlesini hesaplayın. Sonuçları 1 g'a normalleştirin.
    4. Normalleştirilmiş manyetizasyonu (gram başına) ve manyetik alanı çizin. MNP'lerin manyetizasyon doygunluğunu grafikten tahmin edin.

4. Kollajen kaplama protokolü

  1. Kaplama plastik tabaklar
    1. 500 mL otomatik kapatılmış çift damıtılmış suya (DDW) 490 μL HCl ekleyerek 0,01 M HCl hazırlayın.
      NOT: Bu adımı yalnızca kimyasal başlıkta gerçekleştirin.
    2. 50 μg / mL'lik son çalışma konsantrasyonu elde etmek için kollajen tip 1'i (sıçan kuyruğundan çözelti) 0,01 M HCl'de 1:60-1:80 seyreltin. Seyreltilmiş çözeltinin 1,5 mL'lik kısmını 35 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin. Tabağı kaputta 1 saat kapalı bırakın.
    3. Çözeltiyi çıkarın ve steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3x yıkayın. Yemek hücre tohumlama için hazırdır.
  2. Kaplama camı slaytları
    1. Seyreltik kollajen tip 1 (sıçan kuyruğundan çözelti) 1:50 içinde 30% v / v etanol. 35 mm'lik bir kabı kaplamak için, %30 etanolden 1 mL'ye 20 μL kolajen ekleyin.
    2. Yemeği çözelti ile örtün ve tüm çözelti buharlaşana kadar bekleyin ve yemeği birkaç saat açıkta bırakın. Steril 1x PBS'de 3x yıkayın; cam slayt hücre tohumlama için hazırdır.

5. Hücresel MNP alımı ve uygulanabilirliği

  1. Hücresel MNP alımı
    1. Roswell Park Tıp Enstitüsü (RPMI) ortamına %10 at serumu (HS), %5 fetal sığır serumu (FBS), %1 L-glutamin, %1 penisilin/streptomisin ve %0,2 amfoterisilin ekleyerek PC12 hücre kültürü için temel büyüme ortamını hazırlayın ve 0,22 μm naylon filtre kullanarak filtreleyin.
    2. PC12 farklılaşma ortamını hazırlamak için RPMI ortamına %1 at serumu (HS), %1 L-glutamin, %1 penisilin/streptomisiin ve %0,2 amfoterisilin ekleyin ve 0,22 μm naylon filtre kullanarak filtreleyin.
    3. 10 mL temel büyüme ortamı ile tedavi edilmemiş bir kültür şişesinde hücreleri büyütün; her 2-3 günde bir şişeye 10 mL temel büyüme ortamı ekleyin ve 8 gün sonra hücreleri alt kültüre edin.
    4. Hücresel alım için, hücre süspansiyonu bir santrifüj tüpünde 200 × g ve oda sıcaklığında 8 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın.
    5. Hücreleri 3 mL taze temel büyüme ortamında yeniden biriktirin. Yine, hücre süspansiyonu 200 × g ve oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın. Hücreleri 3 mL taze farklılaşma ortamında yeniden biriktirin.
    6. Hücre kümelerini parçalamak için bir şırınga ve bir iğne kullanarak hücreleri 10x epire edin. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve normal kaplamasız 35 mm'lik bir tabakta 106 hücreyi tohumlayın.
    7. İstenilen MNP konsantrasyonunu ve toplam hacmi elde etmek için ölçülen MNP süspansiyon hacmini ve farklılaşma ortamının hacmini yemeğe ekleyin. Hücreleri, MNP'leri ve farklılaşma ortamını karıştırın; kabı 24 saat boyunca 37 °C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde kuluçkalayın.
    8. Hücre süspansiyonu oda sıcaklığında 200 × g'da 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın. Hücreleri 1 mL taze farklılaşma ortamında yeniden biriktirin ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
  2. MNP yüklü hücre farklılaşması
    1. Alım iletişim kuralını gerçekleştirin (bölüm 5.1). Tohum 8 × 35 mm üzerinde10 4 MNP yüklü hücre, farklılaşma ortamı varlığında kollajen tipi l kaplı tabak (bkz. bölüm 4.1'deki kollajen kaplama protokolü). 24 saat sonra, 1:100 taze murine beta-sinir büyüme faktörü (β-NGF) ekleyin (son konsantrasyon 50 ng/mL).
    2. Farklılaşma ortamını yenileyin ve her 2 günde bir taze murine β-NGF ekleyin. Optik mikroskopi kullanarak hücreleri her 2 günde bir görüntüleyin. Ağ oluşumundan sonra (PC12 hücreleri için 6-8 gün), konfokal mikroskopi kullanarak hücreleri görüntüleyin ve parçacıkların floresanını gözlemleyin.
  3. MNP yüklü hücreler için canlılık testi: 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-süloffenil)-2H-tetrazolium-5-karboksinalid (XTT) hücre canlılık testi.
    1. Temel büyüme ortamını adım 5.1.1'e göre hazırlayın. PC12 hücrelerini farklı konsantrasyonlarda (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL ve temel büyüme ortamında 0,5 mg/mL) ve ayrıca düz 96 kuyulu bir plakada (toplam hacim 100 μL/kuyu) üç taraflı kontrol için MNP'ler olmadan geliştirin. Hücreleri % 5 CO 2'de 24 saat kuluçkaya yatırın,37°C'de nemlendirilmiş inkübatör.
    2. Arka plan düzeltmesi için hücresiz ortam içeren boş kuyular hazırlayın. XTT reaktif çözeltisini ve N-metil dibenzopyrazine metil sülfat içeren reaksiyon çözeltisini) kullanımdan hemen önce 37 °C'lik bir banyoda çözün. Net çözeltiler elde edilene kadar hafifçe döndürün.
    3. Bir adet 96 kuyu plakası için, 0,1 mL aktivasyon çözeltisini 5 mL XTT reaktif ile karıştırın. Her kuyuya 50 μL reaksiyon çözeltisi ekleyin, kuyularda boyanın eşit bir dağılımı için plakayı hafifçe sallayın ve ardından plakayı 5 saat boyunca bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
    4. 450 nm dalga boyunda enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) okuyucu kullanarak numunenin boş kuyulara karşı emilimini ölçün. Referans absorbansını 630 nm dalga boyu kullanarak ölçün ve 450 nm ölçümden çıkarın.
    5. 450 nm'de XTT reaktifi ile inkübe edilen kültür ortamında hafif spontan absorbans meydana geldiğinden, boş kuyuların ortalama emiciliğini diğer kuyulardan çıkarın. Hücre örnekleriyle aynı test edilmiş konsantrasyonlarda paralel MNP örneklerinden sinyal değerlerini çıkarın.
  4. MNP yüklü hücreler için canlılık testi: resazurin bazlı hücre canlılık testi
    1. 5.1.1 adımına göre temel büyüme ortamını hazırlayın. PC12 hücrelerini farklı konsantrasyonlarda (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL ve temel büyüme ortamında 0,5 mg/mL) ve 24 saat boyunca düz 96 kuyulu bir plakada üç taraflı kontrol olarak MNP'ler olmadan geliştirin. Hücreleri 37 °C'de %5 CO 2 inkübatörde24 saat kuluçkaya yatırın. Hücresiz ortam içeren boş kuyular hazırlayın.
    2. Hücreleri 1x PBS ile yıkayın. Resazurin bazlı reaktifi (%10 w/v) ortama ekleyin ve 37 °C'lik bir inkübatörde 2 saat kuluçkaya yatırın.
    3. Örneklerin 150 μL aliquot'larını ELISA okuyucuya yerleştirin ve absorbansı 560 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyunda ve 590 nm emisyon dalga boyunda ölçün. Hücre örnekleriyle aynı test edilmiş konsantrasyonlarda MNP'lerin paralel örneklerinden sinyal değerlerini çıkarın.

6. Endüktif olarak bağlı plazma (ICP) kullanılarak hücrelerin içindeki MNP konsantrasyonunun karakterizasyonu

  1. 5.1.1 adımına göre temel büyüme ortamını hazırlayın. PC12 hücrelerini farklı konsantrasyonlarda (0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL ve temel büyüme ortamında 0,5 mg/mL) ve MNP'ler olmadan düz 96 kuyulu bir plakada (toplam hacim 100 μL/kuyu) üç taraflı olarak geliştirin. %5 CO2,37°C'de nemlendirilmiş inkübatörde 24 saat kuluçkaya yatırın.
  2. Süspansiyonu bir santrifüj tüpüne (her kuyudan ayrı ayrı), oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj hücrelerine aktarın ve üstnatantı atın. Hücreleri 1 mL taze farklılaşma ortamında yeniden biriktirin ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
  3. Hücreleri en az 15 dakika boyunca her kuyuya ayrı ayrı 100 μL% 70 nitrik asit ile tedavi ederek lyse. Lislenmiş hücrelere 5 mL DDW ekleyin ve çözeltileri filtreleyin.
  4. ICP kullanarak demir konsantrasyonu ölçün ve hücre başına Fe konsantrasyonu kaydetmek için hücre sayısını kullanın.

7. Manyetik platformda hücre farklılaşması ve büyümesi

  1. Desenli substratı % 70 v/v/ etanol ile temizleyin ve alt tabakayı kaputtaki 35 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin. Desenli substratın altına 1 dakika boyunca büyük bir mıknatıs (~1500 Oe) yerleştirin ve önce kabı mıknatıstan yukarı ve uzağa hareket ettirerek mıknatısı çıkarın ve ardından mıknatısı kaputtan çıkarın. Ultraviyole ışığını 15 dakika açın.
  2. Alt tabakayı bölüm 4.2'ye göre kollajen tip 1 ile kapla. Hücresel MNP alımından sonra hücreleri askıya alın (bölüm 5.1), tohum 105 hücreleri 35 mm'lik bir kültür kabında ve 2 mL farklılaşma ortamı ekleyin. Kültürü% 5 CO2, 37° C'de nemlendirilmiş inkübatörde kuluçkaya yatırın.
  3. 24 saat sonra, 1:100 taze murine β-NGF ekleyin (50 ng /mL'lik son konsantrasyon). Farklılaşma ortamını yenileyin ve her 2 günde bir taze murine β-NGF ekleyin. Hücreleri ışık mikroskopisi kullanarak her 2 günde bir görüntüleyin ve ağ oluşumundan sonra hücreler üzerinde immünostainleme gerçekleştirin (bölüm 8.1).

8. MNP yüklü hücre boyama

  1. Tubulin immünostaining
    1. %16 w/v PFA çözeltisinin 10 mL'sini, 4 mL'sini 10x PBS'nin ve 26 mL'lik DDW'yi karıştırarak %4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın. 50 mL 1x PBS'ye 500 μL iyonik olmayan yüzey aktif madde ekleyerek % 1 PBT'nin 50 mL'sini hazırlayın. %1 PBT'nin 25 mL'sini 25 mL ile 1x PBS'nin 25 mL'sini karıştırarak %0,5 PBT'nin 50 mL'sini hazırlayın. %0,25 PBT'de %1 sığır serumu albümin ve %1 normal eşek serumu karıştırarak blokaj çözeltisi hazırlayın.
      NOT: PFA'yı yalnızca kimyasal kaputun içinde kullanın.
    2. Üstteki ortamı hücrelerden çıkarın. MNP yüklü hücreleri kimyasal bir kaputun içindeki oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 PFA'da sabitlayın. MNP yüklü hücreleri 1x PBS'de 3x, her yıkamada 5 dakika kimyasal bir kaputun içinde yıkayın.
    3. MNP yüklü hücreleri 10 dakika boyunca %0,5 PBT ile permeabilize edin. MNP yüklü hücreleri önce oda sıcaklığında 45 dakika boyunca bloke çözeltisinde kuluçkaya yatırın ve daha sonra 4 °C'de bir gecede tıkama çözeltisinde tavşan anti-α-tübulin antikor ile kuluçkaya yatırın. MNP yüklü hücreleri 1x PBS'de 3x, her yıkamada 5 dakika yıkayın.
    4. MNP yüklü hücreleri Cy2 konjuge eşek anti-tavşan ikincil antikor ile karanlıkta ve oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya yatırın. MNP yüklü hücreleri 1x PBS'de 3x, her yıkamada 5 dakika yıkayın.
    5. Konfokal görüntüleme gerçekleştirin. Tubulin için 492 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyu ve 510 nm emisyon dalga boyu kullanın. MNP'ler (rhodamin) için 578 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyu ve 613 nm emisyon dalga boyu kullanın.
  2. 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) ile nükleer boyama
    1. MNP yüklü hücreleri 1x PBS'de 3x, her yıkamada 5 dakika yıkayın. Numunenin etrafındaki fazla sıvıyı çıkarın, 22 mm x 22 mm'lik bir alanı kaplayacak şekilde DAPI içeren 1 damla (~50 μL) montaj ortamı ekleyin ve karanlıkta ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    2. MNP yüklü hücreleri 1x PBS'de 3x, her yıkamada 5 dakika yıkayın. Konfokal görüntüleme gerçekleştirin. DAPI için 358 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyu ve 461 nm emisyon dalga boyu kullanın. MNP'ler (rhodamin) için 578 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyu ve 613 nm emisyon dalga boyu kullanın.

9. Ölçümler ve istatistiksel analizler

  1. MNP yüklü hücre farklılaşması için morfometrik analiz
    1. Hücre gövdesinden çeşitli mesafelerdeki kesişim sayısını ölçmek için, NGF ile tedaviden 3 gün sonrasına kadar kültürlü hücrelerin faz görüntülerini elde edin.
      NOT: Daha sonra yapılırsa, hücreler tek hücreli çözünürlük ölçümlerini önleyerek ağlar geliştirebilir.
      1. Görüntüleri imageJ görüntü işleme programında açın ve yarı otomatik neurite izleme ve uzunluk ölçümü sağlayan NeuronJ eklentisini kullanın36. Neurite tracer eklentisini kullanarak, neurites'i takip edin ve verileri ikili görüntülere dönüştürün. Soma'nın merkezini tanımlayın.
      2. NeuronJ eklentisinde bulunan Sholl analizini gerçekleştirin. Maksimum yarıçapı tanımlayın. Deneyi üç kez tekrarlayın. Her deneyde 100'den fazla hücreyi analiz edin.
  2. Hücre yerelleştirme çözümlemesi
    1. 3 günlük inkübasyondan sonra manyetik alanda lokalize olan hücrelerin yüzdesini belirlemek için, MNP alımı olan ve olmayan hücrelerin konfokal mikroskobik görüntülerini elde edin. DAPI boyama kullanın (bölüm 8.2).
    2. Desenin üstündeki veya kısmen üstündeki hücreleri (hücrelere dokunarak) ve olmayan hücreleri el ile sayın. Üç deney için tekrarlayın. MNP ile ve alım yapmadan 400'den fazla hücreyi analiz edin.
    3. MNP'li ve MNP'siz toplam hücre sayısı dışında manyetik desenlerin üzerinde olan hücrelerin göreli oranını hesaplayın. Ayrıca, hücrelerin manyetik bir desene inme olasılığını belirlemek için hücre gövdesi çapını desen genişliğine ekleyerek manyetik desenin etkili alanının yüzdesini hesaplayın.
    4. Hücre dağılımının izotropik hücre inişinin bir sonucu olup olmadığını veya manyetik desene tercih edilen bir önyargı olup olmadığını analiz etmek için tek bir örnek Ztesti gerçekleştirin.
  3. Büyüme yönlülük analizi
    1. Neurit büyüme yönlülüğü üzerindeki etkiyi ölçmek için, 8 günlük inkübasyondan sonra MNP tedavisi olan ve olmayan hücrelerin konfokal mikroskobik görüntülerini elde edin. İmmün boyama gerçekleştirin (bölüm 8.1).
    2. ImageJ yazılımını kullanarak, her iki durumda da hücre neuriti ile manyetik şeritler arasındaki açıyı ölçün.
      NOT: Yalnızca manyetik çizgilerde bulunan somalardan kaynaklanan nötralleri analiz edin.
    3. Neurites'in açılarının çizgilerin yönüne (Δφ) göre dağılımını çizin. Dağılımın normal veya tekdüze olmadığını göstermek için Δφ dağılımının Kikare testi gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Farklı geometrik şekillere sahip manyetik platformlar imal edilmiştir (Şekil 1A). Manyetik desenler sputtering ile birikti: Sırasıyla 14 co80Fe20 ve Pd, 0.2 nm ve 1 nm çok katmanlı. Elektron mikroskopisi manyetik desenlerin toplam yüksekliğini ~18 nm(Şekil 1B)olarak ortaya koydu. Bu benzersiz FM çok katmanlı biriktirme, MNP yüklü hücrelerin sadecekenarlaradeğil,tüm manyetik desene doğru çekimini sağlayan substrat düzlemine göre dik manyetizasyon anizotropisi (PMA) ile kararlı bir platformoluşturur. FM çok katmanlı yapının parametreleri, FM çok katmanlı çapraz şekilli bir cihazın imal edildiği manyeto-taşıma ölçümleri ile karakterize edildi (Şekil 1C inset) ve alt tabakaya dik manyetizasyon, AHE direncinin dik manyetizasyon ile orantılı olduğu anomalili salon etkisi (AHE)38ile ölçüldü. AHE vs manyetik alan ölçümü PMA ferrognets göstergesi histegenez döngüsü gösterdi (Şekil 1C). FM çok katmanlılarının kalıntı manyetizasyonu (sıfır alanda manyetik moment) yüksek alanlardaki manyetizasyon doygunluğu (MS)ile aynıydı. Buna ek olarak, FM çok katmanlıların zorlayıcı alanı ~ 500 Oe idi ve 1.200 Oe'de doygunluğa ulaştı, bu da cihazın kolay mıknatıslanmasını sağladı ve kasıtsız manyetik alanların etkisine karşı stabilite sağladı. Çok katmanlıların MS değeri, bölüm3.1'deaçıklandığı gibi bir manyetometre ( Şekil 1D ) kullanılarak ölçüldü. MS 270 emu/cm3idi , bu da benzer yapıların önceki ölçümleriyle eşittir.

Floresan demir oksit (γ-Fe2O3) MNPs önceki bir yayına göre hazırlanmıştır39. MNP'ler, altı katmanlı ince demir oksit filmlerinin rhodamin izotiyosiyanat ve insan serum albümin ile kaplanması da dahil olmak üzere çekirdeklenme ile sentezlendi. İletim elektron mikroskobik ölçümüne göre, MNP'lerin kuru çap büyüklüğü -45 zeta potansiyeli ile ~15 nm idi. MNP'lerin manyetometrik ölçümleri (Şekil 2A) manyetizasyon eğrisinin histezimsiz olmadığını, MNP'lerin süperparamagnetik davranışını, 500 Oe'lik düşük doygunluk alanını ve 22 emu /g'lik nispeten yüksek M S'yi göstermektedir. Manyetik desenler kullanarak hücre lokalizasyonunu kontrol etmek için, PC12 hücreleri 24 saat boyunca demir oksit floresan MNP'lerle karıştırılarak orta derecede inkübe edildi ve manyetik birimlere dönüştürüldü. Ortamdaki MNP konsantrasyonu değiştirilebilir; kaplama deneylerinde 0.25 mg/mL idi. Dapi boyama sonrası konfokal mikroskobik görüntüler alınmıştır(Şekil 2B). MNP'ler PC12 hücrelerinin soma'sına içselleştirildi, ancak merkezdeki karanlık gölge tarafından yansıtılan çekirdeklere değil. Sonuçlar çekirdekte kırmızı florescence olmadığını göstermektedir, bu da MNP'lerin çekirdeğe içselleştirilmediğini veya hücrelerin dış yüzeyine bağlanmadığını gösterir. ICP ölçümlerini kullanarak, PC12 hücrelerine içselleştirilmiş MNP miktarlarını ölçmek mümkündü. Ortadaki MNP konsantrasyonundaki artışla hücrelerin içindeki demir konsantrasyonu artmıştır (Şekil 2C).

MNP yüklü PC12 hücrelerinin farklı konsantrasyonlarda MNP'ler için uygulanabilirliği XTT ve resazurin bazlı tahliller kullanılarak değerlendirildi. Şekil 3A, MNP tedavisinden sonra PC12 hücrelerini gösterir, kollajen kaplı plastik bir kabın üzerinde büyür ve farklılaşmaz. İçselleştirilmiş MNP'lerin farklılaşma üzerindeki etkisini incelemek için Sholl morfolojik ölçümü yapıldı. MNP yüklü hücreler ile kontrol hücreleri(t-test, p > 0.05, n = 3)(Şekil 3B)arasında hücre morfolojisinde anlamlı bir fark gözlenmedi. PC12 hücrelerinin metabolik aktivitesi, farklı MNP konsantrasyonlarına sahip hücre inkübasyonundan sonra XTT ve resazurin bazlı tahliller kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar, MNP'siz PC12 hücrelerinin kontrol ölçümünde normalleştirildi. Bu MNP konsantrasyonları hücrelere karşı önemli bir sitotoksiklik göstermedi, herhangi bir preparat için hücre canlılığında önemli farklılıklar olmadığı açıkça görülüyordu(t-test, p > 0.05, n = 3) (Şekil 3C,D). MNP'lerin hücre kaplaması ve gelişimi üzerindeki etkileri, MNP yüklü olmayan hücrelerle aynı manyetik substratlar üzerinde kaplanmış ve büyümüş hücreler karşılaştırılarak belirlendi. Hücreler tohumlandı ve substrata yapışmak üzere bırakıldı. Her 2 günde bir hücreler bölüm 7'de açıklandığı gibi taze orta ve NGF ile tedavi edildi. Şekil 4, MNP tedavisi olan ve olmayan PC12 hücrelerini gösterir, 20 μm geniş çizgili ve 100 μm aralıklı manyetik bir substratta büyür ve farklılaşma gösterir. 3 günlük büyümenin ardından hücreler immün yetmemiş, DAPI lekeli ve görüntüler çekilmiştir.

Mıknatıslı hücrelerin manyetik desenlere bağlanıp desenlere göre dalları büyüttkleri tespit edilirken, MNP tedavisi olmayan hücreler manyetik cihazlara benzemeden büyüdü (Şekil 4A,B). Şekil 4C, hücrelerin ve ağ oluşumunun yan uzunluğu 200 μm olan altıgen geometriye ve 50 μm çizgi genişliğine sahip bir substrat üzerinde konumlandırılmasını sunar. Hücreler 6 gün sonra görüntülendi. Mıknatıslanmış hücreler manyetik desen üzerinde, çizgili yüzeylere benzer bir yakınlıkta bulunuyordu. Hücre konumlandırması, manyetik desenlerde bulunan veya bunlara bağlı hücre gövdeleri sayılarak ölçüldü. Hücrelerin göreli oranı toplam hücre popülasyonundan hesaplanmıştır. Bu, MNP tedavisi olan ve olmayan hücreler için yapıldı. Manyetik tepkinin etkili alanı, manyetik desenin her iki kenarına hücrelerin çapı (PC12 hücreleri için ~10 μm) eklenerek hesaplandı. Manyetik şerit desenleri için, etkili manyetik alan oranı% 33 idi, bu da hücrelerin manyetik çizgilere rastgele inme olasılığına karşılık geliyor. Sonuçlar, MNP yüklü hücre gövdelerinin% 75'inin manyetik çizgilerle temas halinde olduğunu, mıknatıslanmamış hücrelerin sadece% 35'inin çizgiler üzerinde bulunduğunu göstermiştir (tarafsız bir dağılımla istatistiksel olarak) (Şekil 4D). İstatistiksel analiz, ölçümün rastgele hücre inmesinden elde olmadığını gösterdi (tek örnekli z-test, p < 10-6, n = 430).

Buna karşılık, manyetik altıgenlerin istatistiksel analizi, MNP yüklü hücrelerin somasının% 92'sinin manyetik desenlere bağlı olduğunu, MNP tedavisi olmayan hücreler için% 38'inin ise olduğunu ortaya koydu (Şekil 4E). Altıgenlerin etkili alan oranı substratın %32'si idi. Altıgenler için istatistiksel analizler de ölçümün rastgele hücre inmesinden elde edildiğini belirtmiştir (tek örnekli z-test, p < 10-6, n = 370). Sonuçlar, MNP yüklü hücrelerin manyetik desen için net bir tercihini ortaya çıkarırken, MNP'si olmayan hücreler tüm substrata rastgele yapıştı. Hücre konumlandırma etkisine ek olarak, bu manyetik platformların büyüyen nötralizlerin yönünü de kontrol ettiği bulunmuştur. Şekil 5A, şeritlerin yönüne göre hizalanan nötrritli MNP yüklü hücreleri gösterir. Buna karşılık, MNP'si olmayan hücrelerin kontrol ölçümü, manyetik desenlerden bağımsız olarak platform genelinde neurite büyüme gösterdi.

Nöronal büyüme yönlülüğü üzerindeki manyetik etkiyi değerlendirmek için nötraller ve manyetik çizgiler arasındaki açı ölçüldü. Veriler, MNP yüklü hücrelerin nötrritlerinin% 80'inin manyetik çizgilerin yönüyle, çizgilerin yönüne göre Δφ < 15 ° içinde korelasyon sergilediğini ortaya koydu. Bununla birlikte, MNP'si olmayan hücrelerin nötrritlerinin sadece% 32'si bu aralıkta gelişti. MNP tedavisi olmayan hücreler manyetik çizgilerle hiçbir korelasyon göstermedi ve tekdüze bir açı dağılımına göre büyüdü (Şekil 5B). Δφ dağılımının istatistiksel analizi normal veya tekdüze olmadığını ortaya koydu (Ki-kare testi, s < 0.001). Altıgen geometrinin neurit büyümesi üzerindeki etkisi de gösterilmiştir. Şekil 5C, altıgenlerin manyetik bir deseninin ve kenarlar arasındaki büyük dairelerin üzerinde manyetize edilmiş ve mıknatıslanmamış PC12 hücrelerinin sinir ağı gelişiminin floresan görüntülerini göstermektedir. Altıgenin yan uzunluğu 200 μm ve çizgi genişliği 10 μm idi; daire çapı 30 μm idi. Hücre somas çevreleri için yüksek benzeşim gösterdi ve altıgen anahatlar boyunca iyi yönelimli bir sinir ağı geliştirdi. Yakınlaştırma görüntüsü, manyetik bir daireye bağlı hücreleri ve bu anahatlar boyunca büyüyen nötroritleri gösterir (Şekil 5D).

Figure 1
Şekil 1: Manyetik cihazların karakterizasyonu. (A) Çeşitli geometrik şekillere sahip manyetik cihazların optik mikroskobik görüntüleri. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) Co80Fe20/Pd çok katmanlı elektron mikroskobik görüntüsünün taranır ve çok katmanlıların şeması. Manyetik desenlerin toplam yüksekliği 18 nm'dir. Ölçek çubuğu = 100 nm. (C) FM'in zorlayıcı ve kalıntı manyetik alanlarını gösteren manyetik cihazın anomalili Hall efekt ölçümü. (D) Çok katmanlı cihazın manyetometrisi, hacim başına hesaplanan manyetizasyon doygunluk değerini gösterir. Bu rakam Marcus ve ark.37'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: AHE = Anomali Salonu etkisi; FM = ferromanyetik; B = manyetik alan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: PC12 hücre alımı MNP'ler. (A) Oda sıcaklığında MNP'lerin manyetometrik ölçümü. (B) PC12 hücreleri tarafından MNP alımının konfokal mikroskopi görüntüsü. DAPI ile lekelenmiş çekirdekler; Rhodamin ile etiketlenmiş MNP'ler hücrelere girer. Ölçek çubuğu = 10 μm (C) ICP ölçümü içselleştirilmiş demir oksit MNP'leri (pg) PC12 hücreleri tarafından 24 saat inkübasyondan sonra birkaç MNP konsantrasyonu ile. Bu rakam Marcus ve ark.37'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: MNPs = manyetik nanopartiküller; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; ICP = endüktif olarak birleştirilmiş plazma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: MNP yüklü PC12 hücre canlılığı. (A) MNP'lerle inkübe edilmiş farklılaştırılmış PC12 hücrelerinin konfokal mikroskobik görüntüleri. Oklar, içselleştirilmiş MNP'lerle farklılaştırılmış nötrallar gösterir. Ölçek çubukları = 50 nm. (B) 3 günlük farklılaşmadan sonra PC12 hücrelerinin neurit büyümesinin sholl analizi. (C) 24 saat inkübasyondan sonra artan MNP konsantrasyonları ile tedavi edilen PC12 hücrelerinin XTT canlılık tahlilleri. Ölçümler kontrol etmek için normalleştirilir. (D) 24 saatlik inkübasyondan sonra artan MNP konsantrasyonları ile tedavi edilen PC12 hücrelerinin resazurin bazlı canlılık tahlilleri. Ölçümler kontrol etmek için normalleştirilir. Her iki analizde de istatistiksel bir öneme sahip değildir. Bu rakam Marcus ve ark.37'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: MNPs = manyetik nanopartiküller; XTT = 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro-5-sülophenyl)-2H-tetrazolium-5-karboksinit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Manyetik cihazların üzerinde hücre lokalizasyonu. (A) Manyetik çizgiler üzerinde büyüyen MNP'lerle yüklü PC12 hücrelerinin floresan görüntüleri: (i) α-tübulin etiketleme, (ii) DAPI boyama ve (iii) birleştirilmiş görüntü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) MNP tedavisi olmayan PC12 hücrelerinin floresan görüntüleri, manyetik çizgilerin üzerinde(A)gibi büyür. (C) Altıgen manyetik desen üzerinde MNP'li ve MNP'siz PC12 hücrelerinin floresan görüntüleri. Ölçek çubuğu = 200 μm. (D) Manyetik çizgiler üzerinde bulunan MNP'li ve MNP'siz hücre gövdelerinin yüzdesi. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Noktalı çizgi, hücrelerin manyetik çizgilere inme olasılığını temsil eder. (E) Manyetik altıgenler üzerinde bulunan, MNP'li ve MNPS'siz hücre gövdelerinin yüzdesi. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Noktalı çizgi, rastgele bir dağılım için hücrelerin manyetik desenlere inme olasılığını temsil eder. Her iki analizde de istatistiksel bir öneme sahip değildir. Bu rakam Marcus ve ark.37'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: MNPs = manyetik nanopartiküller; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Nöronal ağ yönlülüğü. (A) MNP tedavisi ile α-tubulin etiketli PC12 hücrelerinin konfokal mikroskobik görüntüleri (solda) ve MNP tedavisi olmadan (sağda), manyetik çizgilerin üzerinde büyüyen. Çizgiler işaretli. (B) Polar histogramlar PC12 hücreleri (solda) üzerinde neurit yönlülük etkisini MNP tedavisi ile ve (sağda) MNP tedavisi olmadan sunar. Oryantasyon açısının sapması, neurites ve manyetik şerit yönelimi (15° kutular) arasındaki açı farkı olarak tanımlanır. (C) Manyetik altıgen bir desenin üzerinde yetişen PC12 hücrelerinin floresan görüntüleri, (solda) MNP tedavisi ile ve (sağda) MNP tedavisi olmadan. Ölçek çubuğu = 200 μm. (D) Manyetik desene göre nötritler geliştiren mıknatıslı bir hücrenin yakınlaştırma görüntüsü. Ölçek çubuğu = 30 μm. Bu rakam Marcus ve ark.37'den değiştirilmiştir. Kısaltma: MNPs = manyetik nanopartiküller. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Temsili sonuçlar, mikron ölçeğinde nöronal ağ oluşumunu kontrol etmek ve düzenlemek için sunulan metodolojinin etkinliğini göstermektedir. MNP yüklü PC12 hücreleri canlı kaldı ve FM elektrotlardan belirli bölgelere manyetik kuvvetler tarafından çekilen manyetik hassas birimlere dönüştürüldü. Bu en iyi şekilde gösterilmiştir Şekil 5CHücrelerin tercihen ince çizgilere değil, altıgenlerin daha büyük köşelerine yapıştığı yer. Ayrıca, hücrelerin dallanma da manyetik desenleri takiben olumlu gelişti. Tüm kontrol deneyleri, manyetik kuvvetlerin hücre gövdelerinin ve büyümelerinin lokalizasyonunu yönlendirdiğini açıkça göstermiştir. Her ne kadar topografik ipuçlarının neurit büyüme40,41'i yönlendirmek için kullanılabileceği gösterilmiş olsa da, MNP'siz hücreler desenin şekline yanıt göstermediği için burada durum böyle değildir.

Birçok araştırma tesisinde bulunan standart fotolithografi ve sputtering ifadeleri kullanılarak yerel manyetik kuvvetlerin mühendisliği için aşağıdan yukarıya bir yaklaşım kullanılarak bu tekniklerin birçok araştırmacı tarafından benimsenmesini kolaylaştırıldı. Aşağıdan yukarıya yaklaşım, santimetre uzunluğundaki alanlar için mikron ölçeğinde çözünürlükle, araştırmacıların ihtiyaçlarına göre karmaşık desen ve şekillerin tasarımında özgürlüğe izin verir. Sonuçlar cam slaytlarda gösterilmiş olsa da, prensip olarak, cihazları nöronal kayıt ve stimülasyon için esnek elektrot dizileri gibi in vivo terapötik uygulamalar için uygun olan diğer biyouyumlu malzemelerin üzerine hazırlamak mümkündür42,43.

Çok katmanlı biriktirme ile elde edilen bu benzersiz PMA platformları,dahaönce gözlemlendiği gibi sadece kenarlarda değil, tüm manyetik desen boyunca güçlü bir manyetik alan üretir. Ek olarak, FM'ler büyük bir kalıntı manyetizasyon doygunluğu ile tasarlanmıştır, yani dış manyetik alan çıkarıldığında bile, elektrotlar tamamen mıknatıslanmış kalır ve harici bir mıknatısa ihtiyaç duymadan hücreleri çekmeye devam eder. Bununla birlikte, harici bir manyetik kuvvet, hücrelerdeki MNP'lerin tamamen mıknatıslandırılmasına yardımcı olabilir, böylece kaplama sırasında çekim ve verimlilik kuvvetini artırabilir. FM tasarımında önemli bir husus tekrar sayısıydı. Daha fazla tekrarlama, olumlu olan toplam manyetik anı artıracak olsa da, birçok katman eklemek de katman karıştırmayı artıracak, daha az kararlı PMA'ya neden olacak ve son olarak düzlem içi manyetizasyona neden olacak44,45 kolay eksen ve elektrotların farklı kenarlarına çekim22,37. Bu nedenle, maksimum manyetik alanlarla kararlı PMA sağlamak için çok katmanlıların FM numarasını ve bileşimini optimize etmek gerekir.

Temsili sonuçlarda sunulan MNP'ler, test edilen konsantrasyonlarda PC12 hücrelerine karşı neredeyse hiç toksisite göstermedi ve hücrelere girebilmelerine ve nispeten yüksek bir manyetik momente sahip olmalarına rağmen hücresel davranışları etkilemediler. Bir hücredeki çekim kuvveti, hücredeki MNP sayısına ve her MNP'nin mıknatıslanmasına bağlıdır. İdeal olarak, her ikisi de yüksek olmalıdır; ancak, ikisi arasında bir denge olabilir. Bazı ticari MSP'lerle hücre canlılığı iyiydi, ama manyetik an çok zayıftı. Laboratuvarda üretilen diğer parçacıklar için manyetik moment yüksekti, ancak MNP'ler toplanma eğilimindeydi ve hücre canlılığı düşüktü. Bu nedenle, MNP'leri seçerken hücre canlılığını test etmek ve manyetizasyonlarını karakterize etmek önemlidir. Burada kullanılan MNP'ler de floresandır, bu da hücrelerdeki konumlarını izlemeyi kolaylaştırır. Sonuçlar manyetik desenin şekline göre gelişen nötronları gösterir ve floresan nötronlar boyunca MNP'lerin varlığını gösterir.

MNP'lerin hücrelere içselleştirme mekanizması daha öncearaştırılmıştır 46. MNP'lerin hücresel alımı, boyutlarına, şekillerine ve yüzey kimyalarına göre endositoz yoluyla gerçekleşir. Önceki çalışmalar, farklı tipte MNP'lerin nöronlara alımını inceledi24; kaplamalı MNP'lerin hücresel alımı, kaplamasız MNP'lerin hücresel alımından daha iyiydi. Şekil 3A,B 'degösterildiği gibi, MNP'ler sitoplazmaya içselleştirildi, ancak çekirdeklerin dışında kaldı ve gelişimleri sırasında neuritlere aktarıldı. Ek olarak, NGF sinyal yolunu aktive eden NGF'ye eşlenen MNP'ler de endositoz47,48aracılığıyla hücrelere içselleştirildi.

Sonuç olarak, bu makale biyolojik element organizasyonu gerektiren araştırmalar için etkili bir manyetik manipülasyon araç kutusu sunun. Manyetik kuvvetlerin kullanımı, hücrelerin konumlandırılmasını sağlar ve neurit büyümesini yönlendirir. Bu yöntem, karmaşık geometrik şekillere sahip platformların tasarlanmasını sağlar. Manyetik çekim kuvvetleri, zaman içinde manyetik kuvvet manzarasını değiştirerek sinir ağı oluşumunu uzaktan manipüle etmek için tasarlanmıştır. Tüm bu metodoloji, MNP'lerle birleşebilecek diğer faktörleri veya kimyasalları kontrol etmek ve bunları mikron ölçeğinde çözünürlükle önceden tasarlanmış ilgi çekici noktalara getirmek için kolayca genişletilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Acknowledgments

Bu araştırma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, İsrail ve İsrail Bilim Vakfı (569/16) tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 15710
6-well cell culture plate FALCON 353846
96-well cell culture plate SPL life sciences 30096
Amphotericin B solution Biological Industries 03-028-1B
AZ 1514H photoresist MicroChemicals GmbH
AZ 351 B developer MicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA) Biological Industries 03-010-1B
Cell and Tissue cultur flask Biofil TCF002250 75.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dish Greiner Bio-One 627-160 35 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based) Biological Industries 20-300-1000
Centrifuge tube Biofil CFT021500 50 mL
Co80Fe20 at% sputter target ACI Alloys 99.95%
Collagen type I Corning Inc. 354236 Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscope Leica TCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-165-152
DAPI fluoromount-G SouthernBiotech 0100-20
Disposable needle KDL 23 G
Disposable  syringe Medispo 1160227640 10 mL
Donor horse serum Biological Industries 04-124-1A
ELISA reader Merk Millipore BioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70% ROMICAL LTD 19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated) Biolab-chemicals 52505
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries 04-127-1A
Fresh murine β-NGF Peprotech 450-34
GMW C-frame electromagnet . Buckley systems LTD 3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32% DAEJUNG CHEMICAL & METALS 4170-4100
ImageJ US National Institutes of Health, Bethesda NeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP) Ametek Spectro SPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measure Keithley 2400
Keithley switching system Keithley 3700
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Light microscope Leica DMIL LED
Maskless photolithography Heidelberg Inst. MLA150
Microscope Slides BAR-NAOR BN1042000C
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 438073
Normal donkey serum (NDS) Sigma D9663
PBS 10x hylabs BP507/1LD
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Pd sputter target ACI Alloys 99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solution Biological Industries 03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagent Molecular probes A-13261 resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulin Santa Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering system Orion AJA Int. Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamine Biological Industries 01-100-1A
Sonication bath KUDOS SK3210HP Frequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometer Quantum Design, CA
Triton X-100 CHEM-IMPEX INTERNATIONAL 1279 non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), London, England. 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , EP19990925247 (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

Tags

Biyomühendislik Sayı 173 manyetik nanopartiküller dik manyetizasyon anizotropisi (PMA) manyetik hedefli ilaç teslimatı manyetik hücre manipülasyonu sinir kültürü sinir mühendisliği biyo-interfacing fotolithografi manyetik çok katmanlı
Birbirine Bağlı Nöronların Mikron Ölçekli Organizasyonu için Manyetik Platformların İmalatı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., … More

Indech, G., Plen, R., Levenberg, D., Vardi, N., Marcus, M., Smith, A., Margel, S., Shefi, O., Sharoni, A. Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons. J. Vis. Exp. (173), e62013, doi:10.3791/62013 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter